CN102268467A - 松乳菇菌丝多糖提取物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及到松乳菇菌丝的提取物，还涉及该提取物的用途，所说的松乳菇提取物是松乳菇多糖。松乳菇多糖，是通过松乳菇菌丝发酵，经提取、纯化得到。本发明用松乳菇多糖做饲料添加剂在断奶仔猪中应用，可起到抗生素和抗应激药物的双重功效，防治仔猪腹泻，提高增重和饲料转化率，给松乳菇多糖在兽药和饲料添加剂的开发利用上提供全新技术。

Description

松乳菇菌丝多糖提取物及其应用

技术领域

本发明涉及到松乳菇菌丝的提取物。

本发明还涉及该提取物的用途。

背景技术

大量科学实验表明许多大型真菌多糖具有很强的抗肿瘤活性，并有调节免疫、抗菌、抗病毒、抗突变、抗衰老、抗溃疡、抗氧化、抗血栓、降血压、降血脂、健胃保肝等方面的重要功能，因而被称为重要的生物效应调节剂，广泛应用于免疫缺陷性疾病、自身免疫疾病和肿瘤等疾病的临床治疗。目前国内外正式用于临床的真菌多糖有香菇多糖、云芝多糖、裂褶多糖等。松乳菇肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富，是备受人们喜爱食用菌，由于松乳菇与植物共生，有特殊的生态条件、营养方式和子实体分化发育条件，对它的驯化有很大难度，难以大规模生产。中国专利申请CN109L568C用培养基(酵母2～10g，尼克酸1～10mg，叶酸2～8mg，生物素1～8mg等组成)进行菌种培养，选用马尾松种子与菌种培养成菌根合成苗。将该菌根合成苗在常规条件下种植2～3年出菇，程序复杂，周期长，仅对子实体进行繁殖，用其制备药物或饲料添加剂有限，未对松乳菇有药理活性的成分进行研究。

国内学者对松乳菇的发酵条件与工艺进行了研究。多数研究表明松乳菇菌丝在以葡萄糖、蔗糖、糊精、甘露醇等为碳源、以玉米浆、牛肉膏、硝酸铵等为氮源的培养基上生长好，矿质盐MgSO₄和NaCl使菌丝启动加快，磷酸二氢钾使菌丝产量提高；VB1、VB6、烟酸对菌丝的生长有促进作用，适宜的培养温度25～27℃，pH6～7.5。目前常用松乳菇菌丝发酵培养基：玉米浆1.5％，硝酸铵0.15％，羧甲基纤维素钠0.4％，葡萄糖1.5％，PH6.5.

多糖是极性大分子化合物，大多采用不同温度的水、稀碱溶液提取，由于水浸时间长且效率低，酸碱浸提易破坏多糖的立体结构及活性，近年来出现了一些新的提取方法和新的设备，如超临界CO₂萃取、超声波提取、微波提取、酶法提取、透析法、柱层析法、分子筛分离法、中空纤维超滤法、膜分离集成等技术。

用复合酶解法提取黄芪多糖，远比纯热水浸提黄芪多糖提取率高[陈学伟，马书林.酶法提取黄茂多糖的研究.[J]上海中医药杂志，2005，1(39)：56-58]。从复合酶提取大枣多糖中得知，酶的介入直接缩短提取工艺时间，这是由酶的高效性，专一性能决定的，一般而言，一次提取2h左右可完成提取任务的80％～90％；而传统工艺完成相同的提取任务则需要提取2～3次且每次提取需3h[石奇.复合酶提取大枣多糖的研究.[D].西北大学，2006，6]。

超声提取技术是目前国内外研究的一大热点。高强度超声波能形成高能量声场，因此可利用声场对溶液形成的声空化作用对溶液进行超声处理。与普通方法相比，该法具有水解效率高，产品质量好等优点，同时还能缩短提取周期，并使反应条件更加温和。国内真菌多糖超声提取主要集中在两方面，一是直接使用超声提取，其次是采用超声技术与其他提取方式相结合，如超声与超滤相结合，超声提取与酶解相结合。李艳等[肉从蓉多糖的超声提取及含量分析[J].西北药学杂志2004，19(3)：107-108]采用超声提取法从肉苁蓉中提取多糖并测定其含量，并用分光光度法测定多糖含量，结果证实了超声法提取多糖，速度加快，收率提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种松乳菇菌丝的提取物。

本发明另一目的是提供上述提取物的用途。

本发明通过松乳菇菌丝发酵，经提取、纯化得到松乳菇多糖。

松乳菇菌丝的发酵的方法现有技术中有公开，例如敖常伟(中南林学院；森林培育学(专业)硕士论文2002年度)公开了松乳菇菌丝较适宜的培养条件，并对其进行了筛选。

从菌丝中提取多糖，现有技术中也公开了许多方法。本申请采用了多种现有方法进行提取，并且也采用了改良后的方法进行了提取。

其中采用了微波提取方法获得了松乳菇菌丝多糖提取物，提取率最高达29.49％。

本发明也采用了复合酶提取松乳菇菌丝多糖，提取率最高达30.38％。本发明实施例中所用的复合酶是纤维素酶、蛋白酶、木瓜蛋白酶。

本发明还采用了超声波提取松乳菇菌丝多糖，提取率最高达42.52％。

本发明还联合两种方法来提取松乳菇菌丝多糖。发现先采用超声波提取，然后将提取物进行复合酶提取，两种方法联用大幅提高了多糖的得率，多糖提取率达64.5％。

对松乳菇菌丝进行多糖提取后所获得多糖粗提物，一般还需要进行脱色和脱蛋白的处理，通常可以采用离子交换树脂脱蛋白，用活性炭脱色。

本发明进一步对松乳菇多糖进行了药理研究。

研究发现松乳菇多糖对沙门氏菌、大肠杆菌、巴氏杆菌有较强的抑制作用；松乳菇多糖对猪繁殖与呼吸道综合征病毒有抑杀作用，对鸡法氏囊病毒和新城疫病毒有一定的抑制作用，可延缓接种病毒鸡胚的死亡时间2-4天；发现松乳菇多糖能显著提高小鼠的免疫功能，包括显著提高小鼠胸腺指数和脾脏指数，显著提高小鼠单核-巨噬细胞吞噬能力、脾细胞增值能力，血清溶血素效价。

本发明用松乳菇多糖做饲料添加剂在断奶仔猪中应用，可起到抗生素和抗应激药物的双重功效，防治仔猪腹泻，提高增重和饲料转化率，给松乳菇多糖在兽药和饲料添加剂的开发利用上提供全新技术。

具体实施方式

本申请中所使用的微生物菌种均是公众能得到的，并且本申请实施例中所使用的菌种的具体来源也是对公众开放。

本发明中，按照加入物质的形态来区分百分比，本发明培养基是液态，一般来说加入是干物质，百分比即重量/体积；加入的是液体物质，百分比即体积/体积。

实例1：松乳菇深层发酵培养基筛选试验

1.材料

(1)松乳菇菌种    湖南民康生物技术研究所保存

(2)培养基

液体培养基：蛋白胨0.3％，硝酸铵0.15％，CMC0.4％(羧甲基纤维素钠)，可溶性淀粉2％，KH₂PO₄ 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，加水至100％。

不同PH值培养基：以上配方培养基分别调PH值5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0。

不同碳源：用葡萄糖，果糖，乳糖，淀粉，麦牙糖取代配方可溶性淀粉。

不同氮源培养基：取与配方中蛋白胨相同含氮量的其他氮源：硝酸铵0.2004g、硫酸铵1.56g、乙酸铵1.82g、尿素0.71g，玉米浆1.5g。

2.方法

菌丝培养特性观察

(1)不同pH值培养基试验：将菌丝接种到不同PH值的培养基上，每一个处理4个重复。

(2)不同碳源试验：将菌丝接种到不同碳源的培养基上，每一个处理4个重复。

(3)不同氮源试验：将菌丝接种到不同氮源的培养基上，每一个处理4个重复。2结果

表1：不同ph值对松乳菇培养的影响

#+++表示菌丝生长很密，++表示菌丝生长较密，+表示菌丝生长较稀

从表1中，可以发现ph值为6.5时菌丝生长速度最快、长势最好，6.0时菌丝萌发时间最快。

表2：松乳菇菌丝在不同碳源中生长的结果

#+++表示菌丝生长很密，++表示菌丝生长较密，+表示菌丝生长较稀

表2说明在不同碳源培养基中，以葡萄糖为碳源的生长最快，乳糖和蔗糖的次之，淀粉生长最慢。不同碳源的培养基，菌丝萌发时间相差不多。

表3：松乳菇菌丝在不同氮源中生长的结果

表3说明不同氮源中，以乙酸铵为氮源的培养基，菌丝生长速度最快，以蛋白胨、硫酸铵和乙酸铵为氮源的培养基萌发时间最短。

筛选出适合松乳菇菌丝生长的培养基：葡萄糖为最佳碳源；乙酸铵为最佳氮源；测定了不同培养基的最适PH值6-6.5。

实例2：松乳菇菌丝多糖微波提取

1材料

干燥松乳菇菌丝体    湖南民康生物技术研究所保存

2方法

2.1松乳菇菌丝多糖微波提取流程

3结果

3.1提取时间对松乳菇菌丝多糖提取率的影响：在60S～160S范围时，多糖提取率随着微波提取时间的延长迅速升高，在160S以后，菌丝多糖提取率增加缓慢，提取时间不宜过长，因为在微波作用下富含水的部分优先破壁，而含水少的细胞则比较滞后，甚至不能被微波破壁，使得细胞内多糖的提取难以进行。

3.2不同料液比对松乳菇菌丝多糖提取率的影响：多糖随着微波提取松乳菇菌丝多糖，随着料液比增加，提取率在升高，在料液比1.0×10^-3∶2～1.0×10^-3∶3时达到最高。

3.3不同乙醇含量对松乳菇菌丝多糖提取率的影响：不同乙醇含量微波取松乳菇菌丝多糖，随着乙醇浓度增加，提取率在升高，在乙醇含量在15％～25％时达到最高。

利用微波技术提取松乳菇菌丝多糖，采用单因素试验的方法研究了浸提时间、料液比和添加提取媒介乙醇浓度三个因素对茶多糖提取率的影响。结果表明，浸提时间为120S～180S、料液比1.0∶2000～3000和乙醇含量15％～25％，本实验微波松乳菇菌丝多糖提取率最高达29.49％。

实例3复合酶提取松乳菇菌丝多糖单因素的试验

1材料

同微波提取

2松乳菇菌丝多糖提取流程(同微波提取，将微波提取改为复合酶提取)

表4实验单因素设计表

3结果

3.1不同料液比对松乳菇菌丝多糖提取率的影响：当料液比达到1∶500时，多糖提取率的上升到最高点，增加水体积时，多糖提取率下降。分析为为，菌丝是一种固体物质，不能充分扩散到溶液中，导致酶与底物的接触面积受到限制，在低的酶浓度下，酶与底物沿可较充分的结合；随着料液比的降低，底物浓度和对酶浓度降低，导致酶与底物不能充分的结合，从而菌丝多糖提取率降低。

3.2提取温度对松乳菇菌丝多糖提取率的影响：50℃是该酶体系的最适作用温度，在50℃之前，随着温度的升高，多糖提取率迅速上升。该曲线反映了温度对本科促反应和细胞内分子扩散的双重影响：在未达到本科的最适作用温度前，升高温度增加了包括酶和底物分子在内的溶液体系的热能，既可使胞内活性物质分子运动速度加快，有利于其从细胞内向溶液扩散，又能提供酶促反应所需的能量，促进酶的作用，使酶解破壁用用加强，进一步促使有效物质从胞内逸出，所以菌丝多糖提取率在这一段时间内提高。然而温度继续升高会对酶带来第二种效应，那就是会导致生物酶部分甚至全部变性，酶促反应受到抑制。

3.3不同pH值对松乳菇菌丝多糖提取率的影响：酶要表现活性，它的活性部位有关基团必须具有一定的解离形式，pH值对酶的影响就是由于pH会影响酶的活性中心或与之有关的基团的解离状态。每种酶都有最适pH值，在此pH值下催化反应的速率最高。对最适pH值偏离不是很大时，酶虽不变性，但会使本科活性部位的基团离子化发生改变，从而降低酶的活力；pH值发生较大偏离时，维护酶的三维结构的共价键就会受到干扰，导致酶蛋白自身的变性。对本实验所用酶体系，最适pH为5.0。

3.4不同酶浓度对松乳菇菌丝多糖提取率的影响

表5不同酶浓度提取松乳菇菌丝多糖

由表5可以看出，添加纤维素、果胶酶和木瓜蛋白酶为主体的复合酶在一定程度上可提高菌丝多糖的提取率。利用复合酶(纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶)技术提取松乳菇菌丝多糖，采用单因素试验的方法研究了不同浸提pH值、浸提温度、料液比和酶浓度四个因素对松乳菇菌丝多糖提取率的影响。结果表明，浸提pH值5.0、浸提温度50、料液比1∶500和复合酶的浓度为(纤维素1.5％，果胶酶3.0％，木瓜蛋白酶3.0％)松乳菇菌丝多糖提取率最高。松乳菇菌丝多糖提取率最高达30.38％。

实例4超声波提取松乳菇菌丝多糖的工艺研究

1材料

同微波提取

2松乳菇菌丝多糖提取流程(同微波提取，将微波提取改为超声提取)

3结果

3.1正交试验提取松乳菇菌丝多糖

确定松乳菇菌丝体超声提取时间，功率，加水量，粒度为四个因素做正交试验：

表6实验因素水平表

表7 L9(3⁴)正交试验结果与直观分析

表8 L9(3⁴)实验方差分析表

从表6的直观分析可以看出，极差R反应了4个因素对多糖提取含量的影响R_A＜R_C＜R_D＜R_B，即因素对提取率的影响顺序：超声提取时间，松乳菇菌丝体的粒度，加水量，超声功率，并得出该正交试验最佳组合为A₃B₂C₁D₃，即超声60分种，超声功率为400W，松乳菇菌丝体粒度为过60目筛，料液比为1∶2500。

从表7的方差分析可以看出，试验因素对结果没有显著影响，从经济、省时的原则考虑，生产上应把松乳菇菌丝体的粒度作为关键因素考虑。

3.2不同温度单因素提取松乳菇菌丝多糖试验

确定提取松乳菇菌丝温度10、20、30、40、50、60℃时，加水100ml，过80目筛，超声功率400W，时间40分钟，多糖提取率会随着时间的升高而升高，由于超声会引起温度的上升，在10℃和20℃超声时，因为降温原因延长了超声时间，所以比实际值偏高。温度超过60℃时，有可能会破坏多糖的分子结构，建议超声提取在60℃以下进行。

3.3研究了利用超声波萃取松乳菇菌丝多糖的提取工艺，采用分光光度比色法测定菌丝多糖含量，通过正交实验和单因素实验对超声波提取松乳菇菌丝多糖的提取工艺进行了系统研究，确定了最佳工艺，即：即超声60分钟，超声功率为400W，松乳菇菌丝体粒度为过60目筛，料液比为1∶2500。松乳菇菌丝多糖提取率最高达42.52％。

实例5超声波、复合酶联合提取松乳菇菌丝多糖实验

将超声波提取得到的多糖进行复合酶提取(方法如上)，得到64.5％的松乳菇粗糖。

实例6：松乳菇菌丝粗糖纯化实验

1材料

松乳菇菌丝胞内多糖粗品：超声波提取法(菌丝体粒度为60目，料液比1∶2500，温度60℃，功率400W，时间60分钟)

2方法

先进行活性炭脱色素，然后732型阳离子交换树脂法脱蛋白质，按下式计算多糖的吸附量和吸附率：

q＝(C₀-C)V/W(mg/g树脂)

$E=\frac{C_0-C}{C_0}\×100\%$

式中q为吸附量；C₀为初始浓度(mg/ml)；C为吸附平衡浓度(mg/ml)；V为吸附液体积；W为树脂重量；E为吸附率。

3结果

3.1蛋白质标准曲线及回归方程的建立：利用CurveExpert1.3软件，以蛋白质含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，得到标准曲线，其回归方程为y＝0.0068x-0.0019，相关系数R²＝0.9993。

表9蛋白质含量和吸光度的关系

3.2活性炭脱色素

通过对多糖溶液的扫描图形分析，其扫描曲线为平滑下降曲线，多糖溶液的吸收峰在340～480nm之间，在340nm处有最大吸收峰，故选340nm为测定波长，在此波长下，吸光度值为1.7065。表3.3为不同量活性炭处理后多糖溶液OD值及脱色率，表3.4为不同活性炭用量对蛋白质脱除率及多糖纯度的影响。从表10、表11中看知，随着活性炭用量的增加，脱色率也在增大。活性炭用量在0.5～1％范围内脱色效果增强幅度较大，此后增强幅度减小，基本趋于稳定。当活性炭用量增加到2％时，多糖溶液已基本无颜色。蛋白质脱除率也随着活性炭用量的增加而增大。活性炭用量在1.5～2.5％范围内蛋白质脱除率增加幅度很大，达到56.1％，而在0.5～1.5％范围内只有9.7％，但可以看出多糖纯度却没有随之升高，反而随着活性炭用量的增加而略有降低，表明活性炭对多糖的吸附量也在不断增加，活性炭用量过大会使多糖损失过大，而当多糖吸附量较低时，蛋白质脱除率也较低，故活性炭不能作为主要的除蛋白质方法。综合考虑表10、表11的结果，活性炭用量宜控制在1～1.5％之间。

表10活性炭用量对脱色率的影响

表11活性炭用量对蛋白质脱除率及多糖纯度的影响

3.3 732型阳离子交换树脂脱蛋白质

3.3.1pH值对脱蛋白的影响

采用树脂分离多糖溶液中的蛋白质，要求树脂对多糖的吸附量要小，而对蛋白质的吸附量要大。蛋白质是两性物质，分子中既含有-NH₂，又含有-COOH，在等电点时以中性离子形式存在，通过调节溶液pH值可以改变其存在形式。本试验采用阳离子交换树脂分离多糖溶液中的蛋白质，那就需要将蛋白质转变成以阳离子的形式存在。在pH值较低时蛋白质是以阳离子的形式存在，因此在对松乳菇多糖溶液和牛血清白蛋白溶液的静态吸附实验中，分别考察了在pH＝4，5，6的条件下，树脂对于多糖和蛋白质的吸附性能影响，见表12和表13。

表12不同pH值下对多糖的吸附性能

表13不同pH值下对蛋白质的吸附性能

从上表可知，采用732型阳离子交换树脂分离松乳菇多糖溶液中的蛋白质是可行的，在不同的pH值下732型阳离子交换树脂对松乳菇多糖的吸附量和吸附率均比较低，在pH4和pH5条件下，吸附量相当，明显小于pH6条件下的吸附量；对蛋白质的吸附量较大，在pH4和pH5条件下，吸附效果相当，明显好于在pH6条件下的吸附效果。随着pH值的减小，树脂对蛋白质的吸附量和吸附率先增大，随后又减小。蛋白质是两性物质，当pH值减小到低于其等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，其在树脂上的吸附量和吸附率会增大，并会随着pH值的继续减小而增加。但试验结果表明pH值继续减小时，蛋白质的吸附量和吸附率反而降低，这可能是由于强酸改变了蛋白质的分子结构，其原因有待进一步研究。因此最佳pH值为5，故选择在pH5的条件下进行动态吸附实验。

3.3.2流速对蛋白质吸附的影响

试液流速的变化直接影响溶质向树脂内表面的扩散，实验中分别以四种不同的流速进行动态吸附实验。

表14不同流速下多糖的纯度

试液多糖原始纯度为80.3％，实验结果表明，通过732型阳离子交换树脂处理，能够较好的提高多糖的纯度，但随着试液流速的增大，树脂对蛋白质的吸附量减少，多糖的纯度降低，这是因为随着流速变快，树脂与蛋白质分子之间的接触时间变短，离子交换量减少；流速变小，有利于吸附，但会延长吸附的时间，不利于大规模工业化生产。在0.5ml/min与1.0ml/min流速下多糖纯度相差很小，因此选择1.0ml/min流速。

本实验研究表明，可采用活性炭对松乳菇多糖溶液脱色，用量在1～1.5％范围内；可采用732型阳离子交换树脂脱蛋白，调多糖溶液pH值为5，控制洗脱流速为1.0ml/min。

实例7松乳菇多糖体外抑菌试验

1材料

(1)菌种：

大肠杆菌(C44103)、链球菌(O1026)、沙门氏菌、巴氏杆菌、金色葡萄球菌购自湖南农业大学微生物实验室

(2)松乳菇菌丝多糖  湖南民康生物技术研究所自制：利用超声提取(菌丝体粒度为60目，料液比1∶2500，温度60℃，功率400W，时间60分钟)松乳菇粗糖，将粗糖进行活性炭脱色、乙醇沉淀、732型阳离子树脂过柱，并对洗脱液进行浓缩最后得到浓度为90.1％的松乳菇多糖；

2方法

2.1菌液制备

将保存菌种接种于肉汤中，经37℃，培养18h后，将菌液稀释至10⁵～10⁶个菌/ml备用。

2.2细菌计数

将制备菌液用生理盐水进行10倍梯度稀释，然后选取适当浓度的0.1ml菌液均匀接种于平皿琼脂培养基上，37℃恒温培养18～20小时后，计算菌落数目，根据菌液稀释浓度计算每毫升菌液的活菌数。

2.3最小抑菌浓度(MIC)测定

采用试管法：取45支灭菌带棉塞的试管，每9支为1组，编号。在超净台上每支试管内分别加入肉汤培养基1.0ml。1～7号试管为试验管，分别加入每毫升含松乳菇多糖0.2、0.15、0.10、0.05、0.025、0.0125、0.00625g的药液0.1ml，然后再分别加入菌液0.1ml；第8号试管只加肉汤和药液1ml，不加菌液，作为阴性对照；第9号试管加肉汤1.0ml，菌液0.1ml，作为阳性对照。然后将试验管和对照管置37℃的恒温箱中培养24h后取出，观察并判定药物对此菌株的最低抑菌浓度(MIC)。

3结果

表15：松乳菇菌丝多糖对畜禽常用病原体的MIC和MBC的测定结果

注：“-”表示无细菌生长，“+”表示有细菌生长，“++”表示菌体生长较强，“+++”表示生长很强。

表15显示松乳菇菌丝多糖对畜禽常用病原菌有一定的抑菌作用，对沙门氏菌、大肠杆菌、巴氏杆菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)分别为25mg/ml和150mg/ml，50mg/ml和100mg/ml，12.5mg/ml和50mg/ml。而对金黄色葡萄球菌、链球菌未见明显的抑菌效果。

实例8松乳菇多糖在鸡胚中对禽病毒的抑制试验

1材料

(1)毒种

IBDV强毒株        由广东温氏惠赠

NDV强毒株         由云南省畜牧兽医研究所惠赠。

(2)鸡胚

普通鸡胚从种鸡场购买种蛋自孵至9-11日龄，经琼脂扩散试验检测对病毒呈阴性。

(3)松乳菇菌丝多糖  湖南民康生物技术研究所自制：利用超声提取(菌丝体粒度为60目，料液比1∶2500，温度60℃，功率400W，时间60分钟)松乳菇粗糖，将粗糖进行活性炭脱色、乙醇沉淀、732型阳离子树脂过柱，并对洗脱液进行浓缩最后得到浓度为90.1％的松乳菇多糖；

2方法

2.1松乳菇菌丝多糖在鸡胚中抑制法氏囊病毒试验：

140枚鸡胚，分成6组，每组20枚，1、2、3、4、5组，分别接50倍稀释的法氏囊病毒冻存原液和含100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6.25mg/ml浓度的等剂量松乳菇菌丝多糖溶液，0.2ml/枚；第6组，接种50倍稀释的法氏囊病毒0.2ml/枚，为阳性对照；第7组接种生理盐水，0.2ml/枚，为空白对照。记录鸡胚的平均死亡时间MDT，并测定血凝价。

2.2松乳菌菌丝多糖在鸡胚中抑制新城疫病毒试验：(处理同上)

3结果

3.1松乳菇菌丝多糖抑制法氏囊病毒试验

鸡胚接种法氏囊病毒(阳性对照组)72小时内全部死亡，组织病变：四肢皮肤或趾关节有充血和出血点，也有的绒毛尿囊膜轻度增厚并混浊，头部和腹部皮下水肿，多数鸡胚发育缓慢。肝肿大，淡黄色，有形状不同的坏死点脾肿大，并有坏死点。肾肿大，充血。心肌色淡。接种试验结果如下表

表16：松乳菇菌丝多糖抑制法氏囊病毒试验(鸡胚死亡数：个)

“-”表示胚体全部死亡

从表16中可以得出，接种松乳菇菌丝多糖和法氏囊病毒混合液，平均死亡时间比阳性对照明显增长，尿囊液血凝效价明显降低，说明松乳菇菌丝多糖对法氏囊病毒有一定的抑制作用，减缓了鸡胚的死亡，但是对病毒不能起到杀灭作用，鸡胚最终全部死亡。

3.2松乳菇菌丝多糖在鸡胚中抑制新城疫病毒试验

鸡胚在接种新城疫病毒(阳性对照组)后48h内死亡，死亡鸡胚全身严重出血、水肿，呈透明状，肝脏有坏死和出血点。接种试验结果如下表

表17：松乳菇菌丝多糖抑制新城疫病毒试验(鸡胚死亡数：个)

-表示无存活胚

从表17中可以得出，接种松乳菇菌丝多糖和新城疫病毒混合液与阳性对照相比，平均死亡时间明显增长，尿囊液HA值明显降低，说明松乳菇菌丝多糖对新城疫病毒有一定的抑制作用，减缓了鸡胚的死亡，但是对病毒不能起到杀灭作用，鸡胚最终全部死亡。

实例9松乳菇多糖体外抗猪繁殖与呼吸道综合征病毒试验

1材料

毒种：猪繁殖与呼吸道综合征病毒    湖南农业大学余兴农老师惠赠

Marc-145细胞         湖南农业大学余兴农老师惠赠

松乳菇菌丝多糖       湖南民康生物技术研究所自制

2方法

(1)利用超声提取(菌丝体粒度为60目，料液比1∶2500，温度60℃，功率400W，时间60分钟)松乳菇粗糖，将粗糖进行活性炭脱色、乙醇沉淀、732型阳离子树脂过柱，并对洗脱液进行浓缩最后得到浓度为90.1％的松乳菇多糖，将松乳菇多糖用60℃蒸馏水溶解制成10mg/ml的多糖溶液。

(2)松乳菇多糖对Marc-145细胞系安全浓度测定

将松乳菇多糖用细胞维持液连续倍比稀释6个浓度后，加到长成单层Marc-145细胞的96孔细胞培养板中，200μl/孔，每个稀释度重复8孔，另设细胞对照，置37℃5％CO₂培养箱继续培养72h，每天观察CPE情况。

(3)TCID₅₀的测定

将病毒在一块48孔板上从10^-1～10^-10作连续10倍的稀释，将稀释好的病毒接种到细胞长满单层的96孔微量培养板中，每一个稀释度做8个孔，每孔接种200μl，37℃培养，逐日观察(一般需7-10d左右)，直至终点，也就是看到能够引起病毒增殖(根据细胞病变)的病毒最高稀释度，最后按照Karber法计算结果。

(4)CPE法观察松乳菇多糖体外抗PRRSV作用

感染细胞的试验在松乳菇多糖对细胞生长安全浓度的基础上，以药物的三种不同的作用方式探讨松乳菇多糖对病毒的作用机理。

(4.1)先加药后加病毒(抗病毒吸附和进入)

在细胞已基本长成单层的96孔中，吸出各孔旧的培养液，加入安全浓度松乳菇多糖，每孔100μl，重复8个孔，设正常细胞对照组和病毒对照组，用记号笔做好标记，置37℃5％CO₂培养箱中培养4h后加入100个TCID₅₀的病毒液100μl，置37℃5％CO₂培养箱中培养72h，每天用倒置显微镜观察细胞病变(CPE)情况并记录，以最后的记录结果为最终的结果。

(4.2)先接毒后加药(抑制病毒的合成及释放)

先用PRRSV毒液作用2h后再加松乳菇多糖，其他操作如上。

(4.3)药物与病毒体外作用一段时间后加入(直接灭活病毒)

用含100TCID₅₀病毒的培养液和松乳菇多糖以安全浓度同时加入一支小试管中，盖上盖子，置37℃5％CO₂培养箱中培养4h后，加入细胞长成单层的96孔培养板中，其他操作如上。

(5)试验效果判定

根据CPE和MTT法来判断药物的作用效果。正常的Marc145细胞呈梭状或多边形，细胞透明度大，胞内颗粒少，胞膜清晰，折光性强，细胞单层完好成铺路石状，培养液上清液透明，呈橙黄色，不见悬浮的细胞和碎片。细胞病变表现为：细胞间隙增大，细胞形态变得不规则，甚至失去原来的特点，胞质中出现空泡、脂质或其它颗粒状物，细胞空泡化、圆缩、堆积，先灶状脱落，再大片脱落，最后整个细胞裂解、破碎。培养液上清液呈淡黄色或紫色，倒置显微镜下可见破碎的、悬浮的细胞。

CPE程度越大，细胞死亡数越多，用MTT测得的OD值越小，细胞保护率就越低，三者存在一定的相关性。在安全浓度这一临界点时细胞发生CPE的统计概率低于20％，也就是80％以上的细胞成活，则表示药物对PRRSV有很好的保护作用，50％-80％则有较好的保护作用，低于50％此药物则无保护作用或药物对细胞的保护作用很低。

3结果

(1)松乳菇多糖对Marc-145细胞的安全浓度

根据细胞病变情况，测得松乳菇多糖对Marc-145细胞的最大安全浓度为1.25mg/ml。

(2)猪繁殖-呼吸道综合征病毒在Marc-145细胞上TCID₅₀的测定结果

表18TCID₅₀的测定和计算(Karber法)

Karber公式为：log 10TCID₅₀＝L-d(s-0.5)，其中L＝最高稀释度的对数；d＝稀释对数之间的差；s＝阳性管比率总和。

log 10TCID₅₀＝-1-1(2.363-0.5)＝-2.863

故TCID₅₀效价＝10^2.863

所以猪繁殖-呼吸道综合征病毒在Marc-145细胞上TCID₅₀为10^2.863/0.1ml，即病毒的7830倍稀释液0.1ml等于一个TCID₅₀。

(3)松乳菇多糖抗PRRSV作用

表19先加松乳菇多糖后加病毒，细胞72h时的CPE情况

注：细胞出现75％-100％细胞病变极为“++++”，50％-75％病变记为“+++”，25％-50％病变记为“++”，0-25％记为“+”，基本无病变记为“-”。

从表19可知，松乳菇多糖能有效抗病毒吸附和进入，细胞病变明显低于对照组，先加松乳菇多糖后加病毒对细胞的保护率为93.99％。

表20先加病毒后加松乳菇多糖，细胞72h时的CPE情况

注：细胞出现75％-100％细胞病变极为“++++”，50％-75％病变记为“+++”，25％-50％病变记为“++”，0-25％记为“+”，基本无病变记为“-”。

从表20可知，松乳菇多糖对于病毒的合成和释放没有作用，药物对细胞的保护了仅为24.81％。

表21松乳菇多糖和病毒同时加入，细胞72h时的CPE情况

注：细胞出现75％-100％细胞病变极为“++++”，50％-75％病变记为“+++”，25％-50％病变记为“++”，0-25％记为“+”，基本无病变记为“-”。

从表21可知，松乳菇多糖能直接灭活病毒，药物对细胞的保护率达98.93％。

松乳菇多糖能够有效抗病毒吸附和进入，灭活病毒作用明显，但对病毒的合成与释放无作用。

实例10松乳菇多糖免疫调节试验

1材料

松乳菇菌丝多糖  湖南民康生物技术研究所自制：利用超声提取(菌丝体粒度为60目，料液比1∶2500，温度60℃，功率400W，时间60分钟)松乳菇粗糖，将粗糖进行活性炭脱色、乙醇沉淀、732型阳离子树脂过柱，并对洗脱液进行浓缩最后得到浓度为90.1％的松乳菇多糖；

昆明种小鼠，体重(20±2g)，普通鼠饲料常规喂养；豚鼠，均购于长沙市疾控中心。

2方法

(1)脾脏指数和胸腺指数测定：60只雌性小鼠均分为4组。对照组：用生理盐水每天灌胃；实验组分别用松乳菇菌丝胞内多糖低剂量100mg/Kg/d、中剂量200mg/Kg/d、高剂量400mg/Kg/d的生理盐水溶液每天灌胃，灌胃量均配制成0.2ml/只。连续灌胃2周后颈椎脱臼处死。参照陈奇1993《中药药理研究方法〔M〕》正常豚鼠血清1∶10稀释液作为补体来源：补体以2只豚鼠血清混合，用生理盐水配成10％(即1∶10)。

(2)单核-巨噬细胞吞噬功能测定：参照陈奇1993《中药药理研究方法〔M〕》

(3)ConA诱导的小鼠脾细胞增殖实验：：参照徐叔云、卞如濂2002《药理学实验方法学〔M〕》

(4)血清溶血素效价测定：参照吴铁、郭澄泓1984“用鸡红细胞作免疫原的溶血素测定法〔J〕”

(5)统计学方法：应用SPSS13.0软件进行统计学处理，

3结果

2.1松乳菇菌丝多糖对小鼠免疫器官指标的影响

由表22可知，松乳菇菌丝多糖能显著提高脾脏、胸腺的相对重量和脾脏、胸腺指数。各剂量组小鼠脾脏、胸腺相对重量与对照组相比差异显著(P＜0.05)，其中高剂量组脾脏相对重量与对照组相比差异极显著(P＜0.01)；低剂量组小鼠脾脏、胸腺指数与对照组相比差异显著(P＜0.05)，中、高剂量组差异极显著(P＜0.01)。

表22：松乳菇菌丝多糖对小鼠脾脏、胸腺指数的影响

与对照组比较，图中^*表示P＜0.05；^**表示P＜0.01

2.2松乳菇菌丝多糖对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响

由表23可知，低剂量组小鼠的单核-巨噬细胞吞噬功能与对照组相比差异不显著(P＞0.05)，中、高剂量组差异显著(P＜0.05)。

表23：松乳菇菌丝多糖对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响

与对照组比较，图中^*表示P＜0.05；^**表示P＜0.01

2.3松乳菇菌丝多糖对小鼠脾细胞增殖的影响

由表24可知，低剂量组小鼠脾细胞增殖程度与对照组相比差异不显著(P＞0.05)，中剂量组差异显著(P＜0.05)，高剂量组差异极显著(P＜0.01)。

表24：松乳菇菌丝多糖对小鼠脾细胞增殖的影响

与对照组比较，图中^*表示P＜0.05；^**表示P＜0.01

2.4松乳菇菌丝胞内多糖对小鼠血清溶血素效价的影响

由表25可知，低剂量组小鼠血清溶血素效价与对照组相比差异显著(P＜0.05)，中高剂量组差异极明显(P＜0.01)

表25：松乳菇菌丝多糖对小鼠血清溶血素效价的影响

                                                      

组别          血清溶血素(OD)

                                                      

对照组        1.5223±0.03262

低齐U量组     1.6057±0.00208^*

中剂量组      1.6288±0.01340^**

高剂量组      1.6620±0.00794^**

                                                      

与对照组比较，图中^*表示P＜0.05；^**表示P＜0.01

小结：与对照组相比，试验组胸腺指数和脾脏指数均显著提高，且中、高剂量组差异极显著(P＜0.01)；中、高剂量组能显著提高小鼠单核-巨噬细胞吞噬能力(P＜0.05)；中剂量组能显著提高小鼠脾细胞增殖能力(P＜0.05)，高剂量组能极显著提高小鼠脾细胞增殖能力(P＜0.01)；三个剂量组均能进一步提高小鼠血清溶血素效价，且中、高剂量组能极显著提高(P＜0.01)。表明原松乳菇菌丝多糖能明显提高小鼠的免疫功能。

实例11松乳菇多糖添加剂配制与应用试验

1材料和方法

1.1材料

松乳菇多糖    湖南民康生物技术研究所自制，多糖含量90.1％；

50％杆菌肽锌  购自北京中农发药业有限公司。

实验动物为湖南省畜牧兽医研究所种猪场的32-38日龄8.8kg左右的长白猪(L)和大白猪(Y)的二元杂交猪。整个试验于2008年4月16日至2008年5月23日在湖南省畜牧兽医研究所原种猪场进行，按窝别、体重、性别相近原则随机分为5个处理，每个处理设3个重复，每个重复6头猪，共90头猪。

表26实验设计

1.2方法

(1)生长性能指标测定

分别于试验开始、结束时早晨空腹状态下(断料12小时)称量各组每头猪的体重，计算各组的平均日增重。记录各处理每重复的采食量，计算出全期平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

(2)腹泻指标测定

试验期间每天上午，傍晚逐头检查仔猪肛门，观察有无粪便污染及红肿并做好记录，计算仔猪腹泻率，腹泻频率和腹泻指数。腹泻率反映发病率，腹泻频率、腹泻指数反映了腹泻的严重程度。三项指标结合使用可较为全面的反映仔猪在试验期的腹泻情况。其中：

腹泻率＝腹泻头数/总头数×100％

腹泻频率＝∑(腹泻仔猪头数×仔猪腹泻天数)/[试验仔猪头数×正试验天数]×100％

腹泻指数＝粪便评分之和/供试猪总头数。该指数越高，代表腹泻越严重。

评分标准见表3

表27：腹泻状况评分标准

(3)试验数据处理

用EXCEL软件对数据整理，用SPSS10.0对数据进行统计分析

2结果

2.1根据每个重复猪的称重情况统计出每重复平均增重，按每个重复的增重、耗料计算出每个处理的日增重、日耗料及料重比，然后汇总于表28。

表28：早期断奶乳猪生产性能(单位：头，kg)

由表28可以看出，组日增重、头均日耗料量均比对照组和抗生素组要高，料重比均比对照组和抗生素组要低，日增重分别提高了15.06％和12.37％；头均日耗料量分别提高了10.67％和9.38％；料重比分别降低了4.05％和2.56％。A3和A4组与对照组(基础日粮)、抗生素组相当，对早期断奶乳猪的日增重、料重比与头均日耗料量与抗生素组没有显著差异(P＞0.05)，在本试验中，添加300克/吨松乳菇多糖粉组生产性能最好。

2.2仔猪腹泻程度

表29：仔猪的腹泻程度

由表29看出，饲料添加多糖能有效降低仔猪断奶的腹泻程度，A5组的腹泻率、腹泻频率、腹泻指数最低，分别为33.33％，3.70％，0.167，均低于对照组A1(p＜0.05)；显著低于抗生素组，A3和A4组的腹泻率、腹泻频率、腹泻指数与对照组相比没有显著差异(P＞0.05)。从本次试验结果来看，多糖添加剂的添加剂量在300克/吨时预防腹泻的效果最好，腹泻率下降了14.28％。但添加抗生素组腹泻率、腹泻频率和腹泻指数为最高，可能断奶仔猪腹泻的主要原因是应激反应，抗生素在预防断奶仔猪应激性腹泻中作用不明显。

Claims (11)

1.松乳菇多糖，是通过松乳菇菌丝发酵，经提取、纯化得到。

2.根据权利要求1所述的松乳菇多糖，其特征在于所说的提取是指采用了微波、复合酶或/和超声波的方法提取松乳菇菌丝多糖粗提物；所说的纯化是指对多糖粗提物进行脱色和脱蛋白的处理。

3.根据权利要求1或2所述的松乳菇多糖，其特征在于松乳菇菌丝发酵的条件是葡萄糖为碳源；乙酸铵氮源；pH值6-6.5。

4.根据权利要求1或2所述的松乳菇多糖，其特征在于采用微波提取时，浸提时间为120S～180S、料液比1.0∶2000～3000和乙醇含量15％～25％。

5.根据权利要求1或2所述的松乳菇多糖，其特征在于采用复合酶提取时，浸提pH值5.0、浸提温度50、料液比1∶500、复合酶的浓度为纤维素1.5％，果胶酶3.0％，木瓜蛋白酶3.0％。

6.根据权利要求1或2所述的松乳菇多糖，其特征在于采用超声波提取时超声60分钟，超声功率为400W，松乳菇菌丝体粒度为过60目筛，料液比为1∶2500。

7.根据权利要求1或2所述的松乳菇多糖，其特征在于采用先超声波提取，然后复合酶提取；

8.一种抗病毒的兽药，含有权利要求1~7之一所述的松乳菇菌丝多糖。

9.根据权利要求8所述的抗病毒兽药，其特征在于所说的病毒是法氏囊病毒、抗猪繁殖与呼吸道综合征病毒或/和新城疫病毒。

10.一种抗菌兽药，含有权利要求1~7之一所述的松乳菇菌丝多糖。

11.一种提高家畜生产性能、提高免疫力的饲料添加剂，含有权利要求1~7之一所述的松乳菇菌丝多糖。