CN108611279B

CN108611279B - 一种囊孔附毛菌的驯化方法及驯化的囊孔附毛菌和应用

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Publication number: CN108611279B
Application number: CN201810433512.5A
Authority: CN
Inventors: 王立安; 姚澜; 赵立强; 张金秀
Original assignee: Hebei Normal University
Current assignee: Hebei Normal University
Priority date: 2018-05-08
Filing date: 2018-05-08
Publication date: 2020-07-10
Anticipated expiration: 2038-05-08
Also published as: CN108611279A

Abstract

本发明提供了一种囊孔附毛菌的驯化栽培方法，属于菌物的人工驯化技术领域。本发明的驯化栽培方法，包括以下步骤：1)野生囊孔附毛菌子实体的分离培养，得母种菌丝体；2)母种菌丝体进行母种扩繁培养，得扩繁母种；3)扩繁母种菌块进行原种培养，得原种；4)原种进行栽培种培养，得栽培种；5)栽培种进行驯化栽培培养，菌丝生长速度快，菌丝长势好、浓密；14～17d原基发生，7～10d形成小子实体，10～15d长成正常子实体，子实体产量高。人工栽培获得的孔附毛菌子实体无毒，其子实体多糖具有明显的体外抗肝癌活性。

Description

一种囊孔附毛菌的驯化方法及驯化的囊孔附毛菌和应用

技术领域

本发明属于菌物的人工驯化技术领域，具体涉及一种囊孔附毛菌的驯化方法及驯化的囊孔附毛菌和应用。

背景技术

我国地域幅员辽阔，菌物资源丰富，野生菌达3700多种。野生菌中很多种类香味独特、味道鲜美，体内含有蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸、矿质元素、维生素等多种营养成分，还有不少具有药用价值，如抗肿瘤、抗炎、抗病毒、保护肝脏、增强免疫力、降血糖、抗胃溃疡、防衰抗老、预防和治疗关节炎等多种药理活性。囊孔附毛菌(Trichaptum biforme)是担子菌门异担子菌纲非褶菌目多孔菌科附毛菌属的一个种，该真菌生于阔叶树上，如桦、杨、柳、栎等。稀生于针叶树上，木材白色腐朽。在中国、越南、马来西亚、印度尼西亚、芬兰、美国等国家均有发现。该菌担子果一年生，无柄，韧革质。菌盖半圆形到扇形，单生或覆瓦状排列并左右相连，直径1～3cm，表面具放射状的粗毛，近白色，灰白色，具有浅土黄色有浅土褐色相间的环纹，具有细长绒毛或绒毛；边缘薄而锐，完整或瓣裂，波浪状，稍内卷。菌肉近白色或木材色，厚1～3mm。菌管与菌肉同色或色稍深，长2～7mm。孔面浅褐色或堇紫色；管口不规则形，往往裂成齿状，高低不平，每毫米0.5～2个。菌丝系统二体型；生殖菌丝透明，薄壁，具锁状联合，直径3～4μm；骨架菌丝淡黄色，厚壁，少分枝，直径4～5μm。囊状体多，无色，稍厚壁，纺锤状，被结晶，突出子实层12～15×5～6μm。目前围绕囊孔附毛菌的研究主要在发酵产物活性上，且数量不多，未见任何囊孔附毛菌驯化栽培技术的报道，所以其一直被视为野生种质资源，无栽培驯化种。

发明内容

本发明的目的在于提供一种囊孔附毛菌的驯化栽培方法，将野生囊孔附毛菌驯化为可供人工培养且具有高子实体得率的菌种。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种囊孔附毛菌的驯化栽培方法，包括以下步骤：

1)取野生囊孔附毛菌的子实体在PDA培养基上分离培养10～11d，得母种菌丝体；

2)将步骤1)得到的所述母种菌丝体在母种培养基上进行7～8d的扩繁培养，得扩繁母种；所述母种培养基包括：木屑25～75g/L(煮汁)，麸皮25～75 g/L(煮汁)，马铃薯切片150～250g/L(煮汁)，葡萄糖18～25g/L，蛋白胨2～4 g/L，无水硫酸镁2～4g/L，磷酸二氢钾1～2g/L，琼脂18～22g/L；

3)取步骤2)得到的所述扩繁母种的菌块在原种培养基上进行17～23d 的原种培养，得原种；所述原种培养基包括以下重量百分比的原料：95～99％的高粱和1～5％的石膏；

4)将步骤3)得到的所述原种在栽培种培养基上扩大培养25～30d，得栽培种；所述栽培种培养基包括以下重量百分比的原料：75～80％的木屑，15～25％的麸皮，0.5～2％的葡萄糖和0.5～2％的石膏；

5)将步骤4)得到的所述栽培种在栽培料上进行30～40d的驯化培养，得驯化的囊孔附毛菌，所述栽培料包括以下重量百分比的原料：75～80％的棉籽壳，15～25％的麸皮，0.5～2％的葡萄糖和0.5～2％的石膏。

优选的，步骤1)所述分离培养的条件包括：15～25℃的培养温度下进行暗培养。

优选的，步骤2)所述扩繁母种培养的条件包括：培养温度为22～28℃。

优选的，步骤3)、步骤4)所述原种、栽培种培养的条件包括：培养温度为22～28℃、空气湿度60～70％。

优选的，步骤4)所述栽培种培养基的含水量为55～65％。

优选的，步骤5)所述驯化培养的条件包括：培养温度为22～28℃、空气湿度为55～70％。

优选的，步骤5)所述驯化培养后，包括菌种人工栽培，所述栽培的条件包括：在15～25℃，空气中CO₂浓度低于0.1％，相对湿度为80～85％。

本发明还提供了一种利用上述的驯化栽培方法得到的驯化囊孔附毛菌(Trichaptum biforme)，保藏编号为CGMCC No.15190，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏时间为2018年1月11日。

本发明还提供了一种上述驯化囊孔附毛菌在制备治疗或预防肝癌药物中的应用。

本发明提供了一种囊孔附毛菌的驯化栽培方法，本发明将野生囊孔附毛菌进行驯化培养，经过分离培养、母种扩繁培养、原种培养、栽培种培养、栽培料培养后得到的驯化种，在栽培料条件下所述野生囊孔附毛菌菌丝生长速度快，菌丝长势好、浓密，子实体产量高，具有广泛的应用价值。

附图说明

图1为野生囊孔附毛菌；

图2为母种菌丝的培养图；

图3为驯化栽培不同出菇方式的囊孔附毛菌子实体；

图4为小鼠灌胃实验的体重变化图；

图5为囊孔附毛菌处理小鼠肝脏组织的病理切片图；

图6为囊孔附毛菌处理小鼠肾脏组织的病理切片图。

具体实施方式

2)将步骤1)得到的所述母种菌丝体在母种培养基上进行7～8d的母种扩繁培养，得扩繁母种；所述母种培养基包括木屑25～75g/L(煮汁)，麸皮 25～75g/L(煮汁)，马铃薯切片150～250g/L(煮汁)，葡萄糖18～25g/L，蛋白胨2～4g/L，无水硫酸镁2～4g/L，磷酸二氢钾1～2g/L，琼脂18～22g/L；

本发明取野生囊孔附毛菌的子实体在PDA培养基上分离培养10～11d，得母种菌丝体。在本发明中，所述野生囊孔附毛菌优选的来源于腐朽的阔叶树上，所述阔叶树优选的为桦树或栎树，更优选的为桦树。在本发明中，所述野生囊孔附毛菌从腐朽的阔叶树干上采集后优选进行菌株的分离，在本发明中，所述分离前优选的进行清洗，所述清洗优选的为利用无菌水进行清洗，所述无菌水的用量优选的为2～4mL。在本发明中，所述分离优选的为分离子实体的伞盖与伞柄，更优选的为分离伞柄和伞盖交接处的菌肉，所述菌肉的大小优选的为0.1～0.15cm，更优选的为0.15～0.25cm，最优选的为0.25～0.3cm，本发明对所述分离的方法并没有特殊的限定，常规的菌株分离方法即可。

得到野生囊孔附毛菌的分离菌肉后，本发明将所述菌肉在PDA培养基上分离培养，所述分离培养的时间优选的为60～90min，更优选的为30～60min，最优选的为15～30min，所述分离培养的条件优选的包括：在15～25℃的培养温度下进行暗培养，所述培养温度优选的为15～18℃，更优选的为18～22℃，最优选的为22～25℃。菌肉系菌丝体交联而成，通过菌肉再生得到的菌种具有形成子实体的能力。

得到母种菌丝体后，本发明将所述母种菌丝体在母种培养基上进行7～8d 的扩繁培养，得扩繁母种；优选的母种培养基包括：木屑25～75g/L，麸皮25～75 g/L，马铃薯切片150～250g/L，葡萄糖18～25g/L，蛋白胨2～4g/L，无水硫酸镁2～4g/L，磷酸二氢钾1～2g/L，琼脂18～22g/L。母种扩繁培养是人工驯化栽培的第一步，如得到的菌种不能快速扩繁就无法保障人工驯化栽培所需的大量菌种。

在本发明中，所述母种培养基中所述木屑、麸皮、马铃薯均为100℃沸水煮15-20min后的煮汁；含量为木屑25～75g/L，麸皮25～75g/L，马铃薯切片 150～250g/L，更优选的为木屑37.5～62.5g/L，麸皮37.5～62.5g/L，马铃薯切片175～225g/L，最优选的为木屑50g/L，麸皮50g/L，马铃薯切片200g/L。在本发明中，所述木屑、麸皮、马铃薯的作用为提供天然碳氮源等营养成分。本发明对所述木屑、麸皮、马铃薯的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售木屑、麸皮、马铃薯即可。

在本发明中，所述母种培养基中所述葡萄糖的含量为18～25g/L，更优选的为18.5～22g/L，最优选的为20g/L。在本发明中，所述葡萄糖的作用为作为碳源，为菌种生长提供能量及营养。本发明对所述葡萄糖的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售葡萄糖即可。

在本发明中，所述蛋白胨在母种培养基中的含量优选的为2～4g/L，更优选的为3g/L。在本发明中，所述蛋白胨的作用为作为氮源，为菌种生长提供氮素营养及能量。本发明对蛋白胨的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售蛋白胨即可。

在本发明中，所述磷酸二氢钾的含量优选的为2～4g/L，更优选的为3g/L。在本发明中，所述磷酸二氢钾的作用是为菌种生长提供磷、钾无机盐营养。本发明对磷酸二氢钾的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售磷酸二氢钾即可。

在本发明中，所述硫酸镁的含量优选的为1～2g/L，更优选的为1.5g/L。在本发明中，所述硫酸镁的作用为提供硫、镁无机盐营养。本发明对硫酸镁的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售硫酸镁即可。

在本发明中，所述琼脂的作用为固化介质，含量优选的为18～22g/L，更优选的为20g/L。本发明对琼脂的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售琼脂即可。

本发明所述母种扩繁培养优选的采用平板培养法，培养时，将所述母种菌丝体接种到母种培养基上进行母种扩繁培养。在本发明中，所述母种菌丝体优选的为直径6mm的囊孔附毛菌的菌丝体，所述菌丝体优选的为菌丝原片。在本发明中，所述母种扩繁培养的时间优选的为10～11d，更优选的为8～10d，最优选的为7～8d。在本发明中，所述母种扩繁培养的条件优选的包括： 22～28℃的温度下培养。在本发明中，所述母种扩繁培养优选的在培养箱中进行，所述培养箱优选的为恒温培养箱，在本发明中，本发明优选将所述培养箱的温度设置为22～28℃，更优选的设置为24～26℃，最优选的设置为25℃。在本发明中，所述培养箱中优选的设置光暗交替，更优选的为光照8～14h，最优选的为光照12h。本发明母种扩繁菌丝体的培养如图2所示。

从栽培成本考虑，母种扩繁培养基采用的全营养、半合成培养基，在驯化栽培过程中存在成本高的不足，故此，得到扩繁母种后，本发明将所述扩繁母种的菌块在原种培养基上进行17～23d的原种培养，得原种；所述原种培养基包括以下重量百分比的原料：95～99％的高粱和1～5％的石膏。在本发明中，所述原种培养基的含水量优选的为40～70％，更优选的为50～65％，最优选的为60％。

在本发明中，所述原种培养基中高粱的质量百分比优选的为96～98.5％，更优选的为98％。本发明中所述高粱的作用为作为天然营养机制，提供菌丝生长所需营养物质。本发明对高粱的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员所熟知的常规市售品种高粱即可。在本发明中，所述原种培养基中石膏的质量百分比优选的为1.5～4％，更优选的为2％。本发明中所述石膏的作用为可为菌丝生长提供硫和钙，同时作为缓冲剂，缓冲生长代谢过程中产生的有机酸，稳定pH。本发明对石膏的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员所熟知的常规市售品种即可。

本发明所述原种培养基的制备方法包括将所述高粱需要充分吸水(含水量55％-60％)后和石膏混合后，分装于原种瓶中，灭菌。在本发明中，所述原种瓶的规格优选的为100×100mm。在本发明中，所述灭菌优选的为高温灭菌，所述高温灭菌的温度优选的为110～150℃，更优选的为120～135℃，最优选的为121℃。在本发明中，所述灭菌的时间优选的为10～60min，更优选的为20～40min，最优选的为30min。待灭菌冷却后接种。

本发明所述接种优选的为将扩繁母种菌块在所述原种培养基上进行原种培养。在本发明中，所述接种的扩繁母种菌块的直径优选的10～15mm，更优选的为11～13mm，最优选的为12mm；本发明接种时，每个原种瓶优选的接种3～5块所述扩繁母种菌块，更优选的为4块。本发明在接种后进行原种培养，所述原种培养优选的在培养箱中进行。在本发明中，所述培养箱设置温度优选的为22～28℃，更优选的为24～26℃，最优选的为25℃。在本发明中，所述培养箱设置空气湿度优选的为65～70％，更优选的为60～65％，最优选的为55～60％。在本发明中，所述培养箱中优选的设置光暗交替，更优选的为光照8～14h，最优选的为光照12h。在本发明中，所述原种培养的时间优选的为20～22d，更优选的为18～20d，最优选的为17～18d。在本发明中，按照上述培养条件进行培养，其菌丝长势好、浓密，菌丝生长速度快，可达到5.26 mm/d。

为进一步降低栽培成本，并让菌种逐步适应天然基质，得到原种后，本发明在栽培种培养基上扩大培养25～30d，得栽培种；所述栽培种培养基包括以下重量百分比的原料：75～80％的木屑，15～25％的麸皮，0.5～2％的葡萄糖和 0.5～2％的石膏。

在本发明中，所述栽培种培养基中木屑的质量分数优选的为76～79％，更优选的为78％。在本发明中，所述栽培种培养基中麸皮的质量分数优选的为 18～22％，更优选的为20％。在本发明中，所述栽培种培养基中葡萄糖的质量分数优选的为0.8～1.5％，更优选的为1％。在本发明中，所述栽培种培养基中石膏的质量分数优选的为0.8～1.5％，更优选的为1％。在本发明中，所述栽培种培养基的含水量优选的为50～65％，更优选的为60％。

在本发明中，所述扩大培养优选的在培养室中进行，所述培养室设置温度优选的为22～28℃，更优选的为24～26℃，最优选的为25℃。在本发明中，所述培养室设置空气湿度优选的为50～55％，更优选的为55～65％，最优选的为65～70％。在本发明中，所述培养室中优选的设置光暗交替，更优选的为光照8～14h，最优选的为光照12h。在本发明中，所述扩大培养的时间优选的为.28～30d，更优选的为26～28d，最优选的为25～26d。

得到栽培种后，本发明将所述栽培种在栽培料上进行30～40d的驯化培养，得驯化的囊孔附毛菌。在本发明中，所述栽培料包括以下重量百分比的原料： 75～80％的棉籽壳，15～25％的麸皮，0.5～2％的葡萄糖和0.5～2％的石膏。

在本发明中，所述栽培料中棉籽壳的质量分数优选的为76～79％，更优选的为78％。在本发明中，所述栽培料中麸皮的质量分数优选的为18～22％，更优选的为20％。在本发明中，所述栽培料中葡萄糖的质量分数优选的为 0.8～1.5％，更优选的为1％。在本发明中，所述栽培料中石膏的质量分数优选的为0.8～1.5％，更优选的为1％。在本发明中，所述栽培料的含水量优选的为 60％。

本发明将上述原料混合后优选将所述混合后的原料分装于菌袋中，灭菌，冷却后接种。在本发明中，所述菌袋的材料优选的为聚丙烯菌袋，更优选的为耐高温聚丙烯菌袋。在本发明中，所述耐高温聚丙烯菌袋的规格优选的为 130×240×0.045mm，每个所述耐高温聚丙烯菌袋装400g所述栽培料。在本发明中，所述灭菌优选的为高温灭菌，所述高温灭菌的温度优选的为 110～150℃，更优选的为120～135℃，最优选的为121℃。在本发明中，所述灭菌的时间优选的为1～5h，更优选的为1.5～3h，最优选的为2h。

待灭菌冷却后本发明进行接种，所述接种后进行驯化培养，所述驯化培养优选的在培养室中进行。在本发明中，所述培养室设置温度优选的为 22～28℃，更优选的为24～26℃，最优选的为25℃。在本发明中，所述培养室设置空气湿度优选的为50～70％，更优选的为55～65％，最优选的为60％。在本发明中，所述驯化培养的时间优选的为36～40d，更优选的为33～36d，最优选的为30～33d。

待驯化的囊孔附毛菌长满菌袋后，本发明将菌袋移入出菇棚出菇，在本发明中，所述出菇优选的采用开袋、划口、脱袋和/或半覆土栽培出菇，更优选的采用开袋和/或脱袋出菇，最优选的为采用脱袋出菇。在本发明中，所述出菇棚内的光照优选的采用自然光照。在本发明中，所述出菇棚内的温度优选的控制在5～35℃，更优选的为15～25℃，最优选的为20℃。在本发明中，所述出菇棚内的空气湿度优选的为70～75％，更优选的为75～80％，最优选的为80～85％。在本发明中，所述出菇棚内的二氧化碳浓度优选的低于0.5％，更优选的为低于0.3％，最优选的为低于0.1％.。在本发明中，出菇棚内培养，在14～17d可观察到原基发生，7～10d即有小子实体形成，10～15d可形成正常子实体。子实体无柄为韧革质；菌盖形状为半圆形或扇形，边缘锐而薄，整体为紫褐色；有短或细长的放射状绒毛，有明显的浅土褐色、浅土黄色相间的环纹。其第一潮菇生物学效率可达到30.62％。

本发明还提供了一种上述驯化囊孔附毛菌在制备治疗或预防肝癌药物中的应用。本发明所述药物的有效成分优选的为子实体多糖，所述子实体多糖的制备方法优选的包括：①将子实体干粉与水按照1g/10mL的比例混合，抽滤得浸提液；②将所述浸提液按照1:4的体积比与乙醇混合，静置过夜，离心所得沉淀即为子实体多糖。本发明对所述子实体干粉的制备方法没有特殊限定，优选的将子实体放于45℃烘箱内，待彻底干燥8～10d后，置于中草药粉碎机中粉碎。本发明步骤①所述混合优选的在旋涡混合器中混合搅拌，所述混合搅拌的温度优选为80℃，所述混合搅拌的转速优选为200rpm，所述混合搅拌的时间优选的为4h。本发明所述抽滤优选的为收集抽滤液体，将得到的抽滤后沉淀继续与水混合，重复3次，并将所有的抽滤液体混合，即得浸提液。本发明步骤②所述乙醇优选的为95％体积浓度的乙醇。本发明所述静置的温度优选的为4℃。本发明步骤②所述离心的转速优选的为3500rpm，所述离心的时间优选的为15min。

下面结合实施例对本发明提供的囊孔附毛菌的驯化栽培方法进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.野生菌种的分离培养：采集桦树上的野生囊孔附毛菌(如图1所示)，无菌水清洗后组织分离取伞柄和伞盖交接处菌肉在PDA试管上培养后获得母种菌丝体；

2.母种扩繁培养：木屑25～75g/L，麸皮25～75g/L，马铃薯切片150～250g/L，葡萄糖18～25g/L，蛋白胨2～4g/L，无水硫酸镁2～4g/L，磷酸二氢钾1～2g/L，琼脂18～22g/L。加水定容到1000mL，pH自然。采用平板培养法，将直径6 mm囊孔附毛菌的菌丝圆片接种至上述母种培养基中，25℃恒温培养箱中培养，培养结果如图2所示。

3.原种培养：原种培养基为：高粱98％，石膏粉2％。根据上述配方，将原种培养基分装于100×100mm原种瓶中，121℃灭菌30min。冷却后接种直径12mm囊孔附毛菌菌种4块，于25℃、空气湿度湿度60～70％培养箱中培养17。

4.栽培种培养：培养基为：木屑78％，麸皮20％，葡萄糖1％，石膏1％，含水量60％，pH自然。在25～35℃、空气湿度50～70％培养箱中培养25d获栽培种。

5.驯化培养：栽培料配方为：棉籽壳78％，麸皮20％，葡萄糖1％，石膏 1％。根据上述配方，将培养料分装于130×240×0.045mm的耐高温聚丙烯菌袋内，每袋装料400g，于121℃灭菌2h，冷却后接种，于25℃、空气湿度湿度60％的发菌室培养30d。

6.将发满的菌袋移入出菇棚，采用脱袋立棒出菇(如图3中1与4所示)，正常自然光照，温度控制在5～35℃，空气中二氧化碳浓度低于0.1％，相对湿度控制在70％～85％，其中出菇温度应控制在15～25℃。14～17d原基发生，7～10 d形成小子实体，10～15d形成正常子实体。

实验例1

驯化后的囊孔附毛菌与野生菌相比，在子实体农艺性状、产量等方面有一定区别。通过肉眼观察两者的菌盖形状、颜色及菇质，同时使用游标卡尺测量子实体的菌盖厚度、菌盖横纵直径，称量单菇重量，并计算出菇形指数及产量，结果见表1。

表1囊孔附毛菌农艺性状及产量分析

由表1可知，人工驯化的子实体与野生菌相比，其菌肉更厚实、颜色更鲜艳、质地更硬，并且菌盖更厚、横纵直径更大，其农艺性状优于野生菌，并且子实体产量更大，驯化后的囊孔附毛菌可以得到大量子实体，为以后的抗肿瘤研究提供充足的材料。

实验例2

参照食品安全国家标准GB 15193.3-2014《急性经口毒性试验》进行。

小鼠为健康的符合国家标准和有关规定的KM小鼠40只，雌雄各半，体重18-22g，同性别实验动物个体间体重相差不超过平均体重的20％，6-8周龄，购于河北医科大学动物实验中心。

将囊孔附毛菌子实体烘干，用中草药粉碎机粉碎后过200目筛，将过筛粉末溶于蒸馏水中，配制最大浓度，直到不可以通过灌胃针。

1.急性经口毒性试验

试验前小鼠在鼠房中环境适应3-5d。小鼠分成2组，每组20只。雌雄各半分笼饲养。试验前小鼠禁食12h，可自由饮水。小鼠最大灌胃体积为20 mL/kg，即每只小鼠灌胃为0.4mL，隔6h后再灌胃一次，饲喂最大剂量达到 6400mg·kg-1，空白组给予同体积的生理盐水。灌胃后小鼠继续禁食4h，然后自由饮水，喂基础饲料，观察小鼠死亡及行为情况，观察期为14d。

主要结果如下：

小鼠灌胃后，所有小鼠活动均稍有减少，但30min后逐渐恢复正常，没有抽搐等异常现象。每天在am 8:00和pm 17:00各观察一次，发现处理组和生理盐水对照组小鼠均无异常情况，进食、饮水、排泄活动正常，毛发光泽、无异常分泌物。

连续观察7d小鼠体重变化情况如图4：囊孔附毛菌处理组与空白组小鼠体重变化均有一个上升后逐渐稳定的趋势，且从第3d开始雌鼠的体重均小于雄鼠体重，而处理组与空白组小鼠体重接近，其中，处理组雄鼠的体重始终大于空白对照小鼠的体重，处理组雌鼠的体重在第5d开始也略大于空白对照小鼠的体重。

在14d的观察中，处理组小鼠均无死亡现象。小鼠的饮食、饮水、毛发、分泌物、行为活动、排泄物等未见异常，体重呈正常增长。

2.实验小鼠肝肾病理学检测

第15d处死后，处死实验鼠后解剖小鼠并肉眼观察各脏器颜色是否存在病变，并对其肝脏与肾脏进行石蜡包埋切片，HE染色后进行病理组织学观察。

主要试验结果：

解剖学检查，肉眼观察小鼠的脑、胃、肝、肾、脾、肺、心、大肠、小肠等器官均未见颜色、质地、体积的异常病理性改变。

对其肝脏组织进行石蜡切片及HE染色后进行显微观察结果见图5所示，其中(A)空白组雌鼠(B)空白组雄鼠(G)囊孔附毛菌实验组雌鼠(H)囊孔附毛菌实验组雄鼠(箭头所指为肝小叶中央静脉)：处理组与空白组切片均红蓝适度、核浆分明，显示出小鼠的肝脏细胞均形态完好，且细胞质饱满、边界清晰，细胞核清晰可见，肝小叶中央静脉均完好，肝细胞总体呈索状并且紧密排列向外扩展呈放射状，肝细胞显示无凋亡现象。囊孔附毛菌子实体对小鼠肝脏无毒性作用。

对小鼠肾脏组织进行石蜡切片及HE染色后进行显微观察结果见图6，其中(A)空白组雌鼠(B)空白组雄鼠(G)囊孔附毛菌实验组雌鼠(H)囊孔附毛菌实验组雄鼠(上面箭头所指为肾小球，下面箭头为肾小管)：处理组与空白组切片中小鼠的肾脏组织中肾单位均完整清晰，且肾小球结构圆整清晰，肾小管结构完整清晰分明，组织间隙清晰可见，细胞质清晰饱满、边界清晰，细胞核完整。实验组均未表现出结构损伤不完整、萎缩症状、细胞凋亡坏死等病变现象。囊孔附毛菌子实体对小鼠肾脏无毒性作用。

实验例3

1.供试材料

囊孔附毛菌子实体由本实验室人工驯化栽培得到。人肝癌细胞HepG2为本实验室保存细胞株

2.子实体多糖的制备

将子实体放于45℃烘箱内，待彻底干燥8-10d后，取出置于中草药粉碎机中粉碎。称取囊孔附毛菌子实体干粉100g。按照干粉(g)：水(mL)＝1：10 的比例将二者混合，用旋涡混合器(80℃、200rpm/min)搅拌4h，待冷却后用抽滤的方法得到浸提液，将抽滤后剩下的沉淀部分继续倒入水，上述操作反复重复3次，按照浸提液(mL)：乙醇(mL)＝1：4的比例加入95％的乙醇，放入4℃冰箱静置过夜，然后用离心(3500rpm/min、15min)的方法得到沉淀，将沉淀取出置于真空冷冻干燥箱内干燥，称重，并计算得率，标记后放入-20℃冰箱备用。

3.体外抗肿瘤活性实验的测定

采用MTT法，取对数生长期的HepG2肝癌细胞，接种浓度为1×105个/mL 的细胞100μL于96孔板中，在二氧化碳培养箱(37℃，5％CO2)中培养24h。各样品均用DMSO溶解，用无血清的RPMI1640培养基稀释各样品至终浓度分别为50、100、200、400、800μg/mL，加100μL各浓度样品，对照组和空白组均加等量的无血清培养基。每种样品浓度均设6个复孔。培养48h后，离心去上清，每孔加100μL 1mg/mL的MTT溶液，继续培养4h后，离心去上清，每孔加150μL的二甲基亚砜，再振荡10min后，用酶标仪检测570 nm处吸光度A。根据下列公式计算样品的细胞增殖抑制率：

4.主要试验结果：

囊孔附毛菌子实体多糖的体外抗肿瘤检测结果见表2.

表2.囊孔附毛菌子实体多糖对HepG2肝癌细胞抑制率(％)

由表2可知，随着处理浓度的增大，HepG2肝癌细胞的存活率逐渐降低，多糖的抑制作用也逐渐增强，呈现明显的浓度-效应关系。多糖浓度大于200 μg/mL时，对HepG2肝癌细胞增殖的抑制率已达到了76.94％。计算其IC₅₀值为78.33μg/mL。上述结果表明，囊孔附毛菌子实体多糖表现明显的体外抗肝癌活性。

驯化后的囊孔附毛菌子实体多糖含量大于2.12％；在浓度为800μg/mL时，对HepG2肝癌细胞抑制率达到85.04％。

由以上实施例可知，本发明提供了一种囊孔附毛菌的驯化栽培方法，可将野生的囊孔附毛菌进行人工栽培，并能快速得到子实体，驯化后14～17d 原基发生，7～10d形成小子实体，10～15d长成正常子实体，子实体产量高。人工栽培获得的子实体无毒，子实体多糖具有明显的体外抗肝癌活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种囊孔附毛菌的驯化栽培方法，包括以下步骤：

1)取野生囊孔附毛菌的子实体在PDA培养基上分离培养10～11d，得母种菌丝体；所述分离培养的条件包括：15～25℃的培养温度下进行暗培养；

2)将步骤1)得到的所述母种菌丝体在母种培养基上进行7～8d的扩繁培养，得扩繁母种；所述母种培养基包括：木屑25～75g/L，麸皮25～75g/L，马铃薯切片150～250g/L，葡萄糖18～25g/L，蛋白胨2～4g/L，无水硫酸镁2～4g/L，磷酸二氢钾1～2g/L，琼脂18～22g/L；所述扩繁母种培养的条件包括：培养温度为22～28℃；

3)取步骤2)得到的所述扩繁母种的菌块在原种培养基上进行17～23d的原种培养，得原种；所述原种培养基包括以下重量百分比的原料：95～99％的高粱和1～5％的石膏；

5)将步骤4)得到的所述栽培种在栽培料上进行30～40d的驯化培养，得驯化的囊孔附毛菌，所述栽培料包括以下重量百分比的原料：75～80％的棉籽壳，15～25％的麸皮，0.5～2％的葡萄糖和0.5～2％的石膏；

步骤3)、步骤4)所述原种、栽培种培养的条件包括：培养温度为22～28℃、空气湿度60～70％；

步骤5)所述驯化培养的条件包括：培养温度为22～28℃、空气湿度55～70％；

步骤5)所述驯化培养后还包括：将得到的驯化囊孔附毛菌进行人工栽培，所述人工栽培的条件包括：培养温度为15～25℃，空气中CO₂浓度低于0.1％，相对湿度为80～85％。

2.利用权利要求1所述的驯化栽培方法得到的驯化囊孔附毛菌，保藏编号为CGMCCNo.15190，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2018年1月11日。

3.权利要求2所述的驯化囊孔附毛菌在制备治疗或预防肝癌药物中的应用。