CN109906877B - 一种翘鳞香菇新菌种及其驯化栽培方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种翘鳞香菇新菌种及其驯化栽培方法与应用。所述的翘鳞香菇(Lentinus squarrosulus Mont.)HMGIM‑130343保藏号为:CCTCC NO:M2017586。本发明还提供了所述新菌种相应的驯化栽培方法,可成功实现翘鳞香菇新菌种的人工栽培。该翘鳞香菇是一种高蛋白,低脂肪,富含各种微量元素的食用真菌,可作为较好的日常菌类蔬菜进行推广栽培。同时,证实该翘鳞香菇发酵液具有显著的α‑葡萄糖苷酶抑制活性,可用于制备降血糖药物,具有很好的经济效益和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的食用菌菌种及其栽培,具体涉及一种翘鳞香菇新菌种及其驯化栽培方法与应用。
背景技术
翘鳞香菇(Lentinus squarrosulus)又名獐子菌、仲帽、獐头菌。因菌盖表面有暗灰色或者黑褐色瓦状厚鳞片,趋向中央特别大并翘起,呈同心环状排列,故称翘鳞香菇。隶属于真菌界(Fungi)、担子菌门(Basidiomycota)、蘑菇纲(Agaricomycetes)、多孔菌目(Polyporales)、多孔菌科(Polyporaceae)、香菇属(Lentinus)。
翘鳞香菇子实体发育初期菌盖中间突起,后扁平,中部脐状或下凹,有时呈浅漏斗状,浅灰褐色,表面有暗灰色到黑褐色瓦状大鳞片,呈同心环状排列,菌盖直径6-10cm。菌肉近白色,菌柄中生或稍偏生,上下等粗或基部膨大,中实、平滑、淡白色,后期变淡褐色。
分布:翘鳞香菇是热带国家例如马来西亚、尼日利亚等国较为常见的一种天然食用菌,在我国主要分布于贵州、云南、广东、广西、海南、福建、西藏、台湾等地。
生境:群生、丛生或近叠生于针阔混交林或阔叶林中腐木上,多发生于春夏温度较高的季节。
功效:翘鳞香菇子实体在幼嫩时味道鲜美,含有较丰富的多糖类和蛋白质等物质,而且有研究表明其具有降低胆固醇和抗肿瘤细胞的作用。本实验室在之前的研究中发现,翘鳞香菇菌丝的醇提物体外抑制肿瘤细胞生长率可高达90%。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种翘鳞香菇新菌种,该菌种来自海南省昌江县霸王岭阔叶林中腐木上,经形态学及分子生物学鉴定为翘鳞香菇。通过对子实体部分进行组织分离得到原始菌株,将该菌株命名为翘鳞香菇HMGIM-130343,该菌株已于2017年10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC,湖北省武汉市洪山区八一路,武汉大学),保藏号为:CCTCC NO:M2017586。
本发明的第二个目的是提供一种上述翘鳞香菇HMGIM-130343的驯化栽培方法。该方法包括以下步骤:
(1)对翘鳞香菇HMGIM-130343的子实体进行组织分离,得到原始菌株分离种;
(2)将分离种按无菌操作接种于含母种培养基的试管中,在培养箱暗培养,直至菌丝长满试管,获得母种;
(3)将母种按无菌操作接种于含原种培养基的菌袋中,在培养箱暗培养,直至菌丝长满菌袋,获得原种;
(4)将原种按无菌操作接种于含栽培种培养基的菌袋中,在养菌房暗培养,直至菌丝长满菌袋,获得栽培种;
(5)待栽培种完成后熟培养后,转入栽培车间进行出菇管理,于温度为28±1℃,相对湿度为80~90%,光照强度为300~600Lx,二氧化碳含量小于1200ppm,保持土层湿润的条件下继续培养,直至菌盖平展,采收。
所述步骤(2)的培养温度为26℃,暗培养时间为10天,所述的母种培养基组成为:马铃薯200mg/mL、葡萄糖20mg/mL,磷酸二氢钾1.5mg/mL,硫酸镁3mg/mL,蛋白胨5mg/mL,VB微量,琼脂20mg/mL,溶剂为水。
所述步骤(3)的培养温度为26℃,暗培养时间为18~22天,所述的原种培养基是通过以下方法制备的,按质量百分数计,包括高粱粒或麦粒98%、碳酸钙2%;按其含量将各组分混合均匀后,再加水,使含水量为60%(质量百分数)。
所述步骤(4)的培养温度为26℃,暗培养时间为30~35天,所述的栽培种培养基是通过以下方法制备的,按质量百分数计,包括棉籽壳50%、木屑38%、麸皮10%、碳酸钙2%;按其含量将各组分混合均匀后,再加水,使含水量为65%(质量百分数)。
所述步骤(5)的光照时间为10h/d,后熟的条件为26℃暗培养,后熟时间为1周。
本发明的第二个目的是提供上述的翘鳞香菇HMGIM-130343在制备降血糖药物中的应用。特别是翘鳞香菇HMGIM-130343的提取物或发酵液在制备降血糖药物中的应用。
本发明的第三个目的是提供翘鳞香菇HMGIM-130343在制备多糖中的应用,如在制备葡萄糖中的应用。
与现有技术相比,本发明的优势在于:
本发明提供了一种翘鳞香菇新菌种及其相应的驯化栽培方法,可成功实现翘鳞香菇新菌种的人工栽培。该翘鳞香菇是一种高蛋白,低脂肪,富含各种微量元素的食用真菌,可作为较好的日常菌类蔬菜进行推广栽培。同时,证实该翘鳞香菇发酵液具有显著的α-葡萄糖苷酶抑制活性,可用于制备降血糖药物,具有很好的经济效益和社会效益。
翘鳞香菇(Lentinus squarrosulus Mont.)HMGIM-130343,该菌株已于2017年10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC,湖北省武汉市洪山区八一路,武汉大学),保藏号为CCTCC NO:M2017586。
附图说明
图1为不同培养基下的翘鳞香菇HMGIM-130343的菌丝长势。
图2为翘鳞香菇HMGIM-130343与市场流通的翘鳞香菇菌株A150358、D150626、E150396之间的拮抗试验结果图。其中,A为菌株HMGIM-130343(图中的130343)、菌株A150358和菌株D150626三者之间的拮抗结果;B为菌株E150396、菌株A150358和菌株HMGIM-130343三者之间的拮抗结果;C为菌株D150626、菌株E150396和菌株HMGIM-130343三者之间的拮抗结果。
图3为野生翘鳞香菇HMGIM-130343的生长图。
图4为驯化后人工栽培翘鳞香菇HMGIM-130343的生长图。
图5为葡萄糖标准曲线图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
实施例1翘鳞香菇HMGIM-130343的获取和鉴定
本发明的翘鳞香菇HMGIM-130343分离自海南省昌江县霸王岭阔叶树倒木上。
翘鳞香菇HMGIM-130343的形态学特征和ITS序列分析为如下:
1.形态特征
子实体群生于腐木上。菌盖直径3~10cm,薄且柔韧,深漏斗形;表面淡黄色至浅褐色;被有同心圆环状排列的灰褐色丛毛状小鳞片,老熟后鳞片褐色,易脱落;边缘薄,初期内卷,后期浅裂或撕裂状。菌肉白色,革质,厚1~4mm。菌褶白色至淡黄色,延生,不等长,密,薄,褶幅窄。菌柄长1~4cm,直径0.4~1cm,圆柱形,中生至偏生,上粗下细,实心,与菌盖同色,被丛毛状小鳞片。担孢子无色,光滑,长椭圆形,5~7×1.5~2.5μm。
2.ITS序列分析
采用生工Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌丝体DNA,以ITS1、ITS4为引物(ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG,ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC)进行ITS区域PCR试验,得到碱基数为682bp的序列,经GenBank序列比对分析,确认该分离的菌株为Lentinussquarrosulus Mont.,命名为翘鳞香菇(Lentinus squarrosulus Mont.)HMGIM-130343。
3.拮抗试验
用普通PDA培养基制作平板培养基(直径9cm),所述的普通PDA培养基配方:马铃薯200g(煮至熟而不烂,取汁去渣),葡萄糖20g,琼脂20g,加水1000mL,pH自然。按三角形接种法分别接入本发明的翘鳞香菇菌株HMGIM-130343,以及3个收集自全国各地的翘鳞香菇市场现有菌株A150358、菌株D150626、菌株E150396(表1),将本发明的翘鳞香菇菌株HMGIM-130343与任意两个市场流通菌株接种至平板,待菌丝长满后,观察是否存在拮抗线,结果见图2。
表1菌株编号及来源
序号 | 菌株编号 | 来源 |
1 | HMGIM-130343 | 海南 |
2 | A150358 | 江西赣州 |
3 | D150626 | 湖南常德 |
4 | E150396 | 云南普洱 |
图2中,A为菌株HMGIM-130343、菌株A150358和菌株D150626三者之间的拮抗结果;B为菌株E150396、菌株A150358和菌株HMGIM-130343三者之间的拮抗结果;C为菌株D150626、菌株E150396和菌株HMGIM-130343三者之间的拮抗结果。由图2可知,翘鳞香菇菌株HMGIM-130343与市场上现有的菌株A150358、菌株D150626、菌株E150396两两之间均存在明显的拮抗线,由于遗传特性不同使得菌丝体具有不相容性,菌丝体拮抗反应是这种不相容状态肉眼可见的指标之一,结果表明,翘鳞香菇菌株HMGIM-130343和市场现有的翘鳞香菇菌株A150358、菌株D150626、菌株E150396之间均存在明显的遗传差异,可判断翘鳞香菇菌株HMGIM-130343与所有市场流通种均不同,为新菌株。
实施例2翘鳞香菇HMGIM-130343的驯化栽培
1.菌种分离纯化培养基的筛选
本发明的翘鳞香菇菌株HMGIM-130343,生长速度快,10天左右菌丝即可覆满试管斜面(18×180mm),菌丝生长温度15~40℃,最适生长温度25~28℃,菌丝生长pH 5.5~7,最适pH 6.5。
将本发明翘鳞香菇菌株HMGIM-130343分别接种于含有自制综合PDA培养基、普通PDA培养基或麦芽汁琼脂培养基的试管中,于26℃培养箱暗培养10天,通过对比各试管斜面培养基下菌丝生长情况,筛选适合翘鳞香菇菌株HMGIM-130343分离纯化的培养基。
其中,自制综合PDA培养基的配方:马铃薯200g(煮至熟而不烂,取汁去渣),葡萄糖20g,磷酸二氢钾1.5g,硫酸镁3g,蛋白胨5g,VB1 100mg,琼脂(条/粉)20g,加水1000mL,pH自然。
普通PDA培养基的配方:马铃薯200g(煮至熟而不烂,取汁去渣),葡萄糖20g,琼脂20g,加水1000mL,pH自然。
麦芽汁琼脂培养基的配方:麦芽膏粉130g,琼脂20g,氯霉素0.1g,加水1000mL,pH自然。
上述培养基的配制为:将各成分混合,加热至各成分溶解均匀后,分装至18×180mm试管(每管约装12ml培养基),121℃高压灭菌30min,待斜面培养基灭菌摆斜面冷却后,备用。
结果见图1。由图1可知,翘鳞香菇菌株HMGIM-130343在自制综合PDA培养基中,菌丝生长速度快,且浓密均匀,吃料深。翘鳞香菇菌株HMGIM-130343在普通PDA培养基中,菌丝生长缓慢,气生菌丝稀疏且极不均匀。翘鳞香菇菌株HMGIM-130343在麦芽汁琼脂培养基中,菌丝浓密均匀,但长速较慢,且易老化形成菌皮和色素沉淀。以上结果表明,自制综合PDA培养基,最适合翘鳞香菇菌株HMGIM-130343分离纯化,菌丝生长快,浓密均匀,且不易老化。
2.驯化栽培
(1)分离种获得
对海南省昌江县霸王岭阔叶树倒木上的野生翘鳞香菇HMGIM-130343子实体进行组织分离,得到原始菌株分离种,该野生翘鳞香菇HMGIM-130343生长状态见图3。
(2)母种培养基及母种制作
自制综合PDA培养基,即马铃薯200g(煮至熟而不烂,取汁去渣),葡萄糖20g,磷酸二氢钾1.5g,硫酸镁3g,蛋白胨5g,VB1 100mg,琼脂(条/粉)20g,水1000mL,pH自然。将各成分混合,加热至各成分溶解均匀后,分装至18×180mm试管(每管约装12mL培养基),121℃高压灭菌30min,待斜面培养基灭菌摆斜面冷却后,按无菌操作接入步骤(1)得到的翘鳞香菇菌株HMGIM-130343分离种,在26℃培养箱暗培养,10天左右菌丝即可长满试管,即得母种。
(3)原种培养基及原种制作
原种培养基按质量分数计,包括高粱粒或麦粒98%,碳酸钙2%,按其含量将各组分混合均匀,然后加入水,使含水量为60%(质量百分数),然后装入小菌袋(15×30cm,每袋装入干高粱或麦粒80g)中,于121℃高压灭菌30min,冷却后按无菌操作接入步骤(2)得到的母种碎菌块(每支母种约能接6~8袋原种),在26℃培养箱暗培养,18~22天菌丝即可长满菌袋,得到原种。
(4)栽培种培养基及培养条件:
栽培种培养基按质量分数计,包括棉籽壳50%,木屑38%,麸皮10%,碳酸钙2%,按其含量将各组分混合均匀,然后加入水,使含水量为65%(质量百分数)。将各组分充分拌匀后装入17×35cm菌袋,盖上食用菌套环,于121℃条件下灭菌120min,冷却后按无菌操作接入步骤(3)得到的原种,在26℃养菌房暗培养,30~35天菌丝即可长满菌袋,得到栽培种,栽培种后熟一周即可转入栽培车间进行出菇管理。
(5)出菇管理
栽培种完成后熟培养后,打开盖子,直立放置,栽培袋之间应留稍许空隙,控制菇房温度在28±1℃,空气相对湿度80~90%之间,光照约为300~600Lx,每天光照10小时。保持栽培房空气中二氧化碳含量在浓度小于1200ppm范围,保持土层湿润。当原基分化后长出幼菇时,每天向幼菇喷施水雾1~2次,直至子实体菌盖伸展开,此时子实体已趋成熟,即可采收。驯化后人工栽培翘鳞香菇HMGIM-130343的生长状态见图4。
实施例3翘鳞香菇HMGIM-130343发酵液多糖含量测定
将翘鳞香菇HMGIM-130343母种按无菌操作接种至灭菌冷却后的液体培养基,培养基配方:马铃薯200g(煮至熟而不烂,取汁去渣),葡萄糖20g,磷酸二氢钾1.5g,硫酸镁3g,蛋白胨5g,VB1 100mg,水1000mL,pH自然;培养基配制为:将各成分混合溶解后,于121℃高压灭菌30min。于26℃、150rpm摇床暗培养10天后,再静置培养5天,分装至50mL离心管,6000prm离心收集上清液于2mL离心管中。采用苯酚硫酸法测定上清液中多糖浓度,以葡萄糖作为标准品,制定葡萄糖浓度-吸光度OD值的标准曲线,见图5。参考上述的方法同时测定市售现有翘鳞香菇菌株A150358、菌株D150626、菌株E150396发酵液中的多糖含量,结果见表2。
表2不同翘鳞香菇菌株发酵液中的葡萄糖含量
由上表可知,本发明翘鳞香菇菌株HMGIM-130343发酵液中的葡萄糖含量均比市场现有的菌株高。
实施例4翘鳞香菇HMGIM-130343驯化子实体营养元素测定
运用GB 5009.6-2016/第一法测定脂肪;运用GB 5009.5-2016/第一法测定蛋白;运用GB 5009.91-2017/第三法测定钾;运用GB 5009.91-2017/第三法测定钠;运用GB5009.241-2017/第二法测定镁;运用GB 5009.91-2017/第二法测定锌;运用GB 5009.92-2016/第三法测定钙;运用GB 5009.87-2016/第三法测定磷。具体结果见表3。
表3翘鳞香菇HMGIM-130343驯化子实体营养元素的测定结果
由上表可知,本发明翘鳞香菇菌株HMGIM-130343是一种高蛋白,低脂肪,富含各种微量元素的食用真菌,可作为较好的日常菌类蔬菜进行推广栽培。
实施例5翘鳞香菇HMGIM-130343发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制活性测定
在67mmol/L的磷酸钾缓冲液(pH6.8)750μL体系中,加入10μL谷胱甘肽(1mg/mL)和50μLα-葡萄糖苷酶(0.4U),再分别加入100μL翘鳞香菇菌株HMGIM-130343的发酵上清液(参照实施例3制备),阴性对照(PBS溶液)和阳性对照(卡博平阿卡波糖5mg/mL),在37℃下反应10min。最后向该体系中加入100μL浓度为116mmol/L的4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-ntrophenyl-α-D-glucopyranoside,pNPG)作为底物开始反应,在37℃下持续反应30min,最后加入5mL浓度为0.1mol/L的Na2CO3以终止反应。pNPG溶液无色,但经α-葡萄糖苷酶水解释放出对硝基苯酚(PNP),PNP在碱性条件下呈黄绿色,在400nm处有最大吸收。通过测定PNP在400nm处的吸收值可以间接地反映反应体系中α-葡萄糖苷酶的抑制活性,具体计算方法可以用以下公式:α-葡萄糖苷酶的抑制活性(%)=(1-(A样品–A样品背景)/(A0–A空))×100,其中A样品代表翘鳞香菇发酵上清液和阿卡波糖在400nm处的吸收值,A样品背景代表翘鳞香菇发酵上清液在400nm处的吸收值,A0代表阴性对照在400nm处的吸收值,A空代表67mmol/L的磷酸钾缓冲液(pH6.8)在400nm处的吸收值。测定结果见表4。
表4翘鳞香菇HMGIM-130343发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制活性测定结果
由上表可知,本发明翘鳞香菇菌株HMGIM-130343发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制率为23.55%,具有良好的抑制活性,弥补了翘鳞香菇关于降血糖功效初探方面的空缺。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,上述优选实施方式不应视为对本发明的限制,本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明的精神和范围内,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.翘鳞香菇(Lentinus squarrosulus) HMGIM-130343,保藏号为CCTCC NO:M2017586。
2.一种如权利要求1所述的翘鳞香菇 HMGIM-130343的驯化栽培方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)对翘鳞香菇HMGIM-130343的子实体进行组织分离,得到原始菌株分离种;
(2)将分离种按无菌操作接种于含母种培养基的试管中,在培养箱暗培养,直至菌丝长满试管,获得母种;
(3)将母种按无菌操作接种于含原种培养基的菌袋中,在培养箱暗培养,直至菌丝长满菌袋,获得原种;
(4)将原种按无菌操作接种于含栽培种培养基的菌袋中,在养菌房暗培养,直至菌丝长满菌袋,获得栽培种;
(5)待栽培种完成后熟培养后,于温度为28±1℃,相对湿度为80~90%,光照强度为300~600Lx,二氧化碳含量小于1200ppm,保持土层湿润的条件下继续培养,直至菌盖平展,采收。
3. 根据权利要求2所述的翘鳞香菇 HMGIM-130343的驯化栽培方法,其特征在于,所述步骤(2)的培养温度为26℃,所述的暗培养时间为10天,所述的母种培养基组成为:马铃薯200 mg/mL、葡萄糖20 mg/mL,磷酸二氢钾1.5 mg/mL,硫酸镁3 mg/mL,蛋白胨5 mg/mL,VB微量,琼脂20 mg/mL,溶剂为水。
4. 根据权利要求2所述的翘鳞香菇 HMGIM-130343的驯化栽培方法,其特征在于,所述步骤(3)的培养温度为26℃,所述的暗培养时间为18~22天,所述的原种培养基按质量百分数计,包括高粱粒或麦粒98%、碳酸钙2%;按其含量将各组分混合均匀后,再加水,使含水量为60%。
5.根据权利要求2所述的翘鳞香菇 HMGIM-130343的驯化栽培方法,其特征在于,所述步骤(4)的培养温度为26℃,所述的暗培养时间为30~35天,所述的栽培种培养基按质量百分数计,包括棉籽壳50%、木屑38%、麸皮10%和碳酸钙2%;按其含量将各组分混合均匀后,再加水,使含水量为65%。
6. 根据权利要求2所述的翘鳞香菇 HMGIM-130343的驯化栽培方法,其特征在于,所述步骤(5)的光照时间为10h/d,后熟的条件为26℃暗培养,后熟时间为1周。
7. 权利要求1所述的翘鳞香菇 HMGIM-130343在制备降血糖药物中的应用。
8. 权利要求1所述的翘鳞香菇 HMGIM-130343的提取物或发酵液在制备降血糖药物中的应用。
9. 权利要求1所述的翘鳞香菇 HMGIM-130343在制备多糖中的应用。
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一株野生翘鳞香菇的培养特性研究;张国广等;《湖北农业科学》;20151231;第54卷(第8期);第1923-1927页 * |
翘鳞香菇研究进展;汪虹等;《食用菌学报》;20170915(第03期);第91-95页 * |
翘鳞香菇菌丝体多糖的分离纯化、抗氧化及体外抗肿瘤活性研究;陈艳娟等;《兴义民族师范学院学报》;20180825(第04期);第117-121页 * |
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CN109906877A (zh) | 2019-06-21 |
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