CN110117548B - 一种薄皮纤孔菌新菌株及其人工栽培方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及薄皮纤孔菌及其人工栽培方法和用途。本发明新菌株采自西藏林芝雅鲁藏布国家级自然保护区，经鉴定为薄皮纤孔菌，命名为薄皮纤孔菌(Inonotus cuticularis)HMGIM‑Z110188，于2019年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国武汉)，保藏编号为CCTCC NO:M 2019272。本发明的薄皮纤孔菌(Inonotus cuticularis)新菌株采集自西藏林芝地区，其栽培试验表明能够成功进行人工栽培且产量较大。同时其发酵液的体外抑制α‑葡萄糖苷酶活性达到了94.7％之高，对于高血糖相关疾病的治疗研究具有重要意义。

Description

一种薄皮纤孔菌新菌株及其人工栽培方法和用途
技术领域
本发明涉及珍稀药用菌新菌株及其人工栽培方法和用途，尤其涉及薄皮纤孔菌新菌株及其人工栽培方法和用途。
背景技术
目前，食药用菌的产业发展迅猛，据中国食用菌协会统计，2017年我国食药用菌的产量达到3712万吨，比2016年增长了3.21％，产值为2721.92亿元。我国占全球75％以上，从业人员超过2000万人，食用菌产业在种植业中排在除了粮、菜、果、油之后的第五位，超过了茶叶和蚕桑。
在食药用菌产业蓬勃发展的今天，越来越多的珍稀食药用菌品种逐渐进入人们的视野，许多原有的珍稀品种逐渐被驯化，如竹荪、茶薪菇、离褶伞、羊肚菌等。但是也有大批的野生食药用菌由于未能被人类认识，没有得到研究。据研究，目前世界上约有300多万种真菌物种，仅仅有1％的物种被认识，其中已知的大型真菌约14000种，国内已确认的食用菌有1789种，药用菌798种，而当中又只有不到100种的野生食药用菌被人类驯化，规模化栽培的品种更只有30多种。人类距离大型真菌的研究与利用还有相当长的道路要走。随着人们生活水平的逐步上升，对于生活品质的要求更高，而大型真菌由于其富含具有营养及功能作用的各种成分，包括真菌多糖、三萜类、甾醇等，对于人体健康具有非常良好的作用，日益受到人们的重视。
纤孔菌属的研究离不开桑黄这一话题。近年来，对桑黄的研究及应用成为了热点。桑黄是一类重要药用真菌子实体的俗称。根据《大观本草》记载“桑耳，味甘，有毒。黑者主女子漏下赤白汁，血病症瘕积聚，阴痛，阴阳寒热，无子，疗月水不调。其黄熟陈白者，止久泄，益气，不饥。其金色者，治癖饮积聚，腹痛，金疮。一名桑菌，一名木麦。”该著作是唯一一本有关桑耳图片的著作。而关于桑黄的药用功能各种本草著作中均有详细记载，其主要功能有治疗痢疾、脐腹涩痛、脱肛泻血等作用。
但对于桑黄的分类学研究，多年来一直存在争议、各方观点不一。据调查目前东亚地区市场交流的桑黄菌重要种类有：火木层孔菌Phellinus igniarius(L.)Quel.、裂蹄纤孔菌Inonotus linteus(Berk.&M.A.Curtis)Teixeira)、瓦宁纤孔菌Inonotus vaninii(Ljub.)T.Wagner&M.Fisch.、亚马木层孔菌Phellinus yamanoi(Imazeki)Parmasto等。而东北大兴安岭地区民间将红缘拟层孔菌Fomitopsis pinicola(Sw.)P.Karst.和褐黄纤孔菌Inonotus xeranticus(Berk.)Imaz.&Aoshima等当作桑黄来使用；包海鹰等认为粗毛纤孔菌Inonotus hispidus(Bull.)P.Karst.是桑黄菌中的一种，该团队从遗传距离方面的结果分析，褐黄纤孔菌与瓦宁层孔菌、裂蹄纤孔菌及火木层孔菌的遗传距离均为0.0000，褐黄纤孔菌与瓦宁层孔菌、裂蹄纤孔菌及火木层孔菌亲缘关系较近。从遗传距离可认为以上几种都有可能为桑黄。戴玉成认为桑黄纤孔菌Inonotus sanghuang Sheng H.Wu，T.Hatt.&Y.C.Dai.为真正的桑黄，是传统本草中记载的正宗桑黄；刘正南等认为我国国产桑黄的基原为火木层孔菌，而日本、韩国产桑黄的基原为裂蹄纤孔菌。而近年来，各学者对桑黄的形态学和分子系统学方面的研究也取得了很大进展，对桑黄类群中涉及到的菌类也得到了进一步的认识。Wu等基于ITS序列的系统发育分析发现东亚地区的桑黄有6个种类，即鲍姆纤孔菌Inonotus baumii(Pilát)T.Wagner&M.Fisch.、小孔忍冬纤孔菌Inonotuslonicericola(Parmasto)Y.C.Dai、大孔忍冬纤孔菌Inonotus lonicerinus(Bondartsev)Sheng H.Wu，Y.C.Dai&T.Hatt.、桑黄纤孔菌I.sanghuang、瓦宁纤孔菌I.vaninii(俗称杨树桑黄)和锦带花纤孔菌Inonotus weigelae T.Hatt.&S.H.Wu。Tian.等对中国的桑黄类群做了进一步研究，发现了另外2个新种：即高山纤孔菌Inonotus alpinus Y.C.Dai&X.M.Tian和环区纤孔菌Inonotus zonatus Y.C.Dai&X.M.Tian。戴玉成等基于ITS序列对中国桑黄类群和火木层孔菌类群中所有种类的系统发育进行了分析，实验结果表明，这两个类群在系统发育关系上相差甚远。曾经广泛被报道为所谓的“桑黄”的火木层孔菌类群具有无色的担孢子，而桑黄类群的担孢子为黄褐色。虽然东亚各国对桑黄分类学进行了广泛研究，对桑黄的认识有了进一步提高，但对于桑黄的概念还需进行试验对其进一步说明。
目前，对纤孔菌属的品种的研究集中于粗毛纤孔菌、鲍姆纤孔菌、怪核柳纤孔菌、锦带花纤孔菌、平伏纤孔菌、桑黄纤孔菌、辐射状纤孔菌、瑞克纤孔菌、斜生纤孔菌等，研究领域集中于真菌资源与分子生物学方面及部分品种的功能研究。目前已经实现栽培的纤孔菌包括鲍姆木纤孔菌、粗毛纤孔菌等；在生物活性研究方面，对多种纤孔菌的抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗病毒等作用开展了研究。
仍需要进一步研究对其他纤孔菌的新菌株进行深入研究。
发明内容
针对以上不足，本发明提供一种薄皮纤孔菌的新菌株及其人工栽培方法和应用。
本发明通过以下方案达到上述目的：
第一方面，本发明的薄皮纤孔菌新菌株采自西藏林芝雅鲁藏布国家级自然保护区，经鉴定为薄皮纤孔菌，并且组织分离获得原始菌株，命名为薄皮纤孔菌(Inonotuscuticularis)HMGIM-Z110188，于2019年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国武汉)，保藏编号为CCTCC NO:M 2019272。
第二方面，本发明提供一种薄皮纤孔菌新菌株CCTCC NO:M 2019272的人工栽培方法，包括制作母种，制作生产母种，制作生产种，栽培培养及栽培管理，以重量百分比计，所述栽培料包括48-52％木屑、36-40％棉籽壳、8-12％麸皮、1-2％CaCO3。
在第三方面，本发明提供一种薄皮纤孔菌新菌株CCTCC NO:M 2019272或其发酵液的应用，用于治疗或预防高血糖相关疾病。
在第四方面，本发明提供一种薄皮纤孔菌新菌株CCTCC NO:M 2019272或其发酵液的应用，用于制备治疗或预防高血糖相关疾病的药物。
在第五方面，本发明提供一种治疗或预防高血糖相关疾病的药物，包括薄皮纤孔菌新菌株CCTCC NO:M 2019272或其发酵液和载体。
综上所述，本发明的薄皮纤孔菌新菌株采集自西藏林芝地区，从形态学鉴定及分子学实验表明，目前还属于薄皮纤孔菌，其栽培试验表明能够成功进行人工栽培且产量较大。同时其发酵液的体外抑制α-葡萄糖苷酶活性达到了94.7％之高，对于高血糖相关疾病的治疗研究具有重要意义。
附图说明
图1为NJ法构建的系统发育树。
图2为ML法构建的系统发育树。
图3为BI法构建的系统发育树。
图4为ITS序列。
图5为野生采集的子实体图。
图6为野生采集的子实体图。
图7为人工栽培得到的子实体图。
图8为人工栽培得到的子实体图。
具体实施方式
第一方面，本发明的薄皮纤孔菌采自西藏林芝雅鲁藏布国家级自然保护区，经鉴定为薄皮纤孔菌，并且组织分离获得原始菌株，命名为薄皮纤孔菌(Inonotuscuticularis)HMGIM-Z110188，于2019年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国武汉)，保藏编号为CCTCC NO:M 2019272。
2011年8月27日胡惠萍、旦真次仁、周振辉、邵满超在西藏林芝雅鲁藏布国家级自然保护区进行大型真菌资源采集和调查，在阔叶木上采集到一份纤孔菌属品种标本，通过组织分离法得到其PDA纯培养物，通过液体培养收集菌丝，通过ITS测序比对，由于经过查询国内的纤孔菌种类基本上都在NCBI上提交了ITS序列，而极少数没有提交序列的品种，如金边纤孔菌Inonotus chrysomarginatus，海南纤孔菌Inonotus hainanensis，赭纤孔菌Inonotus ochroporus等，从宏观形态上就可以判定与所采集的野生菌种不符合。综合三种系统发育树和ITS比对结果及宏观微观结构，如图1至图3所示，基本可以判定该种与薄皮纤孔菌Inonotus cuticularis亲缘关系最接近，在ITS序列比对中相似度达到95.52-96.72％之间，通过进一步构建系统发育树分析，结合其宏观及微观形态，判定其为薄皮纤孔菌，命名为薄皮纤孔菌(Inonotus cuticularis)HMGIM-Z110188。本发明菌株为薄皮纤孔菌，已有发明均与本发明的菌株不相一致。
薄皮纤孔菌(Inonotus cuticularis)CCTCC NO:M 2019272的性状如下：子实体一年生，无柄，单生或覆瓦状叠生，木栓质。菌盖平展。菌盖外伸可达6cm，宽可达10cm。菌盖表面淡黄色、金黄色至黄褐色，有较明显同心环纹，菌盖中部有疣状突起，边缘锐，干后内卷。孔口表面呈浅黄至浅褐色，多角形，每毫米5-6个，不育边缘明显。菌肉浅黄至浅褐色，厚约5mm。孢子椭圆形，黄褐色，厚壁，光滑。
第二方面，本发明提供一种薄皮纤孔菌(Inonotus cuticularis)CCTCC NO:M2019272的人工栽培方法，包括制作母种，制作生产母种，制作生产种，栽培培养及栽培管理，以重量百分比计，所述栽培料包括48-52％木屑、36-40％棉籽壳、8-12％麸皮、1-2％CaCO3。
优选的，以重量百分比计，所述栽培料包括50％木屑、38％棉籽壳、10％麸皮、2％CaCO3。
优选的，所述栽培培养包括：将生产种转接至栽培料中，25-26℃恒温、遮光培养，湿度60％-70％，菌丝生长过程中注意换气，保持二氧化碳浓度4000ppm以下，菌丝长满菌袋进入栽培管理。
优选的，所述栽培管理包括：继续置于25-26℃恒温进行后熟培养，然后进行搔菌处理，打开出菇盖，除去表层老化菌丝层0.3-0.5cm后，套上出菇环盖，重新置于25-26℃恒温，黑暗培养20天后进行出菇管理，控制温度在20℃-22℃，加大通风量，空气相对湿度调整至90％以上，菌丝开始扭结并形成团状原基，此时保持相对湿度不直接朝原基上喷水；控制在空间温度20℃-22℃之间，空气相对湿度在80％-90％，加大通风量，使CO2浓度保持在350～1500ppm，漫射光时长保持每天9小时，子实体生长成菇，采摘。
优选的，所述制作母种包括：将分离的菌种转接至母种培养基，置于25℃恒温暗培养，待菌丝生长而细菌尚未生长时进行尖端菌丝的挑取，得到母种。
优选的，所述母种培养基为孟加拉红培养基。
进一步优选的，以重量百分比计，所述孟加拉红培养基包括：蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％、琼脂2％、1/3000孟加拉红溶液10％、氯霉素0.01％，其余为水。
优选的，所述制作生产母种包括：将母种转接至生产母种培养基，置于25℃恒温暗培养，待菌丝长满斜面得到生产母种。
优选的，所述生产母种培养基为加富综合PDA。
进一步优选的，以重量百分比计，所述加富综合PDA包括：马铃薯20％、葡萄糖2％、蛋白胨1％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素B1微量，其余为水。
优选的，所述制作生产种包括：向生产种培养基中无菌接入生产母种，接种时确保生产母种料块埋入原种料中，置于25℃恒温暗培养，待菌丝吃满料后得到生产种。
优选的，以重量百分比计，所述生产种培养基包括：98-99％高粱和1-2％碳酸钙。
进一步优选的，以重量百分比计，所述生产种培养基包括：98％高粱和2％碳酸钙。
优选的，所述人工栽培方法的制作母种前还包括组织分离菌种。
一种薄皮纤孔菌(Inonotus cuticularis)CCTCC NO:M 2019272的人工栽培方法，包括组织分离菌种后制作母种，制作生产母种，制作生产种，栽培培养及栽培管理，以重量百分比计，所述栽培料包括48-52％木屑、36-40％棉籽壳、8-12％麸皮、1-2％CaCO3。
优选的，所述组织分离菌种包括：采集回来的薄皮纤孔菌子实体在无菌条件下酒精擦拭表面后，撕开，以无菌操作方式接入0.2-0.5mm×0.2-0.5mm的内部菌肉组织，置于25℃中恒温暗培养，待菌丝长满斜面后得到分离的菌种。
优选的，所述组织分离培养基为综合PDA培养基。
进一步优选的，以重量百分比计，所述综合PDA培养基包括马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素B1微量。
本发明的人工栽培方法中发明人根据纤孔菌生长基质特点判断其纤维素和半纤维素酶及木质素酶活较强，采用较高比例的木屑的栽培料进行人工栽培，实现高质量的人工栽培。
在第三方面，本发明提供一种薄皮纤孔菌(Inonotus cuticularis)CCTCC NO:M2019272或其发酵液的应用，用于治疗或预防高血糖相关疾病。
优选的，所述发酵液为薄皮纤孔菌CCTCC NO:M 2019272子实体的液体发酵的上清液。
优选的，所述的高血糖相关疾病主要为长期高血糖引发的全身组织器官发生病变，导致急慢性并发症的发生，例如包括但不限于胰腺功能衰竭、失水、电解质紊乱、营养缺乏、抵抗力下降、肾功能受损、神经病变、眼底病变。
在第四方面，本发明提供一种薄皮纤孔菌(Inonotus cuticularis)CCTCC NO:M2019272或其发酵液的应用，用于制备治疗或预防高血糖相关疾病的药物。
优选的，所述发酵液为薄皮纤孔菌CCTCC NO:M 2019272子实体的液体发酵的上清液。
优选的，所述的高血糖相关疾病主要为长期高血糖引发的全身组织器官发生病变，导致急慢性并发症的发生，例如包括但不限于胰腺功能衰竭、失水、电解质紊乱、营养缺乏、抵抗力下降、肾功能受损、神经病变、眼底病变。
在第五方面，本发明提供一种治疗或预防高血糖相关疾病的药物，包括薄皮纤孔菌(Inonotus cuticularis)CCTCC NO:M 2019272或其发酵液和载体。
优选的，所述发酵液为薄皮纤孔菌CCTCC NO:M 2019272子实体的液体发酵的上清液。
优选的，所述的高血糖相关疾病主要为长期高血糖引发的全身组织器官发生病变，导致急慢性并发症的发生，例如包括但不限于胰腺功能衰竭、失水、电解质紊乱、营养缺乏、抵抗力下降、肾功能受损、神经病变、眼底病变。
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1：
2011年8月27日胡惠萍、旦真次仁、周振辉、邵满超在西藏林芝雅鲁藏布国家级自然保护区进行大型真菌资源采集和调查，在阔叶木上采集到一份纤孔菌属品种标本，如图5和图6所示，通过组织分离法得到其PDA纯培养物，通过液体培养收集菌丝，低温(40℃)烘干，使用液氮研磨，利用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒，进行DNA基因组的提取，得到的DNA溶液-20℃冷藏备用。通过真菌核糖体基因间隔区通用引物ITS1/ITS4(ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)进行材料的ITS-PCR实验，扩增在Biometra PCR仪上进行，PCR反应液组成(共50μl)为：
Figure GDA0003844349950000061
相关试剂(商品编号R001A)由宝生物工程(大连)有限公司生产。反应条件为:94℃反应5min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应1min，30个循环；72℃反应10min.PCR产物直接送检进行双向测序，由华大基因完成。其ITS序列见图4。
测序结果在GenBank进行序列Blast，发现与纤孔菌属的两个品种比较接近，与里克纤孔菌Inonotus rickii相似度为98.32％，与薄皮纤孔菌Inonotus cuticularis相似度为95.92-96.72％。但通过宏观形态与微观形态的鉴别，与里克纤孔菌Inonotus rickii不一样，其突出特征在于菌盖金黄色，但与薄皮纤孔菌Inonotus cuticularis接近。它们在ITS序列上与以上两种分别有9个和8个碱基的不同，显示该品种与比对结果最高的两个种不是同一物种。为进一步验证其品种归属，我们下载了纤孔菌的60多条较权威的研究团队上传的ITS序列，通过最大似然法(ML)，邻接法(NJ)和贝叶斯法(BI)分别构建了系统发育树。如图1至图3所示，分析发现，该品种从基因层面基本可以认定为薄皮纤孔菌Inonotuscuticularis，结合外观形态，认定其为薄皮纤孔菌Inonotus cuticularis。
实施例2
一、培养基(以重量百分比计)：
1、组织分离培养基(综合PDA)：
马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素B1微量，其余为水。
2、母种培养基(孟加拉红培养基)：
蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％、琼脂2％、1/3000孟加拉红溶液10％、氯霉素0.01％，其余为水。
3、生产母种培养基(加富综合PDA)：
马铃薯20％、葡萄糖2％、蛋白胨1％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素B1微量，其余为水。
4、生产种培养基：
98-99％高粱、1-2％碳酸钙。
5、栽培料：
50％木屑，38％棉籽壳，10％麸皮，2％CaCO3，pH自然。
二、方法：
1、组织分离菌种：
制作组织分离培养基，分装试管，在0.11MPa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min，取出冷却摆成斜面。采集回来的野生簇生沿丝伞子实体在无菌条件下用75％酒精擦拭表面后，撕开，以无菌操作方式接入0.2-0.5mm×0.2-0.5mm的内部菌肉组织。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝长满斜面后后得到分离的菌种则可进行转接，其长满的时间大概在10天-15天之间。
2、制作母种：
按配方制作母种培养基，分装试管，在0.11MPa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min，对于分离的菌种进行转接。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝生长而细菌尚未生长时进行尖端菌丝的挑取与转接，得到母种。
3、制作生产母种：
制作生产母种培养基，分装试管，在0.11MPa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min，取出冷却无菌操作接入母种。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝长满斜面后后得到生产母种则可进行转接。生产母种长满的时间大概在15天-20天之间。
4、制作生产种
称取所需比例的高粱，经水泡湿过夜，按比例混入碳酸钙，装入250ml锥形瓶中，折合每瓶装干料100-150g，得到生产种培养基。以硅胶塞封口。在0.147MPa大气压、128℃高温高压湿热灭菌90min，取出冷却后将培养基抖散后无菌操作接入生产母种。接种时确保生产母种料块埋入生产种料中。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝吃满料后(20天左右)则可作为生产种使用接入栽培袋中。
5、栽培培养
称人工驯化培养基取所需比例的培养料，充分混合并加水(含水量为55-65％)，装入17cm×35cm耐高温的透明聚丙烯菌种袋。折合每袋装干料400-420g。装好料后用小木棒在袋料中打洞，洞深至袋底，然后在袋口套上塑料环，扣上配套的盖子，即得一个制好的栽培料袋。在0.147MPa大气压、128℃高温高压湿热灭菌90min，取出冷却后无菌操作接入生产种。接种时确保料块埋入栽培料中。接种后在25℃±1℃、空气相对湿度60-70％的培养室中避光培养。待菌丝吃满料后(60-70d左右)则可进入栽培管理。
6、栽培管理(包括后熟管理、搔菌刺激、原基形成、子实体生长)
(1)后熟管理
待栽培袋中的菌丝长满袋中栽培料后，继续遮光后熟培养20天，进入搔菌刺激阶段。
(2)搔菌刺激
菌丝完全成熟的菌棒，打开菌盖，用灭菌的不锈钢长勺刮去表面的长有白色菌丝的培养基约0.3-0.5cm，再重新盖上菌盖。重新放置于25℃环境，黑暗培养20天后进行出菇管理。
(3)原基形成
搔菌刺激结束后，控制温度在20℃，并加大通风量，保持空间二氧化碳含量在1％以下，空气相对湿度调整至90％以上，经20天后，去除菌盖，把栽培袋竖排放置(袋与袋之间应留有空隙)，此时菌丝开始扭结并形成淡黄色团状原基。
(4)子实体生长期
原基生长至0.5cm后，控制温度在20-22℃，空气相对湿度85-90％之间，每天光照9小时，光照强度300-500lx，并保持空气中二氧化碳浓度350～1500ppm，保持空气湿润。经30天左右，纤孔菌长成成菇。在此期间，每天向幼菇喷施水雾1-2次，直至子实体大小基本不变，说明子实体已趋成熟，此时应采收。从长出原基到子实体成熟约经过30天。如图7和图8所示。
三、出菇情况
1、出菇期：该品种生长周期约为4.5个月，头潮菇出菇期约1个月，本次驯化只出菇1潮。
2、产量：每个菇袋每潮出菇132克，生物转化率在31.4％左右。
3、子实体性状：子实体呈平展扇形，，新鲜时呈浅黄至金黄色，老熟后呈深褐色。
4、与野生状态相比，该品种在人工驯化后子实体个体比较圆整。生物转化率较高。
实施例3降血糖体外试验
一、方法
1、菌种液体发酵
将实施例1采集的纤孔菌野生子实体进行液体发酵，培养基为综合PDA液体培养基，发酵条件为：25℃，180rpm，发酵45天。同时针对另外的49株野生菌株进行发酵。
2、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
在67mmol/L的磷酸钾缓冲液(pH6.8)750μL体系中，加入10μL谷胱甘肽(1mg/ml)和50μLα-葡萄糖苷酶(0.4U)，再分别加入100μL食用菌发酵上清液，阴性对照(PBS)和阳性对照(卡博平阿卡波糖5mg/mL)，在37℃下反应10min。最后向该体系中加入100μL浓度为116mmol/L的4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-ntrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG)作为底物开始反应，在37℃下持续30min最后加入5mL浓度为0.1mol/L的Na2CO3以终止反应。pNPG溶液无色，但经α-葡萄糖苷酶水解释放出对硝基苯酚(PNP)，PNP在碱性条件下呈黄绿色，在400nm处有最大吸收。通过测定PNP在400nm处的吸收值可以间接地反映反应体系中α-葡萄糖苷酶的抑制活性，具体计算方法可以用以下公式：α-葡萄糖苷酶的抑制活性(％)＝(1-(A样品–A样品背景)/(A0–A空))×100％，其中A样品代表食用菌发酵上清液和阿卡波糖在400nm处的吸收值，A样品背景代表食用菌发酵上清液在400nm处的吸收值，A0代表阴性对照在400nm处的吸收值，A空代表67mmol/L的磷酸钾缓冲液(pH6.8)在400nm处的吸收值。
(二)实验结果
经记录吸光值采用计算出50个野生食药菌菌种发酵液的抑制α-葡萄糖苷酶活性数值如下：
表1野生食药菌菌种发酵液抑制α-葡萄糖苷酶活性结果
Figure GDA0003844349950000101
Figure GDA0003844349950000111
如表1的结果可知，薄皮纤孔菌(Inonotus cuticularis)CCTCC NO:M 2019272的发酵液体外抑制α-葡萄糖苷酶活性达到了94.7％，远远高于阳性对照阿卡波糖，比起其他野生菌，也是效果非常显著。
综上所述，该薄皮纤孔菌(Inonotus cuticularis)新菌株采集自西藏林芝地区，从其栽培试验表明能够成功进行人工栽培且产量较大。同时在50株液体发酵液中，它的体外抑制α-葡萄糖苷酶活性达到了94.7％之高，对于降血糖及进一步对其成分开展深入研究将具有重要意义。
以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种薄皮纤孔菌菌株，其特征在于，所述薄皮纤孔菌菌株为薄皮纤孔菌(Inonotuscuticularis)HMGIM-Z110188，保藏编号为CCTCC NO:M 2019272。
2.一种薄皮纤孔菌菌株CCTCC NO:M 2019272的人工栽培方法，其特征在于，包括制作母种，制作生产母种，制作生产种，栽培培养及栽培管理，以重量百分比计，栽培料包括48-52％木屑、36-40％棉籽壳、8-12％麸皮、1-2％CaCO3。
3.根据权利要求2所述的人工栽培方法，其特征在于，以重量百分比计，所述栽培料包括50％木屑、38％棉籽壳、10％麸皮、2％CaCO3。
4.根据权利要求2所述的人工栽培方法，其特征在于，所述栽培培养包括：将生产种转接至栽培料中，25-26℃恒温、遮光培养，湿度60％-70％，菌丝生长过程中注意换气，保持二氧化碳浓度4000ppm以下，菌丝长满菌袋进入栽培管理。
5.根据权利要求4所述的人工栽培方法，其特征在于，所述栽培管理包括：继续置于25-26℃恒温进行后熟培养，然后进行搔菌处理，打开出菇盖，除去表层老化菌丝层0.3-0.5cm后，套上出菇环盖，重新置于25-26℃恒温，黑暗培养20天后进行出菇管理，控制温度在20℃-22℃，加大通风量，空气相对湿度调整至90％以上，菌丝开始扭结并形成团状原基，此时保持相对湿度不直接朝原基上喷水；控制在空间温度20℃-22℃之间，空气相对湿度在80％-90％，加大通风量，使CO2浓度保持在350～1500ppm，漫射光时长保持每天9小时，子实体生长成菇，采摘。
6.根据权利要求2至5中任一所述的人工栽培方法，其特征在于，所述制作母种包括：将分离的菌种转接至母种培养基，置于25℃恒温暗培养，待菌丝生长而细菌尚未生长时进行尖端菌丝的挑取，得到母种；和/或，
所述制作生产母种包括：将母种转接至生产母种培养基，置于25℃恒温暗培养，待菌丝长满斜面得到生产母种；和/或，
所述制作生产种包括：向生产种培养基中无菌接入生产母种，接种时确保生产母种料块埋入原种料中，置于25℃恒温暗培养，待菌丝吃满料后得到生产种。
7.根据权利要求6所述的人工栽培方法，其特征在于，所述母种培养基为孟加拉红培养基，以重量百分比计，所述孟加拉红培养基包括：蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、琼脂2％、1/3000孟加拉红溶液10％、氯霉素0.01％，其余为水；和/或，
所述生产母种培养基为加富综合PDA，以重量百分比计，所述加富综合PDA包括：马铃薯20％、葡萄糖2％、蛋白胨1％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素B1微量，其余为水；和/或，
以重量百分比计，所述生产种培养基包括：98-99％高粱和1-2％碳酸钙。
8.一种薄皮纤孔菌菌株CCTCC NO:M 2019272或其发酵液的应用，其特征在于，用于制备治疗高血糖疾病的药物，所述发酵液为纤孔菌CCTCC NO:M 2019272子实体的液体发酵的上清液。
9.一种治疗高血糖疾病的药物，其特征在于，包括薄皮纤孔菌菌株CCTCC NO:M2019272或其发酵液和载体。
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