CN110754292B - 卵孢小奥德蘑白色变种及其人工栽培方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种卵孢小奥德蘑白色变种及其人工栽培方法，所述卵孢小奥德蘑白色变种为卵孢小奥德蘑(Oudemansiella raphanipes)HMGIM‑W150719,保藏编号为CCTCC NO:M2019557；人工栽培方法包括菌丝培养、出菇管理以及采收。本发明通过野外采集、分子鉴定和驯化栽培等实验筛选获得一株卵孢小奥德蘑白色变种，外观颜色与市场卵孢小奥德蘑商品具有较大的差异，所述白色变种活力更强，富含蛋白质和膳食纤维，具有较佳的科研和商业价值。

Description

卵孢小奥德蘑白色变种及其人工栽培方法

技术领域

本发明涉及卵孢小奥德蘑属真菌领域，具体涉及一种卵孢小奥德蘑白色变种及其人工栽培方法。

背景技术

卵孢小奥德蘑(Oudemansiella raphanipes(Berk.)Pegler&T.W.K.Young)，隶属于担子菌门(Basidiomycota)蘑菇目(Agricales)泡头菌科(Physalacriaceae)小奥德蘑属(Oudemansiella s.l)。小奥德蘑是全球食用历史悠久的食用菌，由于富含氨基酸、维生素、蛋白质、钙、镁等营养成分，具有降血压、抗脂肪肝、抗真菌、减少过氧化氢诱导的活性氧伤害、抑制植物病原菌、抑制肿瘤等药理作用，在中国食用菌市场占据一定地位。卵孢小奥德蘑作为小奥德蘑较热门的品种，口感更胜，肉质细嫩鲜美、柄脆甜、汤汁鲜美、香味浓郁，由于其外观形态与蚁巢伞(鸡枞菌)相似，在广东、贵州、云南等地又叫黑皮鸡枞(黑皮菌、水鸡枞)。通体暗褐色，价格高昂，常见于中高端超市，鲜品每公斤约80-100元，干品每公斤约200-400元，成品有鸡枞油、黑皮鸡枞酱等。

相比于其它珍稀食用菌，卵孢小奥德蘑早在2007年已有报道成功实现人工栽培，小奥德蘑属也有其他栽培成功的品种，如长根奥德蘑、鳞柄小奥德蘑等，但是目前市场品种仍然较为单一，仍未能实现规模化生产，且缺乏高产稳产的菌种，极具开发潜力和价值。因此加强小奥德蘑属野生菌种的收集和驯化工作，筛选优质高产稳产的卵孢小奥德蘑菌种是促进其产业发展的主要途径。

在中医理论里五行五色能指导药材和食物的正确使用，白色属金，入肺经，性偏平、凉，利于益气，早在《黄帝内经》里有记载白色补肺。目前市场主流的白色金针菇，实际上野生金针菇主要是金黄色；玉木耳实际上也是毛木耳白色变异菌株；双孢蘑菇的自然外观也是棕色，还有白色的海鲜菇、白玉菇等白色食品也深受消费者喜爱和认可。目前尚未有关于卵孢小奥德蘑白色变种的报道，倘若能栽培出白色表观基因稳定遗传的卵孢小奥德蘑白色变异种，将开发出重要的科研和商业价值。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明旨在提供一种卵孢小奥德蘑白色变种及其人工栽培方法，本发明的卵孢小奥德蘑白色变种菌株是在自然条件下孕育的，可丰富目前市场卵孢小奥德蘑菌株的种类，为行业提供更多的科研和商业价值。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

卵孢小奥德蘑白色变种，命名为卵孢小奥德蘑(Oudemansiella raphanipes)HMGIM-W150719,保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2019557。

本发明还提供一种上述的卵孢小奥德蘑白色变种的人工栽培方法，包括菌丝培养、出菇管理以及采收。

优选的，菌丝培养包括：在无菌操作条件下取卵孢小奥德蘑白色变种CCTCC NO:M2019557菌块接种于母种培养基，培养至菌丝体长满斜面，将母种菌丝体转接到生产种扩大培养至菌丝体长满袋，取生产种菌丝体接种于栽培料，培养至菌丝体长满袋，进行后熟期培养。

进一步优选的，菌丝培养包括：在无菌操作条件下取0.5×0.5cm卵孢小奥德蘑白色变种CCTCC NO:M2019557菌块接种于母种培养基，控制湿度为50～60％，25℃恒温、黑暗培养10～20天至菌丝体长满斜面，将母种菌丝体转接至生产种扩大培养，25℃恒温、黑暗培养至菌丝体长满袋，取生产种菌丝体接种于栽培料，25℃恒温、黑暗培养，控制湿度为65～75％，定时换气保持二氧化碳浓度为2500～3000ppm，培养25～28天至菌丝体长满袋后，同条件培养28～30天后进行后熟期培养。

优选的，所述母种培养基包括以下重量百分数的组分：马铃薯20％、葡萄糖2％、蛋白胨1％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％，维生素B1微量，余量为水；

所述生产种培养基包括以下重量百分数的组分：高粱98～99％、碳酸钙1～2％；

所述栽培料包括以下重量百分数的组分：棉籽壳45％、木屑30％麸皮20％、玉米粉3％、过磷酸钙1％、石膏1％；

所述栽培料的含水量为65％。

优选的，出菇管理包括：菌丝后熟期满后进行催蕾，至料面菌丝形成并转化成黑褐色，分化出白色米粒状原基。

进一步优选的，出菇管理包括：菌丝后熟期满后打开栽培袋盖子进行催蕾，控制空间温度为26～28℃、空气相对湿度为85～90％、散射光光照10～12h/d、光照强度300～500lx，并加大通风量，保持空间二氧化碳含量在1％以下；催蕾35～40天待料面菌丝形成并转化成黑褐色，分化出白色米粒状原基后，控制空间温度为26～28℃、空间相对湿度为90～95％，散射光光照10～12h/d、光照强度300～500lx，并加大通风量，使二氧化碳浓度保持在350～1500ppm。

进一步优选的，所述栽培袋竖排放置，袋与袋之间相隔15cm。

优选的，采收包括：待幼菇的子实体菌柄长到6～8cm时，采收第一潮菇，待其余幼菇的子实体菌柄长到6～8cm时，采收第二潮菇，持续采收4～5潮。

进一步优选的，采收包括：8～12天幼菇的子实体菌柄长到6～8cm时，采收第一潮菇，继续进行出菇管理，期间每天向其余幼菇喷施水雾1～2次，直至子实体柄菌长到6～8cm时，采收第二潮菇，持续采收4～5潮。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明通过野外采集、分子鉴定和驯化栽培等实验筛选获得一株卵孢小奥德蘑白色变种，外观和颜色与市场卵孢小奥德蘑商品具有较大的差异，本白色变种活力更强，富含蛋白质和膳食纤维，具有较佳的科研和商业价值。

附图说明

图1是卵孢小奥德蘑HMGIM-W150719的外观示意图；

图2是ML法构建系统发育树图；

图3是NJ法构建系统发育树图；

图4是BI法构建系统发育树图；

图5是卵孢小奥德蘑菌株丝体生长速度比较图；

图6是卵孢小奥德蘑驯化栽培情况示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。在未作特别说明的情况下，本发明所采用的试剂、设备和方法均为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

一、卵孢小奥德蘑白色变种概述

本发明的卵孢小奥德蘑白色变种菌株是2015年广东省微生物研究所食用菌研究发展中心科研人员采自浙江。生长基质为腐殖土，单生，如图1所示，菌盖和菌柄雪白光滑，不规则菌褶，无菌环或菌托。组织分离获得原始菌株，命名为卵孢小奥德蘑HMGIM-W150719，于2019年7月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山)，保藏编号为CCTCC NO:M2019557。

二、卵孢小奥德蘑白色变种分子鉴定情况

对野生子实体采用组织分离法得到其PDA纯培养物，采集回来的野生子实体在无菌条件下用75％酒精擦拭表面后，撕开，夹取(0.2～0.5)mm×(0.2～0.5)mm的内部菌肉组织接入加富综合PDA培养基。置于25℃培养箱中恒温、黑暗培养，待菌丝长满斜面后取尖端菌丝转接纯化培养。

收集新鲜菌丝，低温(35℃)烘干，常温研磨，利用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(产自生工生物工程(上海)股份有限公司)进行DNA基因组的提取，得到的DNA溶液(DNA模板)-20℃冷藏备用。通过真菌核糖体基因间隔区通用引物ITS1/ITS4(ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)进行ITS-PCR实验，扩增在Biometra PCR仪上进行，PCR反应液组成(共50μl)如下：

表1真菌ITS PCR体系

表2真菌ITS PCR扩增程序

PCR产物直接送检进行双向测序，由华大基因完成。将测序结果在NCBI GenBank进行序列比对。ITS鉴定结果表示该菌株为卵孢小奥德蘑，同时，如图2～4所示，采用最大似然法(ML)、邻接法(NJ)、贝叶斯法(BI)构建系统发育树确定物种，以干蘑为外群，三种方法建立的系统发育树中HMGIM-W150719均与杨祝良教授发表的卵孢小奥德蘑标准ITS序列在同一分枝内，亲缘关系接近，确定为卵孢小奥德菌株。

三、卵孢小奥德蘑菌株活力比较

取已鉴定的卵孢小奥德蘑HMGIM-W150719保藏种置于25℃活化24h，挖取0.5cm×0.5cm菌块接入约30mL加富综合PDA平板(9cm)中央，25℃暗培养至菌丝体长满。用直径5mm的打孔器在平板上同一半径处打孔，得到完整菌块分别接种到加富综合PDA平板培养基中央，置于25℃下恒温暗培养，每个菌株3个重复。在接种的菌块边缘画线作为菌丝生长起始线(L1)，当生长最快的菌株长满平板边缘时结束所有菌株的生长速度测量，在菌落边缘画终止线(L2)，采用“十字”划线法测量菌落直径，按照公式：菌丝体日均生长速度(cm·d^-1)＝菌落增长长度(L2-L1)/培养天数(d)。

如图5所示，图中，1为卵孢小奥德蘑白色变种，2-7为野生卵孢小奥德蘑菌株，8-10为市售卵孢小奥德蘑菌株。

卵孢小奥德蘑白色变种即图5中1号菌株生长速度为0.42±0.01cm/d，极显著地高于其它野生卵孢小奥德蘑菌株，但低于市场种8号菌株，与另外两株市场种9号和10号生长速度相当，根据生长速度比较结果可知卵孢小奥德蘑白色变种的活力较强。

四、卵孢小奥德蘑白色变种的营养价值

市场销售的卵孢小奥德蘑多为幼嫩时期的子实体，卵孢小奥德蘑白色变种栽培子实体(幼嫩时)干品营养成分分析检测结果显示：每100g干子实体中蛋白质含量为20.8g，脂肪为4.2g，总膳食纤维为37.2g，水解氨基酸总和为15.4g，高于卵孢小奥德蘑市场种子实体；两者磷、钾、钙等微量元素相当，其中白色变种铁含量(8.19mg/100g)高于市场种2倍，锌含量(6.24mg/100g)高于市场种1倍。卵孢小奥德蘑白色变种比美维牛肝菌、松口蘑等蛋白质含量更高(根据《中国食药用菌学》数据进行对比)，脂肪含量低，同时富含微量元素，符合现代都市人追求健康饮食的要求。

表3卵孢小奥德蘑子实体各营养成分含量

五、卵孢小奥德蘑白色变种和市场种卵孢小奥德蘑外观形状差异

以本发明的栽培方法同时栽培卵孢小奥德蘑白色变种和市场种，观察比较外观性状差异。

杨祝良团队记载的卵孢小奥德蘑菌盖幼时半球状，成熟后菌盖逐渐平展，湿时胶黏，呈灰褐色、黄褐色、浅褐色，未成熟时呈棕色至黑褐色，菌盖光滑且具有近黑色辐射状条纹；菌肉呈白色或灰白色，伤后不变色；菌褶直生至弯生，稍微向下延伸，厚，呈白色或乳白色；菌柄近圆柱形，表面污白色至灰色，密被褐色鳞片，但菌柄基部白色；假根为灰黑色。孢子印白色，孢子椭圆形、卵形、近柠檬形，薄壁，无色透明，非淀粉样，非糊精状。

如图6所示，图中，a为卵孢小奥德蘑白色变种的栽培情况示意图，b和c分别为市场种卵孢小奥德蘑的栽培情况示意图。

本发明的卵孢小奥德蘑白色变种HMGIM-W150719子实体单生或群生，菌盖幼时半球状，成熟后菌盖逐渐平展，中部有较宽阔的微突起或呈脐状，湿时胶黏，成熟后为白色。菌肉白色，偏厚。菌褶直生至弯生，疏有小褶，广弧形，白色。菌柄呈圆柱形，白色，近光滑，有纵条纹或无条纹，肉部纤维质且松软，基部稍膨大且向下延伸成假根。孢子印白色，孢子无色，光滑，卵圆形至宽圆形，大小为(14-18)μm×(10-13)μm。

六、培养基配方及人工栽培方式

1、培养基配方

i、母种培养基(加富综合PDA)：马铃薯20％、葡萄糖2％、蛋白胨1％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％，维生素B1微量，余量为水。按配方制作母种培养基，分装试管，0.11MPa、121℃高温高压下湿热灭菌30min，置于斜面上冷却定型，即得。

ii、生产种培养基：98～99％高粱+1～2％碳酸钙，pH自然。称取所需比例的高粱，浸泡过夜后煮熟至透心，取出过滤弃去多余水分，按比例加入碳酸钙拌匀，装入13cm×25cm耐高温的透明聚丙烯袋中，折合每袋装干料200-250g。0.11MPa、121℃高温高压湿热灭菌30min，即得。

iii、栽培料：45％棉籽壳、30％木屑、20％麸皮、3％玉米粉、1％过磷酸钙、1％石膏，栽培料的水分65％、pH自然。干料400g/袋，装入17cm×35cm聚丙烯袋。按栽培料配方所需比例的培养料，备料当天将不同碳源原料如木屑、棉籽壳，以及石膏、过磷酸钙混合，加入40％的水进行预湿搅拌10分钟；第二天加入氮源原料如麸皮和玉米粉，搅拌10分钟，用仪器检测栽培料的含水量(含水量为65％)，继续搅拌20分钟；装入17cm×35cm耐高温的透明聚丙烯袋，折合每袋装干料450g-500g。装好料后用打孔棒在袋料中打洞，洞深至袋底，然后在袋口套上塑料环，扣上配套的盖子，在0.147MPa大气压，128℃高温高压湿热灭菌90min，即得一个制好的栽培料袋。

2、人工栽培方式

(1)菌丝培养：在无菌操作条件下取0.5cm×0.5cm HMGIM-W150719保藏种菌块接种于母种培养基(加富综合PDA)，控制湿度为50％-60％，25℃恒温、黑暗培养10-20天至菌丝体长满斜面。将母种菌丝体转接至生产种扩大培养，25℃恒温、黑暗培养至菌丝体长满袋。取HMGIM-W150719生产种菌丝体接种于栽培料，25℃恒温、黑暗培养，控制湿度为65-75％，定时换气以保持二氧化碳浓度为2500-3000ppm，培养25-28天至菌丝长满袋后，同条件培养28-30天进行后熟期培养。

(2)出菇管理：菌丝后熟期满后进行催蕾，催蕾时打开栽培袋盖子，把栽培袋竖排放置(袋与袋之间相隔15cm)，控制空间温度为26～28℃、空气相对湿度保持在85％～90％、散射光光照10～12h/d、光照强度300～500lx，并加大通风量，保持空间二氧化碳含量在1％以下。出芝管理35～40天料面菌丝形成并转成黑褐色，分化出白色米粒状原基，保持相对湿度，控制空间温度在26℃～28℃之间，空间相对湿度在90～95％之间，散射光光照10～12h/d，光照强度300～500lx，加大通风量，使二氧化碳浓度保持在350～1500ppm。

(3)采收：8～12天后白色卵孢小奥德蘑幼菇的子实体菌柄长到6～8cm时，采收第一潮菇。继续进行出菇管理，期间每天向其余幼菇喷施水雾1～2次，直至子实体菌柄长到6～8cm时，采收第二潮菇，持续采收4～5潮。所述卵孢小奥德蘑白色变种菌株的出菇期为85～95天，第一潮菇出菇期为50天。单潮出菇30.00～47.14g/袋，平均产量为36.42g/袋，头潮生物转化率约8.12％。

以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种卵孢小奥德蘑(Oudemansiella raphanipes)白色变种,其特征在于,所述白色变种为卵孢小奥德蘑(Oudemansiella raphanipes)HMGIM-W150719,保藏编号为CCTCC NO:M2019557。

2.如权利要求 1 所述的卵孢小奥德蘑白色变种的人工栽培方法, 其特征在于,包括菌丝培养、出菇管理以及采收。

3.根据权利要求 2 所述的卵孢小奥德蘑白色变种的人工栽培方法，其特征在于，菌丝培养包括：在无菌操作条件下取卵孢小奥德蘑白色变种CCTCC NO:M2019557 菌块接种于母种培养基，培养至菌丝体长满斜面，将母种菌丝体转接到生产种培养基扩大培养至菌丝体长满袋，取生产种菌丝体接种于栽培料，培养至菌丝体长满袋，进行后熟期培养。

4.根据权利要求 3 所述的卵孢小奥德蘑白色变种的人工栽培方法，其特征在于，菌丝培养包括：在无菌操作条件下取0.5×0.5cm 卵孢小奥德蘑白色变种CCTCC NO:M2019557菌块接种于母种培养基， 控制湿度为 50～60%，25℃恒温、黑暗培养 10～20 天至菌丝体长满斜面，将母种菌丝体转接至生产种培养基扩大培养，25℃恒温、黑暗培养至菌丝体长满袋，取生产种菌丝体接种于栽培料，25℃恒温、黑暗培养， 控制湿度为 65～75%，定时换气保持二氧化碳浓度为 2500～3000ppm， 培养 25～28 天至菌丝体长满袋后，同条件培养28～30 天后进行后熟期培养。

5.根据权利要求3 所述的卵孢小奥德蘑白色变种的人工栽培方法，其特征在于，所述生产种培养基包括以下重量百分数的组分：高粱 98～99%、碳酸钙 1～2%；

所述栽培料包括以下重量百分数的组分：棉籽壳 45%、木屑 30%、麸皮 20%、玉米粉3%、过磷酸钙 1%、石膏 1%；

所述栽培料的含水量为 65%。

6.根据权利要求 2 所述的卵孢小奥德蘑白色变种的人工栽培方法，其特征在于，出菇管理包括：菌丝后熟期满后进行催蕾，至料面菌丝形成并转化成黑褐色，分化出白色米粒状原基。

7.根据权利要求 2 或 6 所述的卵孢小奥德蘑白色变种的人工栽培方法，其特征在于，出菇管理包括：菌丝后熟期满后打开栽培袋盖子进行催蕾，控制空间温度为 26～28℃、空气相对湿度为 85～90%、散射光光照 10～12h/d、光照强度 300～500lx，并加大通风量，保持空间二氧化碳含量在 1%以下；催蕾 35～40 天待料面菌丝形成并转化成黑褐色，分化出白色米粒状原基后，控制空间温度为 26～28℃、空间相对湿度为90～95%，散射光光照10～12h/d、光照强度 300～500lx，并加大通风量，使二氧化碳浓度保持在 350～1500ppm。

8.根据权利要求 7 所述的卵孢小奥德蘑白色变种的人工栽培方法，其特征在于，所述栽培袋竖排放置，袋与袋之间相隔 15cm。

9.根据权利要求 2 所述的卵孢小奥德蘑白色变种的人工栽培方法，其特征在于，采收包括：待幼菇的子实体菌柄长到 6～8cm 时， 采收第一潮菇，待其余幼菇的子实体菌柄长到 6～8cm 时，采收第二潮菇，持续采收 4～5 潮。

10.根据权利要求 2 或 9 所述的卵孢小奥德蘑白色变种的人工栽培方法，其特征在于，采收包括：8～12 天幼菇的子实体菌柄长到 6～ 8cm 时，采收第一潮菇，继续进行出菇管理，期间每天向其余幼菇喷施水雾 1～2 次，直至子实体柄菌长到 6～8cm 时，采收第二潮菇，持续采收 4～5 潮。

Images