CN106635842B - 一株蜜环菌yn01（wt）及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株蜜环菌（Armillaria mellea）YN01（WT），其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号是CCTCC NO：M 2016611；本发明的蜜环菌具有萌发快、生长迅速、易培养、生长力强、与菌材共培养时间短等优点；使用中可缩短天麻培养周期，且经济成本较低，能有效增加天麻产量提高经济效益；为昭通乌天麻共生密环菌菌种培育和昭通天麻产业向现代化、专业化、规模化发展奠定基础。

Description

一株蜜环菌YN01（WT）及其应用

技术领域

本发明涉及一株蜜环菌YN01（WT）及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

蜜环菌（Armillaria mellea），隶属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、口蘑科、蜜环菌属，广泛分布于世界各地林区。具有清目、利肺、益肠胃、抗痉挛、镇静、扩张血管、降血压等作用，且子实体、菌丝、菌索均可入药。蜜环菌是一类具有重要经济价值的高等真菌，也是名贵中药材天麻、猪苓的共生菌。蜜环菌对天麻幼苗的形成、营养器官的生长以及营养生长向生殖生长转化都起决定性的作用。

众所周知，昭通天麻享誉国际，上世纪50年代，昭通地区已经开始进行天麻的无性繁殖，现已广泛实行规模化种植，2011年至2014年，昭通全市累计完成天麻种植24.09万亩、产量7455万公斤；但是天麻市场依然供不应求，天麻种植前景广阔；目前市场上销售的天麻共生蜜环菌存在商业种来源不明、分类混乱等问题，这不仅不利于科学合理的开发利用蜜环菌资源，对于天麻的人工栽培也非常不利；昭通天麻共生密环菌在基础研究方面亦是一片空白。

发明内容

本发明目的在于提供一株从云南昭通乌天麻中分离到的蜜环菌（Armillaria mellea）YN01（WT），其已于2016年11年2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是：中国，武汉，武汉大学；保藏编号为CCTCC NO：M 2016611。

本发明通过对筛选分离到的蜜环菌的生理活性进行研究，通过rDND-IGS序列的比对确定其为蜜环菌（Armillaria mellea），该菌株保存培养基为PDA培养基（去皮马铃薯200g煮汁、葡萄糖20g、琼脂15g、水1000mL、pH自然），活化所用的培养基为改良加富PDA培养基（去皮马铃薯400g煮汁、葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、蛋白胨9g、硫酸镁1.5g、琼脂15g、维生素B₂ 0.02g、水1000mL、pH自然）。本发明提供的蜜环菌萌发快，生长迅速，生长力强，与菌材共培养时间短，可缩短天麻生产的周期。

本发明中蜜环菌菌株具有以下微生物学特征：

（1）形态学特征

在PDA液体培养基中培养，形成白色菌丝球，直接0.8-1.5cm，不分泌色素；在PDA固体培养基上培养，菌株分化出表明菌丝和菌索两种形态；新生菌丝极为纤细，色白，菌丝稠密，菌落直径1-3cm，与培养基连接紧密；新生菌索白色，顶端多二分叉，菌索多竖直延伸，在黑暗中可见蓝绿色荧光；适宜培养温度为25℃。

（2）生理生化特征

碳源液体培养基制备：保持培养基中碳含量等量，分别在150mL基础培养基（去皮马铃薯200g煮汁、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、水1000mL、pH自然）中加入常见碳源：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖各20g，制成不同的碳源培养基，每个碳源3次重复；

表1：蜜环菌YN1的碳源利用试验结果

注：表中“+”表示可利用，“-”表示不可利用。

B、蜜环菌的氮源利用情况

氮源液体培养基制备：保持培养基中氮含量等量，分别在150mL基础培养基（去皮马铃薯200g煮汁、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、水1000mL、pH自然）中加入常见氮源：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素、氯化铵、碳酸氢铵各20g，制成不同的氮源培养基， 每个氮源3次重复；

表2：蜜环菌菌株的氮源利用试验结果

注：表中“+”表示可利用，“-”表示不可利用。

（3）分子鉴定

a、提取总DNA：采用CTAB法提取DNA，取0.01g冻干菌丝体，加入2×CTAB提取液500μl，充分研磨；65 ℃水浴1h；加入等体积的氯仿/Tris-饱和酚（1:1）混合液，13000 r/min离心 10 min；取上清于一新离心管中，加等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），13000 r/min离心 10min；取上清，于上清中加入3mol/L醋酸钾80μl,加等体积冰冷的异戊醇，混匀后置于-20℃冰箱中沉淀1h，13000 r/min 离心 10 min；弃上清，收集沉淀；体积浓度75%酒精冲洗，超净台真空干燥；20μl TE 溶解 DNA, -20 ℃保存备用；

b、rDNA-ITS的扩增：以总DNA为模版进行PCR反应，反应采用通用引物ITS1F和ITS4R扩增目的片段，引物序列为ITS1F：5^,-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3^,；ITS4R: 5^,-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3^,，PCR反应体系(25 uL ) : 10× PCR Buffer2.5μL、dNTP (各l0mmol/L) 1.0μL、模板DNA溶液1.0μL、 5U/μL 的Taq酶0. 3 μL、10μmol/L的ITS1F和ITS4R引物各1 uL，加超纯水补足。PCR反应条件:95 ℃，3min；95 ℃，30s；54℃，60s；72℃,2min；35个循环；72℃延伸，10min。PCR产物经1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的DNA片段，用试剂盒（Biomiga；Gel/PCR Extraction Kit DC3511-01）回收目的DNA片段。

c、rDNA-IGS的扩增：以rDNA-ITS序列为模版进行PCR反应，反应采用通用引物5SA和CNL12扩增目的片段；引物序列为5SA：5^,-CAGAGTCCTATGGCCGTGGAT-3，CNL1: 5^,-CTGAACGCCTCTAAGTCAG-3，PCR反应体系(25 uL ) : 10×PCR Buffer 2.5μL、dNTP (各l0mmol/L) 1.0μL、模板DNA溶液1.0μL、 5U/μL的Taq酶0.3μL、10μmol/L的ITS1l和ITS4引物各1μL,加超纯水补足。PCR反应条件:94 ℃，10min；94 ℃，40s；54℃，60s；72℃,2min； 35个循环；72℃延伸，10min。PCR产物经1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的DNA片段，用试剂盒（Biomiga；Gel/PCR Extraction Kit DC3511-01 ）回收目的DNA片段。

d、TA克隆及测序：按Pmd^TM18-T Vector CloningKit试剂盒(TaKaRa)的操作方法将纯化回收的PCR产物连接到18-T载体上，转入感受态细胞DH5α中，活化1 h后涂布于含有抗生素的LB固体培养基中，37℃倒置培养过夜后挑选阳性克隆菌落于含有氨苄的LB液体培养基培养4 h，菌液PCR检测阳性克隆后，进行双向测序；每个菌株测序时设两个重复；

e、序列分析：实验获得rDNA-IGS序列（如SEQ ID NO：1所示），将所得扩增片段进行测序，测序结果在NCBI上进行Blast分析。结果表明，该菌与其他蜜环菌相似度均在99%以下；为构建这株蜜环菌的系统发育树，从NCBI上下载其他蜜环菌菌株的相关序列，其中包括3株产地为贵州的天麻共生蜜环菌（KJ643360、KJ643361、KJ643372）、3株与猪苓共生蜜环菌（KP162279、KP162282、KP162285）、1株产地为云南的天麻共生菌（KC844230）和产地来自欧洲、日本和不丹等地的蜜环菌共13株，构建系统进化树（见图1）。结果表明，该蜜环菌与其他蜜环菌亲缘关系较远，说明多种蜜环菌能与天麻形成共生关系。

本发明另一目的是将上述菌株应用在天麻人工繁殖中。

本发明的有益效果在于：通过对一株昭通乌天麻共生的蜜环菌的生理活性进行研究，用分子生物学方法确定它的分类地位；证明本发明提供的蜜环菌YN01（WT）具有一下优点：萌发快、生长迅速、易培养、生长力强、与菌材共培养时间短等优点；使用中可缩短天麻培养周期，且经济成本较低，能有效增加天麻产量提高经济效益；为昭通乌天麻共生密环菌菌种培育和昭通天麻产业向现代化、专业化、规模化发展奠定基础。

附图说明

图1为本发明实施例中蜜环菌YN01（WT）系统进化树；

图2为本发明实施例中蜜环菌的生长特征；其中A图为生长7d的蜜环菌；B图为生长10d的蜜环菌；

图3为本发明实施例中蜜环菌菌索在固体培养基上的生长速度；

图4为本发明实施例中不同碳源对菌球直径的影响；

图5为本发明实施例中不同碳源对菌球生物量的影响；

图6为本发明实施例中不同氮源对菌球直径的影响；

图7为本发明实施例中不同氮源对菌球生物量的影响；

图8为本发明实施例中木聚糖酶活性变化曲线；

图9为本发明实施例中羧甲基纤维素酶活性变化曲线；

图10为本发明实施例中漆酶活性变化曲线。

具体实施方法

下面通过实施例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例中方法如无特殊说明，按常规操作进行，如无特殊说明使用试剂均为常规购试剂或按常规方法配制的试剂。

实验所需试剂有，PDA培养基、Tris-HCl、NaCl、EDTA、β-巯基乙醇、Tris-饱和酚、氯仿、异丙醇、醋酸钾、乙醇、葡萄糖、酵母膏5g、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾、维生素B₂，以上试剂购买自昆明拓源经贸有限公司；PCR试剂盒（购自TaKaRa公司）、胶回收试剂盒（购自Biomiga公司）。

实施例1：蜜环菌的采集、分离和鉴定

1、从昭通市卜鲁期大寨子乡采集野生乌天麻，冲洗干净，在超净工作台中用体积浓度75%的酒精浸泡灭菌，取天麻尖端与蜜环菌共生部位，接种在含有氨苄的PDA培养基上，18℃黑暗培养；期间将有菌丝萌动的菌索转移到无抗生素的PDA培养基中25℃黑暗培养2周，期间肉眼观察菌丝、新生菌索形态的一致性，若有形态差异，进行二次分离。对所得菌株的菌索进行检测，若在530nm处可发出蓝緑荧光可初步判定该分离菌株为蜜环菌。之后对其进行分子鉴定，采用CTAB法提取DNA，对其进行rDNA-IGS序列扩增，经检测后送测序公司进行序列测序，所获得的序列与NCBI上序列进行Blast比对，其序列与蜜环菌（Armillaria mellea）的同源性达99%，确定其为蜜环菌，将其命名为蜜环菌YN01(WT)。

2、蜜环菌的生理活性

菌种活化：将保存在4℃的菌种接种在PDA平板上进行一次活化，于25℃恒温箱中黑暗培养7d备用；

蜜环菌菌索培养特性的研究：将活化的蜜环菌菌索尖端切取0.5cm，接入培养基中央，重复3次，置于25℃黑暗培养。观察菌丝萌发时间、菌丝颜色、菌索生长时间、菌索颜色、菌索顶端分叉情况；测量菌索生长速度。

观察的结果：在PDA液体培养基中培养时该菌以菌丝球形态生长，菌丝球色白，直径0.8-1.5cm，不分泌色素；在PDA固体培养基上培养时，有菌丝和菌索两种形态；新生菌丝在接种24h后开始萌发，色白，菌丝稠密；培养2-3d后菌索开始形成，新生菌索白色，顶端多二分叉，菌索多竖直延伸，犹如小须根，背光条件下，可见荧光。这种菌索只是在培养基内部生长，后期部分菌索穿出培养基表面（图2）。

将菌索尖端接种在PDA培养基上，可以看到菌索上长出少量菌丝，培养2-3d后菌索开始形成，菌种YN01菌索在固体培养基上的生长速度见图3。在蜜环菌菌索的生长过程中，我们发现该蜜环菌菌索在接种的第3-4d开始生长，6-7d时菌索的生长速度最快，第9d以后生长速度明显减慢图3；说明YN01菌索的生长旺盛期集中在接种后的4至9d。

上述结果证明本发明体改的蜜环菌YN01(WT)在实际生长过程中萌发快，且生长迅速；是一种能快速萌发、生长的蜜环菌菌株。

3、蜜环菌YN01最适碳源、氮源的筛选

一级菌种的制备：于500mL三角瓶中装入200mL去琼脂后的PDA液体培养基，灭菌冷却后备用，将0.5cm的菌索尖端接入液体培养基（每瓶中接入3段菌索），于黑暗25℃，180r/min摇床上振荡培养10d；

碳源液体培养基制备：保持培养基中碳含量等量，分别在基础培养基（去皮马铃薯200g煮汁、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、水1000mL、pH自然。）中加入葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖各20g，制成不同的碳源培养基，150mL液体装入250mL的三角瓶中，每组3次重复。

氮源液体培养基制备：保持培养基中氮含量等量，分别在150mL基础培养基（去皮马铃薯200g煮汁、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、水1000mL、pH自然。）中加入蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素、氯化铵、碳酸氢铵各20g，制成不同的氮源培养基，液体装入250mL的三角瓶中，每组3次重复。

不同碳源、氮源对蜜环菌生长的影响：在上述供试培养基中接入一级液体菌种3mL，于黑暗28℃，150r/min摇床上振荡培养10d。以菌球直径和生物量干重作为指标判断蜜环菌YN01(WT)的最适碳源和氮源。同等培养条件下菌球直径越大，生物量越高说明碳源或氮源对蜜环菌的生长越有利。

当培养基添加不同碳源，果糖为碳源的培养基中蜜环菌菌球的直径最大，其次依次为葡萄糖、麦芽糖、乳糖，直径最小的为生长在以蔗糖为碳源的培养基中的蜜环菌。不同的碳源对蜜环菌的生长具有不同的影响。

同样，上述五种碳源对蜜环菌菌球的生物量也有不同的影响，与碳源对蜜环菌菌球的影响不同，对菌球生物量影响最大的碳源为蔗糖，其余四种碳源对菌球生物量的影响差异不大。由此可知，对该试验所用蜜环菌而言，在实际生产中我们需要的是能得到大量蜜环菌的碳源，所有在液体培养蜜环菌一级菌种时选择蔗糖作为其碳源提供营养是最经济实惠的（见图4、5）。

在不同氮源对蜜环菌菌球直径的影响分析中，尿素对蜜环菌菌球直径的影响远远超过另外四种氮源，在这四种氮源中氯化铵对蜜环菌菌球直径的影响最大，蛋白胨则影响最小。

与此相反，尿素对菌球直径影响最大，但对蜜环菌生物量的影响反而不大，对生物量影响最大的氮源为酵母膏，其次为蛋白胨，影响最小的为碳酸氢铵。综合不同氮源对蜜环菌菌球直径和生物量的影响，选择酵母膏或蛋白胨作为液体种制备的氮源（见图6、7）。

上述实验结果证明本发明提高的蜜环菌对常见的碳源和氮源均可利用，对不同培养基具有很强的适应能力，方便培养；不需要特殊营养即可快速生长，可在实际应用中降低经济成本。

4、蜜环菌YN01木糖酶活性测定

粗酶液的制备：取一级液体菌种转接入含有150mL液体培养基（葡萄糖46g、无水乙醇24g、酵母膏5g、蛋白胨13g、硫酸镁2g、磷酸二氢钾1g、维生素B₁0.01g、维生素B₂0.03g、水1000mL）的容积为250mL的三角瓶。然后180r/min、22℃暗培养至菌丝球长满三角瓶；在菌种摇瓶培养过程中，每天定时吸取发酵液作为粗酶液，连续取样7d，每次取样体积为2mL。

标准曲线的制备：精确称取分析纯木糖200mg，定容至10mL，从中吸取2mL、4mL、6mL、8mL和10mL，分别定容至10mL，吸取不同浓度的木糖溶液0.5mL，加入1mLpH为4.8的柠檬酸缓冲液，3mLDNS液，沸水浴5至10min，然后加入16mL用0.5mL去离子水代替木糖溶液作为空白对照，在波长530nm处测量吸光度（OD值）；以OD值为纵坐标，木糖含量为横坐标绘制标准曲线。

木聚糖酶酶活性测定：往具塞刻度试管中加入1%的木聚糖溶液（用pH4.8，0.05M柠檬酸缓冲液配置）1.5mL，加稀释5倍的粗酶液1mL混匀，50℃水浴准确保温30min，取出后立即加入DNS试剂1.5mL，具塞摇匀后立即煮沸10min，取出，冷却后加入蒸馏水补足25mL，轻轻上下摇匀，用分光光度计测530nm处的OD值。以煮沸灭活的酶液为对照，每组3个重复。

酶活力计算：在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物或是转化底物中1微摩尔相关基团所需的酶量，称为一个国际单位(U)。酶活性以X表示，单位为酶活性单位每升(U/L)。木聚糖酶活性按以下公式计算：

；

式中：m是根据标准曲线方程计算测得0D值对应的木糖的质量，单位为微克；M是木糖的摩尔质量；V_酶是反应添加的酶液体积，单位是升；t是酶反应时间，单位为分钟；n为酶液稀释倍数。

木聚糖酶活性测定结果见图8，在发酵培养第1d后开始分泌，随着培养时间的增加，木聚糖酶活性迅速增加，在第4d达到最大值（36578.41 U/L），随后木聚糖酶活性下降。在发酵过程中木聚糖酶活性是呈先升高后再下降趋势；发酵第6d和第7d终点时酶活性较低，低于第2d的酶活性，整个发酵过程中变化趋势明显；木聚糖在第1d就开始快速分泌，且酶活性达到万量级别证明本发明提供的蜜环菌菌株能快速适应环境，且菌株本身具有极强的生长活性。

5、蜜环菌YN01的羧甲基纤维素酶（CMC酶）活性测定：

粗酶液的制备同木聚糖酶测定中的方法。

标准曲线的制备：精确称取分析纯葡萄糖200mg，定容至10mL，从中吸取2mL、4mL、6mL、8mL和10mL，分别定容至10mL，吸取不同浓度的木糖溶液0.5mL，加入1mLpH为4.8的柠檬酸缓冲液，3mLDNS液，沸水浴5至10min，然后加入16mL用0.5mL去离子水代替葡萄糖溶液作为空白对照，在波长530nm处测量吸光度（OD值）；以OD值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线。

往具塞刻度试管中加入0.5 %的甲基纤维素钠溶液（用pH4.6，0.1M醋酸盐缓冲液配置）1.5mL，加稀释5倍的粗酶液0.5mL混匀，50℃水浴准确保温30min，取出后立即加入DNS试剂1.5mL ，具塞摇匀后立即煮沸10min ，取出，冷却后加入蒸馏水补足20mL，轻轻上下摇匀，用分光光度计测530nm处的OD值。以煮沸灭活的酶液为对照，每组3个重复。

酶活力计算公式同木聚糖酶活力计算公式；其中M为葡萄糖的摩尔质量，结果见图9。

羧甲基纤维素酶的活性也经过了一个先升高后降低的过程，该酶的分泌在第3d达到最大值（3509.72 U/L），之后逐步下降。在第6天停止分泌，其发酵终点时的酶活远低于发酵第1天的酶活；由于蜜环菌为木腐菌，而木材中90%的主要成分为半纤维素、纤维素、木质素，其必须依靠自身分泌的胞外酶来降解半纤维素、纤维素、木质素等来满足自身生长繁殖所需的营养；而羧甲基纤维素酶的测定结果达到千量级别可证明本发明提高的蜜环菌菌株能很好的利用木材中的营养，对菌材有很好的亲和力。

6、蜜环菌YN01的漆酶酶活性测定：

粗酶液的制备同木聚糖酶测定中的方法。

取0.5mmol/L丁香醛连氮100 μl放入2mL离心管，加入酶液50 μl和1. 5mL pH6. 0的0. 1M 酸盐缓冲液混匀，25℃恒温水浴5min后立即冰浴终止反应，用分光光度计测525nm处的OD值；以煮沸灭活的酶液为对照，每组3个重复；

酶活力计算：在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物或是转化底物中1微摩尔相关基团所需的酶量，称为一个国际单位(U)。酶活性以X表示，单位为酶活性单位每升(U/L)；漆酶活性按下式计算：

；

式中： V_酶是反应添加的酶液体积，单位是升；V_总为反应总体积，单位是升；t是酶反应时间，单位为分钟；n为酶液稀释倍数；e是丁香醛连氮的摩尔消光系数 65000L·(mol·cm)^-1；OD为漆酶吸光度。

在发酵7天的发酵液中，漆酶活性在发酵培养过程中先升高再下降，发酵第1d开始分泌，第4d分泌量达到最高（46.25 U/L），之后漆酶的分泌量开始下降（图10）；漆酶刺激蜜环菌菌索的形成和发育，因此漆酶分泌越早、活性越高对蜜环菌生长的促进作用越强。上述测定结果表明本发明提供的漆酶最大活性达到40 U/L以上，高于大多数已公开发表的蜜环菌；证明蜜环菌YN01(WT)具有极强的生长力。

实施例2：蜜环菌菌种拌种栽培实验

（1）一级菌种的制备：于500mL三角瓶中装入200mL去琼脂后的PDA液体培养基，灭菌冷却后备用，将0.5cm的菌索尖端接入液体培养基（每瓶中接入3段菌索），于黑暗25℃，180r/min摇床上振荡培养10d。

（2）栽培种制备：380mL培养瓶中加入直径1-2厘米的树枝作为菌材，并至瓶2/3处，按照淀粉20%、葡萄糖2%的比例配置营养液，将培养液没过菌材制成瓶装液体培养基，pH自然；遵照无菌操作过程将一级液体菌种转接到灭过菌的瓶装液体培养基上，放入室温25℃，黑暗培养30天，即可培育出瓶装液体菌种；生产出的液体菌种可直接用于昭通地区乌天麻的人工拌种栽培。

（3）7-8月份，采用上述菌种、木材、天麻种子和萌发菌（由昭通昌达公司提供）进行袋装拌种栽培；容器为黑色塑料袋，第一层在塑料袋底部铺一层6cm厚的沙石，以便排水透气，第二层将木材斜切出鱼鳞口，之后与上述液体菌种、萌发菌、天麻种子和木屑混合均匀铺盖在沙石层上，第三层再铺一层约10cm厚的沙石。将拌种栽培的塑料袋整齐排列，覆盖一层木屑，加遮阴网，保持湿度在60-80%，黑暗培养20月可培育出天麻。采用上述方法同时与昭通天麻研究所提供蜜环菌菌种拌种栽培，给培养5袋，对比两个菌种拌种栽培的天麻产量，每袋天麻的平均质量对比结果见表3。

表3 不同菌种天麻拌种栽培对比结果

；

袋装拌种栽培结果如表3所示，在袋装栽培20个月后，YN01(WT)拌种栽培得到的天麻产量明显高于昭通天麻所提供的蜜环菌菌株，每袋可增加0.208Kg的天麻产量；且蜜环菌YN01(WT)与菌材供培养只需30d左右，大大缩短了菌材与蜜环菌的共培养时间；证明本发明提供的蜜环菌菌株YN01(WT)可提高昭通乌天麻栽培产量，同时缩短培养时间，是一个昭通乌天麻栽培的优势菌株。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一株蜜环菌YN01（WT）及其应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 862

<212> DNA

<213> Armillaria mellea

<400> 1

gaagagagtg gtgtgcacat tagacttgtg tttaaataga gctttgctcg tgaaccaaat 60

atggtgggct gggttgtctt tgcggaaacg cttgggcgac ttgtctacga attgtaatca 120

taatatgggc ggcggtgaat cctttgcaga cgacttgaat gggaacgggg tactgtaagt 180

ggtagagtag ccttgttgct acgatccact gaggttaagc ccttgttcta aagatttgtt 240

caactttgtt ggactttctc ttttcttttt acatgctgag accttgaggg ccgggatagt 300

atcctttgtg cactcgcgac agcatgttac ttagattcga aagggtaggc taacaacaac 360

gccttagtgt tttgttacct ttctcttttg aatcacgagt tattatgagc cttgaaggct 420

tataaggcac ttagttagca agctctaacc gtgcgctgac ttggaacggt ctttaccttg 480

tacttgatat cgaccttatg gccgatatcc cgtatatggt atagccaaga tccttgaaag 540

ggcgagtcga cgactgattt tctggatcgt tagtgagcct gagggcctgc cctaaggttg 600

ccatgattga aaaggcctta gaagctaagt aagttaagct acggttacct ttttagccgt 660

ttcaaccgtt tgcttagctt tcgagggcta cgttcaaaat ttgaacggca actggttctg 720

aaacgaaagg tttgctaagt aaaccattgg tcaagatcgg tttgcaacaa ttttggtggc 780

tgtagggcga gttttcattg acttggccta tagtgcgagt tggtaacaaa acgcaataaa 840

atgcatactt gtatcacggc cc 862

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cagagtccta tggccgtgga t 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctgaacgcct ctaagtcag 19

Claims (2)

1.一株蜜环菌（Armillaria mellea）YN01（WT），其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号是CCTCC NO：M 2016611。

2.权利要求1所述的蜜环菌在昭通乌天麻人工繁殖中的应用。

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