CN113564184B - 一种天麻谷氨酰胺合成酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种天麻谷氨酰胺合成酶(GS)基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；编码353个氨基酸残基；构建天麻GS基因的原核表达载体，原核表达分析表明本发明天麻谷氨酰胺合成酶基因为可溶性蛋白，其分子量约为59.94kDa；本发明构建了天麻谷氨酰胺合成酶基因的真核过表达载体，通过农杆菌法转染天麻共生菌蜜环菌，获得转天麻谷氨酰胺合成酶基因的蜜环菌，将转GS基因工程蜜环菌在13℃和28℃下培养，长势比野生型蜜环菌好且生长快速，因此本发明天麻谷氨酰胺合成酶基因有助于缩短蜜环菌的培养时间和提高蜜环菌的抗寒性和抗高温生长，本发明为增强天麻的抗冷性，扩大天麻种植分布范围，增强天麻氮代谢能力及提高天麻产量提供实验基础。

Description

一种天麻谷氨酰胺合成酶基因及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学及基因工程相关技术领域，涉及一种天麻中谷氨酰胺合成酶基因以及在提高天麻抗寒性中的应用。

背景技术

天麻(Gastrodia elata)是与蜜环菌共生的异养多年生草本植物，分布于全国大部分地区；其干燥块茎亦称天麻，是一味常用而较名贵的中药，临床多用于头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、癫痫、抽搐、破伤风等症，天麻的经济药用价值都非常高，而且市场需求量大。天麻过去一直依赖野生资源，自从上个世纪70年代野生变人工种植成功后，人工种植天麻成为主要商品来源。天麻种子萌发不同于其他一般植物，不仅需要适宜的环境条件，而且还需要萌发菌为其提供营养物质才能萌发，当天麻种子萌发形成原球茎后，原球茎从共生菌---蜜环菌(Arimillia mellea)中吸取营养，发育形成白麻又称白头麻，总的看来，天麻整个生活周期中所需要的营养，主要是依靠消化侵入其体内的真菌菌丝来取得，然后白头麻换头生长发育形成箭麻。天麻可进行无性繁殖栽培和有性繁殖栽培，天麻无性繁殖常用健壮无病虫害白麻作麻种。影响天麻生长发育的因素有很多，如环境、温度、土壤、采收等，其中温度是影响天麻生长的关键因子；天麻对温度很敏感，当温度过高或过低，都会抑制天麻的生长；天麻生长最适宜温度为20～25℃；在-4℃以下时天麻易受到冻害死亡而丧失繁殖能力，温度在-4～10℃时则天麻停止生长进入低温休眠期；当土温上升至12～14℃时，天麻的地下块茎开始萌动生长；当温度上升至20℃时，天麻进入迅速生长期，但温度超过30℃时天麻的生长会受到抑制，从而影响产量。

蜜环菌是一种以腐生为主的兼寄生真菌，主要寄生于阔叶树的根、茎和叶，分解有机物质如纤维素、半纤维素、木质素的能力强。蜜环菌是促进天麻生长发育的重要菌根真菌，蜜环菌菌株的不同对天麻的产量有较大影响，蜜环菌的索粗壮发达程度、生长情况、生长速度决定天麻产量高低，因此优质蜜环菌是天麻高产的关键。无杂菌污染、生长旺盛、有绿色荧光及蕈香气味的蜜环菌可使天麻高产。蜜环菌对温度也很敏感，蜜环菌在6～8℃时开始生长，生长最适温度为24℃，超过30℃就停止生长。

转录组是特定类型的细胞、组织、器官或发育阶段的细胞群内转录出来的所有RNA的总和，主要包括mRNA和非编码RNA。处于不同生长期不同环境条件下不同组织的基因表达情况是不同的，因此可用转录组的方法挖掘特定生理功能基因。由于植物对低温的耐受性不同，低温胁迫程度不同，植物表现出不同的响应。已有研究表明植物响应低温胁迫下转录组测序得到的差异表达基因主要集中在氨基酸代谢、脂质代谢、糖酵解、植物激素合成与转导、抗氧化系统和次生代谢产物合成等通路。通过转录组分析，可以获得与低温胁迫相关的差异表达基因，为抗寒性基因功能研究提供候选基因，也为进一步研究植物抗寒性分子机制以及抗寒品种选育提供基础。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明以不同温度下生长的昭通乌天麻(Gastrodiaelata)为研究对象，利用转录组数据组装后得到163261356个Clean reads片段，共有59501个Unigene被注释，KEGG信号通路分析发现，在所有途径中，富集基因最多的是碳代谢途径，其次是翻译、脂质代谢和植物激素信号传导；说明代谢途径、次生代谢产物合成、RNA转运、脂质代谢等的差异基因表达与不同温度下天麻的生长发育的作用机制有关。从转录组数据里筛选出与代谢途径相关的关键基因---谷氨酰胺合成酶基因。对差异表达基因谷氨酰胺合成酶基因进行克隆与功能鉴定；获得一种天麻谷氨酰胺合成酶基因，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示，编码如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，本发明天麻谷氨酰胺合成酶基因全长1062bp。

本发明另一目的是将上述天麻谷氨酰胺合成酶基因应用在提高天麻共生菌蜜环菌抗寒性中。

为了实现本发明的上述目的，本发明的技术方案如下：

1、蜜环菌AM02活化(实验室自己分离，保存于实验室冷库中)，具体步骤为①将蜜环菌菌索取出置于PDA平板(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，ddH₂O 1L，pH自然，115℃灭菌20min)上，25℃培养6天；②待PDA培养基上长出白色幼嫩菌索后，将幼嫩菌索边缘的白色菌丝用针头挑于新PDA培养基(马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、ddH₂O 1L、pH5.5，115℃灭菌20min)培养，此步可重复；③至从中央向外缘长出白色菌丝后，挑取边缘的菌丝于液体完全培养基(葡萄糖46g、酵母膏5g、蛋白胨13g、硫酸镁2g、磷酸二氢钾1g、ddH₂O 1L，pH 6.5，115℃灭菌20min)中25℃、150rpm下避光培养10d，长出菌球备用；

蜜环菌菌材的制备，步骤具体如下：①选质地坚硬、耐腐蚀的阔叶树进行蜜环菌菌材的培养；②将选用的苹果树锯成小段，放清水中浸泡一夜，清洗干净后置于培养瓶中，121℃下灭菌20min，灭菌3次以上，以防止木材中的杂菌污染蜜环菌；③将蜜环菌用FRH-2A破碎机(金坛市白塔新宝仪器厂产)破碎后倒入灭好菌的木材中，待蜜环菌缠于木材上长出菌索后，说明菌材制备成功备用；

2、本发明从云南昭通采集新鲜白头麻(连土一起采回，短暂存于4℃冷库)，将从昭通采集回来的置于4℃冷库的第二年生的天麻(白头麻)从土壤里挖出来，用流水清洗天麻块茎表面的泥土残渍，将块茎放75％乙醇中处理3min，无菌水冲去残留的乙醇，再置于2.5％NaClO溶液中浸泡10min，无菌水冲去残留的NaClO溶液，用超纯水洗干净并置于灭菌水中洗2-3次，将洗净的白头麻表面水分吸干后，接种于蜜环菌菌材上；分别在4℃冷库、13℃恒温箱(箭麻生长的临界温度)和23℃培养室(正常生长温度)黑暗培养条件下培养，然后蜜环菌菌索开始侵染昭通乌天麻，给白头麻(母麻)提供营养，使其发育形成箭麻(商品麻)，第6d观察得到23℃下箭麻开始生长，第40d观察到13℃下箭麻开始生长，第50d观察4℃下天麻不发芽；天麻培养至50d时采集不同温度下生长的天麻样品；将13℃母麻、23℃商品麻和23℃母麻送公司进行转录组测序，从转录组中筛选log2(变化倍数)>2的差异表达基因GS基因；因此取13℃下培养的母麻，采用Trizol Reagent(Invitrogen)法提取天麻的总RNA，RNA反转录获得cDNA，以cDNA为模板，采用巢式PCR引物，进行两次巢式PCR，获得500bp以内的未知片段，胶回收后连接到pMD-18T载体上，转入大肠杆菌DH5α中，测序；将测序结果与靠近已知序列的3’端的引物比对上，再看引物之后的几个碱基是否成功比对，成功比对就说明未知片段比对成功，比对成功后，已知的最后一个碱基开始拼接得一条以ATG开始的片段，用DNAMAN输入拼接得到的序列，查找终止密码子，获得以ATG开始，以TAG终止的一段cDNA全长为1062bp；

2、构建GS基因原核表达载体

将pMD-18T-GS和pET-32a质粒进行酶切，跑胶检测，将pMD-18T-GS质粒酶切的目的条带胶回收，将pET-32a质粒酶切的载体胶回收；原核表达载体连接，取2μLpET-32a-GS质粒用热击法转化感受态细胞BL21(DE3)，挑单菌落于100μg/mL Amp抗性50mL LB液体培养基中，37℃、200r/min摇床过夜培养；取2μL菌液做PCR检测扩增目的条带是否正确，扩增得到目的GS条带说明，转化BL21大肠杆菌成功；将测序成功的pMD-18T-GS质粒和pET-32a空载质粒进行双酶切，pMD-18T-GS质粒切出两条序列，其中一条序列为1062bp(图1A)，与GS扩增片段大小吻合；pET-32a空载质粒切出一条序列(图1B)；将GS片段和pET-32a空目的载体胶回收后，连接转化DH5α，提质粒酶切检测(图1C)，pET-32a-GS质粒切出两条序列，其中一条序列为1062bp，质粒测序结果比对与GS全长序列相似率为100％，说明pET-32a-GS载体构建成功。取2μL pET-32a-GS质粒转入BL21后菌液PCR得到一条1062bp大小的条带(图1D)，表明pET-32a-GS原核表达载体构建成功；

将转化BL21成功的菌液用IPTG诱导蛋白表达，加入1mmol/L IPTG分别置于28℃、37℃摇床进行诱导表达；分别取不加IPTG(对照)和加IPTG诱导表达至0h、2h、4h、6h、8h菌液，进行SDS-PAGE(12％分离胶和4％浓缩胶)分析，跑蛋白胶后，用考马斯亮蓝G-250染色液染色，用脱色液脱色1h，脱色后观察重组蛋白GS表达水平，以确定其最佳诱导表达温度及时间；

可溶性蛋白检测：将上一步验证得到的诱导最适时间对应的菌液，也就是加入1mmol/L的IPTG诱导剂28℃和37℃诱导6h的菌液，离心弃上清，然后向沉淀中加入沉淀等体积的冰上预冷的1×PBS缓冲液，重悬菌体；再用超声破碎机破碎BL21细胞(冰上操作)10min，4℃、12000rpm离心2min，将上清移至新离心管中，沉淀用8mol/L尿素溶解；最后在不加IPTG的上清、沉淀，加IPTG 28℃上清、28℃沉淀，加IPTG 37℃上清、37℃沉淀分别点样跑蛋白胶，观察重组蛋白GS表达水平，以确定其在沉淀还是上清中表达，来判断蛋白的可溶性；GS重组蛋白的纯化：应用亲和层析法纯化带组氨酸标签的GS重组蛋白，跑蛋白胶，观察重组蛋白GS大小，以确定其是否纯化出GS重组蛋白；

根据蛋白大小公式计算，GS基因蛋白大小为38.94KDa，而pET-32a原核表达载体含的His(组氨酸标签)蛋白大小约为21KDa，所以pET-32a-GS蛋白大小约为59.94KDa；当诱导剂IPTG含量为1mmol/L，诱导温度为37℃，诱导时间为8h时蛋白诱导表达效果最佳(图2)。可溶性蛋白检测。加入1mmol/L的IPTG诱导剂37℃和28℃诱导8h，上清和沉淀用SDS-PAGE凝胶电泳分析(图3)，由图可知当诱导剂IPTG含量为1mmol/L，诱导温度为37℃，诱导时间为8h时，上清诱导表达蛋白量多于沉淀诱导表达蛋白量，上清多为可溶性蛋白，沉淀多为包涵体；说明pET-32a-GS重组蛋白大部分在上清中表达，GS原核表达蛋白为可溶性蛋白；应用亲和层析法纯化带His标签的GS原核表达重组蛋白；向OD₆₀₀＝0.6-0.8的600mL的菌液中加入1mmol/L的IPTG，37℃摇床诱导培养8h，破碎，离心，取上清过His标签的层析柱进行蛋白纯化，梯度洗脱纯化的重组蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳染色脱色观察(图4)，经过去除杂蛋白和梯度洗脱后，加入100％的洗涤缓冲液B洗脱得到的洗脱液59.94KDa，基本为纯蛋白，说明GS原核表达重组蛋白纯化成功。

3、将天麻谷氨酰胺合成酶基因的cDNA片段连接至植物过量表达载pH2GW7中，该载体含有增强型启动子，可在受体植物中过量表达目的基因；利用根癌农杆菌介导法，将目的基因转入到受体蜜环菌中，利用PDA培养基培养的方法获得过量表达该基因的转基因型蜜环菌，并通过进一步实验验证该基因是否具有提高蜜环菌抗寒能力的特性；结果表明过量表达该基因的蜜环菌相对于野生型蜜环菌具有更强的抗寒特性。

本发明的优点和技术效果：

本发明所提供的基因应用了转基因的方法，改变逆境下蜜环菌关键基因的表达，有助于缩短蜜环菌的培养时间，提高工程菌抗低温胁迫作用，同时该发明为扩大天麻种植范围、提高栽培天麻的产量和质量、天麻抗寒性、提高天麻氮代谢研究及抗寒天麻的育种提供理论基础。

附图说明

图1为pMD-18T-GS(a)、pET-32a空载(b)和pET-32a-GS(c)质粒双酶切及BL21菌液PCR(d)检测电泳图，A图中M：DL15000 bp DNA Marker，1：pMD-18T空载质粒，2-6：pMD-18T-GS质粒双酶切；B图中M：DL5000 bp DNA Marker，1-2：pET-32a空载质粒双酶切；C图中M：DL5000bp DNA Marker，1-4：pET-32a-GS质粒双酶切检测；D图中M：DL5000 bp DNA Marker，1-6：pET-32a-GS转入BL21菌液PCR产物检测；

图2为37℃下不同时间诱导GS原核蛋白表达结果，其中M为120KDa蛋白Marker(Blue Plus@II Protein Marker)，1：没加IPTG，2-6：分别加1mol/L的IPTG诱导0、2、4、6、8h；

图3为GS原核表达蛋白的可溶性分析结果，其中M：120KDa蛋白Marker(Blue Plus@II Protein Marker)，1：不加IPTG沉淀，2：不加IPTG上清；3：37℃8h沉淀，4：37℃8h上清；5：28℃8h沉淀，6：28℃8h诱导上清；

图4是GS基因重组蛋白的纯化结果，其中M：120KDa蛋白Marker(Blue Plus@IIProtein Marker)，1：GS原核表达全菌裂解液，2：杂蛋白，3：流穿液，4：洗脱液1，5：洗脱液2，6：洗脱液3，7：洗脱液4，8：洗脱液5；

图5为从不同温度天麻转录组数据中筛选的差异表达基因GS的未知片段扩增电泳图(A)和GS未知片段菌液PCR(B)检测电泳图，A图中M：DL5000 bp DNA Marker，1-6：GS基因未知片段扩增PCR产物(500bp)检测；B图中M：DL5000 bp DNA Marker，1-4：GS基因未知片段菌液PCR产物(500bp)检测，5：水作空白对照；

图6为GS基因的全长扩增(A)及pMD-18T-GS菌液(B)PCR检测电泳图；A图中M：DL5000bp DNA Marker，1-10：GS基因全长扩增PCR产物(1062bp)检测，11：水作空白对照；B图中M：DL5000bp DNA Marker，1-6：pMD-18T-GS菌液PCR产物(1062bp)检测，7：水作空白对照；

图7为pMD-18T-GS(A)和pENTR2B-GS(B)质粒双酶切检测电泳图；A图中M：DL15000bp DNA Marker，1：pMD-18T空载质粒，2-6：pMD-18T-GS质粒双酶切；B图中M：DL15000bp DNA Marker，1-2：pENTR2B-GS质粒双酶切检测；

图8为pH2GW7.0-35S-GS载体构建检测(A)和双酶切检测(B)电泳图；A图中M：DL5000bp DNA Marker，1、3、5：pH2GW7.0-35S-GS菌液PCR检测阳性，2、4、6：PCR假阳性；B图中M：DL5000bp DNA Marker，1-4：pH2GW7.0-35S-GS质粒双酶切检测；

图9为过表达载体pH2GW7.0-35S-GS转化农杆菌PCR检测电泳图；其中M：DL5000bpDNA Marker，1-6：pH2GW7.0-35S-GS转化农杆菌PCR产物(1062bp)检测，7：水作空白对照；

图10为13℃培养的GS基因过表达转基因蜜环菌的鉴定图，A图为过表达pH2GW7.0-35S-GS农杆菌转染蜜环菌后在Hyg抗性培养30d长出的转基因工程蜜环菌；B图为13℃培养的过表达pH2GW7.0-35S-GS相对表达量分析，其中WT-AM02：野生型；

pH2GW7.0-35S-GS：过表达GS基因)；C图为培养10d的野生型2号蜜环菌菌索(WT-AM02)；D图为培养10d的过表达GS转基因工程蜜环菌菌索；

图11为28℃培养的GS基因过表达转基因蜜环菌的鉴定图，其中A图为培养5d的野生型蜜环菌菌索(WT-AM02)；B图为培养5d的过表达GS转基因工程蜜环菌菌索。

具体实施方式

下面通过实例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例中方法如无特殊说明，按常规操作进行，如无特殊说明使用试剂均为常规购试剂或按常规方法配制的试剂，如无特殊说明方法中百分数均为质量百分数。

实施例1：本发明天麻谷氨酰胺合成酶(GS)基因的获取

选取13℃下培养的母麻为实验材料，采用Trizol Reagent(Invitrogen)法提取天麻的总RNA，具体是用研钵将0.15g 13℃母麻样品研磨成粉末，加入1mL的TRIzoL提取液在研钵中继续研磨至液体透明，室温静置5min后移入离心管，再加入0.2mL氯仿，振荡混匀，4℃、12000rpm离心15min，转移上清液至新管，重复加入200μL氯仿一次取上清，加入与上清液等体积的异丙醇200μL和柠檬酸钠高盐溶液200μL(用于去除天麻中的多糖)，混匀-20℃静置30min，4℃、12000rpm离心30min，弃上清，沉淀用75％乙醇1mL清洗3次，4℃、7500rpm离心5min，弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20μl稀释1000倍的焦碳酸二乙酯(DEPC)溶解RNA，放-80℃保存备用。

用Prime script RT reagengt Rit with gDNA Eraser试剂盒反转总RNA形成cDNA，具体步骤如下：(1)基因组DNA去除，8μL RNase free ddH₂O、4μL 4×gDNA wiperMIX、1μLOligo(dT)23VN(50μM)、1μL Random hexamers(50ng/μL)和2μL总RNA混匀，42℃加热2min；(2)配制第一链cDNA合成体系，在步骤(1)中加入2μL 10×RT MIX和2μL HiscriptII Enzyme Mix混匀，50℃下加热15min后，85℃加热2min，得反应产物cDNA，置于-20℃或-80℃备用。

从转录组数据中筛选得到的GS基因的CDS是只有5’端的碱基序列，而3’端部分碱基未知，通过DNAMAN和Primer Premier5软件设计GS基因的巢式PCR引物(GS-F1：5’-ATTGGAGCGGACAAATCGTT-3’；GS-F2：5’-ATGCCTGGTCAGTGGGAAT-3’；UN36：5’-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)和全长扩增的引物(GS-F：5’-ggtaccATGTCGCTCCTCACAGATC-3’；GS-R：5’-gatatc CTAAAGAATAGTGGCCTCAG-3’)，全长扩增添加了酶切位点序列，以便构载体时进行双酶切。GS基因序列上游为Kpn I核苷酸内切酶(酶切位点序列为ggtacc)，下游为EcoRV核苷酸内切酶(酶切位点序列为gatatc)；引物由昆明硕擎公司进行合成。

进行两次巢式PCR，第一次巢式PCR：(1)扩增体系：0.7μL上游引物(GS-F1)和0.7μL下游通用引物(UN36)，2μL天麻的cDNA模板，10μL的2×Es Taq Master Mix，6.6μLddH₂O。(2)反应条件：预变性94℃3min；(变性94℃40s，退火53℃30s，延伸72℃2min)30个循环；再延伸72℃10min。第二次巢式PCR：(1)扩增体系：0.7μL上游引物(GS-F2)和0.7μL下游通用引物(UN36)，2μL第一次巢式PCR产物稀释10倍的DNA模板，10μL的2×Es Taq Master Mix，6.6μL ddH₂O。(2)反应条件：退火60℃30s。

将第二次巢式PCR的反应产物进行跑胶检测，将检测到的目的未知片段进行胶回收，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工购买)进行胶回收，具体步骤如下：①切下目的基因凝胶称量，加入凝胶重量4倍的Buffer B2，50℃加热至完全融化；②移入吸附柱8000g30s，弃收集管液体，可重复此操作；③加入500μL Wash Solution 9000g离心30s，弃收集管液体，重复一次此操作，将空吸附柱9000g离心1min；④加入30μL提前60℃预热的Elution Buffer，室温静置1-2min后9000g离心1min；⑤将回收的目的未知片段DNA跑胶检测DNA回收情况，结果见图5A，GS基因未知片段的电泳图，可知未知片段在500bp以内，且6个重复条带一样大；

使用PMD-18T Vector kit(TakaRa公司购买)进行TA克隆，反应体系如下：PMD-18T载体1μL，Solution I 5μL，目的未知片段DNA 4μL，混匀后置于16℃反应4h或过夜；

采用热击法转化感受态细胞DH5α大肠杆菌(购买于上海擎科生物有限公司)，具体步骤如下：将10μL TA克隆的反应体系，转入到不完全融化的100μL感受态细胞DH5α中，混匀，置于冰上30min，42℃加热45s，再置于冰上3min，加入890μL无抗生素LB液体培养基，于37℃、180r/min培养1h后，5000rpm离心2min，将沉淀涂于添加100μg/mL Amp抗生素的LB固体培养基中，37℃培养12h，挑单菌落于10mL相同抗性液体LB培养基中，摇床培养至OD600＝0.6。用GS-F2、UN36引物进行PCR检测，结果见图5B，条带也是在500bp左右；所以初步判定GS基因的3’端序列，在500bp以内；未知片段菌液PCR阳性克隆送上海擎科生物有限公司进行测序，将获得的测序结果与引物序列(GS-F2、UN36)进行比对，并将比对成功的序列与GS基因已知的片段序列进行拼接，使用DNAMAN软件查找终止密码子，得到GS基因全长CDS序列(1062bp)，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码353个氨基酸残基；

用天麻cDNA作为模板，GS-F和GS-R作为引物，PCR扩增GS基因全长序列，PCR扩增全长具体步骤为：(1)扩增体系：0.5μL上游引物(GS-F)、0.5μL下游引物(GS-R)、1μL天麻的cDNA模板、10μL的2×Es Taq Master Mix、8μL ddH₂O。(2)反应条件：预变性94℃3min，(变性94℃40s，退火58℃30s，延伸72℃2min)32个循环，再延伸72℃10min。PCR产物跑胶，将目的片段进行胶回收(参照上述方法)结果见图6A得到一条约1000bp左右的序列，进行TA克隆(参照上述方法)，pMD-18T-GS菌液PCR得到也一条1000bp左右的序列(图6B)，筛选阳性克隆进行双向测序，通过DNAMAN比对，提取质粒送测得到的测序结果与拼接好的序列相似率为99％，只有483位的T碱基突变为C碱基，ATT密码子同义突变为ATC密码子，都编码亮氨酸；说明pMD-18T-GS连接成功。

实施例2：GS基因真核表达载体的构建

采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工)提取的pMD-18T-GS质粒和pENTRTM-2B质粒分别进行EcoR V和Kpn I双酶切(20μL体系)，反应体系和操作过程为：取2μL pMD-18T-GS或pENTRTM-2B质粒、依次加入2μL 10×K buffer、0.5μL Kpn I、0.5μL EcoRV、15μL ddH₂O，混匀后置于37℃反应3h；分别进行胶回收。

将回收的GS目的基因片段和pENTRTM-2B载体片段进行连接，转化DH5α感受态细胞，涂于含100μg/mL Kan抗性的LB固体上37℃培养12h，挑取单菌落于20mL相同抗性LB液体培养基中37℃培养12h，提取质粒双酶切检验，送测比对是否连接上入门载体。

将检测正确的入门克隆载体pENTRTM-2B-GS与目的Getway载体pH2GW7.0进行LR反应，采用Gateway LR Clonase TM II Enzyme Mix试剂盒，具体步骤如下：①配制体系：6μL入门载体pENTRTM-2B-GS质粒，3μL目的载体pH2GW7.0质粒，1μL从-80℃取出漩涡震荡2次后的LR Clonase TM II Enzyme Mix，混匀；②LR反应：将体系置于25℃反应4h或过夜后，在体系中加入1μL Proteinase K，37℃反应10min终止LR反应。转化DH5α，涂布于50μg/mL Spe抗性的LB固体上37℃培养12h，挑取单菌落于相同抗性的LB液体培养基中37℃摇床培养12h，提取pH7WG2.0-35s-GS质粒、双酶切检测，送质粒检测，对比过表达pH7WG2.0-35s-GS载体是否构建成功。

将构建成功的过表达载体质粒pH2GW7.0-35S-GS用电击法转化入农杆菌PMP90中，通过电转化法将pH7WG2.0-35s-GS转入农杆菌感受态pMP90中。具体步骤如下：①将电转杯用75％酒精洗净，无菌下风干，-20℃预冷2min；②取2μLpH7WG2.0-35s-GS质粒于pMP90农杆菌感受态细胞中，混匀加入到预冷的电转杯中；③将电转杯放置电转化槽中进行电转化；④电击后，立即取出电转杯，将菌液加入到900μL的无抗性LB液体培养基中，28℃孵育4h，7500rpm离心2min，菌体涂于100μg/mL Spe抗性的LB固体平板上28℃培养24～48h，挑取单菌落于相同抗性的LB液体培养基中28℃培养24～48h，PCR鉴定单克隆农杆菌菌株。

结果构建过表达载体的入门载体pENTR2B-GS。pMD-18T-GS质粒酶切检验(图7A)切开得到目的条带大小为1062bp的条带后送测，用正确pMD-18T-GS质粒和pENTR2B空载质粒进行双酶切后将目的基因片段和入门载体片段胶回收，用Solution I将其连接，构成pENTR2B-GS入门载体，经过kpnⅠ和EcoR V双酶切检验(图7B)正确后送测序，比对成功后；说明入门载体pENTR2B-GS构建成功。将构建成功的Gateway入门载体pENTR2B-GS使用GatewayLR Clonase TMⅡEnzyme Mix试剂盒，进行LR反应，转化DH5α菌液PCR(图8A)和双酶切检测(图8B)构建情况，阳性质粒送测，得到过表达载体pH2GW7.0-35S-GS。过表达载体pH2GW7.0-35S-GS转化农杆菌菌液PCR检测转化情况(图9)，阳性质粒送测，表明pH2GW7.0-35S-GS农杆菌转化成功，可用后续于转化蜜环菌菌丝。

实施例3：过表达GS真核载体转化蜜环菌AM02

农杆菌转染蜜环菌AM02形成基因工程蜜环菌：①将阳性克隆农杆菌在30mL 100μg/mL Spe抗性培养基中进行扩培至OD600＝1.0左右，4℃、3000rpm离心10min，将沉淀重悬于5mL含150μmol/L乙酰丁香酮(AS)的诱导培养基中，28℃摇床培养至OD600＝1.2。②将蜜环菌菌球用超声匀浆机破碎混匀，避光4℃静置培养3h。③将诱导农杆菌按1:1的比例加入到避光菌丝体中混匀，25℃共培养10h，离心去培养基，使用含400μg/mL cef(头孢噻肟钠)抗生素无菌纯净水洗涤多次后，涂布于含100μg/mL Spe抗性的PDA固体培养基上，25℃避光培养至蜜环菌长出。

GS基因工程蜜环菌验证：挑取转基因蜜环菌于含100μg/mL Spe抗性的PDA培养基中培养，采用Trizol Reagent(Invitrogen)法提取pH2GW7.0-35S-GS密环菌菌索RNA和野生型实验室分离的2号蜜环菌(WT-AM02)菌索的RNA；用Prime script RT reagengt Rit withgDNA Eraser试剂盒反转总RNA形成cDNA；使用Primer Premier 5.0软件设计引物：GS基因引物(F-GCTATTGGAGCGGACAAATCGT；R-CCACTGACCAGGCATCACTTCT)和内参基因β-actin(F-GGGGATGAAGCACAGTCCAA；R-GCCGTGGTTGTGAAGGAGTA)，做Q-PCR检验，用2-ΔΔCt方法计算基因表达水平。用Q-PCR方法对每个样品的至少两个独立的生物复制和三个技术复制进行了分析，以确重复性和可靠性。

将构建的过表达载体pH2GW7.0-35S-GS通过电转法转化农杆菌，25℃下在诱导培养基中与野生型蜜环菌AM02共培养后，将蜜环菌菌丝体用水和加Cef抗生素的水清洗至液体清澈，涂于含Hyg抗性的PDA固体培养基上生长至1个月筛选阳性克隆转基因蜜环菌，发现长出(图10A)的蜜环菌菌落，将其挑于新的相同抗性PDA上继续培养，实验表明在Hyg抗性PDA上正常生长，说明GS转化蜜环菌成功。

将转GS基因工程蜜环菌和野生型蜜环菌AM02分别制备成菌索后，取同样大小的菌索在PDA培养基于13℃和28℃下培养，10d后13℃过表达pH2GW7.0-35S-GS蜜环菌菌索(图10D)长势比野生型AM02(图10C)长势好且快速；28℃下培养5d，过表达pH2GW7.0-35S-GS蜜环菌菌索(图11B)长势也比野生型AM02(图11A)长势更好，说明转入GS基因的蜜环菌有更好的抗低温和高温逆境胁迫作用；还通过Q-PCR分析发现13℃培养的pH2GW7.0-35S-GS密环菌菌索中GS基因相对表达量高于野生型AM02(图10B)，说明GS转基因工程蜜环菌转化成功，GS基因有助于缩短蜜环菌的培养时间和提高蜜环菌的抗寒性，进一步有助于缩短天麻生产的周期。

 序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一种天麻谷氨酰胺合成酶基因及其应用

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1062

<212> DNA

<213> 昭通乌天麻（Gastrodia elata）

<400> 1

atgtcgctcc tcacagatct catcagtctc gacatctcag gtatcacgga gaagattatt 60

gccgagtata tatggatcgg aggatctggt ctggacttga ggagtaaagc aaggactctt 120

ccagggccgg tgaatgatcc caaccagctt cctaaatgga attacgacgg atcgagcact 180

ggccaagctt ccggtgatga cagtgaagtg attctctacc ctcaagctat ctttaaagat 240

cctttcagga ggggaaacaa cattcttgtc atgtgcgact gctacacacc ggctggagag 300

ccgatcccga ccaacaaaag atgcagtgcc gctaaaattt ttaaccatcc tgatgtatcc 360

attgaagaac cttggtatgg cattgagcag gaatacaccc tccttcaaaa aagtgtccga 420

tggcccattg gctggccagt gggtggcttt cctggtcctc agggtccata ttattgtgct 480

attggagcgg acaaatcgtt tggtagtgag attgttgatg cacattacaa agcttgcctt 540

tatgctggaa ttcacatcag tggaatcaat ggagaagtga tgcctggtca gtgggaattt 600

caagtcggtc cagccgccgg catctctgcc agcgatcagc tgtgggtggc tcgttacatt 660

cttgagagga tcactgagat tgctggagtg gttctttcat ttgatccaaa gcctatcaag 720

ggggattgga atggagctgg tgcccacact aactatagca ctaaatccat gaggggaaat 780

ggagggtttg aggagataaa gaaggccatt gagaagctta gccacaagca tgtggaccac 840

atcctgtcct acggcgaggg caatgaacgg cgcctcaccg gggggcacga aaccgccagt 900

atcaaaaatt tcacttgggg tgtcgcgaat cgcggagcgt cggttcgtgt cggtcgtgat 960

actgcggaga acggaaaagg ttatttcgaa gataggaggc ctgcttccaa tatggatccc 1020

tatctcgtga catctttaat tgctgaggcc actattcttt ag                    1062

<210> 2

<211> 353

<212> PRT

<213> 昭通乌天麻（Gastrodia elata）

<400> 2

Met Ser Leu Leu Thr Asp Leu Ile Ser Leu Asp Ile Ser Gly Ile Thr Glu Lys Ile Ile

1                                                       15

Ala Glu Tyr Ile Trp Ile Gly Gly Ser Gly Leu Asp Leu Arg Ser Lys Ala Arg Thr Leu

                25                                      35

Pro Gly Pro Val Asn Asp Pro Asn Gln Leu Pro Lys Trp Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr

                                    50

Gly Gln Ala Ser Gly Asp Asp Ser Glu Val Ile Leu Tyr Pro Gln Ala Ile Phe Lys Asp

                65                                      75

Pro Phe Arg Arg Gly Asn Asn Ile Leu Val Met Cys Asp Cys Tyr Thr Pro Ala Gly Glu

                                    90

Pro Ile Pro Thr Asn Lys Arg Cys Ser Ala Ala Lys Ile Phe Asn His Pro Asp Val Ser

                105                                     115

Ile Glu Glu Pro Trp Tyr Gly Ile Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Leu Gln Lys Ser Val Arg

                                    130

Trp Pro Ile Gly Trp Pro Val Gly Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro Tyr Tyr Cys Ala

                145                                     155

Ile Gly Ala Asp Lys Ser Phe Gly Ser Glu Ile Val Asp Ala His Tyr Lys Ala Cys Leu

                                    170

Tyr Ala Gly Ile His Ile Ser Gly Ile Asn Gly Glu Val Met Pro Gly Gln Trp Glu Phe

                185                                     195

Gln Val Gly Pro Ala Ala Gly Ile Ser Ala Ser Asp Gln Leu Trp Val Ala Arg Tyr Ile

                                     210

Leu Glu Arg Ile Thr Glu Ile Ala Gly Val Val Leu Ser Phe Asp Pro Lys Pro Ile Lys

                225                                     235

Gly Asp Trp Asn Gly Ala Gly Ala His Thr Asn Tyr Ser Thr Lys Ser Met Arg Gly Asn

                                    250

Gly Gly Phe Glu Glu Ile Lys Lys Ala Ile Glu Lys Leu Ser His Lys His Val Asp His

                265                                     275

Ile Leu Ser Tyr Gly Glu Gly Asn Glu Arg Arg Leu Thr Gly Gly His Glu Thr Ala Ser

                                    290

Ile Lys Asn Phe Thr Trp Gly Val Ala Asn Arg Gly Ala Ser Val Arg Val Gly Arg Asp

                305                                      315

Thr Ala Glu Asn Gly Lys Gly Tyr Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ala Ser Asn Met Asp Pro

                                    330

Tyr Leu Val Thr Ser Leu Ile Ala Glu Ala Thr Ile Leu

                                    350

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial）

<400> 3

attggagcgg acaaatcgtt      20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial）

<400> 4

atgcctggtc agtgggaat               19

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial）

<400> 5

gactcgagtc gacatcgatt tttttttttt tttttt            36

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial）

<400> 6

ggtaccatgt cgctcctcac agatc     25

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial）

<400> 7

gatatcctaa agaatagtgg cctcag           26

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial）

<400> 8

gctattggag cggacaaatc gt             22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial）

<400> 9

ccactgacca ggcatcactt ct        22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial）

<400> 10

ggggatgaag cacagtccaa        20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial）

<400> 11

gccgtggttg tgaaggagta    20

Claims (2)

1.一种天麻谷氨酰胺合成酶基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的天麻谷氨酰胺合成酶基因在提高天麻共生菌蜜环菌（Armillariella mellea）抗寒性中的应用。

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