CN116144697A

CN116144697A - GhKV3WRKY29基因及其蛋白在提高植物抗大丽轮枝菌黄萎病中的应用

Info

Publication number: CN116144697A
Application number: CN202211080541.0A
Authority: CN
Inventors: 简桂良; 卢美光; 任玉红; 贺浪
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-09-05
Filing date: 2022-09-05
Publication date: 2023-05-23

Abstract

本发明公开了GhKV3WRKY29基因及其蛋白在提高植物抗大丽轮枝菌黄萎病中的应用，属于基因工程领域。GhKV3WRKY29基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明通过从高抗黄萎病棉花品种中植棉KV3叶片中克隆获得抗黄萎病基因GhKV3WRKY29，通过VIGS沉默该基因，使陆地棉品种的抗大丽轮枝菌黄萎病的能力丧失，超表达则提高了拟南芥抗大丽轮枝菌黄萎病的性能。因此，GhKV3WRKY29基因可以作为遗传改良感黄萎病优质高产农作物品种提供抗病候选基因。

Description

GhKV3WRKY29基因及其蛋白在提高植物抗大丽轮枝菌黄萎病中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及GhKV3WRKY29基因及其蛋白在提高植物抗大丽轮枝菌黄萎病中的应用。

背景技术

棉花是世界上重要的纤维作物和油料作物，在中国31个省份中就有过24个省种植棉花，其中有近3亿人参与其生产，30％的总播种面积用于棉花种植。其中，黄萎病(Verticillium wilt)在生产上对棉花产量和纤维品质危害严重，由于黄萎病菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)危害棉花的维管束，导致化学药剂很难防治，现如今最有效的防治方法是培育和种植抗病品种。在过去的研究中，陆地棉抗黄萎病的相关基因研究进展缓慢，且抗黄萎病的主效基因还未见报道。由于黄萎病菌的易变性，导致过去培育的抗病品种抗病性丧失，不能持久，美国、澳大利亚等国家先后培育出Acala、Sicala 1等一系列抗病品种，但这些品种在我国只能达到耐病水平，Kawchuk从番茄中已经克隆出了抗黄萎病基因Ve，但发现其只能介导对大丽轮枝菌1号小种的抗性，其抗性具有特异性。目前，大多数研究都致力于发掘抗病基因。

WRKY转录因子(WRKY transcription factors)是一种植物特异性转录因子，具有防御损伤及防止病原菌入侵的作用，它是植物中所特有的。在其N端，WRKY家族蛋白有一个能和DNA结合的结构域，C末端既含有锌指结构，又含有高度保守的WRKY结构域，以根据WRKY结构域的数量和锌指结构的特征对WRKY蛋白进行分类，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组。其中，Ⅰ组为C2H2型(C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H)，Ⅱ组与Ⅰ组相同，Ⅲ组为C2HC型(C-X7-C-X23-H-X1-C)。在过去的研究中都发现，WRKY转录因子是一个庞大的家族，在水稻中鉴定出102个WRKY基因，它具有防御信号转递以及防止病菌入侵的作用。WRKY转录因子在寄主防御上可正向和负向调节，过去的绝大多数研究都集中于WRK基因参与的正向抗病反应，Wang等发现在拟南芥中AtWRKY53和AtWRKY70正向调节系统获得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)；Deslandes等发现，AtWRKY52包括核苷酸结合-富含Leu的重复类型R基因产物的结构特征和WRKY结构域，该结构域对青枯病(Ralstonia solanacearum)具有广泛的抗性；Yang等发现WRKY 1、WRKY 3和WRKY 5等11个WRKY基因在马铃薯对晚疫病菌侵染的抵抗反应中具有积极的调节作用；但是，二十一世纪以来，许多研究者开始转向WRKY-TF对病原菌侵染的负调节作用，Grunewald等发现WRKY23转录因子在线虫摄食位点建立的早期阶段表达，敲除WRKY23可降低胞囊线虫(Heterodera schachtii)的侵入；水稻OsWRKY76和OsWRKY45-1基因过表达植物表现出更高的敏感性，OsWRKY45-1的敲除植物，表现出对水稻白叶枯病(Xanthomonasoryzae)的增强抗性；胡椒的CaWRKY58基因，定位于细胞核，感染青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)的辣椒植株中，过度表达CaWRKY58的烟草植株，表现出比野生型植物更严重的病害症状。通过病毒诱导基因沉默(VIGS)沉默的CaWRKY58辣椒植株对强毒青枯病菌菌株FJC100301表现出增强的抗性，表明CaWRKY58在辣椒对青枯病菌侵染的抗性中充当负调节因子的转录激活剂。随着对WRKY转录因子超家族的深入研究，越来越多的WRKY基因被证明在多种植物中参与抗病反应。最近的一项研究表明，陆地棉中的一个Ⅲ族WRKY转录因子GhWRKY70至少通过两种方式负调控大丽轮枝菌的侵染。而如何筛选更多的能够差异表达WRKY转录因子，以为培育抗棉花黄萎病品种提供候选基因，以及为改善现有棉花抗黄萎病不佳的状况具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供GhKV3WRKY29基因及其蛋白在提高植物抗大丽轮枝菌黄萎病中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，过表达该基因可以提高陆地棉抗黄萎病能力，沉默该基因降低了陆地棉抗黄萎病能力。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供GhKV3WRKY29基因在提高或者降低植物抗大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae K.)黄萎病中的应用。

优选的是，过表达所述植物的所述GhKV3WRKY29基因，提高所述植物对黄萎病的抗性；沉默所述植物的所述GhKV3WRKY29基因，降低所述植物对黄萎病的抗性。

优选的是，所述GhKV3WRKY29基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供所述GhKV3WRKY29基因编码的蛋白在提高或者降低植物抗黄萎病中的应用。

优选的是，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

优选的是，所述出发植物包括大丽轮枝菌寄主植物。更优选的为，所述植物包括拟南芥和陆地棉。

本发明还提供一种获取对黄萎病抗性改变的转基因植物的方法，通过将GhKV3WRKY29基因导入出发植物中过表达，得到对黄萎病抗性提高的转基因植物；或者通过沉默出发植物中GhKV3WRKY29基因降低该基因的表达，得到对黄萎病抗性降低的转基因植物。

优选的是，所述GhKV3WRKY29基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的是，所述出发植物包括拟南芥和陆地棉。

优选的是，所述黄萎病为由大丽轮枝菌引起的黄萎病。

本发明公开了以下技术效果：

本发明根据陆地棉转录组测序结果，筛选得到的一个差异表达的GhKV3WRKY29基因，其表达模式为上调表达，通过对该基因的克隆分析，以及应用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术对该基因进行功能验证，证实了该基因在陆地棉抗黄萎病方面的作用。因此，该基因可为培育棉花等农作物抗黄萎病品种提供候选基因。

本发明还通过从棉花叶片中克隆获得陆地棉抗黄萎病的GhKV3WRKY29基因，并通过实验过表达和沉默该基因评价了对黄萎病抗性的影响性，结果证实，过表达该基因具有提高抵抗黄萎病性的能力，沉默则可以降低高抗病棉花品种的抗黄萎病性。这为GhKV3WRKY29应用到陆地棉和其他农作物的抗病育种提供了科学依据，可以将该基因利用分子生物学技术转入感病高产优质的农作物品种，提高其抵抗大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)黄萎病性能，培育抗病高产优质的农作物品种。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例3中不同处理的陆地棉抗病性差异比较图。A：为野生型高抗黄萎病陆地棉品种中植棉KV3接菌强致病力黄萎病菌(大丽轮枝菌)菌系V991；B：为转化空载体pCLCrV(A+B)的高抗黄萎病陆地棉品种中植棉KV3接菌强致病力黄萎病菌(大丽轮枝菌)菌系V991；C：为沉默GhKV3WRKY29基因高抗黄萎病陆地棉品种中植棉KV3接菌强致病力黄萎病菌(大丽轮枝菌)菌系V991；

图2为实施例4超表达GhKV3WRKY29拟南芥接菌强致病力黄萎病菌(大丽轮枝菌)菌系V991黄萎病发生情况比较；A：野生型拟南芥接菌V991；B：转空载体PZP111-eGFP拟南芥接菌V991；C：GhKV3WRKY29超表达拟南芥接菌V991；D：GhKV3WRKY29超表达拟南芥接菌V991。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1克隆陆地棉大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)黄萎病基因GhKV3WRKY29

1、RNA的提取

使用RNAprep Pure植物多酚多糖总RNA提取试剂盒，分别提取棉花品种中植棉KV3叶片样品RNA。

2、cDNA的合成

2.1中间片段cDNA的合成

中间片段cDNA的合成使用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒反转录cDNA。

2.2 3’端的cDNA的合成

3’端的cDNA的合成体系如下表1所示。

表1 3’端的cDNA的合成体系

试剂	用量
		RNase Inhibitor(200U/μl)	0.25μL
3’RACE Adaptor(5mM)	1μL
		dNTP mixture(10mM each)	1μL
5×PrimeScript Buffer	2μL
		cDNA	3.5μL
ddH₂O	2μL
		总RNA	0.25μL
PrimeScript RTase(200U/ml)	10μL
		总量	20μL

按上述体系混匀，离心后，置PCR仪上42℃60min，70℃15min，反应结束后冰上冷却，置于-20℃保存。

2.3 5’端的cDNA的合成

5’RACE的cDNA的合成体系如下：

第一步，合成体系如表2所示。

表2第一步合成体系

试剂	用量
		DTT(100mM)	0.5μL
5×First-Strand Buffer	4.0μL
		dNTP(20mM)	1.0μL
总量	5.5μL

混匀，短暂离心后置于冰上。

第二步，合成体系如表3所示。

表3第二步合成体系

试剂	用量
		总RNA	2μL
5’-CDS Primer A	1μL
		Sterile H₂O	8μL
总量	11μL

充分混匀后，将这11μl产物放置在PCR仪中，设置反应的程序：72℃3min→42℃2min。结束后，冷却1min后备用。

第三步，合成体系如表4所示。

表4第三步合成体系

混匀，短暂离心。

第四步，合成体系如表5所示。

表5第四步合成体系

试剂	用量
		Mix from Step 2	11μL
SMARTerⅡA Oligonucleotide	1μL
		Mix from Step 3	8μL
总量	20μL

用移液枪轻轻吸打混匀，短暂离心。置于PCR仪中，设置程序：42℃90min→70℃10min。用适量Tricine-EDTA Buffer稀释反应所得cDNA后，-20℃保存。

3、引物设计

RACE引物(如表6所示)均由primer 5.0设计而成，GSP、UPM引物试剂盒自带，设计的引物送往生工合成。

表6 RACE引物

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4、GhKV3WRKY29全长克隆

4.1目的基因中间片段克隆

根据已知的cDNA片段，设计中间片段引物，按照下述表7的体系混匀进行PCR扩增。

表7混合体系

试剂	用量
		10×LA PCR buffer	2.5μL
dNTP	2.5μL
		GhKV3WRKY29-F(10μM)	1μL
GhKV3WRKY29-R(10μM)	1μL
		cDNA	1μL
LA Taq酶	0.25μL
		ddH₂O	16.75μL
总量	25μL

PCR程序：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃保存。琼脂凝胶电泳分析扩增产物。

4.2目的基因3’末端克隆

3’RACE采用巢式PCR法扩增。

3’RACE的第一轮PCR扩增体系，如表8所示。

表8第一轮PCR扩增体系

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按上述体系混匀，短暂离心后，进行PCR扩增。

PCR程序：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，20个循环；72℃10min；4℃保存。琼脂凝胶电泳分析扩增产物。之后把第一轮PCR扩增产物稀释50倍，进行第二轮PCR扩增。

3’RACE的第二轮PCR扩增体系，如表9所示。

表9第二轮PCR扩增体系

试剂	用量
		Outer PCR Production	2μL
dNTP mixture(2.5mM each)	8μL
		GSP inner	2μL
3’IGhKV3WRKY29	2μL
		10×LA PCR bufferⅡ(Mg²⁺plus)	4μL
LA Taq(5U/μL)	0.25μL
		ddH₂O	31.75μL
总量	50μL

按上述体系混匀，短暂离心后，进行PCR扩增。

PCR程序：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。琼脂凝胶电泳分析扩增产物，之后胶回收、连接和转化，挑取阳性克隆送生工测序。

4.3目的基因5’末端克隆

用适量Tricine-EDTA Buffer稀释反应所得5’RACE cDNA后，进行5’RACE的PCR扩增，PCR体系如下：

第一轮：

表10第一轮PCR体系

轻轻混匀，短暂离心后，置于冰上。

第二轮：

表11第二轮PCR体系

Mix from Step 1	41.5μL
		5’RACE cDNA	2.5μL
10×UPM	5.0μL
		5’OGhKV3WRKY29	1μL
总量	50μL

按照上述程序配好体系后，轻轻混匀，短暂离心，按照以下程序进行PCR的扩增。

PCR程序：

表12 PCR程序

反应结束后，进行凝胶琼脂糖电泳分析，观察条带情况，若出现弥散条带或者无条带，进行以下操作：

(1)本次模板为此前PCR扩增产物50倍稀释产物(Tricine-EDTA buffer)；

(2)引物采用UPMS和5’IGhX各1μl，采用上述中的PCR体系，并设置反应程序为：94℃3s，65℃30s，72℃1min，20个循环；4℃保存。

反应结束后，进行凝胶琼脂糖电泳分析，之后胶回收、连接和转化，挑取阳性克隆送生工测序。

4.4 GhKV3WRKY29全长克隆

将中间片段、3’RACE片段和5’RACE片段通过DNAman拼接，设计GhKV3WRKY29全长引物qGhKV3WRKY29-F、qGhKV3WRKY29-R(表13)，进行全长PCR扩增。选取5’合成的cDNA，用Tricine-EDTA Buffer稀释5倍作为模板。

反应体系：

表13反应体系

试剂	用量
		10×Pyrobest buffer	2.5μL
Pyrobest DNA polymerase	1μL
		dNTP	2μL
cDNA	2μL
		qGhKV3WRKY29-F	1μL
qGhKV3WRKY29-R	1μL
		ddH₂O	15.5μL
总量	25.0μL

PCR程序：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min；4℃保存。琼脂凝胶电泳分析扩增产物，进行胶回收，加A尾，体系如下：

表14胶回收体系

试剂	用量
		PCR Buffer	2.5μL
rTaq	0.25μL
		切胶产物	20μL
dd H₂O	1μL
		dNTP(2.5mM)	1.25μL
总量	25.0μL

反应条件：72℃30min

将全长PCR反应液连接到T1 simple载体上，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆送生工测序。

经测定，GhKV3WRKY29基因全长1366bp(如下SEQ ID NO:1)，在430-523bp和640-715bp处各有一个内含子，ORF 837bp，3’UTR 86bp，5’UTR 272bp，编码279个氨基酸。

SEQ ID NO:1为：

注：加粗带下划线标记的碱基为起始密码子和终止密码子，灰色标记为ORF。

实施例2GhKV3WRKY29蛋白的生物信息分析

通过在线工具ProtParam的预测，蛋白的分子量为36.82626kDa，等电点为9.80，分子式C₁₆₀₆H₂₅₆₄N₄₇₈O₄₇₂S₂₂；不稳定指数为56.41，属于不稳定蛋白；总平均亲水性-0.653，属于亲水性蛋白；组成蛋白的20种氨基酸，丝氨酸(Ser)所占比例最高(13.8％)，含23个带负电荷的氨基酸残基，以及47个带正电荷的氨基酸残基，序列如SEQ ID NO:2所示。

SEQ ID NO:2为：

MENWDLQAVVGRNSSNDHPIANPEFSFGPWSFQQDEDFMSFPEIFETNPKVLDELEQLYKPFYPDLNPFSTQTIITSSIPVPLHVDEPAEKRKKRPSFTVSQSDISASPNPRRFSRKNQQNRVVEHVTADDLPSDVWAWRKYGQKPIKGSPFPRSYYRCSSSKGCLARKQVERSCSDPRVFIITYTAEHCHGHPTRRSSLAGSTRSKPLTAAKSIEAHAKGETVKQERMKMEVELHGEEEGGKILSPDLLLSDDELIRRLEDFDEGFFVDQFPHFSREM。

应用SignalP 4.0预测该蛋白无信号肽；TMHMM Server v.2.0预测该蛋白无跨膜螺旋区；CDD预测蛋白具有锌指结构域和WRKY结构域。

通过多序列比对及应用MEGA软件，采用BoostStrap设为1000构建GhKV3WRKY29的系统发育树，表明GhKV3WRKY29与木本棉(Gossypium arboreum)、雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)蛋白相似度最高，亲缘关系最近；与可可(Theobroma cacao)、哥伦比亚锦葵(Herrania umbratica)、榴莲(Durio zibethinus)构成了进化树的一支。

用MEGA5.0中的最大似然法构建了系统发育树。表明GhKV3WRKY29属于Ⅱd组WRKY成员，含有一个WRKY结构域和C2H2模式(CX(4-5)CX(22-23)HXH)的锌指结构，有一个核定位信号KRRK。

实施例3沉默高抗黄萎病陆地棉品种中植棉KV3的GhKV3WRKY29基因，使其对强致病力黄萎病菌(大丽轮枝菌)菌系V991的抗病性丧失

1、试验方法

根据引物VIGS-GhKV3WRKY29-F、VIGS-GhKV3WRKY29-R克隆并回收目的片段，与VIGS沉默载体pCLCrVA载体同时用SpeⅠ和PacⅠ双酶切，回收之后用T4连接酶连接并转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR和双酶切验证后，将鉴定正确的GhKV3WRKY29沉默载体转化农杆菌EHA105，经菌落PCR鉴定后，转化成功的农杆菌菌液加入甘油在-80℃条件下保存。

表15 VIGS引物

待棉花中植棉KV3的棉苗子叶展开时，取含有VIGS沉默载体的EHA105菌株，28℃培养至对数生长期，6000×g离心5min，收集菌体，再用乙酰丁香酮溶液(10mmol/L2-吗啉乙磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid,MES)，200μmol/L乙酰丁香酮(acetosyringone,As)，10mmol/L MgCl₂)重悬菌体，并调整菌液浓度至OD₆₀₀＝1.0左右，将它们分别与含pCLCrVB的菌株1:1混合，室温静止放置3h后用于棉花接种。同时，混合含pCLCrVA和pCLCrVB的EHA105菌株，作为空载体对照。取1支1mL的一次性注射器，吸取菌液，在子叶背部注射接种。接种后的棉株置于培养箱中，昼夜温度分别为25℃、20℃，光照16h、黑暗8h条件下培养。17d后采集叶片，提取总RNA，利用荧光定量PCR技术，检测基因表达量，生物学重复3次。

采用蘸根法接种大丽轮枝菌V991(孢子浓度10⁷孢子/mL)，接菌6天后，调查植株真叶的发病情况，并计算病情指数(Disease index，DI)。病情指数＝[∑(各级病株数×相应病级)/调查总株数×最高病级(4)]×100。

2、结果

通过qRT-PCR技术检测目的基因的表达量，结果显示，与接种空载体pCLCRV(A+B)的棉株相比，沉默GhKV3WRKY29植株的目的基因的表达量显著降低(p<0.05)，沉默效率约为53％，表明VIGS技术成功沉默了该基因。

在含营养土蛭石培养花盆中生长的野生型和转基因植株根系均能良好生长。在棉花苗生长20天后，用落叶型强致病力病菌V991孢子悬浮液(浓度10⁷个/mL)，采用蘸根法接种病菌，接种5天、10天、15天调查黄萎病发病情况。

如图1所示结果表明：沉默GhKV3WRKY29基因显著降低了植株抗病性，从而使中植棉KV3黄萎病抗性丧失。

发病率和病情指数见下表，把抗病品种中植棉KV3的GhKV3WRKY29沉默，黄萎病病情指数达到42.98±2.61，极显著高于空载的病情指数12.59±1.25和野生型的病情指数11.15±1.22。表中大写字母代表1％水平的显著差异(见表16)。

表16不同处理组黄萎病病情指数比较

可见，将基因GhKV3WRKY29采用VIGS沉默后，在黄萎病菌胁迫下，高抗黄萎病品种的抗病性丧失了；而野生型抗黄萎病品种和转空载体的抗黄萎病棉花品种在黄萎病菌胁迫下，仍然表现出良好的抗病性。证实了GhKV3WRKY29基因具有提高棉花品种抗黄萎病性的能力，沉默GhKV3WRKY29基因则可以降低抗病棉花品种的抗黄萎病的抗性。

实施例4大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)胁迫下超表达GhKV3WRKY29的拟南芥黄萎病抗性检测

1、实验材料

以转GhKV3WRKY29基因拟南芥第二代拟南芥和野生型拟南芥为实验材料(获取方法见本实验室张华崇硕士论文“VIGS技术解析陆地棉抗黄萎病相关基因即GHB2功能初步鉴定”，中国农业科学院研究生院，2016；以及任玉红硕士论文“棉花黄萎病防治技术及两个抗病相关基因功能研究”，中国农业科学院研究生院，2018)。

2、栽培基质

培养基：1/2MS培养基；1/2MS+50mg/L卡那霉素培养基；

栽培基质：蛭石+1/4MS营养液。

3、试验设计和抗病性测定

野生型拟南芥在1/2MS培养基中培养，转基因拟南芥在1/2MS+50mg/L卡那霉素培养基中培养，待幼苗长到2-3片真叶后移栽至营养钵，移栽7天后进行大丽轮枝菌胁迫处理；超表达植株采用灌根法接种黄萎病菌V991。

共设置3个处理条件：

1)对照(CK)：野生型Col-0型拟南芥和转化空载体分别接种V991后，分别作为阳性和阴性对照；

2)超表达GhKV3WRKY29拟南芥黄萎病抗性检测植株(即第二代纯合后代)。采用灌根法接种黄萎病菌(大丽轮枝菌)V991(孢子悬浮液的浓度10⁷个/mL)。接菌15天后进行拍照观察、发病率测定。

4、结果

野生型Col-0型拟南芥和转化空载体和接种V991发病率和病情指数差异不明显，但超表达GhKV3WRKY29拟南芥植株黄萎病发病率和病情指数极显著低于野生型Col-0型拟南芥和转化空载体，见下表17和图2(表中大写字母代表1％水平的显著差异)。

表17不同处理组黄萎病病情指数比较

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)胁迫下，转化GhKV3WRKY29基因发病极显著低于野生型。过表达GhKV3WRKY29的植株发病率和病情指数极显著低于野生型，这意味着GhKV3WRKY29基因在植株响应大丽轮枝菌环境中起到了重要作用。说明GhKV3WRKY29基因具有提高植物抗黄萎病的能力，在功能上证明了GhKV3WRKY29在陆地棉抗黄萎病性能上起到重要作用，见图2。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.GhKV3WRKY29基因在提高植物抗大丽轮枝菌(Verticillium dahliae K.)黄萎病中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，过表达所述植物的所述GhKV3WRKY29基因，提高所述植物对黄萎病的抗性；沉默所述植物的所述GhKV3WRKY29基因，降低所述植物对黄萎病的抗性。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述GhKV3WRKY29基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

4.权利要求1-3任一项中所述GhKV3WRKY29基因编码的蛋白在提高或者降低植物抗黄萎病中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

6.如权利要求1或权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥和陆地棉。

7.一种获取对黄萎病抗性改变的转基因植物的方法，其特征在于，通过将GhKV3WRKY29基因导入出发植物中过表达，得到对黄萎病抗性提高的转基因植物；或者通过沉默出发植物中GhKV3WRKY29基因，降低该基因的表达，得到对黄萎病抗性降低的转基因植物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述GhKV3WRKY29基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述出发植物包括大丽轮枝菌寄主植物。

10.如权利要求7所述方法，其特征在于，所述黄萎病为由大丽轮枝菌引起的黄萎病。