CN116426541B - 防治作物黄萎病的靶标基因区段、dsRNA及纳米农药组合物 - Google Patents
防治作物黄萎病的靶标基因区段、dsRNA及纳米农药组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116426541B CN116426541B CN202310663568.0A CN202310663568A CN116426541B CN 116426541 B CN116426541 B CN 116426541B CN 202310663568 A CN202310663568 A CN 202310663568A CN 116426541 B CN116426541 B CN 116426541B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dsrna
- target gene
- gene segment
- cotton
- pesticide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 title claims abstract description 77
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 63
- 241000082085 Verticillium <Phyllachorales> Species 0.000 title claims abstract description 41
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 title claims abstract description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 title claims abstract description 17
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims abstract description 73
- 241001123668 Verticillium dahliae Species 0.000 claims abstract description 22
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims abstract description 12
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 claims description 71
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 19
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 claims description 14
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 claims description 14
- GOFJDXZZHFNFLV-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-1,3-dimethyl-N-[2-(4-methylpentan-2-yl)phenyl]pyrazole-4-carboxamide Chemical compound CC(C)CC(C)C1=CC=CC=C1NC(=O)C1=C(F)N(C)N=C1C GOFJDXZZHFNFLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000005815 Penflufen Substances 0.000 claims description 9
- ZOJBYZNEUISWFT-UHFFFAOYSA-N allyl isothiocyanate Chemical compound C=CCN=C=S ZOJBYZNEUISWFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 7
- 239000005730 Azoxystrobin Substances 0.000 claims description 6
- WFDXOXNFNRHQEC-GHRIWEEISA-N azoxystrobin Chemical compound CO\C=C(\C(=O)OC)C1=CC=CC=C1OC1=CC(OC=2C(=CC=CC=2)C#N)=NC=N1 WFDXOXNFNRHQEC-GHRIWEEISA-N 0.000 claims description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000005781 Fludioxonil Substances 0.000 claims description 4
- 239000005842 Thiophanate-methyl Substances 0.000 claims description 4
- 235000016720 allyl isothiocyanate Nutrition 0.000 claims description 4
- MUJOIMFVNIBMKC-UHFFFAOYSA-N fludioxonil Chemical compound C=12OC(F)(F)OC2=CC=CC=1C1=CNC=C1C#N MUJOIMFVNIBMKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QGHREAKMXXNCOA-UHFFFAOYSA-N thiophanate-methyl Chemical compound COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC QGHREAKMXXNCOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 claims description 3
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 claims description 3
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 3
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 3
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 claims description 2
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000241235 Citrullus lanatus Species 0.000 claims description 2
- 235000012828 Citrullus lanatus var citroides Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 claims description 2
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 claims description 2
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 2
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 claims description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 44
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 43
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 23
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 abstract description 13
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 abstract description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract description 8
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 6
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 abstract description 5
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 abstract description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 16
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 11
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 5
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 5
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 4
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 4
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 4
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 4
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 4
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- TUSDEZXZIZRFGC-UHFFFAOYSA-N 1-O-galloyl-3,6-(R)-HHDP-beta-D-glucose Natural products OC1C(O2)COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC1C(O)C2OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 TUSDEZXZIZRFGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005660 Abamectin Substances 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241001131798 Escherichia coli HT115 Species 0.000 description 2
- 239000001263 FEMA 3042 Substances 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100034217 Non-secretory ribonuclease Human genes 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- LRBQNJMCXXYXIU-PPKXGCFTSA-N Penta-digallate-beta-D-glucose Natural products OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC=2C(=C(O)C=C(C=2)C(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)O2)OC(=O)C=2C=C(OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)C(O)=C(O)C=2)O)=C1 LRBQNJMCXXYXIU-PPKXGCFTSA-N 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100247669 Quaranfil virus (isolate QrfV/Tick/Afghanistan/EG_T_377/1968) PB1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150025928 Segment-1 gene Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101100242902 Thogoto virus (isolate SiAr 126) Segment 1 gene Proteins 0.000 description 2
- QXAITBQSYVNQDR-ZIOPAAQOSA-N amitraz Chemical compound C=1C=C(C)C=C(C)C=1/N=C/N(C)\C=N\C1=CC=C(C)C=C1C QXAITBQSYVNQDR-ZIOPAAQOSA-N 0.000 description 2
- 229960002587 amitraz Drugs 0.000 description 2
- RRZXIRBKKLTSOM-XPNPUAGNSA-N avermectin B1a Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@]11O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C2)[C@@H](C)\C=C\C=C/2[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\2)O)C[C@H]4C1 RRZXIRBKKLTSOM-XPNPUAGNSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000853 biopesticidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 101710160359 mRNA 3'-end-processing protein yth1 Proteins 0.000 description 2
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000447 pesticide residue Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108010066527 ribonuclease U Proteins 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 229920002258 tannic acid Polymers 0.000 description 2
- LRBQNJMCXXYXIU-NRMVVENXSA-N tannic acid Chemical compound OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC=2C(=C(O)C=C(C=2)C(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)O2)OC(=O)C=2C=C(OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)C(O)=C(O)C=2)O)=C1 LRBQNJMCXXYXIU-NRMVVENXSA-N 0.000 description 2
- 229940033123 tannic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000015523 tannic acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- PZBPKYOVPCNPJY-UHFFFAOYSA-N 1-[2-(allyloxy)-2-(2,4-dichlorophenyl)ethyl]imidazole Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1C(OCC=C)CN1C=NC=C1 PZBPKYOVPCNPJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical group C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SATHPVQTSSUFFW-UHFFFAOYSA-N 4-[6-[(3,5-dihydroxy-4-methoxyoxan-2-yl)oxymethyl]-3,5-dihydroxy-4-methoxyoxan-2-yl]oxy-2-(hydroxymethyl)-6-methyloxane-3,5-diol Chemical compound OC1C(OC)C(O)COC1OCC1C(O)C(OC)C(O)C(OC2C(C(CO)OC(C)C2O)O)O1 SATHPVQTSSUFFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 229920000189 Arabinogalactan Polymers 0.000 description 1
- 239000001904 Arabinogalactan Substances 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 240000008574 Capsicum frutescens Species 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000004378 Glycyrrhizin Substances 0.000 description 1
- 241000241602 Gossypianthus Species 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 239000005795 Imazalil Substances 0.000 description 1
- 108091023242 Internal transcribed spacer Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000005820 Prochloraz Substances 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 101150094563 YTH1 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 235000019312 arabinogalactan Nutrition 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000001390 capsicum minimum Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 238000002247 constant time method Methods 0.000 description 1
- 239000008358 core component Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000004495 emulsifiable concentrate Substances 0.000 description 1
- 229960002125 enilconazole Drugs 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 244000000004 fungal plant pathogen Species 0.000 description 1
- LPLVUJXQOOQHMX-UHFFFAOYSA-N glycyrrhetinic acid glycoside Natural products C1CC(C2C(C3(CCC4(C)CCC(C)(CC4C3=CC2=O)C(O)=O)C)(C)CC2)(C)C2C(C)(C)C1OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O LPLVUJXQOOQHMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004949 glycyrrhizic acid Drugs 0.000 description 1
- UYRUBYNTXSDKQT-UHFFFAOYSA-N glycyrrhizic acid Natural products CC1(C)C(CCC2(C)C1CCC3(C)C2C(=O)C=C4C5CC(C)(CCC5(C)CCC34C)C(=O)O)OC6OC(C(O)C(O)C6OC7OC(O)C(O)C(O)C7C(=O)O)C(=O)O UYRUBYNTXSDKQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019410 glycyrrhizin Nutrition 0.000 description 1
- LPLVUJXQOOQHMX-QWBHMCJMSA-N glycyrrhizinic acid Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]1O[C@@H]1C([C@H]2[C@]([C@@H]3[C@@]([C@@]4(CC[C@@]5(C)CC[C@@](C)(C[C@H]5C4=CC3=O)C(O)=O)C)(C)CC2)(C)CC1)(C)C)C(O)=O)[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LPLVUJXQOOQHMX-QWBHMCJMSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- SXADIBFZNXBEGI-UHFFFAOYSA-N phosphoramidous acid Chemical compound NP(O)O SXADIBFZNXBEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008659 phytopathology Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- TVLSRXXIMLFWEO-UHFFFAOYSA-N prochloraz Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N(CCC)CCOC1=C(Cl)C=C(Cl)C=C1Cl TVLSRXXIMLFWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000004563 wettable powder Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01C—PLANTING; SOWING; FERTILISING
- A01C1/00—Apparatus, or methods of use thereof, for testing or treating seed, roots, or the like, prior to sowing or planting
- A01C1/06—Coating or dressing seed
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
- A01G13/00—Protecting plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
- A01G7/00—Botany in general
- A01G7/06—Treatment of growing trees or plants, e.g. for preventing decay of wood, for tingeing flowers or wood, for prolonging the life of plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
- A01N25/08—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests containing solids as carriers or diluents
- A01N25/10—Macromolecular compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
- A01N43/34—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- A01N43/36—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom five-membered rings
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
- A01N43/48—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
- A01N43/54—1,3-Diazines; Hydrogenated 1,3-diazines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
- A01N43/48—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
- A01N43/56—1,2-Diazoles; Hydrogenated 1,2-diazoles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N47/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid
- A01N47/08—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having one or more single bonds to nitrogen atoms
- A01N47/28—Ureas or thioureas containing the groups >N—CO—N< or >N—CS—N<
- A01N47/34—Ureas or thioureas containing the groups >N—CO—N< or >N—CS—N< containing the groups, e.g. biuret; Thio analogues thereof; Urea-aldehyde condensation products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N47/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid
- A01N47/40—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having a double or triple bond to nitrogen, e.g. cyanates, cyanamides
- A01N47/46—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having a double or triple bond to nitrogen, e.g. cyanates, cyanamides containing —N=C=S groups
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/60—Isolated nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
- A01P3/00—Fungicides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Ecology (AREA)
- Forests & Forestry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Botany (AREA)
- Soil Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
本发明公开了防治作物黄萎病的靶标基因区段、dsRNA及纳米农药组合物。所述靶标基因区段是大丽轮枝菌VdYTH1基因的靶标基因区段，选自SEQ ID.No.1、SEQ ID.No.2或SEQ ID.No.3所述的任何一种核苷酸序列；本发明还公开了由所述靶标基因区段转录得到的dsRNA；dsRNA与V991共孵育接种棉花的病情指数统计以及真菌生物量和基因沉默效率检测表明，所述靶标基因区段转录的dsRNA有效降低了大丽轮枝菌对棉花的致病力。本发明进一步公开了由dsRNA、纳米载体和农药组成的复合纳米农药组合物，防效测定结果显示，该复合纳米农药组合物对于作物黄萎病具有良好的防治效果。
Description
技术领域
本发明涉及防治植物病害的靶标基因区段、dsRNA及其与纳米农药复配的组合物，尤其涉及防治作物黄萎病的靶标区段，采用该靶标基因区段制备的dsRNA以及该dsRNA与纳米农药复配得到的防治作物黄萎病的纳米农药组合物，属于防治作物黄萎病的RNA生物农药领域。
背景技术
黄萎病（Verticillium wilt）是一种毁灭性的植物维管束病害，主要由植物病原真菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）从植物根部侵染进入维管组织引起，在植物的整个生育期内均可能发生，严重时可导致植物死亡。大丽轮枝菌的寄主植物非常广泛，目前已经发现其可侵染超过400种双子叶植物，包括一年生草本植物、多年生草本植物和木本植物，多种具有重要经济价值的作物如棉花、番茄、马铃薯、辣椒、向日葵等都受到了大丽轮枝菌的威胁（KLOSTERMAN S J, ATALLAH Z K, VALLAD G E, et al. Diversity,pathogenicity, and managementofVerticilliumspecies [J]. Annual Review ofPhytopathology, 2009,47(1): 39-62.），其中棉花受大丽轮枝菌的影响尤为严重。
作为世界上主要的天然纤维作物，棉花是纺织业纤维最重要的来源之一，占人类使用纤维总量的一半（HAGENBUCHER S, OLSON D M, RUBERSON J R, et al. Resistancemechanisms against arthropodherbivores in cotton and their interactions withnatural enemies [J]. CriticalReviews in Plant Sciences, 2013, 32(6): 458-482.）。由大丽轮枝菌引起的黄萎病属于土传病害，因此对该病的控制非常困难，目前还没有较好效果的防治药剂，因而棉花黄萎病被称作棉花的“癌症”（ZHANG G, ZHAO Z, MA P,et al. Integrative transcriptomic and gene co-expressionnetwork analysis ofhost responses uponVerticillium dahliaeinfection inGossypium hirsutum[J].Scientific Reports, 2021, 11(1): 20586-20598.）。
RNA生物农药是利用RNA干扰（RNA interference，RNAi）原理，通过抑制生物体重要功能基因的表达，造成有害生物发育停滞或死亡，进而达到病虫害防控的目的。该技术不会改变有害生物的基因组，也不会对生态系统造成不良影响。RNA生物农药具有精准、高效、绿色无污染等优势，是目前最有可能应用于病虫害防控的新技术之一。由于RNAi对靶标基因沉默的特异性和高效性，可作为一种便捷手段开展病虫害防治及农药新靶标的筛选与鉴定。目前，RNAi技术已被广泛研究并应用于现代农业领域。根据与病原菌侵染寄主毒力相关的基因Chs3b，Ave1、Sge1和NLP1，致病效应蛋白SvrPm3a1/f1，利用这些靶标基因构建的dsRNA瞬转植株或稳转植株，均能够在一定程度上抵御多种真菌病害（Zhao, J. H. and H.S. Guo (2022). RNA silencing: From discovery and elucidation toapplicationand perspectives. Journal of Integrative Plant Biology 64(2): 476-498.）。尽管许多研究表明RNA生物农药具有很强的应用前景，但其稳定性严重制约了其商业用途。作为RNAi的核心成分，双链RNA（dsRNA）在天然状态下极其不稳定，在土壤和水环境中单独存在的dsRNA在48小时内完全降解，核酸酶、雨水、紫外线和微生物等环境因素均会直接影响dsRNA的稳定性（Rank AP, Koch A. Lab-to-Field Transition of RNASprayApplications - How Far Are We.Front Plant Sci. 2021 Oct 15;12:755203.）。因此，如何保证dsRNA的稳定性是实现RNA生物农药商业化使用的最大挑战之一。
目前，中国农药目前多以乳油、可湿性粉剂等剂型为主，存在大量使用有机溶剂、粉尘漂移、水分散性差、有效利用率低、生物活性不高、农药残留与环境污染严重等问题（王安琪, 王琰, 王春鑫等. 农药纳米微囊化剂型研究进展. 中国农业科技导报, 2018, 20(2): 10-18.）。纳米粒子（1-100 nm）可快速包裹药物分子，改变农药的理化性质，提高农药的水溶性和分散性，充分发挥活性成分的生物活性，杜绝有害溶剂并最大程度减少助剂用量，克服农药残留污染（PetersRJB, Bouwmeester H, Gottardo S, et al.Nanomaterials for products and application in agriculture, feed and food.Trends in Food Science andTechnology, 2016, 54: 155-164.）。Yu等人（2019）利用单宁酸制备了阿维菌素和嘧菌酯纳米农药，二者展现出更好的耐光性和缓释能力，同时可以更好的粘附在叶面，叶面保留率增加50%以上，大幅提升了农药的利用率（Yu M, Sun C,Xue Y, et al. Tannic acid-based nanopesticides coating with highly improvedfoliage adhesion to enhance foliarretention. RSC Advances, 2019, 9: 27096-27104.）。Selyutina等人（2020）建立了以天然多糖和多聚糖为核心的农药递送系统，不仅可以提升农药的水溶性，还可以提升农药穿透玉米和油菜种子表皮的能力，抑霉唑和咪鲜胺的表皮穿透力增强10倍以上（Selyutina OY, Khalikov SS, Polyakov NE.Arabinogalactan and glycyrrhizin based nanopesticides as novel deliverysystems for plantprotection. Environmental Science and Pollution Research,2020, 27: 5864-5872.）。
因此，获得有效防治作物黄萎病的靶标基因区段以及dsRNA，再进一步筛选获得与该dsRNA协同增效的农药并用纳米载体进行包裹得到纳米复合农药组合物，能有效提升dsRNA的稳定性及防治作物黄萎病的功效。
发明内容
本发明的目的之一是提供有效防治作物黄萎病的靶标基因区段；
本发明的目的之二是采用所述的防治作物黄萎病的靶标基因区段制备得到的dsRNA；
本发明的目的之三将防治作物黄萎病的dsRNA与纳米载体以及农药复合得到纳米农药组合物。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明的一方面是提供了防治作物黄萎病的靶标基因区段，所述靶标基因区段是大丽轮枝菌VdYTH1基因的靶标基因区段，其选自dsVdYTH1-1、dsVdYTH1-2或dsVdYTH1-3中的任何一种，其核苷序列分别为SEQ ID.No.1、SEQ ID.No.2或SEQ ID.No.3所示；优选的，所述的防治棉花黄萎病的靶标基因区段是dsVdYTH1-1（其核苷酸序列为SEQ ID.No.1所示）。
其中，SEQ ID.No.1（dsVdYTH1-1）所述的核苷酸序列如下：
CACAGAGCGCGAAGACATCACATGGGCAACCCAAAACTCAAGATGTTCCGATCGCTGCAACCTCAAGCGATGCGTTGCTCCAGCCGTTCGGAGCTTTTGGTTCAACTCGAGCTCGGAAAGCTCACGACGTGGACAAGGCCATCATACCCAACGCCAATTGTCACCATACACGCCACTTTGCCAGTCTCCAGCCACCAGAGCAGCGCATTCATCGACACTCAATCACGAAATCACTTGGCAGCGATATTTTTTCACCGCTCCTGGACGGACTCGGCAGCGCACGCCACGCTTGATACTACTTCAAACACTGAACACTGAACACCGACCTCTCCCCAACGCACCCGCCTCTCGCAGCCAGACCACGAGGGCCCCCAGCACCGCAGGCCAGCCAGGGCCAGAAGCCCACACCATGGCAGCGATGACAGCACACCCCTCGCT。
其中，SEQ ID.No.2（dsVdYTH1-2）所述的核苷酸序列如下：
ACACCGAGCCGGCGGCGACCTTCGACTTCACGCCCTTCCTCCGCGCGACGCACCAGCACGCCCTCGCCGCCGACTCGGCGCCCGGCGGGCAGCCGGCGCACACGCACGCGGGCCGCGGGCCGTCGCTCGTGTGCAAGCACTGGCTGCGCGGGCTCTGCAAAAAGGGCGCCCACTGCGAGTTCCTCCACGAGTACAACCTCCGCAAGATGCCCGAGTGCAACTTTTTCACGCGCAACGGCTACTGCTCCAACGGCGAGGAGTGCCTCTACCTGCACATCGACCCGCAGTCCAAGCTGCCGCCCTGCCCCCACTACGACATGGGCTTCTGCCCCCTCGGCCCCGCCTGCGCCAAGAAGCACGTCCGCCGCGCCCTGTGCCTGTTCTACCTCGCCGGCTTCTGCCCCGCGGGGCGCGACTGCCGCGACGGCGCCCACCCGC。
其中，SEQ ID.No.3（dsVdYTH1-3）所述的核苷酸序列如下：
CTACCTGCACATCGACCCGCAGTCCAAGCTGCCGCCCTGCCCCCACTACGACATGGGCTTCTGCCCCCTCGGCCCCGCCTGCGCCAAGAAGCACGTCCGCCGCGCCCTGTGCCTGTTCTACCTCGCCGGCTTCTGCCCCGCGGGGCGCGACTGCCGCGACGGCGCCCACCCGCGGTGGAGGAAGGACCTCGAGCGGCCGAAGCTCAAGGTCGAGGTCCAGCGCGAGGAGGAGGAGCTCAAGCGCCAGGAGGAGCTCGAGAGGCAGGCCGCCGGCCTCCATGAGCCGCAGAGAGATATGCGAGACGACAGGGGCGGCTTCGGCGACAGGGGGGACAGGAGGCATGGCCACGGGGGCAGGGGCGGCGGTGGTGCGGGCGGCGGCAAGTGGCGCGACCGCGGGGGAGGTGGAGGCGGCGGCAGGCGGTTCCGCGGTCGTGG。
其中，由核苷酸序列为SEQ ID.No.1所示的核苷酸序列转录得到dsRNA，所述dsRNA的其中一条RNA的核苷酸序列如下（SEQ ID.No.4）：
CCGGCAGAUCUGAUAUCAUCGAUGAAUUCGAGCUCCACCGCGGUGGCGGCCGCUCUAGAACUAGUGGAUCCACCGGUUCCAUGGCUAGCCACGUGACGCGUGGAUCCCCCGGGCUGCAGGAAUUCGAUAUCAAGCUUCACAGAGCGCGAAGACAUCACAUGGGCAACCCAAAACUCAAGAUGUUCCGAUCGCUGCAACCUCAAGCGAUGCGUUGCUCCAGCCGUUCGGAGCUUUUGGUUCAACUCGAGCUCGGAAAGCUCACGACGUGGACAAGGCCAUCAUACCCAACGCCAAUUGUCACCAUACACGCCACUUUGCCAGUCUCCAGCCACCAGAGCAGCGCAUUCAUCGACACUCAAUCACGAAAUCACUUGGCAGCGAUAUUUUUUCACCGCUCCUGGACGGACUCGGCAGCGCACGCCACGCUUGAUACUACUUCAAACACUGAACACUGAACACCGACCUCUCCCCAACGCACCCGCCUCUCGCAGCCAGACCACGAGGGCCCCCAGCACCGCAGGCCAGCCAGGGCCAGAAGCCCACACCAUGGCAGCGAUGACAGCACACCCCUCGCUGGUACCAAUU。
本发明的另一方面是提供了含有防治作物黄萎病的靶标基因区段的载体，所述的载体可以是RNA干扰载体或者是将该靶标基因区段转录得到dsRNA的基因表达载体。
作为本发明一种优选的具体实施方案，所述的RNA干扰载体是Gateway干扰载体，作为参考，本发明提供了一种构建Gateway干扰载体的方法，包括：通过BP反应，将所述的大丽轮枝菌VdYTH1基因的靶标基因区段连接至pDONR207中再通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2(I)中得到Gateway干扰载体。
作为本发明的一种优选的具体实施方案，所述的将该靶标基因区段转录得到dsRNA的基因表达载体可以是L4440基因表达载体，该L4440基因表达载体内部具有一个双向T7启动子，目的基因片段可通过内部的酶切位点插入到双向T7启动子之间，在IPTG的诱导下，两个反向的T7启动子发挥作用，可以形成互补的dsRNA分子。
本发明的另一方面是提供了由大丽轮枝菌VdYTH1基因的靶标基因区段所转录得到的防治作物黄萎病的dsRNA。
作为本发明一种优选的具体实施方案，所述的由大丽轮枝菌VdYTH1基因的靶标基因区段所转录得到的防治作物黄萎病的dsRNA由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列以及与SEQID No.4所示的核苷酸反向互补的核苷酸序列组成。
本发明的另一方面将所述的防治作物黄萎病的dsRNA与纳米载体以及具有防治作物黄萎病的农药复配在一起得到复合纳米农药组合物。
作为本发明一种优选的具体实施方案，所述的纳米载体为树枝状大分子且经过氨基官能团功能化，其结构式为式Ⅰ所示：
其中，式Ⅰ中n值为1-100中的任意整数。
作为本发明一种优选的具体实施方案，所述的农药优选为氟唑菌苯胺（阿马士）、嘧菌酯（阿米西达）、咯菌腈（适乐时）、甲基硫菌灵或异硫氰酸烯丙酯中的任何一种，优选为氟唑菌苯胺（阿马士）。
作为本发明一种优选的具体实施方案，按照质量比计算，dsRNA、纳米载体与农药的比例为（1-9）：1：1进一步优选，将dsRNA、纳米载体与农药按照5：1：1的比例进行复配得到的复合纳米农药组合物对于黄萎病的防治效果最佳且dsRNA的用量最少。
本发明的再一方面是将所述的靶标基因区段、由该靶标基因区段转录得到的dsRNA以及由该dsRNA与纳米载体以及农药复合得到复合纳米农药组合物应用于防治作物黄萎病。
作为本发明一种参考的实施方案，本发明提供了将所述的靶标基因区段应用于防治作物黄萎病，包括：
（1）构建含有所述靶标基因区段的RNA干扰载体；
（2）将所构建的RNA干扰载体转化到作物或作物细胞中；
（3）筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因作物。
所述转化的方案以及将所述核苷酸引入植物的方案根据可适用于转化的植物或植物细胞的类型而变化。将所述核苷酸引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化和直接基因转移等。
作为本发明一种参考的实施方案，本发明提供了一种应用所述dsRNA与纳米载体或者复合纳米农药组合物防治作物黄萎病的方法，包括：在作物播种前，将作物种子用dsRNA或者复合纳米农药组合物进行拌种处理；播种后，用dsRNA或者复合纳米农药组合物进行灌根处理。
本发明所述作物为大丽轮枝菌的寄主植物，优选为农作物或蔬菜，包括棉花、烟草、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种。
本发明采用dsRNA与化学药剂的纳米复配技术，以高致病力的大丽轮枝菌株V991为实验材料，首先通过体外dsRNA合成技术，筛选获得能够显著抑制病原菌mRNA 3'末端加工蛋白YTH1并降低植株病情指数的靶标区段，然后通过与多种农药与纳米材料复配，筛选最佳的配比，进行拌种及滴灌，最终获得防治棉花黄萎病最佳的靶标基因区段并与纳米载体以及化学农药复配得到的纳米农药组合物。
本发明整体技术方案详述
为了筛选得到干扰效果最佳的靶标基因区段，根据大丽轮枝菌VdYTH1（mRNA 3'-end-processing protein YTH1，VDAG_06824）的编码序列，设计3对特异性引物，引物两端含有Hind III和KpnI酶切位点，分别对目的片段进行扩增，扩增获得大丽轮枝菌VdYTH1基因的靶标基因区段dsVdYTH1-1、dsVdYTH1-2和dsVdYTH1-3，其核苷酸序列分别为SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。通过Hind III和KpnI将克隆获得的靶标片段进行酶切，然后将其构建到L4440载体中，成为RNAi-VdYTH1-N载体。通过PCR扩增验证和DNA测序进行验证后，发现序列与靶标片段序列完成一致。然后，将验证正确的阳性质料转化至大肠杆菌HT115（DE3），用于dsRNA的诱导表达。
本实验采用的L4440表达载体内部具有一个双向T7启动子，目的基因片段可通过内部的酶切位点插入到双向T7启动子之间，在IPTG的诱导下，两个反向的T7启动子发挥作用，可以形成互补的dsRNA分子。工程菌株HT115，自身具有Tet抗性，并且体内缺少RNaseIII样内切酶，因此在菌体内L4440表达出的dsRNA可以保持大片段形式。
将测序正确的单克隆加入到2×YT培养基中，加入IPTG（终浓度约为0.4 mM）进行诱导后收集菌体。利用酸酚法，提取RNA，以检测dsRNA的表达情况，电泳发现其有大量的585bp左右的dsRNA。对提取的各组RNA用RNase处理2 h后，通过琼脂糖凝胶电泳可以发现总RNA全部降解，dsRNA仍然存在。这说明了dsRNA结构相当稳定，不受RNase的影响。
将提取的dsRNA与浓度为107cfu/mL的V991孢子悬浮液共孵育24 h，并接种长至“两叶一心”的棉花幼苗，15天后统计棉花病情指数。结果显示，与接种未处理的V991相比，接种与dsRNA共孵育的V991的棉花的病情指数均有所下降，并且与dsVdYTH1-1（核苷酸序列为SEQ ID No.1所示）共孵育的孢子致病力下降最显著，初步说明孢子与dsRNA共孵育可以降低棉花的病情指数，并且dsVdYTH1-1区段的干扰效果最好。
提取棉花根部DNA，利用qRT-PCR进行真菌生物量分析。结果表明，接种与dsRNA共孵育的V991的棉花的真菌生物量明显降低，约为野生型的26%。为了进一步验证植物病情指数降低与靶标基因表达之间的关系，通过对植物根部病原菌靶标基因的表达量分析，可以观察到与野生型植物相比，转基因植物体内靶标基因表达量下降了约70%。这说明将dsVdYTH1-1作为VdYTH1基因的靶标基因区段设计dsRNA，可以有效降低病原菌的致病力。
选取氟唑菌苯胺（阿马士）、嘧菌酯（阿米西达）、咯菌腈（适乐时）、甲基硫菌灵和异硫氰酸烯丙酯等五种农药，分别对棉花种子进行拌种，以水作为对照。在第6 d、12 d利用农药及水进行灌根处理，每10盆棉苗灌根1 L，每盆4棵棉苗。第15 d采用蘸根法，用107cfu/mL的大丽轮枝菌的孢子悬液接种“两叶一心”的棉花幼苗。在接种后的第15 d，对植株的病害严重程度进行调查。结果显示，与清水处理相比，农药处理后的棉花的病情指数均有所下降，并且阿马士处理组病情指数下降最显著。提取转基因棉花根部DNA，利用qRT-PCR进行真菌生物量分析。分析结果表明，农药处理后的棉花根部的真菌生物量明显降低，并且阿马士处理的棉花下降最明显，约为野生型的40%。
将SPc（60.4 mg/mL）与氟唑菌苯胺（阿马士）按照质量比为1:1混合配制成纳米农药，按照不同的配比将100 ng/μL dsRNA与纳米农药混合孵育，并对棉花进行拌种处理。在第6 d、12 d利用纳米农药及纳米农药复配液进行灌根处理，每10盆棉苗灌根1 L，每盆4棵棉苗。等棉花长至“两叶一心”后利用2.4方法进行接菌，并在接种15 d后根据2.5方法统计发病情况。每组接种12株棉花幼苗，接种实验重复3次，并计算防治效果（CE）。
室内防效测定结果显示，9种复配组合中dsRNA、SPc和氟唑菌苯胺（阿马士）的质量比等于或大于5：1：1时防效最好，CE可达74.65%，具有很好的增效作用，dsRNA质量比用量少于5：1：1的复配防效次之。综上所述，dsRNA、SPc和氟唑菌苯胺三者复配药剂比单独施用效果更好，并且质量比为5：1：1的防效最好且用量最节省。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括
PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代。
术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包含本发明核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。
术语“RNA干扰（RNA interference, RNAi）”意指通过外源或内源性的双链RNA在细胞内诱导同源序列的基因表达沉默的现象。
附图说明
图1为L4440载体的相关信息。
图2为RNAi-VdYTH1不同区段扩增结果；M：marker，1-3为针对VdYTH1基因的不同区段扩增结果。
图3为RNAi-VdYTH1载体菌液PCR验证；M为marker，1-3为针对VdYTH1基因构建RNAi质粒的菌液PCR验证结果。
图4为dsRNA的表达情况；M为marker，1-3为提取的dsVdYTH1的验证结果。
图5为dsRNA与V991共孵育接种的棉花的病情指数统计结果。
图6为dsRNA与V991共孵育接种的棉花根部真菌生物量检测结果。
图7为dsRNA与V991共孵育接种的棉花后体内靶基因相对表达量检测结果。
图8为不同农药拌种及滴灌的棉花的病情指数统计结果。
图9为不同农药拌种及滴灌的棉花的真菌生物量检测结果。
图10为不同比例的纳米农药复配剂处理棉花的病情指数统计结果。
图11为不同比例的纳米农药复配剂处理棉花的防治效果统计结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实验例1防治棉花黄萎病的靶标区段的筛选、dsRNA的制备以及dsRNA与纳米载体和农药复配得到的复合纳米农药组合物以及防治棉花黄萎病的实验
1.材料与方法
（1）植物材料
选择珂字棉312作为实验材料，先将棉种置于70%的酒精中浸泡1 min，无菌水冲洗1次，再使用30%的H2O2浸泡30 min，无菌水冲洗3次。棉种在无菌水中浸泡过夜，之后转入已灭菌的营养土中，营养土盛放在无底的一次性纸杯中。将纸杯置于人工气候箱中培养；温度25 ± 2℃，相对湿度75 ± 5 %，光周期L：D为16 h：8 h。
（2）菌株和质粒
棉花黄萎病原菌：大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）V991，高致病力落叶型菌株。
病毒载体：L4440载体由美国斯坦福大学Andrew Fire教授（StanfordUniversity，CA，USA）赠送。
菌株：大肠杆菌（E.coli）HT115（DE3）；大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株，由发明人本实验室保存。
（3）相关溶液的配制
LB（Luria-Bertani）培养基：酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L；
完全培养基（complete medium，CM）：酵母提取物6 g/L，酸水解酪蛋白6 g/L，蔗糖10 g/L；
2×YT液体培养基（PH=7.0）：酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨16 g/L，NaCl 5 g/L
（4）真菌的培养以及植物接种方式
将大丽轮枝菌孢子培养于液体CM培养基中，25℃振荡培养5-7天。经5层纱布过滤，离心收集孢子。用蒸馏水稀释，并在显微镜下观察，将孢子浓度调整至107cfu/mL后备用。
待棉花幼苗长至“两叶一心”时，采用无底纸钵蘸根法接种大丽轮枝菌的孢子悬浮液，每个纸杯接种10 mL的上述孢子悬浮液。接种完成后，置于人工气候箱中继续培养，每隔3 d定量浇水。每组接种12株棉花幼苗，接种实验重复3次。
（5）植物病情指数统计
在接种15 d后，观察大丽轮枝菌接种后棉花的发病情况，统计病情指数。病情采用5级分级法：0级，无病症；1级，子叶变黄，真叶无病症；2级，子叶全部出现病症，1-3片真叶出现病状；3级，包括子叶在内，超过5片棉花叶片出现病症；4级，所有叶片均表现病症，叶片脱落，植株枯死。统计病株率，计算病情指数，病情指数计算方法如下：观察发病
病情指数=[∑（各级病株数×对应的病级）/（10×4）]×100
棉花茎段纵剖：接种过大丽轮枝菌的棉花幼苗，在接种后第15天时，观察植株发病情况，并截取子叶上部约2 cm的茎段，从茎段中央进行纵剖，观察维管束颜色。重复接种3次，重复观察3次。
（6）植物体内真菌生物量测定
在接种大丽轮枝菌第15天，选取棉花根部组织，提取基因组DNA，DNA提取方法参考试剂盒使用说明。以Vd-F/Vd-R为检测引物：
Vd-F：CCGCCGGTCCATCAGTCTCTCTGTTTATAC；
Vd-R：CGCCTGCGGGACTCCGATGCGAGCTGTAAC。
检测混合DNA样品中的大丽轮枝菌基因组DNA中的核糖体RNA基因ITS1和ITS2区域（Z29511）。
棉花持家基因Ployubiquitin作为内参基因，其检测引物为Pu-F/Pu-F：
Pu-F：AGCTCGGATACGATTGATAACG；
Pu-F：GAAGACGAAGAACAAGGGGAAG。
数据采用2-△△CT法进行分析（Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relativegene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CTMethod[J].Methods. 2001 Dec;25(4): 402-8.）。
（7）RNAi-VdYTH1干扰载体的构建
为了筛选得到干扰效果最佳的靶标基因区段，根据大丽轮枝菌VdYTH1（mRNA 3'-end-processing protein YTH1，VDAG_06824）的编码序列，设计3对特异性引物，引物两端含有Hind III和KpnI酶切位点（如表1），分别对目的片段进行扩增。然后利用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并进行片段回收。将目的片段以载体分别进行酶切反应，将其构建至L4440载体中。最后，利用PCR扩增检测以及测序分析，将验证好的阳性质粒转化至大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株中。
表1VdYTH1不同区段引物信息
加粗斜体处为酶切位点。
挑取测序正确的阳性克隆，重新摇菌，提取质粒。选用Hind III和KpnⅠ进行双酶切，2 h后进行1%琼脂糖电泳，回收的目的条带，将回收产物片段-20℃保存备用。
表2双酶切体系
首先将L4440干涉载体双酶切后，连接步骤按照T4连接酶说明书进行，连接反应体系如下表3：
表3连接反应体系
16℃水浴中过夜。
（8）大肠杆菌（E. coli）HT115（DE3）感受态细胞的转化
实验室所用的大肠杆菌HT115（DE3）菌株系由美国国家线虫遗传学中心提供，其菌株本身带有四环素抗性，感受态制备方法参照美国Timmons博士提供的方法，步骤如下：
a、挑取大肠杆菌HT115（DE3）单菌落，接种于5 mL LB液体培养基（Tet+，终浓度为12.5 µg/mL）中，37℃振荡培养过夜。
b、次日以1：100的体积比接种于25 mL LB液体培养基（Tet+），37℃振荡培养。
c、待OD595nm约为0.4时，将菌液4℃ 、3000 rpm 离心10 min。
d、去上清，加入相当于原培养物1/2体积（12.5 mL）的预冷无菌50 mM CaCl2，用移液器轻轻上下温柔吹打混匀，重悬沉淀。
e、冰浴30 min，4℃、3000 rpm离心10 min。
f、去上清，加入相当于原培养物1/10体积（2.5 mL）的预冷无菌50 mM CaCl2，再加入相应体积的75%灭菌甘油，使其终浓度为10%，上下轻轻吹打混匀，迅速在冰上冷冻，分装（150 µL/管），-80℃冰箱中保存备用。
（9）大肠杆菌（E. coli）HT115（DE3）感受态细胞的转化
大肠杆菌HT115（DE3）感受态细胞的转化方法与DH5a感受态细胞的转化略有不同，具体方法如下：
a、在150 µL感受态细胞中加入1 µL重组干涉载体质粒，冰浴30 min。
b、将离心管放至42℃的循环水浴中1 min。
c、快速将管转移到冰浴中2 min。
d、超净台中，每管加1 mL SOC液体培养基，37℃摇床中培养1 h。
e、将含转化的感受态细胞的LB液体培养基转移到含Amp和Tet的双抗LB固体培养基平板上（Amp终浓度为0.1 mg/mL，Tet终浓度为12.5 µg/mL)。
e、平板置于超净台中至表面菌液被吸收，倒置平板于37℃培养。
f、待平板上长出单菌落以后，挑取单克隆接入到5 mL LB培养基中（含Amp和Tet抗性），培养过夜，抽提质粒，进行酶切鉴定。将鉴定正确的重组载体保存备用。
（10）dsRNA的诱导表达
将鉴定正确的菌接种于15 mL的LB培养基中（Amp+），37℃，240 r/min振荡过夜培养，取过夜培养的菌液，以1:100的体积比接种于100 mL的LB液体培养基（Amp+）中，37℃240 r/min振荡培养3 h左右至菌液OD595nm为0.4-0.45；加入经过滤菌处理的IPTG使其终浓度为0.4 mmol/L，继续振荡培养4 h；收集菌液用于提取HT115（DE3）总RNA。
（11）Trizol法提取大肠杆菌HT115（DE3）总RNA
取50 mL诱导后的菌液，12000 r/min离心2 min，弃上清；加入1 mLTrizol充分裂解细菌，注意不要有小的菌块残留，混匀后室温静置5 min；加入200 μL氯仿，剧烈震荡15 s至溶液成乳白色，静置2 min；4℃ 12000 r/min离心15 min，小心吸取上清至离心管中；加入500 μL异丙醇，将管中液体轻轻颠倒混匀10次，室温静置10 min；4℃ 12000 r/min离心10 min，弃上清；加入1 mL 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀，然后4℃ 7500 r/min 5 min，彻底去除上清；室温静置晾干10min，加入30 μL的Nuclease Free Water溶解沉淀。将提取的总RNA进行电泳检测，空质粒L4440所提取的dsRNA作为对照，片段长度约为200 bp，若产物在600 bp左右即为诱导提取成功。
（12）抗菌农药筛选
选取氟唑菌苯胺（阿马士）、嘧菌酯（阿米西达）、咯菌腈（适乐时）、甲基硫菌灵和异硫氰酸烯丙酯等五种农药，分别对棉花种子进行拌种，以水作为对照。在第6 d、12 d利用农药及水进行灌根处理，每10盆棉苗灌根1 L，每盆4棵棉苗。第15 d采用蘸根法，用107cfu/mL的大丽轮枝菌的孢子悬液接种“两叶一心”的棉花幼苗。在接种后的15 d，根据2.4对植株的病害严重程度进行调查。
（13）纳米载体SPc的结构特征
SPc的结构特征：为树枝状大分子且经过氨基官能团功能化。其结构式为式Ⅰ所示，n值为1-100。
（14）dsRNA与纳米农药的最佳复配比例筛选
将SPc（60.4 mg/mL）与氟唑菌苯胺（阿马士）按照质量比为1:1混合，按照不同的配比将100 ng/μLdsRNA与纳米农药混合孵育，并对棉花进行拌种处理。在第6 d、12 d利用纳米农药及纳米农药复配液进行灌根处理，每10盆棉苗灌根1 L，每盆4棵棉苗。等棉花长至“两叶一心”后利用2.4方法进行接菌，并在接种15 d后根据2.5方法统计发病情况。每组接种12株棉花幼苗，接种实验重复3次，并计算防治效果（CE），计算公式如下：
2试验结果
（1）大丽轮枝菌VdYTH1靶标区段质粒的构建
本实验采用的L4440表达载体内部具有一个双向T7启动子（图1）。目的基因片段可通过内部的酶切位点插入到双向T7启动子之间。在IPTG的诱导下，两个反向的T7启动子发挥作用，可以形成互补的dsRNA分子。工程菌株HT115，自身具有Tet抗性，体内缺少RNaseIII样内切酶，因此在菌体内L4440表达出的dsRNA可以保持大片段形式。
根据大丽轮枝菌VdYTH1编码序列信息，设计引物，扩增获得针对靶标基因的3个不同区段（图2）。
通过Hind III和KpnⅠ将克隆获得的靶标片段进行酶切，然后将其构建到L4440载体中，成为RNAi-VdYTH1载体。通过PCR扩增和DNA测序验证后，发现序列与靶标片段序列完成一致（图3）。然后，将验证正确的阳性质料转化至大肠杆菌HT115（DE3），用于dsRNA的诱导表达。
（2）dsRNA的提取
将测序正确的单克隆加入到2×YT培养基中，加入IPTG（终浓度约
为0.4 mM）进行诱导后收集菌体。利用酸酚法，提取RNA，以检测dsRNA的表达情况（图4），电泳发现其有大量的585 bp左右的dsRNA。对提取的各组RNA用RNase处理2 h后，通过琼脂糖凝胶电泳可以发现总RNA全部降解，dsRNA仍然存在。这说明了dsRNA结构相当稳定，不受RNase的影响。
（3）dsRNA与V991共孵育接种的棉花的病情指数统计
将提取的dsRNA与浓度为107cfu/mL的V991孢子悬浮液共孵育24 h，并接种长至“两叶一心”的棉花幼苗，15天后统计棉花病情指数。结果显示（图5），与接种未处理的V991相比，接种与dsRNA共孵育的V991的棉花的病情指数均有所下降，并且与dsVdYTH1-1共孵育的孢子致病力下降最显著，初步说明孢子与dsRNA共孵育可以降低棉花的病情指数，并且dsVdYTH1-1区段的干扰效果最好。
（4）dsRNA与V991共孵育接种的棉花根部真菌生物量及基因沉默效率检测
提取棉花根部DNA，利用qRT-PCR进行真菌生物量分析。图6表明，接种与dsRNA共孵育的V991的棉花的真菌生物量明显降低，约为野生型的26%。为了进一步验证植物病情指数降低与靶标基因表达之间的关系，通过对植物根部病原菌靶标基因的表达量分析，可以观察到与野生型植物相比，转基因植物体内靶标基因表达量下降了约70%（图7）。这说明VdYTH1基因的区段1作为靶标片段设计dsRNA，可以有效降低病原菌的致病力。
（5）不同农药拌种及滴灌的棉花的病情指数统计
以蘸根法接种不同农药拌种及滴灌的棉花，15天后统计棉花病情指数。结果显示（图8），与清水处理相比，农药处理后的棉花的病情指数均有所下降，并且阿马士处理组病情指数下降最显著。提取转基因棉花根部DNA，利用qRT-PCR进行真菌生物量分析。图9表明，农药处理后的棉花根部的真菌生物量明显降低，并且阿马士处理的棉花下降最明显，约为野生型的40%。
（6）dsRNA与纳米农药的最佳复配比例筛选
根据表4的室内防效测定结果显示，单独施用dsRNA、阿马士均能降低病株的病情指数，减轻植株的黄萎病病症，并且dsRNA、SPc和阿马士的复配组合的效果比单独施用的效果更好。在9种复配组合中，随着dsRNA施用比例增加防效逐渐增强，直到5：1：1时防效可达74.65%，之后再增加施用比例防治效果也不再显著提高（图10-11）。综上所述，dsRNA、SPc和阿马士三者复配药剂比单独施用效果更好，并且dsRNA、SPc和阿马士的质量比为5：1：1的防效最好且dsRNA的用量最节省。
表4复配剂室内防效及增效作用
注：数据为平均值±标准差；数据后不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
Claims (9)
1.防治作物黄萎病的靶标基因区段，其特征在于，所述靶标基因区段是大丽轮枝菌VdYTH1基因的靶标基因区段，其核苷酸序列为SEQ ID.No.1所示。
2.含有权利要求1所述的靶标基因区段的载体。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述的载体是RNA干扰载体，或者所述的载体是将靶标基因区段转录得到dsRNA的基因表达载体。
4.由权利要求1中核苷酸序列为SEQ ID.No.1所述的靶标基因区段转录得到的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列和与SEQ ID No.4所示的核苷酸反向互补的核苷酸序列组成。
5.一种防治作物黄萎病的复合纳米农药组合物，其特征在于，由权利要求4所述的dsRNA与纳米载体和农药组成；所述的纳米载体的结构式为式Ⅰ所示：
其中，n值为1-100中的任意整数；
所述的农药选自氟唑菌苯胺、嘧菌酯、咯菌腈、甲基硫菌灵或异硫氰酸烯丙酯中的任何一种。
6.根据权利要求5所述的复合纳米农药组合物，其特征在于，dsRNA、纳米载体与农药的质量比例为（1-9）：1：1。
7.根据权利要求6所述的复合纳米农药组合物，其特征在于，dsRNA、纳米载体与农药的比例为5：1：1。
8.权利要求1所述的靶标基因区段、权利要求4所述的dsRNA或权利要求5-7任何一项所述的复合纳米农药组合物在防治作物黄萎病中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述作物包括棉花、烟草、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310663568.0A CN116426541B (zh) | 2023-06-06 | 2023-06-06 | 防治作物黄萎病的靶标基因区段、dsRNA及纳米农药组合物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310663568.0A CN116426541B (zh) | 2023-06-06 | 2023-06-06 | 防治作物黄萎病的靶标基因区段、dsRNA及纳米农药组合物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116426541A CN116426541A (zh) | 2023-07-14 |
| CN116426541B true CN116426541B (zh) | 2023-09-01 |
Family
ID=87080042
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310663568.0A Active CN116426541B (zh) | 2023-06-06 | 2023-06-06 | 防治作物黄萎病的靶标基因区段、dsRNA及纳米农药组合物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116426541B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA3077067A1 (en) * | 2017-10-17 | 2019-04-25 | The Regents Of The University Of California | Controlling fungal pathogens using rnai-based strategy |
| CN114736915A (zh) * | 2022-06-14 | 2022-07-12 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 大丽轮枝菌VdNRPS2基因抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用 |
| CN116144697A (zh) * | 2022-09-05 | 2023-05-23 | 中国农业科学院植物保护研究所 | GhKV3WRKY29基因及其蛋白在提高植物抗大丽轮枝菌黄萎病中的应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060247197A1 (en) * | 2004-10-04 | 2006-11-02 | Van De Craen Marc | Method for down-regulating gene expression in fungi |
| US20100257634A1 (en) * | 2009-04-03 | 2010-10-07 | Venganza Inc. | Bioassay for gene silencing constructs |
-
2023
- 2023-06-06 CN CN202310663568.0A patent/CN116426541B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA3077067A1 (en) * | 2017-10-17 | 2019-04-25 | The Regents Of The University Of California | Controlling fungal pathogens using rnai-based strategy |
| CN114736915A (zh) * | 2022-06-14 | 2022-07-12 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 大丽轮枝菌VdNRPS2基因抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用 |
| CN116144697A (zh) * | 2022-09-05 | 2023-05-23 | 中国农业科学院植物保护研究所 | GhKV3WRKY29基因及其蛋白在提高植物抗大丽轮枝菌黄萎病中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 棉花黄萎病菌Vd08284弱毒相关病毒研究;冯自力;中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑(第2014/10期);第D046-42页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116426541A (zh) | 2023-07-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111187726B (zh) | 一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌作为底盘细胞制备的稻瘟病杀菌剂 | |
| CN102010466B (zh) | 植物抗性相关蛋白myb及其编码基因与应用 | |
| CN107034146B (zh) | 一种促进农作物生长的拮抗木霉菌及其应用 | |
| CN107299105B (zh) | 西瓜枯萎病菌致病性FonAGL3基因、其缺失DNA片段、缺失突变体及其应用 | |
| AU2014350744C1 (en) | Method for controlling pests | |
| WO2017106171A1 (en) | Rna interference for control of insect pests | |
| CN113528518B (zh) | 抑制核盘菌的miRNA及其应用 | |
| WO2017118260A1 (zh) | 用于控制昆虫侵袭的核苷酸序列及其方法 | |
| CN110669762B (zh) | 用于控制昆虫侵袭的核苷酸序列及其方法 | |
| CN100491535C (zh) | 川草二号老芒麦转抗虫基因技术 | |
| CN102851297B (zh) | 一种烟蚜hunchback基因cDNA及其应用 | |
| CN116426541B (zh) | 防治作物黄萎病的靶标基因区段、dsRNA及纳米农药组合物 | |
| CN115261386A (zh) | 靶向沉默辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1的双链rna分子及应用 | |
| CN115976051A (zh) | 马铃薯StRTP7基因及其在抗病育种中的应用 | |
| CN105524150A (zh) | 大丽轮枝菌致病相关基因VdGFP的功能分析及其应用 | |
| CN112195178B (zh) | 番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787及其克隆方法与应用方法 | |
| CN112094845B (zh) | 一种改良植物农艺性状和抗性的核酸及其应用 | |
| CN111979244B (zh) | 一种抑制稻瘟病菌致病性的小分子rna及应用 | |
| CN101781654B (zh) | 棉花抗真菌病害相关基因GhMPK7及其应用 | |
| US10308954B2 (en) | Method for the control of nematodes in plants | |
| CN109666655B (zh) | 一种禾谷镰刀菌单链环状DNA病毒FgGMTV1/HB58及其应用 | |
| CN110669761B (zh) | 用于控制昆虫侵袭的核苷酸序列及其方法 | |
| CN102140446A (zh) | 油菜iMyAP基因过表达在油菜抗菌核病中的应用 | |
| CN102352357B (zh) | 抑制FLPs神经肽基因的dsRNA及其应用 | |
| JP2003510066A (ja) | パスツリアの効率的産生のための材料および方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |