CN111979244B

CN111979244B - 一种抑制稻瘟病菌致病性的小分子rna及应用

Info

Publication number: CN111979244B
Application number: CN202010862939.4A
Authority: CN
Inventors: 赵弘巍; 丁绍晨; 喻晗晞; 李涛
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-08-25
Filing date: 2020-08-25
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2040-08-25
Also published as: CN111979244A

Abstract

本发明公开了一种抑制稻瘟病菌致病性的小分子RNA，其特征在于，所述小分子RNA为双链，由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核酸序列或者SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核酸序列组成。本发明还公开小分子RNA在防治稻瘟病上的应用以及小分子RNA防治稻瘟病的方法，本发明的小分子RNA能够抑制水稻稻瘟病菌芽管萌发、附着胞的形成、菌丝生长，进而能够有效防治水稻稻瘟病，其次，选择跨膜蛋白MoPth11的编码基因为靶标基因，从信号通路早期实施抑制，大大降低了稻瘟病菌的致病力；本发明的小分子RNA稳定性强，用于制备的生物杀菌剂不仅抗菌效果明显，而且绿色环保。

Description

一种抑制稻瘟病菌致病性的小分子RNA及应用

技术领域

本发明涉及RNA干扰技术，尤其涉及一种通过靶向稻瘟病菌MoPth11基因抑制水稻稻瘟病的小分子RNA，以及该小分子RNA在防治稻瘟病上的应用。

背景技术

稻瘟病是由稻瘟病菌引起的一种对水稻生长造成巨大危害的真菌病害，稻瘟病菌几乎在所有生长阶段都感染植物，使水稻产量降低10％至35％，稻瘟病菌的侵染初期包括4个阶段，分别是孢子粘附、孢子萌发、芽管生长和侵染结构(附着胞)的形成。其中，孢子萌发、芽管生长和附着胞的形成在稻瘟病菌侵染水稻的过程中起至关重要的作用，也是稻瘟病防治的理想时期。

RNA干扰(RNAi)是小分子RNA识别具有同源互补序列的mRNA并抑制其表达甚至降解其分子的过程，也被称为基因沉默。植物产生的小分子RNA可以跨膜进入侵染植物的病原真菌细胞内并通过抑制特定基因的表达抑制其致病性，基于基因沉默技术的体外施用可以有效抑制施用对象体内靶基因的表达水平。因此，如何选取稻瘟病菌致病靶标进行RNA干扰成为本领域的热门问题。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种通过靶向稻瘟病菌MoPth11基因抑制水稻稻瘟病的小分子RNA，以及上述小分子RNA在防治稻瘟病上的应用。

技术方案：本发明的一种抑制稻瘟病菌致病性的小分子RNA，所述小分子RNA为双链，由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核酸序列或者SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核酸序列互补配对组成。

正义链：5’-AAAGACACCAGCAUGUGCGAUTT-3’(SEQ ID No.1)；

反义链：5’-CGCACAUGCUGGUGUCUUUGUTT-3’(SEQ ID No.2)；

正义链：5’-AAAGACACCAGCAUGUGCGTT-3’(SEQ ID No.3)；

反义链：5’-CGCACAUGCUGGUGUCUUUTT-3’(SEQ ID No.4)；

所述小分子RNA在抑制稻瘟病菌致病性上的应用。

所述小分子RNA在防治稻瘟病上的应用。

所述小分子RNA在调控稻瘟病菌靶标基因表达上的应用。

包含所述小分子RNA的杀菌剂。

所述杀菌剂还包括稻瘟净、敌瘟磷、稻瘟灵、苯并咪唑类杀菌剂、噻唑类杀菌剂中的一种或几种。

包含所述小分子RNA的杀菌剂在防治稻瘟病上的应用。

利用所述的小分子RNA防治稻瘟病的方法，将含有所述的小分子RNA的溶液或杀菌剂喷洒于水稻叶片、茎秆或穗部。

所述小分子RNA的溶液的浓度为1.8-4μg/μl。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)本发明的小分子RNA能够抑制水稻稻瘟病菌芽管萌发、附着胞的形成、菌丝生长，进而能够防治水稻稻瘟病；(2)选择跨膜蛋白MoPth11为靶标基因，从信号通路早期实施抑制，大大降低了稻瘟病菌的致病力；(3)本发明的小分子RNA稳定性强，用于制备的生物杀菌剂不仅抗菌效果明显，而且绿色环保。

附图说明

图1为本发明小分子RNA对稻瘟病菌芽管生长抑制效果的四种发育形态图；

图2为本发明小分子RNA对稻瘟病菌处理6和10小时后各种芽管形态的数量分布图，其中Pth11(dT)表示处理组，Mock表示对照组；

图3为本发明小分子RNA对稻瘟病菌附着胞形成率的抑制效果柱状图，其中**表示显著性差异(p-value<0.05)；

图4为经过本发明小分子RNA处理后离体大麦叶片上的稻瘟病病斑对照图；

图5为离体大麦叶片上病斑面积定量分析柱状图；

图6为离体大麦叶片上分离得到稻瘟病菌的MoPth11基因相对表达量柱状图；

图7为经过本发明小分子RNA处理后离体水稻叶片上的稻瘟病病斑对照图；

图8为离体水稻叶片上病斑面积定量分析柱状图；

图9为离体水稻叶片上分离得到稻瘟病菌的MoPth11基因相对表达量柱状图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

本发明小分子RNA中的前21个碱基来源于MoPth11的cDNA编码序列，序列如SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2或SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。MoPth11的cDNA编码序列来源于National Center for Biotechnology Information的数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)中编号为MGG_05871的基因。选择MoPth11的cDNA编码序列第99-119共21个碱基序列作为本发明小分子RNA的前21个碱基。为保证小RNA分子的稳定性，小RNA分子设计为dsRNA，并在每条链的3’末端加两个胸腺嘧啶，以便稳定小RNA结构，形成完整的21个碱基的小RNA分子。将此序列分别与两个水稻基因组数据库中的水稻基因组序列(http://rice.plantbiology.msu.edu/；http://www.gramene.org/)进行比对，检测其对水稻基因非特异性沉默的可能性。比对结果显示本发明小RNA分子与水稻基因组序列的相同性最大只有7个碱基，不能达到RNA沉默的有效长度，排除了沉默水稻基因的可能性。

在现有技术中，中国发明专利：一种抑制稻瘟病菌毒性的小RNA分子及应用，公开号：CN103409426A，公开了一种以MoAP1为靶标，采用基于RNA沉默技术的体外施用来沉默MoAP1基因，从而降低稻瘟病菌的毒性，以MoAP1为靶标的小分子RNA可以有效的抑制气生菌丝的生长，但是其对附着胞、侵染钉等早期侵染结构的形成并没有明显的抑制，而本申请的靶标MoPth11是一个定位于细胞膜的G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor或称为GPCR)。位于G-protein/cAMP信号通路的上游，起到稻瘟病菌细胞表面识别作用。在稻瘟病菌与水稻发生互作后，信号的识别和传导首先通过MoPth11进行传输，通过影响细胞自噬、附着胞形成、侵染钉形成以及致病性等环节调控稻瘟病菌的致病力，进一步来说，MoPth11位于信号通路的上游，而MoAP1位于MoPth11的下游。选取MoPth11作为RNAi的靶标可以在信号通路的更上游进行干涉和调控，达到最优化的防控效果。

本发明小RNA分子(见SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的核酸序列)委托南京金斯瑞生物科技有限公司直接合成双链，合成后进行干燥处理成干粉，将得到小分子RNA干粉进行溶解，将浓度稀释为1.8μg/μl，于-80℃保存。

实施例1小分子RNA对稻瘟病菌生长的抑制

首先选取了野生型稻瘟病菌Guy11作为实验菌株，该菌株由南京农业大学植物保护学院卵菌与真菌分子生物学实验室馈赠，并在本实验室保藏。

将稻瘟病菌Guy11滤纸片从超低温冰箱中取出，接种于CM培养基上，使用封口膜将平板密封，置于28℃的恒温培养箱，避光培养一周左右。然后在菌落边缘切出5mm×5mm稻瘟病菌的琼脂块，接种于SDC培养基上，再放于28℃恒温的培养箱中，培养5天。在超净台内用已灭菌后的1.5ml离心管的底部将培养基表面菌丝轻轻刮去。然后把平板放置于黑光灯下诱导产孢。诱导5天之后，可观察到表面产生大量分生孢子，在培养基中加入2ml的RNaseFree ddH₂O清洗孢子，用蓝色的RNase Free的移液枪枪头把孢子轻轻刮下，使用灭过菌的擦镜纸过滤，并收集孢子悬浮液备用，最后在显微镜下用血球计数板观察并计算悬浮液中孢子的浓度。

从SDC培养基上收集的分生孢子过滤离心收集，然后将稻瘟病菌孢子悬浮液调节到2×10⁵cfu/ml。在载玻片滴10μl RNase Free ddH₂O用以吸附Fisher公司的疏水玻片，在疏水玻片上滴加孢子悬浮液5μl，RNase Free ddH₂O 4μl和人工小分子RNA溶液(200μM)1μl，对照处理将人工小分子RNA溶液替换为RNase Free ddH₂O 1μl，然后使用移液枪轻轻地吸打使其均匀混合。将载玻片放置在透明的塑料箱中，并在透明的塑料箱底部铺上一层浸满水的滤纸，并用保鲜膜小心的将容器密封，使容器湿度(RH)保持在>95％，从而模拟稻瘟病菌孢子侵染水稻的环境。将透明的塑料箱移入28℃培养箱中培养，分别于6小时，10小时取出，在电子显微镜下观察稻瘟病菌孢子芽管的生长情况以及孢子的附着胞形成情况，结果分别参见图1和图2。

本发明还对小分子RNA对稻瘟病菌芽管生长情况进行了定量统计。按照芽管的发育情况将稻瘟病菌分为四种形态，分别对小分子RNA和对照处理中芽管生长不同形态的稻瘟病菌孢子数量分布进行了统计。

从图1可见，芽管生长大致可以分为以下4类：

正常：正常生长孢子；类型1：芽管正常，不形成附着胞的孢子；类型2：芽管弯曲，形成附着胞的孢子；类型3：芽管弯曲，且不形成附着胞的孢子。

图2为小分子RNA对稻瘟病菌(Guy11)芽管生长的抑制效果(Mock表示对照组，Pth11(dT)表示处理组)。从图2可以看出，在6小时，对照组中芽管正常的孢子约占91％，类型1的孢子约占8％，类型2的孢子约占1％，类型3的孢子约占0；处理组中芽管正常的孢子约占0，类型1的孢子约占37％，类型2的孢子约占3.8％，类型3的孢子约占60％。在10小时，对照组中芽管正常的孢子约占93％，类型1的孢子约占3％，类型2的孢子约占3％，类型3的孢子约占0；处理组中芽管正常的孢子约占1.7％，类型1的孢子约占26％，类型2的孢子约占38％，类型3的孢子约占34.5％。由此可以得出，小分子RNA抑制了稻瘟病菌(Guy11)孢子芽管的萌发与生长。

图3为小分子RNA对稻瘟病菌(Guy11)附着胞形成率的抑制效果(Mock表示对照组，Pth11(dT)表示处理组)。从图3中可以看出，在6小时，对照组附着胞的形成率为74.3％，处理组附着胞形成率为4％；在10小时，对照组附着胞的形成率为90.5％，处理组附着胞形成率为39.6％。由此可以得出，小分子RNA抑制了稻瘟病菌(Guy11)附着胞的形成。

实施例2小分子RNA抑制稻瘟病菌的致病性及调控稻瘟病菌靶标基因的表达

从SDC培养基上收集的分生孢子过滤离心收集，然后将稻瘟病菌孢子悬浮液调节到2×10⁵cfu/ml。取一个圆形的玻璃皿，在皿底铺上浸湿的吸水纸，使容器湿度(RH)保持在>95％，从而模拟稻瘟病菌孢子侵扰水稻的环境。分别选取生长健康且生长周期为4周左右的水稻叶片或生长周期为1周左右的大麦叶片，将上述叶片平整地铺在吸水纸上，滴加孢子悬浮液5μl，RNase Free ddH₂O 3μl和2％的明胶溶液(增加孢子在水稻叶片上的附着性)1μl和人工小分子RNA溶液1μl，对照处理将人工小分子RNA溶液替换为RNase Free ddH₂O 1μl，然后使用移液枪轻轻地吸打使其均匀混合。用枪头在水稻叶片待侵染处轻轻戳1-2下，并用10μl的移液枪将孢子悬浮液滴水稻叶片伤口处，最后并用保鲜膜小心地将容器密封。将接种水稻叶片的培养皿移入28℃恒温培养箱中，黑暗培养24h后，转移至光暗时间各12h的光照培养箱中继续培养，5-7d后观察离体发病情况并拍照,。每次每种小分子RNA使用至少3个叶片。

使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取上述的的大麦叶片和水稻叶片总RNA。实时定量PCR分析小分子RNA靶标基因MoPth11的表达量。

从图4和图5可以看出，经本发明的小分子RNA处理后再侵染大麦叶片与对照组相比，稻瘟病病斑的面积明显减小，从图6可以看出，在经过小分子RNA处理后，大麦叶片上分离得到稻瘟病菌的MoPth11基因相对表达量明显受到抑制。

从图7和图8可以看出，经本发明的小分子RNA处理后再侵染水稻叶片与对照组相比，稻瘟病病斑的面积明显减小，从图9可以看出，在经过小分子RNA处理后，水稻叶片上分离得到稻瘟病菌的MoPth11基因相对表达量明显受到抑制。

由此可以见，以上实施例及数据说明了本发明小分子RNA在抑制稻瘟病菌的致病性及调控稻瘟病菌靶标基因的表达上有明显的效果。

实施例3小分子RNA溶液浓度对防止效果的影响

将本申请的小分子RNA溶于水中，配制成浓度别分为0.4、0.8、1.2、1.8、2、3、4、8、12、16、20μg/μl的溶液，喷洒于受到稻瘟病菌孢子侵扰后的水稻叶片，并用保鲜膜小心地将容器密封。将接种水稻叶片的培养皿移入28℃恒温培养箱中，黑暗培养24h后，转移至光暗时间各12h的光照培养箱中继续培养，5-7d后观察离体发病情况并拍照,。每次每种小分子RNA使用至少3个叶片。根据水稻叶片病斑面积的大小，得出不同浓度小分子RNA溶液的相对防治效果。

表1：asiRNA-Pth11溶液最佳防治浓度测试

根据表1可知，当小分子RNA浓度小于1.8μg/μl时，相对防治效果较差，当小分子RNA浓度大于4.0μg/μl时，防治效果提升不明显，且会增加成本，因此当小分子RNA溶液的浓度在1.8-4μg/μl时，防治稻瘟病菌的效果较好，生产效益较高。

实施例4

选用稻瘟灵和异稻瘟净的混合剂(由安徽朝农高科化工有限公司生产)作为杀菌剂，喷洒于受到稻瘟病菌孢子侵扰后的水稻叶片，并用保鲜膜小心地将容器密封。将接种水稻叶片的培养皿移入28℃恒温培养箱中，黑暗培养24h后，转移至光暗时间各12h的光照培养箱中继续培养，5-7d后观察离体发病情况并拍照,。每次使用至少3个叶片。。根据水稻叶片病斑面积的大小，得出不同复配剂的相对防治效果。

对比例1

与实施例4相比，选用稻瘟灵、异稻瘟净和三环唑的混合剂作为杀菌剂，其他步骤及参数均与实施例4相同。

对比例2

与实施例4相比，选用稻瘟灵、异稻瘟净、三环唑和福美双的混合剂作为杀菌剂，其他步骤及参数均与实施例4相同。

对比例3

与实施例4相比，选用稻瘟灵、异稻瘟净、三环唑、福美双和asiRNA-Pth11的混合剂作为杀菌剂，其他步骤及参数均与实施例4相同。

表2 asiRNA-Pth11最佳复配组合测试

	防治效果(以实施例4的防治效果为100％)
		实施例4	100.0
对比例1	122.3
		对比例2	127.0
对比例3	302.4

由表2可知，稻瘟灵、异稻瘟净、三环唑和福美双同时添加作为混合杀菌剂时，其防治效果较好，当在稻瘟灵、异稻瘟净、三环唑和福美双混合杀菌剂中添加小分子RNAasiRNA-Pth11时，防治效果成倍增长，小分子RNA与混合杀菌剂的复配性能强，市场应用前景广阔。

序列表

<110> 南京农业大学

<120>一种抑制稻瘟病菌致病性的小分子RNA及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> Artificial sequence(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

aaagacacca gcaugugcga utt 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> Artificial sequence(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

cgcacaugcu ggugucuuug utt 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial sequence(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

aaagacacca gcaugugcgt t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial sequence(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

cgcacaugcu ggucucuuut t 21

<210> 5

<211> 1896

<212> DNA

<213> CDS(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

atggttgcat tcacccggtt gctgcttgcc accgcggcgc tgatatgcgg agcggcttca 60

gtcatagtcg atcaacaaac attaatcgac attgtcacaa agacaccagc atgtgcgatg 120

ccatgtttta ccaacgcagt catatcaaga aactgtagcc ttgcgagcgc acaactagtt 180

gcagattgca tctgcgtctc caatccgact ctttcagtag cggcaacttg cgtgcagaag 240

agttgcaagt ggaaggagca gctgatcgca cggaacttga cgttattttc tctgtgcaag 300

ggctacccca ttgagaatcg cagtgccgac gtcatcaaca ttgccattat cggattcgct 360

gtcacggtac cagttgtgat cttaaggata ttgtcgaggc tatacagctc aggccgactc 420

tggtgggacg attacacatg tcttgttgca tctgtgtttt tgttcggaat gcttggaatg 480

cagttggaaa gcgcgcgact tggattcggc aaacatatct gggtcatcga tgaaatgcca 540

ggcctgtcac tactaaagta cttctggttc ggtcagatga tgtacattgt ggtccaggtc 600

tttgccaaaa tctccattct aattctttac attcgactgt ttaccacacc atggttccag 660

atgttttgca agctcagtat ggtttttatg gccttgcacg gtgtggggta catggtcctc 720

gtcattgtgc agtgcctgcc ggttgccgca gtttacgatc gaagcatcga aggcaaatgc 780

atggagttca acccaatcgt ctactcgggt gctgcattga gcgtttttga agatgtggtc 840

ctggtggtga taccaatccc cgagctctgg agtctgcggt tgaactttaa gaaaaagatg 900

gggctgatgc taatgtttgc cattggtctt gtcgccacgg tcacgagcat tgtccggatc 960

aactacctgg tcaagatcgg gtttacatat gatcagccgt gggacaacgt ggacccaata 1020

acgtggtccg taatagaaga gttctgcgcc atcatctgcg gcagcctccc ttcatgtcga 1080

gcaatagtga acgcgtggat cccacggata tggtcctcga tcgatcactc agacgtaggc 1140

aacagcctgg acgtacagag agacaacgcc tttgcacgat ccgaaaaggc cctcggaggt 1200

gccccgcaag cggccagacg aaaacgattc tcgctctatc gattgacgac cgagatcgat 1260

ccattagatc tggactttcg ccagtcgggc ggaaagtgga agagctgccc gtccatcaac 1320

gagcgggata gcgaggatgg aatgggcaat ctagaagaga tcaccatctg ctcggacacg 1380

aagcgcgctt ccgagacgct gaagcggagg acagagatcg gtgcgagtcc agacgacccg 1440

gacatggtga gcgtgccgat acacagcccg ggcgaggtgg ttgagatgtc gcggcgcgcc 1500

agcaccagcg tcctgcacca atccgtcgtc gagagtctgg tccggtactc gatggcgccg 1560

tcgtcgcgtt cgaaccggtc cttttccgtc attggcaacg cgtgggtagc ccctgacgcc 1620

actgtcgaag gtggcgccag ccacacggca gtggcgtccg acgttcccga cgttcccgcc 1680

gtgccagatt tgccaatcga caggcttgtg tggccgctgc cgtcgaggtc ggtgacgtcc 1740

atacaggctg atgccgagtt cagcggcccg ataagagacc gtctcgccag cgacggcagc 1800

atcaacacgg agctggggat ggaggcggag gaaaaaagcg ggttcatggg cagtgcacgt 1860

aattcacgtc aaggactgcc cggtggtctc atctaa 1896

Claims

1.一种包含小分子RNA的杀菌剂，其特征在于，所述小分子RNA为双链，由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核酸序列或者SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核酸序列互补配对组成，所述小分子RNA在杀菌剂中的浓度为1.8-4μg/μl，所述杀菌剂还包括稻瘟灵、异稻瘟净、三环唑和福美双。

2.权利要求1所述的小分子RNA在抑制稻瘟病菌MoPth11基因表达的应用。

3.权利要求1所述的小分子RNA在抑制稻瘟病菌致病性的应用。

4.权利要求1所述的小分子RNA在防治稻瘟病的应用。

5.权利要求1所述的杀菌剂在防治稻瘟病的应用。

6.利用权利要求1所述的小分子RNA防治稻瘟病的方法，其特征在于，将含有所述的小分子RNA的溶液和杀菌剂喷洒于水稻或大麦的叶片、茎秆或穗部。