CN113462580B

CN113462580B - 一株贵州木霉Hz36菌株、生防菌剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113462580B
Application number: CN202110894333.3A
Authority: CN
Inventors: 陈桃; 赵艳丽; 谢甲涛; 姜道宏; 付艳苹; 程家森; 李博
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2021-08-05
Filing date: 2021-08-05
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2041-08-05
Also published as: CN113462580A

Abstract

本发明涉及植物病害防治技术领域，特别是涉及一株贵州木霉Hz36菌株、生防菌剂及其制备方法和应用。本发明提供的Hz36菌株不仅对于根肿病有显著的防治效果，而且对人畜没有安全隐患；由实施例可知，利用所述Hz36菌株的发酵液处理油菜根肿病病菌休眠孢子，3天后根肿菌休眠孢子萌发抑制率为36.4％，6天后根肿菌的萌发抑制率达48.4％；Hz36菌株对油菜根肿病的防效达到44.29％，对拟南芥根肿病的防效达到52.18％；qPCR结果显示发病的油菜及拟南芥根部根肿菌含量显著降低；透射电镜切片显示处理组的油菜根部根肿菌含量显著减少，石蜡切片不仅显示出Hz36菌株处理组的根肿菌含量减少，并且根肿菌发育滞后。

Description

一株贵州木霉Hz36菌株、生防菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及植物病害防治技术领域，特别是涉及一株贵州木霉Hz36菌株、生防菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

十字花科作物根肿病是一种世界性的土传病害，由芸薹根肿菌(Plasmodiophorabrassicae)的侵染引起，寄主范围广，可危害油菜、大白菜、甘蓝、萝卜、荠菜和花椰菜等100多种十字花科作物。该病害主要危害寄主根部，造成根部薄壁细胞增生而形成肿瘤，在条件适宜年份，油菜根肿病在一般田块株的发病率为20％～50％，严重时高达100％，发病区域的油菜和蔬菜减产20％以上，严重时甚至颗粒无收。发生根肿病后一般需要换地种植，并且施用大量化学农药进行防治，不但成本大量增加，而且食用安全存在隐患。

针对根肿病防治困难的瓶颈问题，在根肿菌寄主群体中寻找可以利用的抗病种质资源及在寄主微生态环境或寄主中寻找有效的生防菌进行生物防治均是解决目前根肿病防治困境的方向。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一株贵州木霉Hz36菌株、生防菌剂及其制备方法和应用。本发明提供的贵州木霉Hz36菌株不仅对于根肿病有显著的防治效果，而且对人畜没有安全隐患。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一株贵州木霉(Trichoderma guizhouense)Hz36菌株，所述菌株的保藏编号为CCTCC NO：M2021079。

优选的，所述菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了一种生防菌剂，所述生防菌剂包括上述的Hz36菌株的孢子。

优选的，生防菌剂中Hz36菌株的孢子数量为1×10⁷CFU/mL。

本发明还提供了上述生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：

将上述Hz36菌株接种于PDA培养基中，培养7～10d，得到所述的生防菌剂。

优选的，所述培养的温度为20～28℃。

本发明还提供了上述的Hz36菌株或上述的生防菌剂或利用上述制备方法制备得到的生防菌剂在防治植物根肿病和/或促进植物生长中的应用。

优选的，所述促进植物生长包括促进种子萌发和/或促进根系生长。

优选的，所述植物包括十字花科植物。

优选的，所述十字花科植物包括油菜或拟南芥。

有益效果：

本发明提供一株贵州木霉(Trichoderma guizhouense)Hz36菌株，所述菌株的保藏编号为CCTCC NO：M2021079。本发明提供的Hz36菌株不仅对于根肿病有显著的防治效果，而且对人畜没有安全隐患；由实施例可知，利用本发明提供的Hz36菌株的发酵液处理油菜根肿病病菌休眠孢子，3天后根肿菌休眠孢子萌发抑制率为36.4％，6天后根肿菌的萌发抑制率达48.4％；Hz36菌株对油菜根肿病的防效达到44.29％，对拟南芥根肿病的防效达到52.18％；qPCR结果显示发病的油菜及拟南芥根部根肿菌含量显著降低；透射电镜切片显示处理组的油菜根部根肿菌含量显著减少，石蜡切片不仅显示出Hz36菌株处理组的根肿菌含量减少，并且根肿菌发育滞后。

生物保藏说明

贵州木霉Hz36菌株，拉丁名为Trichoderma guizhouense，于2021年1月15日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2021079。

附图说明

图1为Hz36菌株在PDA培养基上的菌落示意图，其中A为Hz36菌落形态；B为Hz36分生孢子梗；C为Hz36分生孢子；

图2为Hz36菌株系统发育树；

图3为Hz36菌株的发酵液抑制根肿菌的休眠孢子的萌发；其中A为用Hz36菌株处理3天的休眠孢子及对照用DAPI染色的结果，有荧光显示根肿菌未萌发，无荧光显示根肿菌的休眠孢子已经萌发为初级游动孢子，bar＝20μm；B为用Hz36菌株处理3天和6天的休眠孢子及对照萌发率的统计，t-test双尾检测，*p<0.5，**p<0.01；

图4为用Hz36菌株处理油菜根肿病25天后的根部表型，Mock为未接种对照，PB为接种根肿菌对照，PB+Hz36为共接种根肿菌和Hz36菌株；bar＝1cm；

图5为Hz36菌株处理根肿病25天后的病情指数统计，PB为接种根肿菌对照，PB+Hz36为共接种根肿菌和Hz36菌株；

图6为q-PCR检测用Hz36菌株处理根肿病25天后根肿菌的含量，Mock为未接种对照，PB为接种根肿菌对照，PB+Hz36为共接种根肿菌和Hz36菌株；

图7为透射电镜观察Hz36菌株处理过的油菜根肿病菌，其中A为Mock，未接种对照；B为PB为接种根肿菌对照；C为PB+Hz36为共接种根肿菌和Hz36菌株；bar＝2μm，PC＝plantcell，植物细胞；PCW＝plant cell wall，植物细胞壁；SP＝secondary plasmodium，根肿菌次级游动孢子囊；

图8为用Hz36菌株处理拟南芥根肿病21天后的根部表型，Mock为未接种对照，PB为接种根肿菌对照，PB+Hz36为共接种根肿菌和Hz36菌株，bar＝1cm；

图9为Hz36菌株处理根肿病21天后的病情指数统计，PB为接种根肿菌对照，PB+Hz36为共接种根肿菌和Hz36菌株；

图10为q-PCR检测用Hz36菌株处理根肿病21天后根肿菌的含量，Mock为未接种对照，PB为接种根肿菌对照，PB+Hz36为共接种根肿菌和Hz36菌株；

图11为石蜡切片观察Hz36菌株处理油菜根肿病35天后的病情指数统计，其中A和B为Mock，未接种对照，B是A图的局部放大，bar＝50μm；C和D为PB为接种根肿菌对照，D是C图的局部放大，bar＝50μm；E和F为PB+Hz36为共接种根肿菌和Hz36菌株，bar＝50μm；

图12为Hz36菌株对油菜种子萌发率的影响和根部的促生作用，其中A为用Hz36菌株处理油菜种子一周内萌发率的统计，t-test双尾检测，n＝3，数据平均值±SD，*p<0.5，**p<0.01，***p<0.001，ns＝no significant difference，没有显著性差异；B为用Hz36菌株处理油菜种子萌发后的根长，t-test双尾检测，n＝19-31，数据平均值±SD，*p<0.5，**p<0.01，***p<0.001，ns＝no significant difference，没有显著性差异。

具体实施方式

本发明提供一株贵州木霉(Trichoderma guizhouense)Hz36菌株，所述菌株的保藏编号为CCTCC NO：M2021079。

本发明所述Hz36菌株优选具有以下性质：

(1)在25℃(PDA培养基上)培养条件下，菌落生长迅速，5天后菌落呈棉质，绿色分生孢子形成厚而密的同心环；分生孢子在3天之后形成。

(2)分生孢子梗透明，壁光滑，轮生和形成金字塔结构；分生孢子单细胞，球状，大多为2～3μm直径，在显微镜下呈淡黄绿色。

(3)生长特性为20℃到28℃均能生长良好，25℃为最适生长温度，在35℃条件下生长极为缓慢。

(4)Hz36菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：

GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTGCCTCTTGGCGGCGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。

本发明提供的Hz36菌株不仅对于根肿病有显著的防治效果，而且对人畜没有安全隐患；另外，本发明提供的Hz36菌株还可以促进植物种子的萌发和/或促进根系生长。

在本发明中，生防菌剂中Hz36菌株的孢子数量优选为1×10⁷CFU/mL。

本发明还提供了上述生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：

如无特殊说明，本发明对所述PDA培养基的各组分来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。

在本发明中，每L所述PDA培养基优选包括：土豆200g、葡萄糖20g、琼脂20g和余量的水；所述水优选包括蒸馏水；所述PDA培养基的pH优选为7.0。

在本发明中，所述培养的时间为7～10d，优选为8～9d，更优选为8.5d；所述培养的温度优选为20～28℃，更优选为25℃。

在本发明中，所述促进植物生长优选包括促进种子萌发和/或促进根系生长；所述植物优选包括十字花科植物；所述十字花科植物优选包括油菜或拟南芥。

本发明提供的Hz36菌株或上述生防菌剂不仅对于根肿病有显著的防治效果，而且对人畜没有安全隐患；由实施例可知，利用本发明提供的Hz36菌株的发酵液处理油菜根肿病病菌休眠孢子，3天后根肿菌休眠孢子萌发抑制率为36.4％，6天后根肿菌的萌发抑制率达48.4％；Hz36菌株对油菜根肿病的防效达到44.29％，对拟南芥根肿病的防效达到52.18％；qPCR结果显示发病的油菜及拟南芥根部根肿菌含量显著降低；透射电镜切片显示处理组的油菜根部根肿菌含量显著减少，石蜡切片不仅显示出Hz36菌株处理组的根肿菌含量减少，并且根肿菌发育滞后；另外，上述生防菌剂可以使油菜种子初期萌发率显著提高22％～55％，并且可以显著促进油菜根部的生长，相对于对照可以提高12.3％左右。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一株贵州木霉Hz36菌株、生防菌剂及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

菌株的分离及鉴定

菌株的分离地点及分离方法：

采集湖北省枝江市油菜根肿病发病田块肿大的油菜根组织，用75％乙醇(体积浓度)浸泡2～3min，无菌水清洗5～6次，去除根表皮，然后将根切成小块，接种到PDA培养基上，20℃恒温培养室中倒置培养2～3天，待组织周围长满菌丝后，用接种针挑取菌丝于新的PDA培养基中，培养2～3天，重复菌丝尖端纯化3～4次，获得一株真菌菌株将其编号为Hz36；所述PDA培养基的制备为：取土豆200g、葡萄糖20g、琼脂20g，补充蒸馏水至1000mL混合均匀，调pH至7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min，得到PDA培养基。

Hz36菌株在25℃(PDA培养基上)培养条件下，菌落生长迅速，5天后菌落有点棉质，绿色分生孢子形成厚而密的同心环，(图1中A)。分生孢子梗透明，壁光滑，轮生和形成金字塔结构(图1中B)。分生孢子单细胞，球状，大多为2～3μm直径，壁光滑，在显微镜下呈淡黄绿色(图1中C)，进一步结合ITS DNA序列进行鉴定。

菌株的16S rDNA鉴定：

取上述Hz36菌株接种在铺有玻璃纸的PDA平板上，20℃培养3天后刮取菌丝。按照CTAB法提取菌种DNA，PCR扩增其ITS序列，使用通用引物ITS4:5'-tcctccgcttattgatatgc-3'(seq id no：2所示)和its5:5'-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3'(SEQ ID NO：3所示)。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s；57℃退火30s；72℃延伸1min，循环35次，72℃最后延伸5min。PCR反应体系(20μL)：ddH₂O 8μL，2×PCR Master Mix(含Taq酶和dNTP)10μL，10μΜ的引物ITS40.5μL，10μΜ的引物ITS50.5μL，DNA模板(50ng/μL)1μL。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，利用凝胶成像仪拍照。大小鉴定正确的PCR产物应用PCR回收试剂盒回收，由武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序。测序后的序列见序列表SEQ ID NO：1。将测序结果与GenBank(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)中已知的ITS rDNA序列进行Blast同源性比较，发现与Trichodermaguizhouense同源性达到99.38％。

序列分析及系统发育分析：

对初步鉴定为Trichoderma harzianum复合种的Hz36菌株，分别扩增了ACT(a-actin)(Tact1:5'-TGGCACCACACCTTCTACAATGA-3(SEQ ID NO：4所示)'和Tact2:5'-TCTCCTTCTGCATACGGTCGGA-3'(SEQ ID NO：5所示))、TEF1(nuc translation elongationfactor 1-α)(EF1-728F:5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3'(SEQ ID NO：6所示)和EF1-1R:5'-GCCATCCTTGGGAGATACCAGC-3'(SEQ ID NO：7所示))、CAL(calmodulin)(CAL-228F:5'-GAGTTCAAGGAGGCCTTCTCCC-3'(SEQ ID NO：8所示)和CAL-737R:5'-CATCTTTCTGGCCATCATGG-3'(SEQ ID NO：9所示))和ITS(nuc internal transcribed spacers rDNA regions)(ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(SEQ ID NO：10所示)和ITS5:5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'(SEQ ID NO：11所示))，采用默认设置的MAFFT v.7对每个基因的测序菌株和参考菌株的核苷酸序列进行多重比对。将每个比对好的序列按顺序(ACT-TEF1-CAL-ITS)首尾相连进行拼接，最后使用CIPRES(http://www.phylo.org/portal2/login！input.action)在线对多位点序列比对进行最大似然法(Maximum Likelihood,ML)系统发育分析，

发育分析结果见图2，与贵州木霉的亲缘关系最近。结合菌株菌落及孢子梗和孢子形态，将Hz36菌株鉴定为贵州木霉。

Hz36菌株的16S rDNA序列为SEQ ID NO：1所示。

实施例2：

一种生防菌剂，制备方法为：

将实施例1中纯化出的菌株接种到PDA培养基(所述培养基的制备方法与实施例1相同)活化，25℃恒温培养室中培养8d，用无菌的ddH₂O将分生孢子洗下来，收集洗脱液即为Hz36菌株的孢子悬液。将分生孢子浓度调至约1×10⁷个孢子/mL，得到所述生防菌剂。

实施例3：

Hz36菌株对油菜根肿病菌休眠孢子萌发的抑制作用

芸薹根肿菌休眠孢子液制备：从湖北省枝江市发病的油菜根部提取休眠孢子。洗净的油菜根部肿大组织表面消毒处理：70％的乙醇(体积浓度)处理2min，10％的过氧化氢处理1h，最后用无菌蒸馏水充分冲洗5次。处理后的根部肿大组织用锋利的小刀切成小块，加入适量的无菌蒸馏水在匀浆机中匀浆，8层纱布过滤掉植物碎片，滤液2500×g离心10min，弃上清液，用无菌蒸馏水悬浮沉淀。重复离心操作两次，弃上清液，50％(w/v)蔗糖溶液悬浮沉淀，2500×g离心15min，小心收集含有休眠孢子的上清液到另一个无菌离心管中，加入等量的无菌蒸馏水，充分混匀后2500×g离心15min，弃上清液，用无菌蒸馏水悬浮管底的干净休眠孢子沉淀，重复该步骤5次，以充分洗净休眠孢子中的蔗糖。对提取的新鲜休眠孢子进行消毒处理，以减少各种细菌的污染。休眠孢子悬浮于2％(w/v)的氯胺-T溶液，室温处理20min，用无菌蒸馏水离心清洗5次。清洗后的休眠孢子悬浮于抗生素溶液(1000ppm硫酸抗敌素，1000ppm盐酸万古霉素，6000ppm头孢噻肟钠)，25℃黑暗环境处理24h，用无菌蒸馏水离心清洗5次。处理后的干净休眠孢子用血球计数板统计溶度，并用1/10霍格兰营养液稀释到1.0×10⁶spores/mL，加入终溶度为100ppm的头孢噻肟钠溶液，以抑制保存期间的细菌污染。制备好的休眠孢子液于4℃保存备用。其中霍格兰营养液配方：大量元素(四水硝酸钙945mg/L，硝酸钾506mg/L，硝酸铵80mg/L，磷酸二氢钾136mg/L，硫酸镁493mg/L，微量元素5mL/L，铁盐2.5mL/L，pH＝6.0)，微量元素(硫酸镁493mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L)，铁盐(七水硫酸亚铁2.78g，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)3.73g，蒸馏水500mL，pH＝5.5)。

油菜根系分泌液制备：在培养皿中铺3层高温灭菌滤纸片，将油菜种子以75％(体积浓度)酒精消毒10min，无菌水清洗6次，晾干后置于培养皿中，每皿50粒，无菌水培养，待其生长到出现两片真叶，收集培养液，经0.22μm滤膜过滤，即得根系分泌物溶液，置于4℃冰箱保存，备用。

Hz36菌株无菌发酵滤液制备：用灭菌的打孔器(直径5mm)打取活化2天的菌丝块，每50mL PDB培养基(实施例1制备的PDA培养基中不加琼脂粉)接种8个菌丝块，培养3瓶，在25℃下150r·min^-1下振荡培养10天。培养液经7000r·min^-1离心10min，上清液用0.22μm滤膜过滤，即得Hz36菌株的无菌发酵液，置于4℃冰箱中，备用。

根肿菌休眠孢子萌发抑制试验：对照组(Mock)为根肿菌休眠孢子悬液、油菜根系分泌物溶液和PDB培养基进行1：1：1(体积比)混合；处理组(Hz36)为根肿菌休眠孢子悬液、根系分泌物溶液和Hz36菌株无菌发酵滤液进行1：1：1(体积比)混合，每个处理3次重复组，于22℃条件下黑暗培养，分别在第3天和第6天镜检休眠孢子萌发情况，休眠孢子萌发判定用DAPI染色(染细胞核)10～15s，显微镜下着色的为未萌发的休眠孢子，未着色的为萌发的休眠孢子(休眠孢子萌发为初级游动孢子)。萌发率及萌发抑制率按以下公式进行计算：萌发率＝萌发孢子数/孢子总数×100％；萌发抑制率＝(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率×100％。结果见表1和图3。

表1不同处理组对根肿菌休眠孢子萌发率的抑制效果

组别	3天萌发率(％)	6天萌发率(％)
			Mock	57.7±6.31	76.9±8.43
Hz36	36.7±3.04	39.7±3.75

注：表1中Mock表示对照组，Hz36表示处理组。

由表1和图3可知，第3天处理组的萌发率为36.7％，而对照组的萌发率为57.7％，3天后根肿菌休眠孢子萌发抑制率为36.4％，第6天处理组的萌发率为39.7％，而对照组的萌发率为76.9％，6天后根肿菌的萌发抑制率达48.4％(图3中B)。实验重复3次结果相似。结果表明Hz36的发酵液可以抑制根肿菌休眠孢子的萌发(图3中A)。

实施例4：

Hz36菌株对油菜根肿病的防治作用

将油菜置于20℃的光照培养室中(12h光照，12h黑暗，70％相对湿度)，培养19天后每株油菜接种1mL实施例2制备的Hz36菌株孢子悬液(1×10⁷个孢子/mL)，同时再接种1mL根肿菌休眠孢子悬液(1×10⁶个孢子/mL)做为处理对照；单独接种根肿菌休眠孢子作为阳性对照；不接种根肿菌的为阴性对照。每个处理均有32株油菜，在第25天时进行病害发生情况的统计。油菜根肿病病情分级标准参照文献【吴道军,陈国康,杨晓琴,等.4种甘蓝根肿病分级标准的应用评价[J].西南农业学报,2013,26(002):591-594.】：0级，根部无肿瘤；1级，侧根有小肿瘤；3级，主根肿大，直径小于2倍茎基部；5级，主根肿大直径是茎基部的2～3倍；7级，主根肿大，直径是茎基部的3～4倍；9级，主根肿大，直径是茎基部的4倍以上或肿瘤龟裂。病情指数＝∑(各级发病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级发病值)×100；防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100。结果见表2、图4和图5。

表2不同处理组中不同病级占有情况(单位：％)

组别	0级	1级	2级	3级	4级	5级	6级	7级	8级	9级
											PB	0	43.75	37.5	9.37	3.13	6.25	0	0	0	0
PB+Hz36	46.88	25	15.62	3.13	6.25	3.12	0	0	0	0

注：表2中PB代表阳性对照组，PB+Hz36代表Hz36菌株处理组。

由表2、图4和图5可知，接种根肿菌PB25天后，阳性对照组根肿病的病情指数为21.18，Hz36菌株处理组油菜根肿病的病情指数为11.18(图4和图5)，防效高达44.29％。实验重复三次，结果相似。

利用CTAB法提取根肿菌的DNA，肿大的根部样品于液氮中充分研磨，加入1mL65℃预热的CTAB提取缓冲液充分混匀，于65℃水浴锅中水浴30min，再加入等体积的氯仿/苯酚(v/v＝1/1)，充分振荡均匀；12000rpm离心10min，取上清液于另一个1.5mL EP管中，加入等体积的氯仿，充分振荡均匀；12000rpm离心10min，取上清加入两倍体积无水乙醇充分混匀；-20℃沉淀30min，12000rpm离心12min，小心弃上清液，管底DNA沉淀用70％酒精洗涤3次，获得的DNA沉淀室温干燥，加适量的TE缓冲液溶解。

利用q-PCR技术检测各处理组中寄主植物根组织的含菌量，所有q-PCR实验相关反应体系采用SYBR Green Real-Time PCR MasterMix(Bio-Rad,California,USA)，20μL反应体系的配制根据产品说明书，在配套仪器CFX96TM real-time PCR detection system(Bio-Rad)上运行荧光定量实验，分别以油菜的Actin基因为内参，扩增内参基因的引物为：Atactin-F:5’-AATCCACGAGACAACCTA-3’(SEQ ID NO：12所示)和Atactin-R:5’-AGCGATACCTGAGAACATA-3’(SEQ ID NO：13所示)，根肿菌Actin基因(Pbactin-F:5’-CACCGACTACCTGATGAA-3’(SEQ ID NO：14所示)和Pbactin-R:5’-CAGCTTCTCCTTGATGTC-3’(SEQ ID NO：15所示))指示根肿菌含量，计算寄主植物(分别以油菜和拟南芥Actin基因为模板的扩张曲线Ct值)中根肿菌的含菌量(以根肿菌Actin基因为模板的扩张曲线Ct值)。结果如图6和表3所示。

表3不同处理组根肿菌的相对含量

组别	PB	PB+Hz36	Mock
				根肿菌的相对含量	1±0.07	0.076±0.003	0.005±0.000002

注：表3中PB代表阳性对照组，PB+Hz36代表Hz36菌株处理组，Mock代表阴性对照组。

由图6可知，Hz36菌株处理组的根组织积累的根肿菌菌量显著少于根肿菌的对照组。

取Hz36菌株处理组和根肿菌对照组的油菜根部进行透射电子显微镜(TEM)显微观察，样品的制备和电镜的拍摄均由中科院病毒所的电镜平台完成，结果如图7所示。

由图7可知，Hz36菌株处理组中根肿菌的孢子含量非常少，几乎没有看见，而接种根肿菌的油菜根部细胞内充满了许多成熟的休眠孢子。结合病情指数统计结果、q-PCR检测根肿菌的含量和电镜观察根肿菌的含量均表明Hz36菌株处理油菜根肿病后，油菜根肿病得到很好的缓解。

实施例5：

Hz36菌株对拟南芥根肿病的防治作用

将拟南芥置于20℃的光照培养室中(12h光照，12h黑暗，70％相对湿度)，培养14天后每株油菜接种1mL实施例2制备的Hz36菌株孢子悬液(1×10⁷个孢子/mL)，同时再接种1mL根肿菌休眠孢子悬液(1×10⁶个孢子/mL)做为处理对照；单独接种根肿菌休眠孢子作为阳性对照；不接种根肿菌的为阴性对照。每个处理均有15株拟南芥，在第21天时进行病害发生情况的统计，结果如表4、表5和图8～10所示。

表4不同处理组中不同病级占有情况(单位：％)

组别	0级	1级	2级	3级	4级
						PB	0	46.67	53.33	0	0
PB+Hz36	60	6.67	33.33	0	0

注：表4中PB代表阳性对照组，PB+Hz36代表Hz36菌株处理组。

表5不同处理组根肿菌的相对含量

组别	PB	PB+Hz36	Mock
				根肿菌的相对含量	1±0.025	0.061±0.00003	0.001±0.0000002

注：表中PB代表阳性对照组，PB+Hz36代表Hz36菌株处理组，Mock代表阴性对照组。

由表4、表5和图8～10可知，PB对照组植株根系呈现肿大症状(图8)，病情指数为38.33(图9)，而Hz36菌株处理组根部几乎不肿大(图8)，病情指数为18.33(图9)，防效为52.18％。参考实施例4的方法利用qPCR技术对拟南芥根组织的含菌量进行了检测，Hz36菌株处理后根肿菌的含量显著降低(图10)，结合病情指数和q-PCR检测根肿菌的含量的结果表明Hz36菌株对拟南芥根肿病的有较好的防治作用。实验重复3次，结果相似。

实施例6：

Hz36菌株对根肿菌发育的抑制作用

将油菜置于20℃的光照培养室中(12h光照，12h黑暗，70％相对湿度)，培养19天后每株油菜接种1mL实施例2制备的Hz36菌株孢子悬液(1×10⁷个孢子/mL)，同时再接种1mL根肿菌休眠孢子悬液(1×10⁶个孢子/mL)做为处理对照；单独接种根肿菌休眠孢子作为阳性对照；不接种根肿菌的为阴性对照。在第35天时对根肿菌的发育状态进行检测，选取Hz36菌株处理组、根肿菌阳性对照组和未接种的阴性对照组的根部组织做石蜡切片，甲苯胺蓝(Toluidine blue)染色样品的制备由武汉博尔夫生物公司完成。阳性对照组的油菜根皮层组织中充满了大量的成熟休眠孢子(图11中C和图11中D)，未接种阴性对照中没有发现根肿菌孢子(图11中A和图11中B)，而Hz36菌株处理组中只有少量的次级游动孢子囊(图11中E和图11中F)，表明Hz36菌株对根肿菌的发育有显著的抑制作用。

实施例7：

Hz36菌株对油菜种子的促萌发作用

华双四号油菜种子用75％酒精(体积浓度)溶液于室温下消毒10min，无菌水清洗6～7次，洗净残留的酒精溶液，选取大小均一油菜种子在Hz36菌株无菌发酵滤液浸泡处理6h。将灭菌的滤纸平铺于灭过菌的平皿底部，均匀放置处理后的种子100粒。以无菌水作为空白对照(Mock)，每个组设置3个重复，放于人工植物光照培养箱(培养条件设定：23℃，12h光照，12h黑暗，70％相对湿度)中生长。皿中每天加5mL无菌水，连续7天统计种子的萌发率。结果如图12中A和表6所示，同时对第7天和12天的油菜根长进行统计分析，结果如图12中B和表7所示。

表6不同处理组连续7天种子萌发率(单位：％)

组别

1天

2天

3天

4天

5天

6天

7天

Mock

1.67±0.58

30.33±1.53

47.33±4.04

65±5

79.33±2.31

81.33±2.08

92.33±1.53

Hz36

3.67±1.53

49.67±2.52

60.67±4.93

72.67±2.08

79.33±2.08

85±2

95±1.73

注：表6中Mock表示对照组，Hz36表示处理组。

表7不同处理组7天和12天油菜根长统计结果(单位：cm)

组别	7天	12天
			Mock	6.05±0.87	10.34±0.93
Hz36	6.84±0.87	11.79±1.15

注：表7中Mock表示对照组，Hz36表示处理组。

由图12中A和表6可知，处理后第一天、第二天和第三天的种子萌发率显著高于对照组55％、39％和22％，但是第四天到第七天没有显著的变化，表明Hz36菌株处理后可以提高油菜种子早期的萌发率。该实验重复三次，实验结果相似。

由图12中B和表7可知，用Hz36菌株处理七天后可以显著提高11.5％，十二天后可以显著提高12.3％，表明Hz36菌株对油菜的根部有显著的促生作用。该实验重复两次，实验结果相似。

综上所述，Hz36菌株对油菜根肿病和拟南芥根肿病都有较好的防效，能够降低油寄主中肿病菌的含量和延缓根肿菌的发育，可以促进油菜籽早期的萌发和促进早期油菜根长的生长，体外可以抑制根肿菌休眠孢子的萌发。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一株贵州木霉Hz36菌株、生防菌剂及其制备方法和应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 644

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtctccgtt ggtgaaccag cggagggatc attaccgagt 60

ttacaactcc caaaacccaa tgtgaacgtt accaaactgt tgcctcggcg ggatctctgc 120

cccgggtgcg tcgcagcccc ggaccaaggc gcccgccgga ggaccaacca aaactctttt 180

tgtatacccc ctcgcgggtt ttttataatc tgagccttct cggcgcctct cgtaggcgtt 240

tcgaaaatga atcaaaactt tcaacaacgg atctcttggt tctggcatcg atgaagaacg 300

cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc agaattcagt gaatcatcga atctttgaac 360

gcacattgcg cccgccagta ttctggcggg catgcctgtc cgagcgtcat ttcaaccctc 420

gaacccctcc ggggggtcgg cgttggggat cggccctgcc tcttggcggc ggccgtctcc 480

gaaatacagt ggcggtctcg ccgcagcctc tcctgcgcag tagtttgcac actcgcatcg 540

ggagcgcggc gcgtccacag ccgttaaaca cccaacttct gaaatgttga cctcggatca 600

ggtaggaata cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg agga 644

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggcaccaca ccttctacaa tga 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctccttctg catacggtcg ga 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catcgagaag ttcgagaagg 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gccatccttg ggagatacca gc 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gagttcaagg aggccttctc cc 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

catctttctg gccatcatgg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aatccacgag acaaccta 18

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agcgatacct gagaacata 19

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

caccgactac ctgatgaa 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cagcttctcc ttgatgtc 18

Claims

1.一株具有防治植物根肿病、促进植物种子的萌发和促进根系生长中的一种或多种作用的贵州木霉（Trichoderma guizhouense）Hz36菌株，其特征在于，所述菌株的保藏编号为CCTCC NO：M2021079。

2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

3.一种生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂包括权利要求1或2所述的Hz36菌株的孢子。

4.根据权利要求3所述的生防菌剂，其特征在于，生防菌剂中Hz36菌株的孢子数量为1×10⁷CFU/mL。

5.权利要求3或4所述生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求1所述Hz36菌株接种于PDA培养基中，培养7~10d，得到所述的生防菌剂。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述培养的温度为20~28℃。

7.权利要求1或2所述的Hz36菌株或权利要求3或4所述的生防菌剂或利用权利要求5或6所述制备方法制备得到的生防菌剂在防治植物根肿病和/或促进植物生长中的应用，其特征在于，所述防治植物根肿病的包括防治油菜或拟南芥根肿病；所述促进植物生长包括促进油菜种子萌发和/或促进油菜根系生长。