CN110938551A - 拟康宁木霉t-51菌株在西瓜枯萎病防治中的应用 - Google Patents

拟康宁木霉t-51菌株在西瓜枯萎病防治中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株拟康宁木霉T‑51菌株在西瓜枯萎病生物防治中的应用。本发明的拟康宁木霉T‑51菌株分生孢子悬浮液能够显著抑制苗期西瓜枯萎病。拟康宁木霉T‑51菌株的液体培养物滤液能够抑制西瓜枯萎病菌的菌丝生长。拟康宁木霉T‑51菌株在PDA上生长产生的挥发性物质能够抑制西瓜枯萎病菌的菌丝生长和分生孢子萌发。

Description

拟康宁木霉T-51菌株在西瓜枯萎病防治中的应用
技术领域
本发明涉及植物病害生物防治技术领域，具体地说涉及拟康宁木霉T-51菌株在西瓜枯萎病防治中的应用。
背景技术
木霉菌是广泛存在于自然界的一种真菌。木霉菌(Trichoderma spp.)属于半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科。木霉菌广泛存在于土壤、根围、叶围、种子等生态环境中，也是一种优良的生防菌。由于木霉菌的广泛适应性、广谱性和多机制性，因此该菌一直是植物病害生物防治研究的重点对象。
西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)引起造成西瓜连作障碍的重要病害，在西瓜设施栽培生产中危害尤为严重。长期以来，西瓜枯萎病防治主要依赖于轮作和化学药剂。但由于西瓜栽培面积逐渐扩大，能够用于轮作的空间越来越少，并且化学药剂的过量使用严重污染农产品和生态环境，危及人畜健康。因此，近年来生物防治正日益成为西瓜枯萎病防控中的一条重要的途径。
发明内容
本发明的目的首先在于提供一种拟康宁木霉(Trichoderma koningiopsis)T-51菌株，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2015729。
该菌株分离自湖北武汉地区油菜田土壤中，该菌种已于2015年12月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；保藏地点为：中国、武汉、武汉大学。
该拟康宁木霉T-51菌株置于葡萄糖马铃薯琼脂培养基PDA上培养一周，菌丝发达、产生大量气生菌丝，产生蓬松茂密的产孢簇，呈浅绿色至深绿色，无可溶性色素，无明显气味，最适生长温度为24～30℃，光照条件有利于其生长和产孢。
本发明还提供了上述拟康宁木霉菌株T-51菌在防治西瓜枯萎病中的应用；具体的说，使用拟康宁木霉菌株T-51分生孢子悬浮液接种于西瓜根际土壤中，可防治西瓜苗期枯萎病。
其中所述的拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液，是通过如下制备方法制备得到的：
1)将拟康宁木霉T-51菌株接种在PDA培养基上培养，得到拟康宁木霉T-51菌株菌落；
2)将步骤1)得到的拟康宁木霉T-51菌株菌落边缘菌丝接种到PDA培养皿上培养；
3)在步骤2)的培养皿中加入无菌水，刮洗菌落表面的分生孢子，混匀，即得到拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液；
其中所述步骤1)中，培养条件为在温度为20℃，光照条件下培养2天；
所述步骤2)中，培养条件为在温度为20℃，光照条件下培养2天。
其中，PDA培养基的配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉11g,补充蒸馏水至1000ml。
PDA制作方法：将洗净后去皮的马铃薯切片，加水800ml煮沸约半小时，用纱布滤去马铃薯，然后加入葡萄糖20g，将11g琼脂粉加200ml水搅拌均匀，加入上述溶液中，再加水补足至1000ml，搅拌溶解后分装灭菌。
本发明还提供了一种利用拟康宁木霉T-51菌株制备抑制西瓜枯萎病菌生长的滤液，其是通过如下方法制备的：
1)将拟康宁木霉T-51菌株接种在PDA培养基上培养，得到拟康宁木霉T-51菌株菌落；
2)将步骤1)得到拟康宁木霉T-51菌落边缘的菌丝块接种至PDB培养液中培养，得到培养物；
3)将步骤2)得到的培养物离心，取离心上清液经滤纸过滤，得到的初级滤液经细菌过滤器再次过滤，得到滤液。
其中，PDB液体培养基的配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，补充蒸馏水至1000ml。
PDB制作方法：将洗净后去皮的马铃薯切片，加水1000ml煮沸约半小时，用纱布滤去马铃薯，然后加入葡萄糖20g，加水补足至1000ml，搅拌溶解后分装灭菌。
进一步地，所述步骤1)中，培养条件为在温度为20℃，光照条件下培养2天；所述步骤2)中，培养条件为在温度为25℃、150r/min的条件下振荡培养7天。
本发明还提供了一种拟康宁木霉T-51菌株在PDA培养基上产生的挥发性物质对西瓜枯萎病抑制的应用，所述挥发性物质在密闭条件下能够抑制枯萎病菌的菌丝生长、孢子萌发。
本发明的有益效果在于：
1)本发明的拟康宁木霉T-51菌株的分生孢子悬浮液对西瓜枯萎病起到明显的抑制作用。
2)本发明的拟康宁木霉T-51菌株的液体培养物滤液对西瓜枯萎病原菌菌丝生长具有明显的抑制作用。
3)本发明的拟康宁木霉T-51菌株在PDA上生长产生的挥发性物质对西瓜枯萎病原菌的菌丝生长和分生孢子萌发具有明显的抑制作用。
本发明的拟康宁木霉T-51菌株的分生孢子悬浮液在对西瓜枯萎病起到明显抑制作用的同时，还能够促进西瓜种子的萌发和西瓜幼苗的生长，因此具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为拟康宁木霉T-51菌株的分生孢子悬浮液浸种对西瓜苗期枯萎病的防治效果；
图2为拟康宁木霉T-51菌株的液体培养物滤液对西瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制作用；
图3为拟康宁木霉T-51菌株在PDA培养基上产生的挥发性物质对西瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制作用；
图4为拟康宁木霉T-51菌株在PDA培养基上产生的挥发性物质对西瓜枯萎病菌孢子萌发芽管生长的抑制作用。
其中：A：西瓜枯萎病菌分生孢子萌发情况，
B：西瓜枯萎病菌分生孢子的萌发率，
C：西瓜枯萎病菌分生孢子萌发的芽管长度测量结果。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
下列实施例中所用的原料试剂除非特别注明的，均为常规市售产品。
实施例1 拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液的制备
PDA制作方法：将洗净后去皮的马铃薯切片，加水800ml煮沸约半小时，用纱布滤去马铃薯，然后加入葡萄糖20g，将11g琼脂粉加200ml水搅拌均匀，加入上述溶液中，再加水补足至1000ml，搅拌溶解后分装灭菌。
PDA培养基的配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉11g,补充蒸馏水至1000ml。
1)将拟康宁木霉T-51菌株接种在PDA培养基上培养，培养条件为在温度为20℃，光照条件下培养2天；得到拟康宁木霉T-51菌株菌落；
2)将步骤1)得到的拟康宁木霉T-51菌株菌落边缘菌丝接种到PDA培养皿上培养；培养条件为在温度为20℃，光照条件下培养2天；
3)在步骤2)的培养皿中加入无菌水，刮洗菌落表面的分生孢子，混匀，即得到拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液。
实施例2：拟康宁木霉T-51菌分生孢子悬浮液浸种对西瓜苗期枯萎病的抑制作用
供试西瓜材料为W28-7，来源于上海市农业科学院园艺研究所。用1×107个孢子/mL拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液(实施例1中制备的)将西瓜种子浸种8-10小时，无菌水浸种作为对照，各处理50粒种子。供试西瓜枯萎病菌(尖孢镰刀菌西瓜专化型)分离自田间西瓜枯萎病病株根部，并经过了病原学鉴定和致病力检测。
浸种后的西瓜种子在28℃下保湿催芽，然后播种至装有育苗基质的直径8cm×高6cm的育苗纸钵，在网室中生长至一叶一心时期。每处理选取10株长势一致的一叶一心时期的西瓜幼苗，将幼苗从纸钵中取出，用水洗净根部，将幼苗根部在浓度为1×106浓度的西瓜枯萎病菌孢子悬浮液中浸泡10分钟，然后再将幼苗栽回育苗钵中，继续在网室生长10-15天，观察西瓜幼苗枯萎病的发病情况，计算病情指数。
将西瓜枯萎病的发病严重程度分为0～5级：
0级：完全健康；
1级：中午1-2片子叶发黄萎蔫，夜间能恢复；
2级：子叶严重萎蔫或一片真叶萎蔫；
3级：真叶明显萎蔫，子叶严重枯萎或枯死；
4级：全株明显萎蔫，心叶成活；
5级：整株枯死倒伏。
根据公式计算病情指数：病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100。
结果如图1所示，经过拟康宁木霉T-51菌株孢子悬浮液浸种处理后的西瓜幼苗枯萎病病情指数与对照相比明显下降。
实施例3：拟康宁木霉T-51菌株的液体培养物滤液对西瓜枯萎病菌(尖孢镰刀菌)菌丝生长的抑制作用
1、制备拟康宁木霉T-51菌的液体培养物滤液
PDB制作方法：将洗净后去皮的马铃薯切片，加水1000ml煮沸约半小时，用纱布滤去马铃薯，然后加入葡萄糖20g，加水补足至1000ml，搅拌溶解后分装灭菌。
其中，PDB液体培养基的配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，补充蒸馏水至1000ml。
1)将拟康宁木霉T-51菌株接种在PDA培养基上培养，培养条件为在温度为20℃，光照条件下培养2天，得到拟康宁木霉T-51菌株菌落；
2)将步骤1)得到拟康宁木霉T-51菌落边缘的菌丝块接种至PDB培养液中培养，培养条件为在温度为25℃、150r/min的条件下振荡培养7天，得到培养物；
3)将步骤2)得到的培养物离心，取离心上清液经滤纸过滤，得到的初级滤液经细菌过滤器再次过滤，得到滤液。
2、在20ml PDA培养基中添加200μl上述拟康宁木霉T-51菌株液体培养物滤液，装于直径9cm的培养皿中制成平板。以加入200μl PDB的PDA培养基制成平板为对照。在含有各种处理的平板中央接种直径5mm的西瓜枯萎病菌菌丝块(源于PDA培养5d的菌落边缘)。在20℃下培养5天，测定各平板西瓜枯萎病菌的菌落直径。各处理设置5个重复。结果如图2所示，拟康宁木霉T-51菌株的液体培养物滤液对西瓜枯萎病菌菌丝生长有抑制作用。
实施例4：拟康宁木霉T-51菌产生的挥发性物质对西瓜枯萎病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用
一、拟康宁木霉T-51菌株产生的挥发性物质对西瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制作用
在两个PDA平板上分别接种西瓜枯萎病菌和拟康宁木霉T-51菌株的菌丝块(源于PDA培养2d的菌落边缘)，将两个培养皿对扣，拟康宁木霉T-51菌株菌丝块在下，西瓜枯萎病菌在上，用宽5cm的保鲜膜缠绕3圈将双皿密封。以空白PDA和西瓜枯萎病菌对扣培养为对照。将对扣好的培养皿在20℃下培养5天，测量西瓜枯萎病菌的菌落直径。结果如图3所示，拟康宁木霉T-51菌株产生的挥发性物质对西瓜枯萎病菌菌丝生长有明显的抑制作用。
二、拟康宁木霉T-51菌株产生的挥发性物质对西瓜枯萎病菌孢子萌发的抑制作用
在PDA平板上接种拟康宁木霉T-51菌株的菌丝块，20℃下培养两天。取100μl浓度为1×107个孢子/ml的西瓜枯萎病菌分生孢子悬液均匀涂布在另一个PDA平板上。将两个培养皿对扣，拟康宁木霉T-51菌株在下，西瓜枯萎病菌孢子在上，用封口膜将双皿密封。以空白PDA培养皿与接种西瓜枯萎病菌孢子液的平板对扣作为对照。每个处理做5个重复。将所有平板置于20℃下培养，分别在3h、6h、9h、12h时在光学显微镜下统计各平板西瓜枯萎病菌孢子的萌发率，并测量芽管长度，每平板随机调查150个以上的孢子。结果如图4所示，拟康宁木霉T-51产生的挥发性物质能够减慢西瓜枯萎病菌孢子的萌发速率，并对西瓜枯萎病菌孢子萌发后的芽管伸长有显著的抑制作用。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (5)

1.拟康宁木霉T-51菌株在防治西瓜枯萎病中的应用，其特征在于，使用拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液浸种8-10小时，用于防治苗期西瓜枯萎病。
2.权利要求1所述拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液，其是通过如下方法制备得到的：
1)将拟康宁木霉T-51菌株接种在PDA培养基上，20℃，光照下培养2天，得到拟康宁木霉T-51菌株菌落；
2)将步骤1)得到的拟康宁木霉T-51菌株菌落边缘菌丝接种到PDA培养皿上培养，20℃，光照下培养7-10天；
3)在步骤2)的培养皿中加入无菌水，刮洗菌落表面的分生孢子，混匀，即得到拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液。
3.拟康宁木霉T-51菌株的液体培养物滤液通过如下方法制备得到的：
1)将拟康宁木霉T-51菌株接种在PDA培养基上，20℃，光照下培养2天，得到拟康宁木霉T-51菌株菌落；
2)将步骤1)得到拟康宁木霉T-51菌落边缘的菌丝块接种至PDB培养液中，25℃、150r/min的条件下振荡培养7天，得到培养物；
3)将步骤2)得到的培养物离心，取离心上清液经滤纸过滤，得到的初级滤液经细菌过滤器再次过滤，得到滤液。
4.权利要求3拟康宁木霉T-51菌株的液体培养物滤液用于抑制西瓜枯萎病菌的菌丝生长的用途。
5.拟康宁木霉T-51菌株在PDA培养基上产生的挥发性物质用于抑制西瓜枯萎病菌的菌丝生长和分生孢子萌发的用途。
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