CN112522130B - 一种防治橡胶榕白绢病的链霉菌、其菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种防治橡胶榕白绢病的链霉菌、其菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种防治橡胶榕白绢病的链霉菌，其命名为链霉菌(Streptomycetes spectabilis)AY‑12，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日：2019年9月4日，保藏编号为GDMCC NO：60759。本发明从土壤中分离筛选出链霉菌(Streptomycetes spectabilis)AY‑12，对橡胶榕白绢病具有防治作用，对多种病原菌具有拮坑作用，对橡胶榕白绢病的防治具有重要意义，对生态环境影响小。

Description

一种防治橡胶榕白绢病的链霉菌、其菌剂及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及植物的微生物防治技术领域，具体涉及一种防治橡胶榕白绢病的链霉菌，即链霉菌(Streptomycetes spectabilis)AY-12及其菌剂、菌剂的制备方法和应用。
背景技术
橡胶榕(Ficus elastica)也称印度榕，是桑科榕属常绿木本观叶植物。橡胶榕属于热带树种，喜阳耐阴，适应强光，可盆栽观赏，也可栽入庭院，是我国南方地区重要的观赏植物。在橡胶榕的栽培中，白绢病一直是困扰其健康生长的重要限制因素。白绢病主要发生于橡胶榕的根、茎基部，一般在近地面的根茎处开始发病，而后向上部和地下部蔓延扩展。病部首先呈褐色，进而皮层腐烂。受害植物叶片失水凋萎，枯死脱落，植株生长停滞。据调查，该病在广东橡胶榕种植基地都有发生，在个别花场发生严重，发病率甚至达到30％以上。该病属土传病害，寄主范围较广泛，生产上极难防控。
目前，橡胶榕防治白绢病的主要方法是采用化学农药防治，但长期使用化学农药容易造成农药残留超标以及病原菌抗药性和环境污染等问题。生物防治具有经济有效、防效持久、环境友好等优势，因此，从土壤分离获得对橡胶榕白绢病菌具有拮抗作用的微生物菌种，对该病害的防治具有重要意义，符合绿色环保及农业可持续发展的需求。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术中橡胶榕白绢病防治存在的防治效果不理想、环境生态遭到破坏的问题，提供一种防治橡胶榕白绢病的链霉菌，该链霉菌株对橡胶榕白绢病菌具有强烈的抑菌作用，可抑制菌丝的扩展以及降低菌核形成数量，利用该链霉菌株制备的生物菌剂环保无毒性，对生态环境影响小。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种防治橡胶榕白绢病的链霉菌，其命名为链霉菌(Streptomycetesspectabilis)AY-12，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼，保藏日：2019年9月4日，保藏编号为GDMCC NO：60759。
具体地，所述链霉菌(Streptomycetes spectabilis)AY-12具有以下生物学特征：在高氏一号培养基上培养7d后观察，其单菌落为圆形，气生菌丝粉色、较发达，基内菌丝暗橙色，孢子丝长直，无螺旋，孢子短杆状，表面光滑。
具体地，所述高氏一号培养基为：可溶性淀粉20g、NaCl 0.5g、KNO31g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、琼脂20g，用水定容至1000mL，调pH至7.4。
本发明还提供了一种包含上述防治橡胶榕白绢病的链霉菌的菌剂，所述菌剂采用如下方法制得：
(1)将链霉菌AY-12平板打5mm菌饼，接种2菌饼至100mL PD液体培养基中进行摇床培养，培养条件为：28℃，搅拌速度180r/min培养3天，制成种子液；
(2)取种子液接种于液体发酵培养基中，所述液体发酵培养基的配方为：每升液体中含了可溶性淀粉20g、NaCl 0.5g、KNO31g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g和FeSO4·7H2O0.01g，按照种子液和液体发酵培养基的总液体量每80mL中含8mL种子液的比例接种，然后于28℃条件下、180r/min振荡培养7天，获得菌剂。
上述制备方法中，所述PD液体培养基为：葡萄糖20g和马铃薯200g，用水定容至1000mL。
本发明还提供了将上述菌剂用于防治橡胶榕白绢病的应用，该应用的具体方法是：在橡胶榕苗期灌根使用，每株100mL，连续使用3-4次，每次间隔10天。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明从土壤中分离筛选出链霉菌(Streptomycetes spectabilis)AY-12，对橡胶榕白绢病具有防治作用，对多种病原菌具有拮坑作用，对橡胶榕白绢病的防治具有重要意义，对生态环境影响小。
2、本发明利用链霉菌(Streptomycetes spectabilis)AY-12制备菌剂，对橡胶榕白绢病菌有强烈的抑菌作用，可抑制菌丝的扩展以及降低菌核形成数量，而且该菌剂来源环保无毒性，对生态环境影响小，且该菌株培养条件要求低，具有很好的开发应用前景。
附图说明
图1为本发明链霉菌(Streptomycetes spectabilis)AY-12在高氏一号培养基上的菌落正面形态图；
图2为本发明链霉菌(Streptomycetes spectabilis)AY-12的孢子形态图；
图3为空白对照组对橡胶榕白绢病菌的皿内抑菌效果图；
图4为本发明的菌剂对橡胶榕白绢病菌的皿内抑菌效果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明的保护范围。
实施例1
一种防治橡胶榕白绢病的链霉菌，其命名为链霉菌(Streptomycetesspectabilis)AY-12，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼，保藏日：2019年9月4日，保藏编号为GDMCC NO：60759。
该链霉菌AY-12菌株是通过以下方法采集得到的：该菌株于2019年6月24日从广东省阳山县桑树林土壤经常规稀释平板法分离得到。
所述常规稀释平板法分离的具体方法为：将采集的土样经自然风干，过筛，取10g置于三角瓶中，再加入90mL的无菌水，置180r/min摇床震荡20min；然后用无菌水依次稀释土壤悬液至104倍，量取0.1mL滴于高氏一号培养基表面，用三角涂棒涂布均匀；随后置28℃恒温培养箱中培养，随时观察菌落生长情况，挑取平板中单菌落划线转接到另外的高氏一号培养基上培养，经3次划线分离纯化，获得单菌落，接种斜面培养后于4℃保存。
所述高氏一号培养基的配方为：可溶性淀粉20g、NaCl 0.5g、KNO3 1g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、琼脂20g，纯净水定容至1000mL，调pH至7.4。
该链霉菌AY-12菌株的生物学特征观察如下：
将链霉菌AY-12菌株在所述高氏一号培养基上培养7天后观察，其单菌落为圆形，气生菌丝粉色、较发达，基内菌丝暗橙色，孢子丝长直，无螺旋，孢子短杆状，表面光滑。
该链霉菌AY-12菌株在pH为7.4的液体发酵培养液中，28℃培养条件下，180r/min振荡培养7天，发酵液清亮，菌球圆形，均一。所述液体发酵培养液为：每升液体中含了可溶性淀粉20g、NaCl 0.5g、KNO31g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g和FeSO4·7H2O 0.01g。
根据《链霉菌鉴定手册》推荐的8种培养基，将菌株AY-12接种后，于28℃培养15d观察菌株生长情况，记录气生菌丝、基内菌丝的颜色以及是否产生可溶性色素。AY-12菌株在高氏一号培养基、PDA培养基、无机盐淀粉琼脂、燕麦培养基、葡萄糖天门冬素培养基和克氏培养基上生长良好；而在察氏培养基、麦芽汁酵母膏培养基上生长较差，在上述8种培养基上均有不同程度色素产生。根据以上形态特征分析，对照链霉菌鉴定手册，将AY-12初步鉴定为链霉菌粉红孢类群。
用细菌基因组提取试剂盒提取AY-12菌株基因组DNA，采用细菌通用引物：
F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO：1)
R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(SEQ ID NO：2)
进行16S rDNA的PCR扩增，将所得序列提交到GenBank数据库进行分析比对。所测得16S rDNA序列，共1398个有效碱基，与GenBank基因库中原核生物的16S rDNA序列进行比较，调出与其序列同源性较高菌株的16S rDNA序列。比对相似性98％以上的菌株均为Streptomycetes spectabilis，结合形态及分子生物学特征鉴定AY-12菌株为Streptomycetes spectabilis。
链霉菌AY-12菌株的16S rDNA核苷酸全序列如SEQ ID NO：3所示：序列如下：
GCGTTAGGATTTAGTCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACACGGGATCGCATGATCTTCGTGTGGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTARGKTGGTGGGCGACATTCCACGTCGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCSSCCTGGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAARGRAWTTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTKGSYTWWATTTCGACGCAACGCGARGAACCTTACCAARGCTTGACATACACCGGAAACGGCCAGAGATGGTCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGGACGCTGTTCGCTCTGTGGCTCAGAGCTGACGACAGCGAACCCCCC
采用液体发酵法测定该链霉菌AY-12菌株代谢产物的抑菌活性：
将培养于高氏一号平板的链霉菌AY-12菌株接种于PD液体培养基中，于28℃条件下，180r/min振荡培养3d。取8mL链霉菌AY-12菌株种子培养液接种于80mL所述液体发酵培养基，于28℃条件下，180r/min振荡培养7d。收集发酵液，12000rpm/min离心10min，获取上清液，并用细菌滤器过滤备用。在PDA培养基上培养橡胶榕白绢病菌，打孔器打菌饼，将菌饼置于链霉菌AY-12发酵液中浸泡8h，用无菌滤纸吸干菌饼多余水分，接种于PDA培养基平板，每个处理3次重复，以空白发酵培养基浸泡为对照，28℃恒温培养箱内培养。培养3天对照接近满皿，测量菌落直径。请参照图3，图3为空白对照组对橡胶榕白绢病菌的皿内抑菌效果图；图4为链霉菌AY-12发酵液对橡胶榕白绢病菌的皿内抑菌效果图。
经测定，链霉菌AY-12菌株发酵液对橡胶榕白绢病菌具有明显抑制作用，抑制率达45％。将处理组与对照组继续培养30天，发酵滤液浸泡处理橡胶榕白绢病菌菌核产生数量与对照组相比降低50％。
上述的PDA培养基的配方为：称取200g马铃薯，洗净去皮切小块，加水煮沸半个小时，纱布过滤，再加入20g葡萄糖和20g琼脂，充分溶解后定容到1000mL，趁热纱布过滤分装，121℃灭菌20分钟，冷却后贮存备用。
以其它几种植物病原真菌为对象，测定链霉菌AY-12菌株的抑菌范围。倒PDA平板，将在PDA上培养好的香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)、柑橘炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)平板打菌饼，将菌饼分别置于链霉菌AY-12菌株液体发酵液中浸泡8h，用无菌滤纸吸干菌饼多余水分，接种于PDA平板，每个处理3次重复，以空白发酵培养液浸泡为对照，28℃恒温培养箱内培养。培养5天后测量菌落直径。通过对这几种真菌病害病原菌进行抑菌性能测试，测出的结果，即链霉菌AY-12菌株对3种病原菌的抑制作用如下表1所示：
表1链霉菌AY-12菌株对3种病原菌的皿内抑制作用
Figure BDA0002712898270000081
由上表可以看出，链霉菌AY-12菌株对这几种植物真菌病害的病原菌都有抑制作用。
实施例2
一种防治橡胶榕白绢病的链霉菌的菌剂，所述菌剂采用如下方法制得：
(1)将链霉菌AY-12平板打5mm菌饼，接种2菌饼至100mL PD液体培养基中进行摇床培养，培养条件为：28℃，搅拌速度180r/min培养3天，制成种子液；
(2)取种子液接种于液体发酵培养基中，所述液体发酵培养基的配方为：每升液体中含了可溶性淀粉20g、NaCl 0.5g、KNO31g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g和FeSO4·7H2O0.01g，按照种子液和液体发酵培养基的总液体量每80mL中含8mL种子液的比例接种，然后于28℃条件下、180r/min振荡培养7天，获得菌剂。
上述制备方法中，所述PD液体培养基为：葡萄糖20g和马铃薯200g，用水定容至1000mL。
实施例3
将实施例2制得的防治橡胶榕白绢病的链霉菌的菌剂用于防治橡胶榕白绢病，具体的防治方法为:将实施例2制得的菌剂(链霉菌AY-12发酶液)灌于橡胶榕根部。具体步骤：选取株高为40cm左右的健康橡胶榕植株，将白绢病菌培养平板打菌饼置于植株根部，每株环根部放置10个菌饼。接种后，每株苗浇灌AY-12发酵液100mL，相隔10天、20天分别再次浇灌。以液体发酵液培养基和清水处理植株为空白对照。每个处理10株苗，每处理3次重复。待清水对照发病达70％以上时记录发病情况。实验结果表明，当清水对照发病率为87％时，链霉菌AY-12发酵液处理发病率仅为13％，能显著降低橡胶榕的发病率(如表2所示)。链霉菌AY-12发酵液能有效防治橡胶榕白绢病，具有良好的应用潜力。
表2链霉菌AY-12发酵液对橡胶榕白绢病的防治效果
处理 平均发病率(％)
AY-12发酵液 13
液体发酵液培养基 93
清水 87
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应局限于该实施例和附图所公开的内容，所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，落入本发明保护的范围。
序列表
<110> 仲恺农业工程学院
<120> 一种防治橡胶榕白绢病的链霉菌、其菌剂及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 1398
<212> DNA
<213> 链霉菌属(AY-12)
<400> 3
gcgttaggat ttagtcggcg aacgggtgag taacacgtgg gcaatctgcc ctgcactctg 60
ggacaagccc tggaaacggg gtctaatacc ggatatgaca cgggatcgca tgatcttcgt 120
gtggaaagct ccggcggtgc aggatgagcc cgcggcctat cagctagttg gtgaggtaac 180
ggctcaccaa ggcgacgacg ggtagccggc ctgagagggc gaccggccac actgggactg 240
agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggcgaaag 300
cctgatgcag cgacgccgcg tgagggatga cggccttcgg gttgtaaacc tctttcagca 360
gggaagaagc gaaagtgacg gtacctgcag aagaagcgcc ggctaactac gtgccagcag 420
ccgcggtaat acgtagggcg cgagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa gagctcgtag 480
gcggcttgtc acgtcggttg tgaaagcccg gggcttaacc ccggggtctg cagtcgatac 540
gggcaggcta gagttcggta ggggagatcg gaattcctgg tgtagcggtg aaatgcgcag 600
atatcaggag gaacaccggt ggcgaaggcg gatctctggg ccgatactga cgctgaggag 660
cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacggtggg 720
cactargktg gtgggcgaca ttccacgtcg tccgtgccgc agctaacgca ttaagtgccc 780
sscctggggg agtacggccg caaggctaaa actcaargra wttgacgggg gcccgcacaa 840
gcggcggagc atgtkgsytw watttcgacg caacgcgarg aaccttacca argcttgaca 900
tacaccggaa acggccagag atggtcgccc ccttgtggtc ggtgtacagg tggtgcatgg 960
ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttgt 1020
cccgtgttgc cagcaggccc ttgtggtgct ggggactcac gggagaccgc cggggtcaac 1080
tcggaggaag gtggggacga cgtcaagtca tcatgcccct tatgtcttgg gctgcacacg 1140
tgctacaatg gccggtacaa tgagctgcga taccgcgagg tggagcgaat ctcaaaaagc 1200
cggtctcagt tcggattggg gtctgcaact cgaccccatg aagtcggagt cgctagtaat 1260
cgcagatcag cattgctgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcacg 1320
tcacgaaagt cggtaacacc cgaagccggt gggacgctgt tcgctctgtg gctcagagct 1380
gacgacagcg aacccccc 1398

Claims (7)

1.一种防治橡胶榕白绢病的链霉菌，其特征在于：其命名为链霉菌(Streptomycetesspectabilis)AY-12，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日：2019年9月4日，保藏编号为GDMCC NO：60759。
2.如权利要求1所述的防治橡胶榕白绢病的链霉菌，其特征在于,具有以下生物学特征：在高氏一号培养基上培养7d后观察，其单菌落为圆形，气生菌丝粉色、较发达，基内菌丝暗橙色，孢子丝长直，无螺旋，孢子短杆状，表面光滑。
3.如权利要求2所述的防治橡胶榕白绢病的链霉菌，其特征在于,所述高氏一号培养基为：可溶性淀粉20g、NaCl 0.5g、KNO31g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、琼脂20g，用水定容至1000mL，调pH至7.4。
4.一种如权利要求1所述的防治橡胶榕白绢病的链霉菌的菌剂的制备方法，其特征在于：将所述链霉菌AY-12菌株经液体发酵制备成生物制剂，包括以下步骤：
(1)将链霉菌AY-12平板打5mm菌饼，接种2菌饼至100mL PD液体培养基中进行摇床培养，培养条件为：28℃，搅拌速度180r/min培养3天，制成种子液；
(2)取种子液接种于液体发酵培养基中，所述液体发酵培养基的配方为：每升液体中含了可溶性淀粉20g、NaCl 0.5g、KNO31g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O0.5g和FeSO4·7H2O0.01g，按照种子液和液体发酵培养基的总液体量每80mL中含8mL种子液的比例接种，然后于28℃条件下、180r/min振荡培养7天，获得菌剂。
5.如权利要求4所述的防治橡胶榕白绢病的链霉菌的菌剂的制备方法，其特征在于，所述PD液体培养基为：葡萄糖20g和马铃薯200g，用水定容至1000mL。
6.一种防治橡胶榕白绢病的链霉菌的菌剂，其特征在于：采用权利要求4或5所述的制备方法制备而成。
7.权利要求6所述的防治橡胶榕白绢病的链霉菌菌剂的应用，其特征在于：在橡胶榕苗期灌根使用，每株100mL，连续使用3-4次，每次间隔10天。
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