CN108277182A - 一种壮观链霉菌xwstsp130906j234及其在三七疫病防治中的应用 - Google Patents

一种壮观链霉菌xwstsp130906j234及其在三七疫病防治中的应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种壮观链霉菌XWSTSP130906J234及其在三七疫病防治中的应用，所述壮观链霉菌XWSTSP130906J234保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101，保藏日期2017年08月08日，保藏编号CGMCC No.14504。本申请提供的壮观链霉菌XWSTSP130906J234对恶疫霉的抑制效果强，可以用于三七疫病的生物防治，且具备工业化生产的特性。

Description

一种壮观链霉菌XWSTSP130906J234及其在三七疫病防治中的 应用
技术领域
本申请属于生物技术领域，具体地说，涉及一种壮观链霉菌XWSTSP130906J234及其在三七疫病防治中的应用。
背景技术
壮观链霉菌(Streptomyces spectabilis)属于放线菌门(Actinobacteria)，放线菌纲(Actinobacteria)，放线菌亚纲(Actinobacteridae)，放线菌目(Actinobacterales)，链霉菌科(Streptomycetaceae)，链霉菌属(Streptomyces)。壮观链霉菌能产生许多抗生素，如大观霉素、曲张链菌素、硝苯吡喃酮、巴佛洛霉素、间环丙菌素和壮观链菌素等，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、杀虫、除草等活性。
三七(Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen.)又名田七，为五加科人参属的中国特有种，是一种我国重要的名贵中药材，由于在活血化瘀和心脑血管性疾病方面具有独特的疗效，并随着人们对三七认识程度的不断深入，三七产品市场需求量越来越大，刺激了三七种植面积不断扩大。但三七的病害问题一直是困扰三七种植业发展的重要障碍，其中三七疫病就是其中一个重要病害，其病原菌鉴定为鞭毛菌亚门卵菌纲的恶疫霉Phytophthoracactorum(Leb.et Cohn)该病原菌不仅能侵染三七地上部分造成叶片、花序软腐披垂、茎秆扭折、猝倒，还能引起地下部分的种腐和根腐，造成块根呈水浸状腐烂，对三七产业造成严重的经济损失。目前关于该病害的防治，主要还是采用化学农药。大量和长期使用化学农药容易导致病原菌产生抗性，同时还造成严重的环境污染、农药残留等问题，给人类健康和环境安全带来严重的威胁。与传统的化学农药相比，微生物源农药具有很多优点，尤其是在环境相容性和安全性方面的优势尤为明显，如对环境无污染、无残留、对人和家畜无危害等。
微生物源农药被认为是传统化学农药的有效替代物，壮观链霉菌也逐渐地应用于农业作物的病害防治中。
发明内容
本申请提供一种壮观链霉菌XWSTSP130906J234及其在三七疫病防治中的应用，用以提供一种运用于三七疫病防治的微生物源菌剂研发的菌株，避免或减少由不合理使用化学农药所导致的抗药性、环境污染和人类健康威胁问题。
本申请公开的壮观链霉菌XWSTSP130906J234，保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101，保藏日期2017年08月08日，保藏编号CGMCC No.14504。
如上所述的壮观链霉菌XWSTSP130906J234，其中，所述的壮观链霉菌是从马铃薯与玉米间作田中玉米的根际土壤中，采用平板稀释法分离获得。
如上所述的壮观链霉菌XWSTSP130906J234，其中，所述壮观链霉菌的分离过程为：将采集回的土壤在阴凉处放置6天，自然风干后，取5g土壤溶于盛有45mL无菌水的锥形瓶中，摇晃震荡30min，将其配制成悬浮液，然后按10倍浓度梯度稀释成10-3g/mL或者10-4g/mL的稀释液，运用平板涂布稀释法，取200μL稀释液分别涂布于高氏I号培养基上，每个浓度梯度做3个重复，倒置放于28℃培养箱中培养7天，根据菌株特征，挑取形态各异的菌株在高氏I号平板培养基上纯化2-3次，运用斜面培养基于4℃冰箱保存。
本申请公开的壮观链霉菌XWSTSP130906J234在三七疫病防治中的应用，其中，所述的壮观链霉菌的分离培养基采用高氏一号固体培养基，所述高氏I号固体培养基组成为：可溶性淀粉20.0g、NaCl 0.5g、KNO3 1.0g、MgSO4.7H2O 0.5g、K2HPO4 0.5g、FeSO4.7H2O0.01g、琼脂20.0g、蒸馏水1L，pH 7.4-7.6，在121℃下灭菌20min。
如上所述的应用，其中，所述的壮观链霉菌的分离培养基采用PDA培养基，所述PDA培养基的制作过程为:将马铃薯洗净去皮，切成小块，取200g加水煮烂，用4层纱布过滤，加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，再补足水分至1000毫升，121℃灭菌15min。
如上所述的应用，其中，采用对峙生长法测定所述的壮观链霉菌对三七疫病病原菌恶疫霉的抑制效果，具体为：采用对峙生长法测定放线菌的抑菌活性，将放线菌和供试真菌分别用高氏I号培养基和PDA培养基培养7天，然后用无菌打孔器分别取出直径为5mm的菌饼，对接于新鲜PDA培养基上，供试真菌接于培养基中心，于距供试真菌2cm处的两边接放线菌，每处理重复3次，28℃培养箱中培养5天后，测定各处理组和对照组的菌落半径，计算抑菌率，计算公式为：抑菌率＝1-处理半径/对照半径。
如上所述的应用，其中，所述的壮观链霉菌菌株在高氏I号培养基上培养7天后，其气生菌丝的颜色为橙色，基内菌丝的颜色为绯红色，无水溶性色素，在16×100倍光学显微镜下，其孢子丝呈弯曲或波形，孢子为椭圆形。
本发明提供的壮观链霉菌XWSTSP130906J234及其在三七疫病防治中的应用具有以下优点：
1、可以从马铃薯玉米间作田玉米根际土壤分离获得菌株，对恶疫霉的抑制效果强，可以用于三七疫病的生物防治，且具备工业化生产的特性。
2、避免或减少了由不合理使用化学农药所导致的抗药性、环境污染和人类健康威胁问题。
具体实施方式
以下将详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本申请公开的壮观链霉菌XWSTSP130906J234，保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101，保藏日期2017年08月08日，保藏编号CGMCC No.14504。
如上所述的壮观链霉菌XWSTSP130906J234，其中，所述的壮观链霉菌是从马铃薯与玉米间作田中玉米的根际土壤中，采用平板稀释法分离获得。
如上所述的壮观链霉菌XWSTSP130906J234，其中，所述壮观链霉菌的分离过程为：将采集回的土壤在阴凉处放置6天，自然风干后，取5g土壤溶于盛有45mL无菌水的锥形瓶中，摇晃震荡30min，将其配制成悬浮液，然后按10倍浓度梯度稀释成10-3g/mL或者10-4g/mL的稀释液，运用平板涂布稀释法，取200μL稀释液分别涂布于高氏I号培养基上，每个浓度梯度做3个重复，倒置放于28℃培养箱中培养7天，根据菌株特征，挑取形态各异的菌株在高氏I号平板培养基上纯化2-3次，运用斜面培养基于4℃冰箱保存。
本申请公开的壮观链霉菌XWSTSP130906J234在三七疫病防治中的应用，其中，所述的壮观链霉菌的分离培养基采用高氏一号固体培养基，所述高氏I号固体培养基组成为：可溶性淀粉20.0g、NaCl 0.5g、KNO3 1.0g、MgSO4.7H2O 0.5g、K2HPO4 0.5g、FeSO4.7H2O0.01g、琼脂20.0g、蒸馏水1L，pH 7.4-7.6，在121℃下灭菌20min。
本申请提供的上述壮观链霉菌XWSTSP130906J234于2016年9月，在云南省宣威市板桥镇马铃薯与玉米间作田玉米根际土壤中采用平板稀释法分离获得。该菌株产生的生物活性物质对三七疫病病原菌恶疫霉Phytophthora cactorum(Leb.etCohn)有较强的抑菌活性，在三七疫病中具有很大的开发应用前景，具备工业化生产的特性。
如上所述的应用，其中，所述的壮观链霉菌的分离培养基采用PDA培养基，所述PDA培养基的制作过程为:将马铃薯洗净去皮，切成小块，取200g加水煮烂，用4层纱布过滤，加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，再补足水分至1000毫升，121℃灭菌15min。
如上所述的应用，其中，采用对峙生长法测定所述的壮观链霉菌对三七疫病病原菌恶疫霉的抑制效果，具体为：采用对峙生长法测定放线菌的抑菌活性，将放线菌和供试真菌分别用高氏I号培养基和PDA培养基培养7天，然后用无菌打孔器分别取出直径为5mm的菌饼，对接于新鲜PDA培养基上，供试真菌接于培养基中心，于距供试真菌2cm处的两边接放线菌，每处理重复3次，28℃培养箱中培养5天后，测定各处理组和对照组的菌落半径，计算抑菌率，计算公式为：抑菌率＝1-处理半径/对照半径。
如上所述的应用，其中，所述的壮观链霉菌菌株在高氏I号培养基上培养7天后，其气生菌丝的颜色为橙色，基内菌丝的颜色为绯红色，无水溶性色素，在16×100倍光学显微镜下，其孢子丝呈弯曲或波形，孢子为椭圆形。
本申请运用高氏一号固体培养基，采用平板稀释法从马铃薯与玉米间作田玉米根际土壤分离纯化出该菌，采用形态鉴定和分子鉴定确定了该菌的分类地位，其在高氏I号培养基上培养7d后，气生菌丝的颜色为橙色，基内菌丝的颜色为绯红色，无水溶性色素产生，孢子丝弯曲或波形，孢子为椭圆形。16S rDNA序列与EzTaxon server 2.1数据库中的Streptomyces spectabilis NBRC 13424(T)的相似性为98.91％。邻接(N-J)系统发育树也与Streptomyces spectabilis NBRC 13424(T)聚为一支。上述结果说明该菌株为壮观链霉菌(Streptomyces spectabilis)。采用对峙生长法测定该菌对三七疫病病原菌恶疫霉Phytophthora cactorum(Leb.etCohn)的抑制效果，结果发现，该菌株对恶疫霉的抑菌效果为75.12％。因此，该菌株有用于三七疫病生物防治的菌株的开发的潜力。
本申请运用高氏一号固体培养基，采用平板稀释法从马铃薯与玉米间作田玉米根际土壤分离纯化出该菌，采用形态鉴定和分子鉴定确定了该菌的分类地位。
实施例一：壮观链霉菌的分离、鉴定
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1土壤采集
于2016年9月6日，采集云南省宣威市板桥镇(N26°05′52.3″，E104°04′27.5″，1967米)马铃薯玉米间作田玉米根际，其玉米品种为会单4号，采集方法采用四分法，将采集的土样装入无菌袋中密封，带回实验室于4℃冰箱保存备用。
1.1.2分离培养基
高氏一号固体培养基：可溶性淀粉20.0g、NaCl 0.5g、KNO3 1.0g、MgSO4.7H2O0.5g、K2HPO4 0.5g、FeSO4.7H2O 0.01g、琼脂20.0g和蒸馏水1L，pH 7.4-7.6，在121℃下灭菌20min。
1.1.3放线菌的分离纯化方法
分离方法：将采集回的土壤在阴凉处放置6天，自然风干后，取5g土壤溶于盛有45mL无菌水的锥形瓶(V＝200mL)中，摇床震荡30min，将其配制成悬浮液，然后按10倍浓度梯度稀释成10-3、10-4g/mL的稀释液，运用平板涂布稀释法，取200μL稀释液分别涂布于高氏I号培养基上，每个浓度梯度做3个重复，倒置放于28℃培养箱中培养7天。根据菌落特征，挑取形态各异的菌株在高氏I号平板培养基上纯化2-3次，运用斜面培养基于4℃冰箱保存。
形态鉴定方法：采用插片法进行形态观察，每个平板插4片，于盖玻片1/2处接种放线菌，培养7～10d，经美蓝染色后在显微镜下观察拍照，参照《链霉菌鉴定手册》进行鉴定。
分子鉴定方法：首先采用高氏一号固体培养基培养放线菌7d，然后用无菌打孔器(D＝5mm)打取两块菌饼，加入内盛100mL液体高氏I培养基的的锥形瓶(V＝250mL)中，28℃摇床中振荡培养7d，取1.5mL的菌液于EP管中，12000r/min离心10min，弃上清液。加入含20g/L溶菌酶的1×TE 500μL，37℃下水浴1h，每10min震荡一次。然后加入50μL的20％SDS(质量体积比)和5μL的蛋白酶K(20g/L)，37℃下水浴1h。加入500μL酚/氯仿/异戊醇(25:24:1，体积比)，12000r/min，4℃离心10min，取上清液，重复2次。加1/10体积3mol/L的乙酸钠和500μL异丙醇，4℃下沉淀2h以上。12000r/min离心15min，去上清液，加70％乙醇洗涤两次，风干，加50μL1×TE溶解DNA。取5μL基因组DNA琼脂糖电泳检测。
16S rRNA基因PCR扩增反应体系为50μL：引物27f和1492r各1μL，PCR mix 25μL,模板DNA 0.5μL，ddH2O 22.5μL。反应条件:94℃预变性5min；94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸2min，32个循环；72℃总延伸5min。反应结束后取3μL产物凝胶电泳检测。条带清明了PCR产物送中美泰和生物技术(北京)有限公司进行测序。根据测序结果，将序列进行拼接，然后将拼接完整的16S rDNA序列提交到网站EzTaxon server 2.1(http://147.47.212.35:8080/)进行比对，查找相似性最高的典型菌株并下载其序列。运用MEGA6.06软件，采用国际通用的邻接法和Kimura双参数矫正模型构建系统发育树。重复取样1000次进行自展值分析来评估系统进化树的拓扑结构的稳定性。
1.2鉴定结果
形态鉴定结果：该菌株在高氏I号培养基上培养7d后，其气生菌丝的颜色为橙色，基内菌丝的颜色为绯红色，无水溶性色素，在16×100倍光学显微镜下，其孢子丝弯曲或波形，孢子为椭圆形。查阅《链霉菌鉴定手册》(阎逊初，1975)，发现该菌株与状观链霉菌的形态特征相似。
分子鉴定结果：根据公司双端测序结果，采用Contigexpress软件进行拼接，拼接好的序列与EzTaxon server 2.1数据库进行比对，结果发现EzTaxon server 2.1数据库中的Streptomyces spectabilis NBRC 13424(T)(登录号AB184393)菌株的相似性为98.91％。根据Stackebrandt提出的16S rDNA序列相似性大于98.4％可以作为种的判别标准，可以判定该菌为状观链霉菌。此外，系统发育分析也表明该菌与StreptomycesspectabilisNBRC 13424(T)聚为一支，说明该菌与Streptomyces spectabilis具有同源性，也更加说明了该菌的分类地位。
因此，根据其形态特征、16S rDNA序列相似性以及系统发育分析等结果，可以确定该菌为状观链霉菌。
实施例二：壮观链霉菌的分离、鉴定
2.1材料与方法
2.1.1供试培养基
高氏一号固体培养基：可溶性淀粉20.0g、NaCl 0.5g、KNO3 1.0g、MgSO4.7H2O0.5g、K2HPO4 0.5g、FeSO4.7H2O 0.01g、琼脂20.0g和蒸馏水1L，pH 7.4-7.6，在121℃下灭菌20min。
PDA培养基:将马铃薯洗净去皮，切成小块，取200g加水煮烂(煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即煮马铃薯块煮马铃薯块可)，用4层纱布过滤，加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，再补足水分至1000毫升，121℃灭菌15min。
2.1.2供试作物病原菌
三七疫病病原菌恶疫霉Phytophthora cactorum(Leb.etCohn)由云南农业大学植物保护学院云南省植物病理重点实验室提供。
2.2对农作物病原菌的抑制作用的筛选方法
运用对峙生长法测定放线菌的抑菌活性，将放线菌和供试真菌分别用高氏I号培养基和PDA培养基培养7天，然后用无菌打孔器(D＝5mm)分别取出直径为5mm的菌饼，对接于新鲜PDA培养基上(供试真菌接于培养基中心，于距供试真菌2cm处的两边接放线菌)，每处理重复3次，28℃培养箱中培养5天后，测定各处理组和对照组的菌落半径。按如下公式计算抑菌率：抑菌率＝1-处理半径/对照半径。
2.2抑菌试验结果
采用对峙生长法测定三七疫病病原菌恶疫霉Phytophthora cactorum(Leb.etCohn)的抑制效果，从表1可以看出，该菌株对三七疫病病原菌恶疫霉的抑菌效果较好，其抑菌率可达75.12％。因此，该菌株有用于三七疫病生物防治的菌株的开发的潜力和运用前景。
表1壮观链霉菌对三七疫病病菌病原菌恶疫霉的抑菌试验结果
综上所述，本申请提供的壮观链霉菌XWSTSP130906J234及其在三七疫病防治中的应用，一方面，可以从马铃薯玉米间作田玉米根际土壤分离获得菌株，对恶疫霉的抑制效果强，可以用于三七疫病的生物防治，且具备工业化生产的特性。另一方面，避免或减少由不合理使用化学农药所导致的抗药性、环境污染和人类健康威胁问题。
上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改，并能够在本申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.一种壮观链霉菌XWSTSP130906J234，保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101，保藏日期2017年08月08日，保藏编号CGMCC No.14504。
2.如权利要求1所述的壮观链霉菌XWSTSP130906J234，其特征在于，所述的壮观链霉菌是从马铃薯与玉米间作田中玉米的根际土壤中，采用平板稀释法分离获得。
3.如权利要求2所述的壮观链霉菌XWSTSP130906J234，其特征在于，所述壮观链霉菌的分离过程为：将采集回的土壤在阴凉处放置6天，自然风干后，取5g土壤溶于盛有45mL无菌水的锥形瓶中，摇晃震荡30min，将其配制成悬浮液，然后按10倍浓度梯度稀释成10-3g/mL或者10-4g/mL的稀释液，运用平板涂布稀释法，取200μL稀释液分别涂布于高氏I号培养基上，每个浓度梯度做3个重复，倒置放于28℃培养箱中培养7天，根据菌株特征，挑取形态各异的菌株在高氏I号平板培养基上纯化2-3次，运用斜面培养基于4℃冰箱保存。
4.如权利要求1所述的壮观链霉菌XWSTSP130906J234在三七疫病防治中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的壮观链霉菌的分离培养基采用高氏一号固体培养基，所述高氏I号固体培养基组成为：可溶性淀粉20.0g、NaCl 0.5g、KNO3 1.0g、MgSO4.7H2O 0.5g、K2HPO4 0.5g、FeSO4.7H2O 0.01g、琼脂20.0g、蒸馏水1L，pH 7.4-7.6，在121℃下灭菌20min。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的壮观链霉菌的分离培养基采用PDA培养基，所述PDA培养基的制作过程为:将马铃薯洗净去皮，切成小块，取200g加水煮烂，用4层纱布过滤，加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，再补足水分至1000毫升，121℃灭菌15min。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，采用对峙生长法测定所述的壮观链霉菌对三七疫病病原菌恶疫霉的抑制效果，具体为：采用对峙生长法测定放线菌的抑菌活性，将放线菌和供试真菌分别用高氏I号培养基和PDA培养基培养7天，然后用无菌打孔器分别取出直径为5mm的菌饼，对接于新鲜PDA培养基上，供试真菌接于培养基中心，于距供试真菌2cm处的两边接放线菌，每处理重复3次，28℃培养箱中培养5天后，测定各处理组和对照组的菌落半径，计算抑菌率，计算公式为：抑菌率＝1-处理半径/对照半径。
8.如权利要求4-7任一项所述的应用，其特征在于，所述的壮观链霉菌菌株在高氏I号培养基上培养7天后，其气生菌丝的颜色为橙色，基内菌丝的颜色为绯红色，无水溶性色素，在16×100倍光学显微镜下，其孢子丝呈弯曲或波形，孢子为椭圆形。
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