CN107502570A

CN107502570A - 一株生防枯草芽孢杆菌bj‑1及其应用

Info

Publication number: CN107502570A
Application number: CN201710711397.9A
Authority: CN
Inventors: 郑露; 何有为; 黄俊斌
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2017-08-18
Filing date: 2017-08-18
Publication date: 2017-12-22
Anticipated expiration: 2037-08-18
Also published as: CN107502570B

Abstract

本发明公开了一株生防枯草芽孢杆菌BJ‑1及其应用，所述的枯草芽孢杆菌已送至中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M2017443，本发明的枯草芽孢杆菌为一株生防菌，对多种真菌具有良好的抑制效果。利用本发明提供的枯草芽孢杆菌BJ‑1可有效抑制稻瘟病菌菌丝生长、孢子萌发及附着胞的形成，浸泡处理水稻种子能促进水稻生长且诱导植株产生抗性，避免了化学防治对环境和稻米安全的潜在不良影响及抗病品种利用的感病化风险；此外，枯草芽孢杆菌繁殖快，具有很强的稳定性，耐高温耐储存，无毒副作用，可将其作为活体菌剂和代谢产物的剂型加工开发。

Description

一株生防枯草芽孢杆菌BJ-1及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，尤其涉及一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BJ-1及其在水稻稻瘟病防治中的应用。

背景技术

水稻是世界上重要的粮食作物之一，全球有近一半的人口以水稻为主要粮食。在我国，水稻的种植面积约占全国耕地面积的1/4，年产量约为全国粮食总产量的1/2。水稻病害是影响水稻产量和质量重要的限制因子，其中稻瘟病是流行范围最广、危害最大的世界性真菌病害之一。稻瘟病可引起水稻大幅度减产，严重时减产40％～50％，甚至颗粒无收。世界各稻区均有发生，其中以叶部、节部发生为多，发生后可造成不同程度减产，尤其穗颈瘟和节瘟发生早而重，可造成白穗以致绝产。近年来，我国稻瘟病年发生面积有逐年增加的趋势，局部大爆发并不少见，因此研究和防治水稻稻瘟病刻不容缓。

在农业生产上，稻瘟病防治主要依靠抗瘟水稻品种种植和化学农药施用。由于稻瘟病菌遗传背景复杂，易变异，加上抗瘟品种单一化，主栽品种的遗传同质性高，抗瘟品种很难保持持久抗病性，常常在大面积种植几年后丧失抗性而感病化。在这种情况下，化学农药成了防治稻瘟病的主要手段，但化学农药一直存在着耐药性、污染环境、农药残留、生物多样性降低、人畜毒害等诸多无法克服的弊端，严重限制了在将来的农业生产上的使用。枯草芽孢杆菌作为一种有益生防菌逐渐引起人们的普遍关注，国内外对其研究日益增多，大部分报道集中采用枯草芽孢杆菌发酵液喷雾处理水稻地上部组织达到防治稻瘟病的目的，其次生代谢产物可通过溶菌、抑菌和产生抗生素等作用有效防止稻瘟病菌侵染。但利用枯草芽孢杆菌发酵液进行种子处理防治稻瘟病鲜见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株新分离的生防菌即枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株BJ-1，该菌株已于2017年8月17日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M2017443，分类命名：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BJ-1。

本发明的另一个目的在于提供了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BJ-1的应用，该菌株可用于制备成水稻种子浸液从而促进水稻植株的生长且诱导植株抗性预防水稻稻瘟病，或是制备成防治水稻稻瘟病的生物喷剂，能有效抑制水稻稻瘟病菌菌丝生长并造成菌丝畸形以及抑制附着胞的形成，或是制备成真菌抑菌剂。

本发明的技术方案如下：

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BJ-1的获得：

本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BJ-1是在湖北省武汉市华中农业大学湖北省作物病害检测与安全控制重点实验室自然污染的番茄燕麦平皿上分离得到，申请人将其命名为BJ-1，该菌株已于2017年8月17日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M2017443，分类命名：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BJ-1。

枯草芽孢杆菌BJ-1的菌学特征：

枯草芽孢杆菌BJ-1为革兰氏阳性细菌，在LB固体培养基上初期呈乳黄色，油渍状，后期显乳白色，湿润，表面光滑，菌体细胞呈杆状。菌株能使明胶液化，耐盐，能利用蔗糖、葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-纤维二糖、糊精、D-甘露醇、甘油，但不能利用D-乳糖，D-半乳糖。

本发明制备的枯草芽孢杆菌BJ-1菌株的保藏：将枯草芽孢杆菌的菌体保存在终浓度为25％的甘油中，-80℃冷冻保藏。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BJ-1的制备方法包括：将枯草芽孢杆菌BJ-1菌液接种于液体LB培养基中，在温度为35-38℃，150-220rpm培养。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BJ-1的应用，包括利用该菌株的发酵液制备成水稻种子浸液或是制备成防治水稻稻瘟病的生物喷剂，或是制备成真菌抑菌剂。

优选的，所述的真菌包括但不限于稻曲病菌、稻瘟病菌、茎点霉、烟草赤星病菌、灰霉病菌、炭疽病菌或核桃黑斑病菌中的一种或几种。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

利用本发明提供的枯草芽孢杆菌BJ-1发酵液可有效抑制稻瘟病菌菌丝生长、孢子萌发及附着胞的形成，浸泡处理水稻种子能促进水稻生长且诱导植株产生抗性，避免了化学防治对环境和稻米安全的潜在不良影响及抗病品种利用的感病化风险；此外，枯草芽孢杆菌繁殖快，具有很强的稳定性，耐高温耐储存，无毒副作用，可将其作为活体菌剂和代谢产物的剂型加工开发。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌BJ-1的抑菌谱。

图1中：A，稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)；B，稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)；C，黄连茎点霉(Phoma aguilegiicola)；D，烟草赤星病菌(Alternariaalternata)；E，草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea)；F，白菜炭疽病菌(Colletotrichumhigginsianum)；G，核桃黑斑病菌(Stagonosporopsis cucurbitacearum)；H，油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)；I，桃树溃疡病菌(Botryosphaeria dothidea)；J，党参紫纹羽菌(Helicobasidium mompa)；K，棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)；L，白术角担菌(Ceratobasidium)。

图2为枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液对水稻稻瘟病菌菌丝生长的抑制作用及致畸作用示意图。

图2中：A，只接稻瘟病菌处理(未添加BJ-1发酵滤液)；B，发酵滤液终浓度为0.5％；C，1％；D，5％；E，10％；F，20％；G，稻瘟菌的菌丝；H，发酵滤液终浓度为0.5％处理的稻瘟菌菌丝。

图3为枯草芽孢杆菌BJ-1在水稻离体叶片上对稻瘟病的防治效果测定示意图。

图3中：A，未添加枯草芽孢杆菌发酵液只点接稻瘟菌分生孢子液处理；B，发酵液浓度0.5％；C，发酵液浓度1％；D，发酵液浓度2.5％；E，发酵液浓度5％；F，发酵液浓度10％；G，未添加枯草芽孢杆菌发酵滤液只点接稻瘟菌分生孢子液处理；H，发酵滤液浓度0.5％；I，发酵滤液浓度1％；J，发酵滤液浓度2.5％；K，发酵滤液浓度5％；L，发酵滤液浓度10％；M，未添加枯草芽孢杆菌菌体只点接稻瘟菌分生孢子液处理；N，菌体浓度为10⁶CFU/ml；O，菌体浓度为10⁷CFU/mL；菌体浓度为P，10⁹CFU/mL。

图4为枯草芽孢杆菌BJ-1在盆栽水稻上对稻瘟病的防治效果测定示意图。

图4中：A，只喷接稻瘟孢子液处理；B，同时喷接5％枯草芽胞杆菌发酵液；C，发酵液种子处理；D，三环唑药剂处理；E，发酵液种子处理水稻长势；F，清水种子处理水稻长势。

图5为枯草芽孢杆菌BJ-1抗菌肽物质的PCR检测示意图。

具体实施方式

实施例1：枯草芽孢杆菌BJ-1的分离筛选与发酵培养

一、分离鉴定及抗菌谱的测定

本发明的微生物是在湖北省武汉市华中农业大学湖北省作物病害检测与安全控制重点实验室自然污染的番茄燕麦平皿上分离得到一株较强拮抗活性的枯草芽孢杆菌。分离纯化参照植病研究法(方中达，1998)，方法是从自然污染平皿上挑取枯草芽孢杆菌菌落，经5ml无菌水稀释后，用接种针沾取少量稀释液在PDA平皿上画线，挑选所需特征单菌落，经过3次相同的划线培养，最终得到纯的枯草芽孢杆菌菌株。申请人将其命名为BJ-1，通过菌落形态、Biolog鉴定和16SrDNA序列分析，最后将该生防菌菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。采用平板对峙培养法对枯草芽孢杆菌BJ-1进行初步生防测试，发现该菌株具有较广的抑菌谱，对多种植物病害病原菌具有较好的抑制作用，其中对稻曲病菌、稻瘟病菌、黄连茎点霉、烟草赤星病菌和十字花科植物炭疽病菌等的菌丝生长具有明显的抑制作用(表1，图1)而对稻瘟病菌拮抗作用最为明显，拮抗带达到22.7mm。该菌株已于2017年8月17日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M2017443，分类命名：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BJ-1。

表1枯草芽孢杆菌BJ-1对供试植物病原菌的拮抗作用

注：在28℃培养7days后测量BJ-1与各病原菌之间的最短距离。利用最小差异显著法(LSD)

分析处理间的差异显著性，同一列中字母相同表示差异不显著(P<0.05)。

二、枯草芽孢杆菌BJ-1的种子培养和发酵培养

(1)菌种活化：将-80℃甘油中保存的枯草芽孢杆菌BJ-1划线接种于固体LB培养基，在温度为37℃恒温箱中培养24h，然后挑取单菌落接种于2mL的液体LB培养基中，在37℃、180rpm条件下振荡培养24h。

(2)菌种培养：将步骤(1)的枯草芽孢杆菌BJ-1菌液按体积比0.5％的比例接种于250mL液体LB培养基上，在温度为37℃恒温箱中培养24h。

(3)发酵：将经过步骤(2)菌种培养的枯草芽孢杆菌BJ-1培养液接种于液体LB培养基，接种量为LB液体培养基体积的0.5％，接种后控制发酵温度在37℃，180rpm条件下振荡培养72h发酵，即获得枯草芽孢杆菌BJ-1发酵液，用于以下实施例。

枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液：将上述枯草芽孢杆菌BJ-1发酵液置于8000r/min离心15分钟，上清液用细菌过滤器过滤，即可获得枯草芽孢杆菌BJ-1的发酵滤液，用于以下实施例。

LB培养基成分：Tryptone(胰蛋白胨)10g，Yeast Extract(酵母提取物)5g，NaCl(氯化钠)10g，补充蒸馏水定容至1000ml。

实施例2：枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液对稻瘟病菌菌丝生长的抑制作用及致畸作用

一、枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液对稻瘟病菌菌丝生长的抑制作用

将枯草芽孢杆菌发酵液滤液添加至PDB中混合成不同浓度后(v/v，0，0.5％，1％，2.5％，5％，10％，20％)，打取直径为5mm的稻瘟病菌菌丝块接种于75mL含不同浓度发酵液滤液的PDB培养液中，以不添加发酵滤液处理为对照，置于28℃，180rpm条件下振荡培养7d后，用预先干燥并称重的定性滤纸(直径10cm)过滤菌丝，并置于60℃干燥箱中烘干至恒重，用精度为万分之一克的电子天平称量菌丝干重。每个处理设置3个重复。结果(表2)表明枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液对稻瘟菌菌丝具有明显的抑制作用，含0.5％枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液的PDB培养基处理对稻瘟菌菌丝的生长抑制率达56.33％，稻瘟菌菌丝干重随发酵滤液浓度的增加而降低，含20％枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液的PDB培养基处理对稻瘟菌菌丝的生长抑制率达94.67％。

表2枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液对稻瘟菌菌丝生长的抑制作用

注：在PDB培养液中测定BJ-1发酵滤液对稻瘟菌菌丝生长的影响，在28℃，180rpm摇培7天后称量菌丝干重，利用最小差异显著法(LSD)分析处理间的差异显著性，同一列中字母相同表示差异不显著(P<0.05)。

^B培养液的最终pH值。

二、枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液对稻瘟病菌菌丝的致畸作用

将枯草芽孢杆菌BJ-1发酵液滤液添加至含PDA中混合成不同浓度后(v/v，0，0.5％，1％，5％，10％，20％)，打取直径为5mm的菌丝块接种于含不同浓度发酵液滤液的PDA培养皿中，以不添加发酵滤液的PDA平板为对照，置于28℃培养7d后利用十字交叉法测量菌落直径，并挑取菌落边缘菌丝进行显微观察。每个处理设置3个重复。结果如图所示(图2)，枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液对稻瘟菌菌丝有致畸作用，随枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液浓度的增加，稻瘟菌边缘菌丝褶皱化，菌落中间菌丝堆积。挑取发酵滤液终浓度为0.5％的边缘菌丝显微观察发现发酵滤液处理后的稻瘟菌菌丝膨大成畸形，有菌丝缢断现象。

实施例3：枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液对稻瘟菌孢子萌发及附着胞形成的抑制作用

将枯草芽孢杆菌BJ-1发酵液滤液分别用0.025％的吐温稀释成不同浓度(v/v，1％，2％，5％，10％，20％，40％)后与含有吐温20(终浓度0.025％)的浓度为1×10⁶个/ml的稻瘟菌孢子液等体积混合，使该孢子液所含发酵滤液的浓度分别为(v/v，0.5％，1％，2.5％，5％，10％，20％)，稻瘟菌的孢子浓度为5×10⁵个孢子/ml。将上述含有不同浓度枯草芽孢杆菌发酵液滤液的稻瘟菌孢子液分别接种到疏水玻片，每个玻片4滴，每滴10μl。接种后置于28℃下恒温黑暗条件下保湿培养18h后在显微镜下直接统计孢子萌发率以及附着胞形成百分率。以不添加发酵滤液的稻瘟病菌孢子液接种为对照，每个处理设置三个重复，每个重复统计100个孢子。结果如表所示(表3)，枯草芽孢杆菌发酵液滤液处理的分生孢子不正常萌发，芽管畸形膨大，不产生附着胞。当发酵滤液终浓度为0.5％时，分生孢子芽管畸形率占96.41％，附着胞形成率为47.33％。随着发酵滤液浓度的升高，附着胞形成率逐渐降低。当发酵滤液浓度为20％时，附着胞形成率仅为0.33％。这说明枯草芽孢杆菌发酵滤液对稻瘟菌的孢子萌发和附着胞形成具有明显的抑制作用。

表3.枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液对稻瘟菌分生孢子萌发及附着胞形成的影响

注：接种后在28℃培养18h观察稻瘟菌分生孢子萌发率、芽管畸形率和附着胞形成率。利用最小差异显著法(LSD)分析处理间的差异显著性，同一列中字母相同表示差异不显著(P<0.05)。

实施例4：枯草芽孢杆菌BJ-1在水稻离体叶片上对稻瘟病的防治效果测定

在发酵液和发酵滤液中分别添加吐温20，使其终浓度为0.025％。分别按照实施例3所述方法，稀释成不同浓度后与浓度为1×10⁶孢子/mL的稻瘟菌孢子液等体积混合，使该孢子液所含发酵液和发酵滤液的浓度分别为(v/v，0.5％，1％，2.5％，5％，10％，20％)。同时将枯草芽孢杆菌BJ-1的发酵液离心(12000rpm，20min)，所得沉淀用无菌水重悬浮后再离心，将如此重复洗涤三次所得的菌体沉淀添加到含有0.025％吐温20的稻瘟菌孢子液中(5×10⁵孢子/ml)使其所含枯草芽孢杆菌BJ-1菌体终浓度分别为10⁷、10⁸和10⁹CFU/mL，以不添加枯草芽孢杆菌BJ-1菌体和滤液的稻瘟菌孢子液接种为对照，每个处理设置3个重复(每重复3片叶，每片叶接种3点)。将上述各孢子液分别接种到离体水稻叶片上(水稻品种：丰两优香1号)，置于28℃恒温黑暗培养30h后持续光照培养，培养3d后发现(图3)，不含发酵液处理的水稻叶片出现典型的稻瘟病病斑，而发酵液终浓度高于2.5％的处理其水稻叶片上均未发现病斑。相似的趋势在发酵滤液及菌体试验中同样如此，发酵滤液浓度在5％以上叶片无病斑。菌体含量为10⁷CFU/mL时，叶片有褐色斑点，但无扩展趋势，当菌体含量高于10⁸CFU/ml时，无病斑出现。这表明随发酵滤液和菌体浓度的升高，枯草芽孢杆菌BJ-1可完全抑制稻瘟病的发生。同时也说明，菌体，菌体发酵液和发酵滤液，均可用于防治水稻稻瘟病。

实施例5：枯草芽孢杆菌BJ-1发酵液对稻瘟病的盆栽防治效果测定

根据实施例1制备枯草芽孢杆菌BJ-1发酵液，分别不同处理测定其对稻瘟病的盆栽防效，本实施例所用水稻种子品种为丰两优香1号，不同处理组如下。

处理组(1)水稻种子用枯草芽孢杆菌BJ-1发酵液浸泡1天后漂洗正常催芽播种，待水稻生长至五叶期时，喷雾接种含有0.025％吐温20的稻瘟菌分生孢子液(5×10⁵孢子/mL)，接种量为每盆30mL。

处理组(2)水稻种子清水浸泡催芽播种待生长至五叶期时，将BJ-1发酵液添加至稻瘟菌分生孢子液中，使该孢子液所含发酵液和稻瘟菌分生孢子终浓度分别为5％(V/v)和5×10⁵孢子/mL，并添加吐温20使其终浓度为0.025％，然后喷雾接种水稻植株，接种量为每盆30mL。

阴性对照(3)水稻种子清水浸泡催芽播种待生长至五叶期时，以喷含有0.025％吐温20的稻瘟菌孢子液(5×10⁵孢子/mL)为阴性对照，接种量为每盆30mL。

阳性对照(4)水稻种子清水浸泡催芽播种待生长至五叶期时，将三环唑药剂添加至稻瘟菌分生孢子液中，使该孢子液所含药剂浓度和稻瘟菌分生孢子浓度分别为750μg/mL和5×10⁵孢子/mL，并添加吐温20使其终浓度为0.025％，然后喷雾接种水稻植株，接种量为每盆30mL，为阳性对照。

以上每个处理设置3个重复(即3盆水稻，每盆水稻统计100片叶)。待水稻生长至五叶期接种前，分别测量BJ-1发酵液种子处理和清水种子处理的水稻株高。将各处理的水稻置于28℃下恒温黑暗保湿30h后持续光照，6d后按照0-9级标准调查发病情况，计算病情指数和防治指数(IRRI，1980)。结果表明(表4，图4)，5％枯草芽孢杆菌BJ-1发酵液喷雾处理防治指数为50.01％，BJ-1发酵液浸泡种子处理的防治指数达到74.28％略高于三环唑药剂处理(750μg/mL)。此外，利用枯草芽孢杆菌BJ-1发酵液进行种子处理，能显著促进水稻植株生长，具有较好的促生作用；同时能够诱导水稻植株抗病性。这表明枯草芽孢杆菌BJ-1发酵液种子处理及后期地上部喷雾防治均可有效防止稻瘟病的发生。

表4.枯草芽孢杆菌BJ-1对稻瘟病的盆栽防治效果

注：接种后6d调查发病率计算病情指数。利用最小差异显著法(LSD)分析处理间的差异显著性，同一列中字母相同表示差异不显著(P<0.05)。

实施例6：枯草芽孢杆菌BJ-1抗菌肽物质的PCR检测

采用已报道的枯草芽孢杆菌抗菌肽合成基因引物进行PCR扩增，引物如表5所示，PCR扩增采用25μL反应体系，反应液包括2×PCR Mix12.5μL，上下游引物(浓度为10μM)各1μL，模板DNA 1μL，ddH₂O补足25μL。PCR反应程序为：第一步，94℃预变性5min；第二步，94℃变性30s，退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；第三步，72℃终延伸10min。取5μL PCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶中电泳，通过凝胶成像仪观察结果，根据PCR扩增结果中条带有无来确定枯草芽孢杆菌BJ-1中所含抗菌肽的种类。结果如图5所示，BJ-1能够产生表面活性素(sfp，srfAA，SPAB-ERIB)，丰原素(fenB，FENCEA)，枯草菌素(spa，spaS)和杆菌溶素(BAC，BACD)，覆盖了抗菌肽三大家族，从分子层面说明了枯草芽孢杆菌BJ-1能够产生具有抑菌及诱导抗性的活性物质。

表5.枯草芽孢杆菌BJ-1抗菌肽物质的PCR检测

Claims

1.一株分离的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BJ-1，保藏编号为CCTCC NO：M2017443。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备防治水稻稻瘟病水稻种子浸液中的应用。

3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备防治水稻稻瘟病生物喷剂中的应用。

4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备同时促进水稻生长和增强水稻抗病性药剂中的应用。

5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备抑制水稻稻瘟病菌菌丝生长制剂中的应用。

6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备抑制水稻稻瘟病附着胞形成制剂中的应用。

7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备真菌抑制剂中的应用，所述的真菌包括稻曲病菌、稻瘟病菌、茎点霉、烟草赤星病菌、灰霉病菌、炭疽病菌或核桃黑斑病菌中的一种或几种。