CN114907986B - 一种哈茨木霉菌及其在防治三七根腐病制剂中的应用 - Google Patents

一种哈茨木霉菌及其在防治三七根腐病制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种哈茨木霉菌及其在防治三七根腐病制剂中的应用。本发明的哈茨木霉菌菌株，所述的哈茨木霉菌菌株为PRWS18，保藏名称为哈茨木霉菌Trichoderma harzianum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2021年4月6日；保藏编号：CGMCC No.21477。本发明的哈茨木霉菌从滇重楼根际土壤中分离得到，能够同时对三七根腐病菌(尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、恶疫霉菌)具有良好的抑制作用。

Description

一种哈茨木霉菌及其在防治三七根腐病制剂中的应用
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种哈茨木霉菌菌株及其在防治三七根腐病制剂中的应用。
背景技术
近年来，随着中药资源需求量的急剧增长，中药野生资源破坏严重，野生转为栽培成为满足市场需求的必由之路。野生中药材很少发生病害，即使有也不会形成灾害，从野生变为人工栽培后，其生长环境发生变化，在农业生态系统中，种类单一，密度增加，且高水高肥、人为远程调种等管理措施创造了病害发生流行的条件，病害易于在种群内部、田块之间、地区之间蔓延传播，导致栽培药材病害加重。
三七(Panax notoginseng)为五加科人参属多年生草本植物，是我国名贵中药材。三七是多年生宿根植物，喜温暖阴湿的环境，由于生产上连年大面积单一种植，为病害的发生提供了有利条件。三七主要病害为根腐病，其病原菌主要有：链格孢菌(Alternariaalternaria)、腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茎点霉(Phomaherbarum)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、恶疫霉菌(Phytophthoracactorum)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、根结线虫(Meloidogyne sp.)等。其中又以腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌、链格孢菌、恶疫霉菌为云南文山发生流行的主要三七根腐病原菌。根腐病可导致三七产量降低5～20％，严重时可达到70％以上，占三七各种病害的70～85％，目前已造成三七种植业的重要制约因素之一。
目前对三七根部病害的防治主要以化学防治为主，包括：(1)土壤熏蒸消毒处理。其原理为利用化学熏蒸剂对土壤进行熏蒸处理，以达到消杀土壤病原菌的目的。虽然土壤熏蒸消毒处理能显著降低三七根腐病的发病率，但因化学熏蒸剂的毒性，易对周围环境造成污染，并破坏土壤的微生态群落。(2)化学杀菌剂。主要包括多菌灵、甲基硫菌灵、甲霜灵、腐霉利等化学农药。化学农药长期使用会造成环境污染、生态系统破坏、病原菌抗药性产生，甚至给中药材带来农药残留和重金属污染等危害，因此合理降低农药使用，找到绿色、环境友好型的防控方式，对防治中药材病害有重要的意义。
发明内容
针对目前三七根腐病害发生严重，且化学农药防治易带来环境污染、农药残留、抗药性等问题，提供一株高效防治三七根腐病的哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)菌株及其在防治三七根腐病制剂中的应用。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种哈茨木霉菌菌株，所述的哈茨木霉菌菌株为PRWS18，保藏名称为哈茨木霉菌Trichoderma harzianum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2021年4月6日；保藏编号：CGMCC No.21477。
进一步地，所述的哈茨木霉菌菌株的ITS基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
本发明所述的哈茨木霉菌菌株制备的哈茨木霉菌菌剂。
进一步地，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)所述的哈茨木霉菌的发酵培养物；
(b)所得哈茨木霉菌的孢子悬液；
(c)所得哈茨木霉菌细胞的超声裂解沉淀。
本发明所述的哈茨木霉菌的发酵液的制备方法，包括如下步骤：在100mL PDA液体培养基中接入5个直径6mm的木霉菌PRWS18菌饼，28℃、180r/min条件下恒温摇床上培养7d后，用滤纸过滤菌液后，再用直径0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，获得无菌发酵滤液，制得哈茨木霉菌的发酵液。
进一步地，所述的PDA液体培养基由如下组分组成：土豆为100g～200g，葡萄糖为5g～20g，定容至1L蒸馏水中，pH为6～8，121℃灭菌20min。
本发明所述的哈茨木霉菌的孢子悬液的制备方法，包括如下步骤：将哈茨木霉菌菌株PRWS18接种于PDA固体培养基平板上，28℃倒置培养7天，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成孢子悬浮液，显微镜下计数孢子浓度，使所述的孢子悬液的浓度为1.0×105cfu/mL。
进一步地，所述的PDA固体培养基由如下组分组成：土豆为100g～200g，葡萄糖为5g～20g，琼脂10g～20g，定容至1L蒸馏水中，自然pH为6～8，121℃灭菌20min。
本发明所述的哈茨木霉菌菌株或哈茨木霉菌菌剂在生产用于防治三七根腐病制剂中的应用。
进一步地，使用哈茨木霉菌孢子悬液或发酵液对三七进行灌根处理，对三七根腐病菌具有良好的抑制作用(尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、恶疫霉菌)。
有益效果：本发明的滇重楼根际土壤中分离得到，能够同时对三七根腐病菌(尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、恶疫霉菌)具有良好的抑制作用。因此，该菌的菌株发酵液能够有效防治三七根腐病。
与现有技术相比，本发明具有如下优点:
本发明的菌株PRWS18具有广谱抗性，可以同时拮抗多种三七根腐病菌，可以开发为高效的生防菌剂，有效降低化学农药的使用。
附图说明
下面将结合附图进一步说明，附图中：
图1为本发明的哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)PRWS18菌落形态图。
图2为本发明的哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)PRWS18 NJ系统进化树图。
图3为本发明的哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)PRWS18平板对峙效果图。
具体实施方式
通过以下实施例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。
本发明的一种哈茨木霉菌菌株，所述的哈茨木霉菌菌株为PRWS18，保藏名称为哈茨木霉菌Trichoderma harzianum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2021年4月6日；保藏编号：CGMCC No.21477。
所述的哈茨木霉菌菌株的ITS基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
本发明所述的哈茨木霉菌菌株制备的哈茨木霉菌菌剂。其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)所述的哈茨木霉菌的发酵培养物；
(b)所得哈茨木霉菌的孢子悬液；
(c)所得哈茨木霉菌细胞的超声裂解沉淀。
本发明所述的哈茨木霉菌的发酵液的制备方法，包括如下步骤：在100mL PDA液体培养基中接入5个直径6mm的木霉菌PRWS18菌饼，28℃、180r/min条件下恒温摇床上培养7d后，用滤纸过滤菌液后，用直径0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，获得无菌发酵滤液，制得哈茨木霉菌的发酵液。
所述的PDA液体培养基由如下组分组成：土豆为100g～200g，葡萄糖为5g～20g，定容至1L蒸馏水中，pH为6～8，121℃灭菌20min。
本发明所述的哈茨木霉菌的孢子悬液的制备方法，包括如下步骤：将哈茨木霉菌菌株PRWS18接种于PDA固体培养基平板上，28℃倒置培养7天，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成孢子悬浮液，显微镜下计数孢子浓度，使所述的孢子悬液的浓度为1.0×105cfu/mL。
所述的PDA固体培养基由如下组分组成：土豆为100g～200g，葡萄糖为5g～20g，琼脂10g～20g，定容至1L蒸馏水中，自然pH为6～8，121℃灭菌20min。
本发明所述的哈茨木霉菌菌株或哈茨木霉菌菌剂在生产用于防治三七根腐病制剂中的应用。使用哈茨木霉菌孢子悬液或发酵液对三七进行灌根处理，对三七根腐病菌具有良好的抑制作用(尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、恶疫霉菌)。
实施例1
菌株的获得
哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)PRWS18，采自于云南省嵩明种植滇重楼的根际土壤，取10g根际土壤溶解于100mL滇重楼根系分泌物中，28℃摇床200rpm培养，每24小时取一次土壤悬液按照10-5稀释后分别涂板于添加滇重楼根系分泌物(10mg/mL)的PDA培养基用于培养真菌。待长出菌落后纯化3次，后用于拮抗菌筛选试验。
实施例2
菌株鉴定
1形态特征观察
在PDA培养基上培养2-7天的菌株PRWS18观察其菌落形态，培养2天内菌落菌丝为白色绒绒质，第三天在接种点附近开始产生分生孢子，产孢簇表面为颗粒状或粉状，产孢簇初为白色，后期转变为黄色至绿色，产黄色色素(图1a,b)。分生孢子梗具树状分支，次级分支较少，一个主支常具1～2个次级分支。次级分支顶端产生瓶梗，瓶梗短，两端细，中间粗，常具3～4个轮生，瓶梗顶端产生近球形的分生孢子座(图1c)，分生孢子呈椭圆或近球形，直径约3μm(图1d)。
2ITS序列分析
液氮研磨法提取菌株基因组DNA后，采用引物：ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，进行PCR扩增。凝胶电泳后送生物工程(上海)有限公司测序，序列全长为574bp(见SEQ)。将所得序列提交到GenBank数据库进行BLAST分析比对，发现与PRWS18同源性最高的菌株为Trichoderma harzianum strain MH339867，同源性为99.66％。以ITS序列构建NJ系统进化树，PRWS18与Trichoderma harzianum在同一分支(图2)。根据以上形态特征分析、ITS分析及NJ系统进化树，将菌株初步鉴定为Trichodermaharzianum。
实施例3
菌株PRWS18对三七病原菌的抑菌活性
采用平板对峙培养法，在90mm的PDA平板两端分别将三七腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporium)、恶疫霉菌(Phythophthora cactorum)和木霉菌菌株PRWS18进行接种，只接种三七病原菌作为CK对照。每个处理重复3次。经PDA培养基7天计算抑菌率：抑制率(％)＝(对照组靶标菌落直径－处理组靶标菌落直径)/对照组靶标菌落直径×100％。PRWS18对三七病原菌抑菌活性的结果见表1。木霉菌菌株PRWS18对三七病原菌的生长抑制率如表1所示：
表1
Figure BDA0003621471630000061
如表1所示，本发明的实验结果表明：菌株对PRWS18三七腐皮镰刀、三七尖孢镰刀菌及三七恶疫霉菌的生长抑制率在50.5～67.9％之间。说明木霉菌菌株PRWS18通过空间和营养竞争可以抑制三七病原菌的生长，并且该木霉菌株具有良好的广谱抗三七病原菌效果。
实施例4
菌株PRWS18发酵菌液制备
在100mLPDA液体培养基中接入5个直径6mm的木霉菌PRWS18菌饼，28℃、180r/min条件下恒温摇床上培养7d后，用直径0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，获得无菌发酵滤液。
所述的PDA液体培养基由如下组分组成：土豆160g，葡萄糖16g，定容至1L蒸馏水中，pH为6.8，121℃灭菌20min。
实施例5
菌株PRWS18发酵菌液对三七病原菌的抑菌活性
将实施例4中的PRWS18发酵菌添加至与PDA固体培养基中，制成含30％发酵液的PDA平板。将三七腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌、恶疫霉菌分别接种于添加30％发酵液的PDA平板上作为处理组；三七病原菌接种于无添加发酵液的PDA平板作为CK对照组。每组3次重复，28℃恒温培养7天后测定菌落直径并计算抑制率，木霉菌菌株PRWS18发酵液对三七病原菌的生长抑制率如表2所示：
表2
Figure BDA0003621471630000071
由表2可知，添加30％PRWS18发酵液能够显著抑制三七腐皮镰刀菌及三七恶疫霉菌的生长，抑制率在45.84～59.78％之间。
实施例6
菌株PRWS18孢子悬液制备
将哈茨木霉菌菌株PRWS18接种于PDA固体培养基平板上，28℃倒置培养7天，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成孢子悬浮液，显微镜下计数孢子浓度，使所述的孢子悬液的浓度为1.0×105cfu/mL；
所述的PDA固体培养基由如下组分组成：土豆100g，葡萄糖20g，琼脂18g，定容至1L蒸馏水中，pH为6.8，121℃灭菌20min。
实施例7
哈茨木霉菌PRWS18孢子悬液对三七腐皮镰刀菌的防治效果
三七腐皮镰刀菌孢子悬液制备：将三七腐皮镰刀菌接种于PDA固体培养基平板上，28℃倒置培养7天，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成孢子悬浮液，显微镜下计数孢子浓度，调整上述孢子悬液的浓度为1.0×105cfu/mL。
哈茨木霉菌PRWS18孢子悬液制备按实施例6进行。
选取1年生三七苗进行灌根实验。实验设：CK组，以接种无菌蒸馏水为对照10mL；SI组，只接种三七腐皮镰刀菌10mL；DI组：同时接种三七腐皮镰刀菌10mL及哈茨木霉菌10mL。每组3个重复，每个重复接种20株三七苗。14天后统计发病率、病情指数及防治率。
病情指数和防效分别按照下列公式计算
病情指数＝Σ(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100
严重度分级标准：0级：根无病；1级：病斑占根表面积的20％以下；2级：病斑占根表面积的21％-40％；3级：斑占根表面积的41％-65％，外观受严重影响；4级：病斑占根表面积的66％以上或完全腐烂。
防治率(％)＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100
哈茨木霉菌PRWS18对三七根腐病的防治效果如表2所示，哈茨木霉菌PRWS18孢子悬液对三七腐皮镰刀菌的生防效果如表3所示：
表3
Figure BDA0003621471630000081
如表3所示，本发明的盆栽试验表明，施用该菌株防控三七腐皮镰刀菌，可以有效降低病情指数，对三七腐皮镰刀菌的防治率达69.48％。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
序列表
<110> 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所
<120> 一种哈茨木霉菌及其在防治三七根腐病制剂中的应用
<130> 2022
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 582
<212> DNA
<213> 人工序列(哈茨木霉菌菌株的ITS基因序列)
<400> 1
aactcccaac ccaatgtgaa cgttaccaaa ctgttgcctc ggcgggatct ctgccccggg 60
tgcgtcgcag ccccggacca aggcgcccgc cggaggacca acctaaaact cttattgtat 120
accccctcgc gggttttttt tataatctga gccttctcgg cgcctctcgt aggcgtttcg 180
aaaatgaatc aaaactttca acaacggatc tcttggttct ggcatcgatg aagaacgcag 240
cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca 300
cattgcgccc gccagtattc tggcgggcat gcctgtccga gcgtcatttc aaccctcgaa 360
cccctccggg gggtcggcgt tggggatcgg ccctccctta gcgggtggcc gtctccgaaa 420
tacagtggcg gtctcgccgc agcctctcct gcgcagtagt ttgcacactc gcatcgggag 480
cgcggcgcgt ccacagccgt taaacaccca acttctgaaa tgttgacctc ggatcaggta 540
ggaatacccg ctgaacttaa gcatatcata aggcgggagg aa 582

Claims (9)

1.一种哈茨木霉菌菌株，其特征在于：所述的哈茨木霉菌菌株为PRWS18，保藏名称为哈茨木霉菌Trichoderma harzianum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2021年4月6日；保藏编号：CGMCC No. 21477。
2.根据权利要求1所述的哈茨木霉菌菌株，其特征在于：所述的哈茨木霉菌菌株的ITS基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的哈茨木霉菌菌株制备的哈茨木霉菌菌剂。
4.根据权利要求3所述的哈茨木霉菌菌剂，其活性成分为如下（a）（b）中的至少一种：
（a）权利要求1所述的哈茨木霉菌的发酵培养物；
（b）权利要求1所述的哈茨木霉菌的孢子悬液。
5.权利要求1所述的哈茨木霉菌菌株的发酵液的制备方法，其特征在于包括如下步骤：在 100 mL PDA液体培养基中接入5个直径6mm的权利要求1的哈茨木霉菌菌株的PRWS18菌饼，28 ℃、180 r/min条件下恒温摇床上培养 7 d后，用滤纸过滤菌液，之后用直径0.22 μm的无菌过滤器过滤除菌，获得无菌发酵滤液，制得哈茨木霉菌的发酵液。
6.根据权利要求5所述的哈茨木霉菌菌株的发酵液的制备方法，其特征在于：所述的PDA液体培养基由如下组分组成：土豆为100g～200g，葡萄糖为5g～20g，定容至1L蒸馏水中，pH为 6～8，121℃灭菌20min。
7.权利要求1所述的哈茨木霉菌菌株的孢子悬液的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将权利要求1所述的哈茨木霉菌菌株PRWS18接种于PDA固体培养基平板上，28℃倒置培养7天，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成孢子悬浮液，显微镜下计数孢子浓度，使所述的孢子悬液的浓度为1.0×105cfu/mL。
8.根据权利要求7所述的哈茨木霉菌的孢子悬液的制备方法，其特征在于：所述的PDA固体培养基由如下组分组成：土豆为100g～200g，葡萄糖为5g～20g，琼脂10g～20g，定容至1L蒸馏水中，pH为6～8，121℃灭菌20min。
9.权利要求1至8任一项所述的哈茨木霉菌菌株或哈茨木霉菌菌剂在生产用于防治三七根腐病的制剂中的应用。
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