CN112970780A - 人参专用微生物菌剂和降低人参锈腐病发病率的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及人参专用微生物菌剂和降低人参锈腐病发病率的方法。人参专用微生物菌剂包括重量比例为1:(10～100)的枯草芽孢杆菌悬液与生物菌肥；降低人参锈腐病发病率的方法包括以下步骤：(a)准备枯草芽孢杆菌发酵种子液，(b)将枯草芽孢杆菌发酵种子液进行扩培和稀释，然后将所得稀释液与生物菌肥复配，得到含有枯草芽孢杆菌菌液的复合肥，(c)将所述含有枯草芽孢杆菌菌液的复合肥以2～100Kg/亩的施用量施用于人参栽培地中。本申请能降低人参锈腐病的发病率，提高人参的质量，减少化肥和农药的施用，对于提高人参种植效益和保护生态环境都有良好效果。

Description

人参专用微生物菌剂和降低人参锈腐病发病率的方法
技术领域
本申请涉及人参栽培技术领域，特别地涉及人参专用微生物菌剂和降低人参锈腐病发病率的方法。
背景技术
人参Panax ginseng为五加科多年生草本植物，是我国传统名贵中药材，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津、安神等功效[1]。我国人参主要产地为东北地区。由于多年的无序采挖，野生人参已处于濒危状态，目前市面上常见的人参产品均为人工栽培。作为一种多年生的草本植物，人参从播种到采收通常至少需要5～6年。锈腐病是人参生产上危害较重的根部土传病害之一，常年发病率约为25～45％，严重地块高达90％以上，该病害发病重，难防治，对栽培人参的产量及品质影响很大。
目前，人参锈腐病的防治主要施用化学农药，不仅造成环境污染，还对人参品质具有重要影响。针对人参锈腐病的一些生防菌易受外界条件影响，且在与土壤、植物根际细菌微生物的竞争中难以长期占优势，使它们的实用价值受到极大影响。而来源于人参的内生细菌，比普通微生物菌剂受环境影响小，相对而言，生防效果会较为稳定。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是杆菌科的一种革兰氏阳性细菌，可用于益生菌或生防制剂。迄今为止，已发现超过400种枯草芽孢杆菌的菌株，相应的基因组序列已在美国国立生物技术信息中心(NCBI)公布。申请人在早期研究中，应用平板培养法从健康人参根内分离到40余株内生细菌，其中一株内生菌鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis，并命名为枯草芽孢杆菌YZ-ge25，该菌株对人参菌核菌、人参锈腐菌和人参黑斑菌均有明显的抑制作用[2]。枯草芽孢杆菌YZ-ge25发酵液中的脂肽粗提物至少含有1种抗菌环肽[3]。扫描电镜观察发现，菌株YZ-ge25分泌的抑菌脂肽明显抑制人参锈腐菌菌丝体的正常生长，导致菌丝体形态异常，发育畸形[4]。以上研究表明，该菌株具有潜在的防治人参根部锈腐病菌的能力，但尚未得到其在防治人参锈腐病过程中的田间施用方法。
参考文献
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发明内容
针对现有技术存在的不足，本申请提供一种人参专用微生物菌剂，其包括重量比例为1:(10～100)的枯草芽孢杆菌悬液与生物菌肥，其中所述枯草芽孢杆菌为中国医学科学院药用植物研究所栽培中心分离的枯草芽孢杆菌YZ-ge25菌株。
本申请还提供一种降低人参锈腐病发病率的方法，其包括以下步骤：
(a)准备枯草芽孢杆菌发酵种子液；
(b)将枯草芽孢杆菌发酵种子液进行扩培和稀释，然后将所得稀释液与生物菌肥复配，得到含有枯草芽孢杆菌菌液的复合肥；
(c)将所述含有枯草芽孢杆菌菌液的复合肥在人参栽培地中施用。
在一个实施方案中，其中步骤(a)进一步包括：从冰箱取出枯草芽孢杆菌YZ-ge25菌株，将所述枯草芽孢杆菌YZ-ge25菌株涂布于固体培养基平板，倒置于37℃培养，至平板上出现单菌落为止；挑取一环YZ-ge25菌株的单菌落，将所述YZ-ge25菌株的单菌落接入50～100ml液体培养基中，在37℃、160r/min振荡培养18～24h，即得菌株发酵种子液备用。
在一个实施方案中，其中步骤(b)进一步包括：将所述枯草芽孢杆菌发酵种子液接种液体培养基，摇培1～24h，得到枯草芽孢杆菌发酵液；其中，所述枯草芽孢杆菌发酵种子液接种所述液体培养基的比例为1:(75～120)(v/v)，所述液体培养基包括LB液体培养基或Landy液体培养基。
在一个实施方案中，其中步骤(c)中的所述人参栽培地包括东北地区适合栽培人参的林地或农田地，优选没有栽培过人参的林地；所述含有枯草芽孢杆菌菌液的复合肥的施用量为2～100Kg/亩。
本申请提供的方法是将枯草芽孢杆菌YZ-ge25发酵液与生物菌肥复配后，施用于人参栽培地，用于防治人参锈腐病。该方法能够增加枯草芽孢杆菌YZ-ge25发酵液的稳定性，便于在田间施用。施用该含有枯草芽孢杆菌YZ-ge25的复合肥后，能够显著降低人参锈腐病发病率，其效果明显大于单独施用生物菌肥的效果。
菌株保藏信息
本发明所用的枯草芽孢杆菌菌种为YZ-ge25菌株，该菌株在2013年4月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.7526。保藏地址：中国.北京.中国科学院微生物研究所.邮政编码：100101。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本申请中具体实施方式，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下，所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。本发明的上述内容及其他方面将通过下文进一步描述清楚，其中：
除非指明或者另外定义，使用的所有术语具有在本领域中的通用意义，为本领域技术人员所公知。例如，可以参见丁万隆著《药用植物病虫害防治彩色图谱》、沈萍著《微生物学》等。
本申请中，术语“锈腐病”指对人参根部危害最大的一种土传病害，是由四种柱孢属真菌引起的、发生在人参根部的病害。其危害人参的根、地下茎、越冬芽。人参锈腐病在我国人参产区均有发生。
本申请中，术语“枯草芽孢杆菌”是芽孢杆菌属的一种，革兰氏染色为阳性，可形成内生抗逆芽孢，为需氧型细菌。
本申请中，术语“种子液”指细菌菌种通过液体发酵，形成的能够满足大规模发酵需求的菌悬液。该悬液中的细菌具备一定的菌体规模，且生长周期一致，菌种活力高。
本申请中，术语“扩培”指种子液接种到液体培养基中进一步扩大规模发酵，以满足菌剂生产的需要。
本申请中，术语“复配”指大规模发酵的菌液按照特定的比例与基础有机肥混合，最终形成适用于人参病害防治的人参专用微生物菌剂。
本申请中，术语“菌株”指任何由一个独立分离的单细胞繁殖而成的纯种群体及其后代。
本申请中，术语“单菌落”指单个细菌形成的菌落。
本申请中，术语“摇培”指菌株接种液体培养基后，在摇床上以特定温度和转速震荡培养。
本申请中，术语“悬液”指菌株经液体发酵培养后，在培养基中形成含有大量菌体的悬浊液。
本申请中，术语“复合微生物有机肥”指特定微生物与营养物质复合而成，能提供、保持或改善植物营养，提高农产品产量或改善农产品品质的活体微生物制品。
本申请中，术语“人工撒播”指徒手将微生物菌剂撒施到田间土壤。
本申请中，术语“机械撒播”指通过机械化手段将微生物菌剂撒施到田间土壤。
本申请中，术语“水肥一体化灌溉”指将微生物菌剂与灌溉水混合，在灌溉的同时将微生物菌剂一同施入土壤的做法，该方法能够减少人工，提高效率。
在一个实施方案中，本申请的人参专用微生物菌剂包括重量比例为1:(10～100)的枯草芽孢杆菌悬液与生物菌肥，所述重量比例优选为1:(10～50)、更优选1:(10～30)、最优选1:20。
在一个实施方案中，本申请的人参栽培方法可以包括但不限于如下步骤：
(a)准备枯草芽孢杆菌发酵种子液；
(b)将枯草芽孢杆菌发酵种子液进行扩培和稀释，然后将所得稀释液与生物菌肥复
配，得到含有枯草芽孢杆菌菌液的复合肥；
(c)将含有枯草芽孢杆菌菌液的复合肥在人参栽培地中施用。
在一个实施方案中，枯草芽孢杆菌为中国医学科学院药用植物研究所栽培中心分离的枯草芽孢杆菌(自命名为YZ-ge25)，枯草芽孢杆菌YZ-ge25菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
在一个实施方案中，其中步骤(a)进一步包括：从冰箱取出枯草芽孢杆菌YZ-ge25菌株，涂布于固体培养基平板，倒置于37℃培养至平板上出现单菌落为止。挑取一环该菌株单菌落，接入50～100ml液体培养基中，在37℃、160r/min振荡培养18～24h，即得菌株发酵种子液备用。
上述固体培养基包括通用型培养基，优选LB固体培养基、牛肉膏蛋白胨培养基和PDA培养基，更优选牛肉膏蛋白胨培养基。上述液体培养基包括LB培养基和Landy培养基，优选LB培养基。
在一个实施方案中，步骤(b)进一步包括：将枯草芽孢杆菌发酵种子液接种液体培养基，摇培1～24h，得到枯草芽孢杆菌发酵液；其中，枯草芽孢杆菌发酵种子液接种所述液体培养基的比例为1:(75～120)(v/v)、优选1:100(v/v)，液体培养基包括LB液体培养基或Landy液体培养基，优选Landy液体培养基。
在一个实施方案中，步骤(b)进一步包括：将枯草芽孢杆菌发酵液用水稀释成枯草芽孢杆菌悬液，然后将枯草芽孢杆菌悬液与生物菌肥复配，其中枯草芽孢杆菌悬液优选1012～1013cfu/ml的YZ-ge25细菌悬液，更优选1013cfu/ml的YZ-ge25细菌悬液。
在一个实施方案中，生物菌肥进一步包括市售微生物菌肥和复合微生物有机肥，其中枯草芽孢杆菌悬液与生物菌肥的复配重量比例为1:(10～100)、优选1:(10～50)、更优选1:(10～30)和最优选1:20。
在一个实施方案中，其中步骤(c)中的所述人参栽培地包括适合栽培人参的林地或农田地，优选东北地区未栽种过人参的新林地；所述含有枯草芽孢杆菌菌液的人参专用微生物菌剂的施用量为2～100Kg/亩，优选2～50Kg/亩和2～30Kg/亩，更优选2～16Kg/亩，最优选2～8Kg/亩；其中步骤(c)可通过人工撒播、机械撒播或水肥一体化灌溉进行。
实施例
以下通过实施例来详细描述本申请，但是本申请并不限于这些实施例。
实施例1利用枯草芽孢杆菌发酵液防治人参锈腐病的实验1
(1)培养基的制备
配制LB液体培养基：称取蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母粉5g，加蒸馏水至1L，调节pH为7.0。装瓶，至高压灭菌锅内，在121℃高压灭菌30min，取出晾凉备用。
配制Landy液体培养基：葡萄糖20g，谷氨酸5g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl0.5g，MnSO4 5mg，CuSO4·5H2O 0.16mg，FeSO4·7H2O 0.15mg，蒸馏水1L，pH 7.0。
配制LB固体培养基：称取蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母粉5g，琼脂粉15g，加蒸馏水至1L，装瓶，至高压灭菌锅内，在121℃高压灭菌30min。固体培养基晾凉至50～80℃，倒入灭过菌的玻璃培养皿或一次性塑料培养皿。待培养基凝固即可。
(2)YZ-ge25菌种的接种和发酵液的制备
将人参细菌YZ-ge25菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7526。从菌种保藏冰箱取出YZ-ge25菌株，涂布LB固体平板培养基，并倒置于37℃培养24～48h，至长出单菌落为止。挑取一环YZ-ge25菌株接入100ml LB液体培养基中，在30℃、160r/min振荡培养24h，即得菌株发酵种子液。
(3)含YZ-ge25发酵液的复合肥的配制与施用
将枯草芽孢杆菌YZ-ge25发酵种子液以1:100(v/v)的比例接种，即2mL种子液接种200mL的Landy液体培养基，在37℃、160r/min振荡培养24h。将所得发酵液用无菌水稀释，稀释后的菌株发酵液用分光光度计测量OD600，通过标准曲线计算菌液浓度，加水稀释成1013cfu/mL悬浮液，再按照1:20(w/w)比例与复合微生物有机肥(购自济南峪新农业科技有限公司)充分混匀，最终形成含YZ-ge25菌株的人参专用微生物菌剂。
(4)田间试验
实验场地为吉林省靖宇县镇郊参场，所选地块为曾种植过玉米、大豆等作物的农田地，此前未曾栽种过人参。经过两年土壤改良，移栽生长较为一致的三年生人参种苗。2015年5月中下旬人参幼苗移栽时，将含YZ-ge25发酵液的人参专用微生物菌剂按特定用量均匀撒入开好的沟槽内。其中，人参专用微生物菌剂的施用量分别为2Kg/亩、8Kg/亩、16Kg/亩的施用量，对照1(CK1)不施复配人参专用微生物菌剂及其他复合微生物有机肥，对照2(CK2)为不含YZ-ge25发酵液的复合微生物有机肥(按照有机肥使用说明进行操作，每亩用量300Kg)。当年秋季调查不同处理人参锈腐病的发生情况，SPSS20.0对不同处理人参锈腐病发病率的显著性差异进行统计分析。
表2.不同处理人参锈腐病的发病率
Figure BDA0002948720290000061
注：a、b、c分别代表不同处理在p＝0.05水平的显著性差异，相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著。
实施例2利用枯草芽孢杆菌发酵液防治人参锈腐病的实验2
除了人参专用微生物菌剂的施用量分别为80Kg/亩、50Kg/亩和30Kg/亩以外，实施例2以与实施例1相同的方式进行，获得与实施例1类似的降低人参锈腐病发病率的效果。
实施例3利用枯草芽孢杆菌发酵液防治人参锈腐病的实验3
除了枯草芽孢杆菌YZ-ge25悬浮液与复合微生物有机肥(购自济南峪新农业科技有限公司)按照重量比例为1:80以外，实施例3以与实施例1相同的方式进行，获得与实施例1类似的降低人参锈腐病发病率的效果。
产业上的可利用性
随着社会的发展，人们对健康更加关注，人参作为一种珍贵的药食两用资源，市场需求量逐年增加。人参栽培技术的研究受到越来越多的关注。人参锈腐病是一种土传病害，主要侵染人参根部，造成人参根腐烂，该病发病率高，难于根治。化学防治会造成参地及周边生态环境污染，同时农药残留对人参质量也有较大影响。本申请涉及的降低锈腐病发病率的人参栽培方法，应用范围较广，操作简单，不使用农药和化肥，能够为参农带来较大的经济效益，也能为人参产区带来良好的生态效益。

Claims (10)

1.一种人参专用微生物菌剂，其包括重量比例为1:(10～100)的枯草芽孢杆菌悬液与生物菌肥。
2.根据权利要求1所述的人参专用微生物菌剂，其中所述重量比例为1:(10～100)、优选1:(10～50)、更优选1:(10～30)，最优选1:20。
3.根据权利要求1所述的人参专用微生物菌剂，其中所述枯草芽孢杆菌为中国医学科学院药用植物研究所栽培中心分离的枯草芽孢杆菌YZ-ge25，所述枯草芽孢杆菌YZ-ge25菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；所述生物菌肥包括市售微生物菌肥和复合微生物有机肥。
4.一种降低人参锈腐病发病率的方法，其包括以下步骤：
(a)准备枯草芽孢杆菌发酵种子液；
(b)将所述枯草芽孢杆菌发酵种子液进行扩培和稀释，然后将所得稀释液与生物菌肥复配，得到含有枯草芽孢杆菌菌液的复合肥；
(c)将所述含有枯草芽孢杆菌菌液的复合肥以一定的施用量施用于人参栽培地中。
5.根据权利要求4所述的降低人参锈腐病发病率的方法，其中所述枯草芽孢杆菌为中国医学科学院药用植物研究所栽培中心分离的枯草芽孢杆菌YZ-ge25。
6.根据权利要求5所述的降低人参锈腐病发病率的方法，其中所述枯草芽孢杆菌YZ-ge25菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
7.根据权利要求4所述的降低人参锈腐病发病率的方法，其中步骤(a)进一步包括：从冰箱取出枯草芽孢杆菌YZ-ge25菌株，将所述枯草芽孢杆菌YZ-ge25菌株涂布于固体培养基平板，倒置于37℃培养，至平板上出现单菌落为止；挑取一环YZ-ge25菌株的单菌落，将所述YZ-ge25菌株的单菌落接入50～100ml液体培养基中，在37℃、160r/min振荡培养18～24h，即得菌株发酵种子液备用；其中，所述固体培养基包括通用型培养基，优选LB固体培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基，更优选牛肉膏蛋白胨培养基；其中所述液体培养基包括LB培养基、Landy培养基，优选LB培养基。
8.根据权利要求4所述的降低人参锈腐病发病率的方法，其中步骤(b)进一步包括：将所述枯草芽孢杆菌发酵种子液接种液体培养基，摇培1～24h，得到枯草芽孢杆菌发酵液；其中，所述枯草芽孢杆菌发酵种子液接种所述液体培养基的体积比例为1:(75～120)、优选1:100，所述液体培养基包括LB液体培养基或Landy液体培养基，优选Landy液体培养基；其中将所述枯草芽孢杆菌发酵液用水稀释成特定浓度的枯草芽孢杆菌悬液，然后将所述枯草芽孢杆菌悬液与生物菌肥复配，其中所述枯草芽孢杆菌悬液优选1012～1013cfu/ml的YZ-ge25细菌悬液，更优选1013cfu/ml的YZ-ge25细菌悬液。
9.根据权利要求8所述的降低人参锈腐病发病率的方法，其中所述生物菌肥包括市售微生物菌肥和复合微生物有机肥；其中所述枯草芽孢杆菌悬液与所述生物菌肥的复配重量比例为1:(10～100)，优选1:(10～50)，更优选1:(10～30)，最优选1:20，最终形成人参专用微生物菌剂。
10.根据权利要求4所述的降低人参锈腐病发病率的方法，其中步骤(c)中的所述人参栽培地适用于产区所有适合人参栽培的土地，优选未栽种过人参的新林地；所述一定的施用量是指每亩人参施用微生物菌剂的量为2～100Kg/亩，优选2～50Kg/亩和2～30Kg/亩，更优选2～16Kg/亩，最优选2～8Kg/亩；其中所述步骤(c)可通过人工撒播、机械撒播或水肥一体化灌溉进行。
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