CN115595278B - 人参防病促生菌肥及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了枯草芽孢杆菌TJ23‑2菌株，保藏编号为CCTCC M 2022750。一种复配菌肥，它是由下述方法制备的：JJ5‑2菌、NT35菌、NJ13菌和TJ23‑2菌株分别发酵，制成4种发酵培养液；将4种发酵培养液等体积复配，接种量、混匀，发酵培养，干燥，得复配菌肥；所述的复配菌肥在人参防病促生方面的应用。优点在于：通过对菌株与载体的筛选，明确了菌肥发酵工艺与菌肥配方，验证了菌肥的实际应用效果，确定了菌肥C 8 g/m2处理后可以提高土壤细菌丰富度和多样性，改变了人参正常生长的微生物组成变化规律，降低了土壤中锈腐病原菌的丰富度；且可以提高人参皂苷含量，相关合成酶基因表达量上调。
Description
技术领域
本发明属于微生物菌肥技术领域，具体涉及人参防病促生菌肥及其应用。
背景技术
吉林省是我国人参主要的生产地区，全国人参总产量的4/5来源于吉林省。韩国的人参产量不足吉林省的1/3，但人参的产值却是吉林省的4倍。进入21世纪以后，我国的人参产业在对外出口贸易面临着严峻的考验，人参的品质下降，导致我国的环境面临着巨大的压力，致使病害防治变得更加不容乐观。
为解决这一难题，运用生防菌来防治人参病害引起了越来越多的关注，生防菌广泛存在于人参体内以及根际土壤之中，通过拮抗作用、竞争作用和诱导人参产生抗性来达到减少病害的目的，明确生防菌对人参锈腐病的防治作用具有一定的科学意义。
随着人们对可绿色、持续农业的不断重视以及对可持续植保观念的认识不断发展，生物防治的地位也不断的升高。为了寻求更加安全有效地人参病害防治方式，生物防治走入了人们的视线。生防菌具有安全环保、繁殖速度快以及部分生防菌还具一定的促生作用等优点，因此微生物菌剂、菌肥等的研发与利用是防治人参病害的必然趋势。
微生物菌肥是一种具有特定功能或者多种功能的新兴生物肥料制品，其核心是具有特殊功能的微生物通过其生命活动以达到在农业生产中具有改善土壤环境、提高作物产量、减少经济植物病害发生等目的。近年来，随着科研工作者对生物菌肥的研究日益增多，“生物菌肥”已变得耳熟能详。且微生物菌肥无毒副作用、投入成本低，在粮食安全、节约资源、修复土壤等方面均强于化学肥料，更符合绿色农业的发展理念。常见的菌肥有三种，微生物菌剂、生物有机肥、复合微生物菌肥。
发明内容
本发明目的是提供人参防病促生菌肥及其应用。
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis TJ23-2菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2022750。
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis TJ23-2菌株在防止人参病害方面的应用；
所述的病害是由锈腐病原菌引起的。
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis TJ23-2菌株在人参促生长的应用。
一种复配菌肥，它是由下述方法制备的：
1）苏云金芽孢杆菌B. thuringiensis JJ5-2菌、贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis NT35菌、甲基营养型芽孢杆菌Bacillusmethylotrophicus NJ13菌和所述的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis TJ23-2菌株分别发酵，制成4种发酵培养液；
2）将步骤1）制备的4种发酵培养液等体积复配，按35~45%接种量加入到载体中，混匀，在25~30℃下发酵培养7~10d，干燥，得复配菌肥；所述的载体，是小麦秸秆粉和玉米秸秆粉按体积比1：1~3混合得到的载体；
步骤1）所述的发酵，其发酵培养基为：
TJ23-2发酵培养基：葡萄糖26 g，酵母浸粉12.9 g，氯化钠11 g，硫酸锰0.3 g，蒸馏水1000 mL，pH7.0；
JJ5发酵培养基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1000 mL，pH7.0；
NT35发酵培养基：酵母浸粉25g，玉米粉15g，磷酸氢二钾15g，硫酸铵25g，蒸馏水1000mL，pH7.0；
NJ13发酵培养基：葡萄糖30g，淀粉15g，酵母浸粉15g，磷酸氢二钾1g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.0；
步骤2）所述的小麦秸秆粉和玉米秸秆粉体积比为1:3；
步骤2）所述的接种量为40%；
步骤2）所述的发酵培养温度为28℃；
所述的复配菌肥，在人参种植时施用量为8g/m2。
本发明提供了枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis TJ23-2菌株，该菌株已于2022年05月30日在（中国典型培养物保藏中心-武汉大学）进行保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M2022750。一种复配菌肥，它是由下述方法制备的：1）苏云金芽孢杆菌JJ5-2菌、贝莱斯芽孢杆菌NT35菌、甲基营养型芽孢杆菌NJ13菌和所述的枯草芽孢杆菌TJ23-2菌株分别发酵，制成4种发酵培养液；2）将步骤1）制备的4种发酵培养液等体积复配，按35~45%接种量加入到载体中，混匀，在25~30℃下发酵培养7~10d，干燥，得复配菌肥；所述的载体，是小麦秸秆粉和玉米秸秆粉按体积比1：1~3混合得到的载体；所述的枯草芽孢杆菌在人参防病或促生方面的应用。优点在于：通过对菌株与载体的筛选，明确了菌肥发酵工艺与菌肥配方，验证了菌肥的实际应用效果，确定了菌肥C 8 g/m2处理后可以提高土壤细菌丰富度和多样性，改变了人参正常生长的微生物组成变化规律，降低了土壤中锈腐病原菌的丰富度。
附图说明
图1 不同菌株产蛋白酶试验效果；
图2 不同菌株产蛋白酶水解圈直径比较；
图3 不同菌株产淀粉酶试验效果；
图4 不同菌株产淀粉酶水解圈直径比较；
图5 不同菌株产纤维素酶试验效果；
图6 不同菌株产纤维素酶水解圈直径比较；
图7 不同菌株降解效果比较；（a）木质素透明圈直径；（b）半纤维素透明圈直径；
图8 人参离体接种；A：TJ23-2；B：JJ5；C：NJ13；D：NT35；E：TJ23-2：JJ5：NJ13：NT35=1：1：1：1；F：清水对照处理组；
图9 种子萌发试验；A：TJ23-2；B：JJ5；C：NJ13；D：NT35；E：TJ23-2：JJ5：NJ13：NT35=1：1：1：1；F：清水对照处理组；
图10 菌株TJ23-2形态学观察；
图11 菌株TJ23-2系统进化树；
图12 不同处理下人参指标统计；A.人参发病情况；B.人参防治效果；C.人参生长情况；D.人参主根长度情况；E.人参根直径情况；F.增产率结果；
图13 0.4 mg/mL人参皂苷标准品峰图；
图14 不同生长期各处理组酶活力变化情况；A.蔗糖酶；B.脲酶；C.磷酸酶；D.过氧化氢酶。
具体实施方式
实施例1 菌肥供试菌株筛选
一、试验材料
1、供试菌株
抗病菌株：NT35、NJ13、FG14、JA26、JA38、TU26；促生菌株：TJ23-2、JJ5-2、JI39、JI6，病原真菌人参锈腐菌由吉林农业大学生命科学学院微生物资源开发与利用研究室保存。
2、供试材料
三年生的健康人参，表皮及芦头未染病；充分后熟的人参种子，芽表面无锈斑和萎蔫情况。
3、供试培养基
1）LB液体培养基；LB固体培养基；马铃薯葡萄糖培养基(PDA)；
2）蛋白酶初步筛选培养基:脱脂奶粉3.0g、琼脂3.0g、蒸馏水200mL；
3）淀粉酶初步筛选培养基：淀粉20.0g，酵母膏5.0g，蛋白胨10g，磷酸氢二钠5.0g，硫酸镁0.1g，氯化钠0.1g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.4，卢戈氏碘液:碘1g，碘化钾2g，加水定容至300 mL；
纤维素酶初步筛选培养基：羧甲基纤维素钠1 g，琼脂2 g，硫酸铵0.25 g，磷酸氢二钾0.3 g，硫酸镁0.05 g，定容至100 mL，pH7.0；
4）木质素初步筛选培养基：（愈创木酚-PDA 固体培养基）：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂18 g/L，愈创木酚0.4 g/ L，微量VB1，pH自然；
5）半纤维素降解菌分离培养基：氯化钠5g、琼脂15~20g、牛肉膏3g、蛋白胨10g、0.5%的木聚糖、水1000mL；
6）TJ23-2发酵基础培养基：葡萄糖10 g，酵母浸粉10 g，氯化钠6 g，硫酸镁0.1 g，蒸馏水1000 mL，pH7.0；
7）JJ5-2发酵培养基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1000 mL，pH7.0；
8）NT35发酵培养基：酵母浸粉25 g，玉米粉15 g，磷酸氢二钾15 g，硫酸铵25 g，蒸馏水1000 mL，pH7.0；
9）NJ13发酵培养基：葡萄糖30 g，淀粉15 g，酵母浸粉15 g，磷酸氢二钾1 g，氯化钠5 g，蒸馏水1000 mL，pH7.0。
二、菌肥用菌的筛选
（一）筛选方法
1、生防菌株间拮抗性测定
含菌平板的制备：配制每瓶含有45 mL LB固体培养基，将菌株用8.0 mm的打孔器在该菌种平板上打2个菌饼接种放在LB液体培养基中培养过夜，备用，然后将准备好的45mL LB固体培养基融化后，冷却至约45℃，抽取5 mL的菌株的发酵液加入到装有45mL LB培养基中，充分混匀后迅速倒入培养皿中，制成含菌平板。
菌株的接种：将待测菌株用8.0 mm的打孔器打下一个菌饼后，倒置于制备的含菌平板中央，与含菌平板紧密接触后放入28 ℃培养箱中培养2-3 d。
待菌株长出后，观察中心菌饼附近有无透明抑菌圈，并测量直径与记录，观察是否可以进行复配。
2、产酶能力试验测定
（1）产蛋白酶测定
将产蛋白酶特定培养基融化后，制成平板，用灭菌后的牙签蘸取待测菌株，然后将含菌的牙签在平板上均匀点接三次，然后放入28 ℃培养箱中培养2-3 d，取出培养皿并用肉眼观察平板，出现水解圈证明待测菌株有产蛋白酶的能力。
（2）产淀粉酶测定
将产淀粉酶特定培养基融化后，制成平板，用灭菌后的牙签蘸取待测菌株，然后将含菌的牙签在平板上均匀点接三次，然后放入28 ℃培养箱中培养2-3 d，取出培养皿在菌落周围滴加碘液，并用肉眼观察平板，出现水解圈证明待测菌株有产淀粉酶的能力。
（3）产纤维素酶测定
将产纤维素特定培养基融化后，制成平板，用灭菌后的牙签蘸取待测菌株，然后将含菌的牙签在平板上均匀点接三次，然后放入37 ℃培养箱中培养2-3 d，取出培养皿对处理组用2%的刚果红染色15 min后，用1 M 的盐水进行脱色，并用肉眼观察平板，出现水解圈证明待测菌株有产纤维素酶的能力。
（4）降解木质素测定
将木质素筛选培养基融化后，制成平板，用灭菌后的牙签蘸取待测菌株，然后将含菌的牙签在平板上均匀点接三次，然后放入28 ℃培养箱中培养2-3 d，取出培养皿并用肉眼观察平板，出现水解圈证明待测菌株降解木质素的能力。
（5）降解半纤维素测定：
将半纤维素分离培养基融化后，制成平板，用灭菌后的牙签蘸取待测菌株，然后将含菌的牙签在平板上均匀点接三次，然后放入37 ℃培养箱中培养2-3 d，取出培养皿并用肉眼观察平板，出现水解圈证明待测菌株有降解半纤维素的能力。
3、室内离体接种试验
生防菌株发酵液的制备：TJ23-2、JJ5-2、NJ13、NT35在LB固体培养基上划线培养24h后，用8.0 mm的打孔器在培养基上打2个菌饼接种到灭菌的LB培养液中(50/250 mL)，TJ23-2和JJ5-2在温度28℃、转速160rpm条件下培养12h制得种子液，NJ13和NT35在温度28℃、转速160rpm条件下培养9h获得种子液。以4.0%接种量接种在配置好的发酵培养基中，TJ23-2和JJ5-2在温度28℃、转速160rpm培养24h获得发酵液，NJ13和NT35在温度28℃、转速160rpm培养72h获得发酵液。然后将各生防菌株发酵液浓度稀释到108 cfu/mL，备用。试验处理组设计如表1。
生防菌接种：取长势相同的健康的3年生人参，用75％的酒精消毒2 min，用无菌水冲洗干净，晾干。用灭菌的20 μL枪头在人参表皮不同部位刺破成小孔制造伤口，并使伤口深度保持一致，每根人参4次重复，表皮放上脱脂棉，在脱脂棉上加入200 μL生防菌株的发酵液，定殖1d。
病原菌接种：取下脱脂棉，将人参锈腐病菌用打孔器制成直径8 mm的菌饼，将菌病菌丝面紧贴于人参表皮的伤口处进行侵染，用提前灭过菌的牙签对锈腐菌饼与人参进行固定，定殖1d。
处理组为接种人参锈腐病病原菌，对照组为只接种无菌水，每个处理3次重复。每日观察人参的发病状况。并在处理后的1 d、3 d、6 d、9 d、12 d、15 d拍照记录。
4、室内平皿种子萌发试验
将生防菌株制得发酵液后，8000 rpm离心5 min收集菌体。用无菌水洗涤2次后重悬浮于无菌水中，血球计数板测定浓度并将其稀释成浓度为109cfu/mL的细菌悬浮液；试验处理组设计同表1。
选择将已后熟且芽表面无锈斑的人参种子在接种前用1%或0.5%次氯酸钠浸泡2min，然后用无菌水彻底清洗，然后将人参种子浸泡在菌悬液中3 h，取出晾干表面液体后，置于装有无菌湿润沙子的培养皿中，每皿均匀摆放8粒种子即为1次重复，试验设置3次重复，将平皿于暗处18-23 ℃放置催芽10-15d，以无菌水处理的种子为对照。
（二）结果
1、生防菌株间拮抗性测定
采用琼脂块抑菌环法，对实验室供试的10株细菌间做拮抗性试验，结果如表2，菌株TJ23-2和JA38之间有拮抗作用，抑菌圈直径为8.0 mm；菌株FG14和TJ23-2以及JJ5-2之间有较强的拮抗作用，抑菌圈直径分别为12.3 mm和12.8 mm；菌株JA26和NJ13之间的拮抗效果最强，抑菌圈直径达到了16.8 mm；菌株JI39和NT35以及NJ13之间的拮抗作用较强，抑菌圈直径分别为12.7 mm和15.3 mm；菌株TU26和NT35之间的拮抗作用较轻，抑菌圈直径为6.3mm；其余菌株间没有明显的拮抗效果，表明菌株间可以进行复配使用。
2、菌株的产酶能力试验测定
对生防菌株进行产蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶，以及降解木质素、半纤维素能力的初步筛选，对各菌株的产酶能力进行统计比较。
（1）产蛋白酶测定
对含有产蛋白酶特定培养基的培养皿进行点接接种，水解效果如下图1所示，JA26没有明显的水解圈，其余菌株都有明显的水解效果，从图2中可知FG14，TJ23-2和NT35的水解效果处于较高水平。
（2）产淀粉酶测定
对装有产淀粉酶特定培养基的培养皿进行点接接种，水解效果如下图3所示，NJ13、FG14、NT35有水解能力，其余菌株都没有明显的水解效果，从图4中可知NJ13水解能力最强其水解圈直径达到了9.0 mm，除NJ13、FG14、NT35外其余菌株不产生水解圈，即没有产淀粉酶的能力。
（3）产纤维素酶测定
对装有产纤维素酶特定培养基的培养皿进行点接接种，水解效果如下图5所示，FG14、JJ5-2、NJ13、TJ23-2、NT35有较明显的水解圈，其余菌株都没有明显的水解效果，从图6中可知FG14、JJ5-2、TJ23-2和NT35水解能力较强，NJ13水解能力低于其他菌株，其余菌株不产生水解圈，即没有产纤维素酶的能力。
（4）降解木质素能力测定
对装有木质素筛选培养基的培养皿进行点接接种，试验结果如图7（a）所示，TJ23-2、JJ5-2、FG14、NJ13、NT35可在培养基上产生透明圈，有降解木质素的能力，其余菌株都没有在培养基上产生透明圈，即没有产降解木质素的能力。
（5）降解半纤维素能力测定
对装有半纤维素分离培养基的培养皿进行点接接种，试验结果如图7（b）所示，TJ23-2、JJ5-2、FG14、NJ13、NT35可在培养基上产生透明圈，有降解半纤维素的能力，其余菌株都没有在培养基上产生透明圈，即没有产降解半纤维素的能力。
综合菌株间拮抗性测定和菌株产酶特性筛选试验结果，得到4株优良菌株TJ23-2、JJ5-2、NJ13、NT35可进行复配使用。
3、室内离体接种试验
人参室内离体接种试验，结果如表3，从侵染深度指标可知4株菌株等比复配处理组显著低于其它处理组，且与对照组对比效果明显；扩散程度指标可知4株菌株等比复配处理组与抗病菌NT35：NJ13等比复配处理组显著优于其它处理组，且与对照组对比效果明显。
由图8可以看出对照组在第6 d时，接种部位开始发生变色，而4种菌株等比复配处理组无明显变化。在第15 d时，表皮和剖面都显示对照组4个接种部位发生严重腐烂变色，而处理组表面发生轻微变色并无腐烂情况出现。
注：A：TJ23-2，B：JJ5-2，C：NT35，D：NJ13；各复配处理比例1：1 。
4、室内平皿种子萌发试验
室内人参种子萌发试验，从芽长指标可知，如表4，4株菌株等比复配处理组显著高于其它处理组，且与对照组对比效果明显；根长指标可知4株菌株等比复配处理组与JJ5-2：NT35：NJ13等比复配处理组显著优于其它处理组，且与对照组对比效果明显。
由图9可以看出菌体复配处理组种子的促生效果明显优于对照组，菌体复配处理组的根和芽都比对照组生长旺盛。
注：A：TJ23-2，B：JJ5-2，C：NT35，D：NJ13；复配比例1：1：1：1 。
通过菌株间共培养的拮抗性试验，得到了可以进行复配的菌株。通过产酶能力试验，进一步确定了各菌株的产酶能力；并最终确定了符合试验要求的4株菌株：TJ23-2、JJ5-2、NT35、NJ13；复配比例1：1：1：1；所述的JJ5-2菌，为苏云金芽孢杆菌B. thuringiensis，公开于《一株人参内生产吲哚乙酸细菌的筛选及鉴定》；所述的NT35菌，为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）NT35菌，公开于《Bacillus velezensis NT35菌株抗菌蛋白的分离纯化及性质研究》；所述的NJ13菌为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillusmethylotrophicus）NJ13，它的保藏编号为CGMCC No.6679。
三、菌株TJ23-2的鉴定
（1）培养特征和形态特征观察
将菌株TJ23-2划线接种在LB培养基上，28℃培养24 h，观察记录单菌落形态；采用革兰氏染色法，进行染色观察细胞形态。
（2）生理生化学特征
参照东秀珠编辑的《常见细菌系统鉴定手册》对菌株TJ23-2进行生理生化特性测定。
（3）菌株TJ23-2的16S rRNA分子鉴定
25 μLPCR反应体系参考张亮等人。反应结果经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，纯化后样品送生工测序。所获序列在NCBI数据库中进行BLAST同源性比对并提交GenBank获取授权登记号，利用MEGA 7.0软件进行多序列比对并构建系统发育树。
结果：由于实验室供试的10株生防菌中，TJ23-2尚未明确其菌株类型，所以需对其进行鉴定。
菌株TJ23-2的菌落呈白色，菌落表面不透明（图10A），革兰氏染色结果为阳性菌（图10B）。
菌株TJ23-2的生理生化特性测定结果如表5所示，菌株TJ23-2不产生吲哚乙酸，可以利用D-葡萄糖、木糖、阿拉伯糖。
将测序得到菌株TJ23-2的16SrRNA基因序列上传到NCBI，测序结果经BLAST同源性比对，从序列的一致性比率来看，菌株TJ23-2应属于芽孢杆菌属（Bacillus sp.），为进一步确定菌株TJ23-2在芽孢杆菌属里的所属位置，选取了一些在BLAST比对结果中相似度较高的菌种进行进化树分析，结果如图11。发现菌株TJ23-2在芽孢杆菌菌属内与Bacillus subtilis的亲缘关系较近，在进化树内聚为一类，且同源性高达99.90%。
通过形态学、生理生化及16SrRNA基因序列分析，最终确定菌株TJ23-2为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M 2022750。
实施例2 复配菌肥的制备
一、材料
菌肥载体：小麦秸秆和玉米秸秆（吉林农业大学提供）；
LB液体培养基；LB固体培养基；
TJ23-2发酵培养基：葡萄糖26 g，酵母浸粉12.9 g，氯化钠11 g，硫酸锰0.3 g，蒸馏水1000 mL，pH7.0；
JJ5发酵培养基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1000 mL，pH7.0；
NT35发酵培养基：酵母浸粉25g，玉米粉15g，磷酸氢二钾15g，硫酸铵25g，蒸馏水1000mL，pH7.0；
NJ13发酵培养基：葡萄糖30g，淀粉15g，酵母浸粉15g，磷酸氢二钾1g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
二、载体预处理
小麦秸秆粉、玉米秸秆粉载体进行干燥处理，待彻底烘干后进行粉碎，过18目筛、装袋备用。
三、菌株发酵液的制备
1、菌株活化：将甘油管保存的菌株NT35（Bacillus velezensis）、NJ13（Bacillus methylotrophicus）、TJ23-2（Bacillus subtilis）和JJ5-2（Bacillus thuringiensis）涂布于NA培养平皿上活化，然后再划线转接在含NA培养基的培养皿中备用；
2、种子液的制备：将活化后的4株菌打菌饼备用，然后分别接种在LB液体培养基中，温度28℃，转速为160rpm，培养10 h制备种子液；
3、发酵培养液的制备
1）将菌株NT35种子液按4%接种量接入发酵培养基，在温度28℃、pH为7.0、转速160rpm下，培养72h，获得菌体量为2×1010cfu/ml；所述发酵培养基组分包括：酵母浸粉2.5%，玉米粉1.5%，磷酸氢二钾1.5%，硫酸铵2.5%；
2）将菌株NJ13种子液按4%接种量接入发酵培养基，在温度28℃、pH 7.0、转速为160 rpm下，培养72 h，获得菌体量为3×1010cfu/ml；所述发酵培养基组分包括：葡萄糖3%、淀粉1.5%、酵母浸粉1.5%、磷酸氢二钾0.1%、氯化钠0.5%；
3）将菌株TJ23-2种子液按6%接种量接入发酵培养基，在温度37℃、pH7.0、转速为160rpm下，培养24h，获得菌体量为3×109cfu/ml；所述发酵培养基组分包括：葡萄糖2.6%，酵母浸粉1.3%，氯化钠1%，硫酸锰0.03%；
4）将菌株JJ5-2种子液按4%接种量接入发酵培养基，在温度28℃、pH7.0、转速为160rpm下，培养24h，获得菌体量为3×109cfu/ml；所述发酵培养基组分包括：胰蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%、氯化钠1%。
按上述方法分别制备4株菌的发酵培养液。
四、复配载体菌肥的配制
1、准备复配载体：将复配载体（小麦秸秆粉和玉米秸秆粉）按复配比例1：3（体积比）复配后，称取10g装于肥料袋中，然后向袋中加入40%的蒸馏水，封袋，放入高压灭菌锅121℃，灭菌2次，每次60 min左右，充分保证载体灭菌完全；
2、接种：将4株生防菌TJ23-2、JJ5-2、NT35、NJ13分别培养制得发酵液后，等比例（体积相同）配置成菌体混合接种液备用；待复配载体灭菌完成后，温度降至室温，在超净工作台内以40%接种量将菌体混合接种液加入到复配载体中，保证接种后的复配载体充分搅拌均匀，封袋；
3、发酵：将接种后的复配载体置于28℃恒温培养箱中，培养时间为7-10d，待复配载体发酵完成后，制得菌肥；
4、菌肥成肥处理：将制得的复配菌肥置于28℃且通风的干燥箱内，保证箱体清洁无污染，待菌肥含水量下降至25%左右，取出放于阴凉干燥处备用。
实施例3 菌肥防病、促生应用
供试人参及土壤：吉林省抚松县抽水乡人参锈腐病发生地块内2年生人参，品种为大马牙；土壤为小区内人参根际土壤。
供试药剂：见表6。
一、不同配方复配菌肥的制备
供试菌肥：除菌肥载体不同，其余制备方法同实施例2；所述的供试菌肥分为以下四组：
A）小麦秸秆粉：玉米秸秆粉（重量比1：2）配方菌肥；
B）小麦秸秆粉：玉木耳菌包粉（重量比1：2）配方菌肥；
C）小麦秸秆粉：玉米秸秆粉（重量比1：3）配方菌肥；
D）豆粕粉：玉米秸秆粉（重量比2：1）配方菌肥。
二、田间种植方法
首先对小区进行划分，将整个小区进行等比划分成1 m2的小区，试验小区处于坡度较大的山腰位置，考虑到坡顶和坡底的土壤条件和外界自然条件差异较大，所以栽种采用循环套种来保证各处理试验的同一性，即坡顶为各处理组第一次重复，坡中为各处理组第二次重复，坡底为各处理组第三次重复；小区划分完成后用插地牌标注各小区处理组信息，用小区内的土对相应菌肥进行拌土稀释，然后均匀地洒在对应小区，然后将参苗均匀的铺在参床内，覆土厚度距参苗芦头上方2-3公分左右为宜。
三、田间试验设计
田间试验在吉林省抚松县抽水乡人参锈腐病发生地块进行，选用2年生人参栽苗，品种为大马牙。
小区设计：每个小区面积1 m2，每个处理设置3次重复，行距20 cm，小区间间隔20cm，每行20株，每小区约60株。
菌肥处理组有效成分及对照组有效成分均在见表7。
四、防病效果
人参收获后对全小区人参根进行病害严重度分级调查，计算防治效果，并拍照记录，比较各小区间发病情况差异，分级标准参照Rahman报道，见表8，病情指数、增产率计算公式如下。
病情指数（disease severity index，DSI）=[(X1×1)+(X2×2)+(X3×3)+(X4×4)+(X5×5)+(X6×6) +)]/(X1+X2+X3+X4+X5+X6)；X1、X2、X3、X4、X5和X6分别代表1-6级的病株数。
防治效果（%）=（对照组平均病情指数-处理组平均病情指数）/对照组平均病情指数×100%
增产率（%）=（处理组株平均重量-对照组株平均重量）/对照组株平均重量×100%
结果：分析对数据比较分析；结果显示菌肥C 8 g/m2处理组的病情指数比其余处理组显著低，其病情指数仅为1.68；而清水对照处理组组的病情指数最高达到了4.385，其余对照组的病情指数表现都差于菌肥C 8 g/m2处理组，表明菌肥C在田间应用时8 g/m2的施用量对人参的发病情况有显著的抑制作用，试验结果如图12A。
对各处理组病情指数进行统计后，以清水对照组为基准计算各处理组的防治效果，结果显示菌肥C 8 g/m2处理组的防治效果高于其余处理组，达到了61.1%，而其余对照组的防治效果最高为50%左右，中农绿康对照处理组仅为44%左右，表明菌肥C在田间应用时8 g/m2的施用量对人参的防治效果有显著的促进作用，试验结果如图12B。
对上述促生指标进行统计分析后，以清水对照组为基准计算各处理组间的增产率，结果显示菌肥C 8 g/m2处理组的增产率高于其余处理组，达到了32.31%，而对照组中防治效果最高的中农绿康处理组为20%左右，多菌灵对照处理组仅为6.14%，表明菌肥C在田间应用时8 g/m2的施用量对人参的增产有显著的促进作用，试验结果如图12C。
四、促生效果
人参收获后对各小区人参根分别进行称重，并对主根直径和根的长度进行测量，并拍照记录，比较各小区间促生指标差异。
结果：
1、根部：对收获的各小区、各处理的人参进行统计株数并称量重量，统计各处理根部重量指数并运用方差分析对数据比较分析。菌肥C 8 g/m2的株平均重量比其余处理组显著高，达到了55.6 g，清水对照处理组仅为42.17 g，且其余对照处理组的平均重量均低于菌肥C 8 g/m2处理组，表明菌肥C在田间应用时8 g/m2的施用量对人参根部的生长有显著的提升效果，试验结果如图12D。
2、主根根长：对各处理组促生重量进行统计后，统计比较各处理组的主根长度情况，运用方差分析对数据比较分析。菌肥A 8 g/m2处理组和菌肥C 8 g/m2处理组的根长显著高于其它处理组，分别为达到了233.0 mm和232.44 mm，而清水对照处理组的根长仅为203.2 mm。试验结果如图12E。
3、根直径：对各处理组促生重量进行统计后，统计比较各处理组的根直径生长情况，运用方差分析对数据比较分析。结果显示各处理组之间没有显著差异，但菌肥C处理组的主根直径整体情况较好，整个处理组平均值达到了10.5 mm左右，而清水处理组仅为9.68mm。试验结果如图12F。
根据综上结果得出菌肥C为优良菌肥；后续以菌肥C（即载体为小麦秸秆粉：玉米秸秆粉= 1：3）进行实验。
实施例4优良菌肥对人参根际土壤酶活力的影响
1、田间种植方法
首先对小区进行划分，将整个小区进行等比划分成1m2的小区，小区划分完成后用插地牌标注各小区处理组信息。用优良菌肥进行拌土处理，均匀地洒在对应小区，然后将参苗均匀的铺在参床内，覆土厚度距参苗芦头上方2-3公分左右为宜。
2、土壤取样
在人参展叶期、开花结果期、参根膨大期和成熟期田间取样，取样时根据人参地面部分生长情况，选择各处理组长势旺盛、茎叶无明显病害的人参。对照组选择清水对照处理组、益微6 g/m2对照处理组、多菌灵6 g/m2对照处理组、中农绿康5 g/m2对照处理组，处理组选择菌肥C 8 g/m2处理组，随机取各处理组的人参根系附近约50 g土壤用于后续土壤酶活力检测，待取土完成后将人参周围覆盖，防止水分流失破坏人参生长状态。土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶、过氧化氢酶活力测定方法参考关松荫编辑的《土壤酶及其研究法》。
3、结果
结合防病、促生试验结果，可以得到菌肥C的施用量为8 g/m2时田间表现最为优异，为进一步验证其作用机制，对该处理组与清水对照处理组、益微6 g/m2对照处理组、多菌灵6 g/m2对照处理组、中农绿康5 g/m2对照处理组分别于展叶期、开花结果期、参根膨大期和成熟期的根际土壤进行相关酶活力的测定，运用方差分析对数据进行整理分析。
1）蔗糖酶酶活力测定
试验结果显示各处理组在开花结果期蔗糖酶活力达到峰值，菌肥C 8 g/m2处理组蔗糖酶活力在整个生长期内均高于清水对照处理组，且在所有处理组中蔗糖酶活力一直保持较高水平，可以得出菌肥C 8 g/m2处理可以提高土壤蔗糖酶活力，为人参生长发育提供能量，测定结果如图14A。
2）脲酶酶活力测定
试验结果显示菌肥C 8 g/m2处理组的脲酶酶活力在展叶期、开花结果期和伸根膨大期保持稳定且处于高水平，其余对照处理组脲酶酶活力均不够稳定，不能始终保持高水平。可以得出菌肥C 8 g/m2处理可以提高土壤脲酶活力，试验结果如图14B。
3）磷酸酶酶活力测定
试验结果显示各处理组磷酸酶酶活力随着生长酶活力逐步增加，菌肥C 8 g/m2处理组磷酸酶活力在人参整个生长期内保持较高水平。可以得出菌肥C 8 g/m2处理可以提高土壤磷酸酶活力加快土壤中有机磷的利用，提高人参的生长速率，试验结果如图14C。
4）过氧化氢酶酶活力测定
试验结果显示菌肥C 8 g/m2处理组的过氧化氢酶酶活力在整个生长期内显著高于清水对照处理组过氧化氢酶活力，在整个人参生长期内在所有处理组中保持较高水平。可以得出菌肥C 8 g/m2处理可以提高土壤过氧化氢酶活力，试验结果如图14D。
实施例5优良菌肥对人参皂苷含量的影响
1、人参皂苷含量测定
对收获后的菌肥C 8 g/m2处理组、清水对照处理组、益微6 g/m2对照处理组、多菌灵6 g/m2对照处理组、中农绿康5 g/m2对照处理组的人参植株洗净，置于滤纸上晾干，粉碎过40目筛。人参皂苷的提取采用索氏提取器提取，用甲醇作溶剂。具体提取人参皂苷方法为新鲜人参样品经60℃烘干后粉碎（过40目筛），精确称取供试品0.50 g，用定性滤纸包好，置索式提取器提取管中，提取瓶中加入100 mL纯甲醇，90℃回流提取12 h。旋转蒸发仪减压蒸干甲醇，残余物用少量50%的色谱纯甲醇溶液溶解，最后定容至10 mL既得供试样品。
6种人参皂苷标准品配制成3.00 mg/mL，取等体积混合，为浓度为0.50 mg/mL人参皂苷混合标样，再取此混合标样进行稀释，分别得到0.40，0.25，0.20 mg/mL 混合标样。
人参皂苷含量的测定采用反相高效液相色谱法进行，以C18柱（4.6 mm×250 mm, 5mm）为洗脱柱，洗脱溶液为乙腈和水，进行梯度洗脱。梯度洗脱程序为：0-20 min，22% 乙腈；20-25 min，22-30% 乙腈；25-45 min，30-46% 乙腈；45-55 min，46-64% 乙腈；55-70 min，64-66%；70-85 min，66-100%。测量样品用孔径为0.45 mm有机滤膜过滤后上样。
2、结果
通过高效液相分析了菌肥C 8 g/m2处理组和多菌灵、益微、中农绿康、清水对照处理组人参样品的皂苷含量。通过皂苷标准品的单品得出各个标准品的出样时间确定人参皂苷出峰顺序为Rg1>Re>Rb1>Rc>Rb2>Rd，出峰时间分别为27.8 min、30.3 min、68.3 min、73.5 min、78.4 min、84.8 min。根据不同浓度标准品的峰面积，得到R2>99%线性拟合的线性方程，根据样品的不同出峰时间及出峰面积，计算其所含有的单体皂苷的含量。如表14所示。根据表中数值，可以看出，菌肥C 8 g/m2的人参皂苷含量影响较大，经菌肥C 8 g/m2处理后可以提升总皂苷含量。
Claims (8)
1.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）TJ23-2菌株，保藏编号为CCTCC M 2022750。
2. 权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）TJ23-2菌株在防治人参锈腐病方面的应用。
3. 权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）TJ23-2菌株在人参促生长方面的应用。
4.一种复配菌肥，它是由下述方法制备的：
1）苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis ）JJ5-2菌、贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis ）NT35菌、保藏编号为CGMCC No .6679的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillusmethylotrophicus）NJ13菌和权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）TJ23-2菌株分别发酵，制成4种发酵培养液；
2）将步骤1）制备的4种发酵培养液等体积复配，按35~45%接种量加入到载体中，混匀，在25~30℃下发酵培养7~10d，干燥，得复配菌肥；所述的载体，是小麦秸秆粉和玉米秸秆粉按体积比1：1~3混合得到的载体。
5.根据权利要求4所述的一种复配菌肥，其特征在于：步骤1）所述的发酵，其发酵培养基为：
TJ23-2发酵培养基：葡萄糖26 g，酵母浸粉12.9 g，氯化钠11 g，硫酸锰0.3 g，蒸馏水1000 mL，pH7.0；
JJ5发酵培养基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1000 mL，pH7.0；
NT35发酵培养基：酵母浸粉25g，玉米粉15g，磷酸氢二钾15g，硫酸铵25g，蒸馏水1000mL，pH7.0；
NJ13发酵培养基：葡萄糖30g，淀粉15g，酵母浸粉15g，磷酸氢二钾1g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.0。
6.根据权利要求5所述的一种复配菌肥，其特征在于：步骤2）所述的小麦秸秆粉和玉米秸秆粉体积比为1:3。
7.根据权利要求6所述的一种复配菌肥，其特征在于：步骤2）所述的接种量为40%。
8.根据权利要求7所述的一种复配菌肥，其特征在于：步骤2）所述的发酵培养温度为28℃。
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Citations (7)
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|---|---|---|---|---|
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| CN103013860A (zh) * | 2012-11-29 | 2013-04-03 | 吉林农业大学 | 一株人参病害生物防治菌株的获得及应用 |
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Patent Citations (7)
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| 生防菌株NJ13对人参灰霉病室内毒力及田间防治效果;陈长卿;李佳;姜云;许朋;尹望;高洁;;农药(第06期);67-69 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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