CN112359084A - 一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备及防治应用 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备及防治应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备及防治应用，所述的枯草芽孢杆菌株DR‑22，菌株保藏号为CGMCC NO：19784：该菌具有生长速度快、产孢量高、抗逆性强、活性产物丰富、菌体蛋白高等。本发明特色在于枯草芽孢杆菌固体发酵技术及菌体蛋白制备技术，制备过程包括以下步骤：(1)菌株活化，得到活化的菌株；(2)扩增培养，制备菌液的种子液；(3)发酵培养，制得菌剂；(4)菌体蛋白制备：发酵菌体、烘干、粉碎过筛、浸提沉淀、等电点酸沉淀、离心收集沉淀、干燥去除水分、菌体蛋白。本发明最终防效能够达到73.76％，且防治效果稳定，为防治烟草花叶病毒病提供了很好的生物防治的选择。

Description

一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备及防治应用
技术领域
本发明属于农业微生物防治领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备及防治应用。
背景技术
烟草是我国重要的经济作物，其经济价值较高。而烟草花叶病毒病是烟草生产上分布最广、发生最为普遍、危害最为严重的一大类病害，是严重影响烟草健康生长的主要障碍之一。烟草花叶病病烟草植株感染病毒后，叶绿素受破坏，光合作用减弱，叶片生长被抑制，叶小、畸形，减产幅度可达20％～80％。病毒病发生后，还严重影响烟叶的品质，使品质变劣。
目前，对于烟草花叶病毒病主要的防治方式为栽种抗耐病品种、化学药剂的使用以及轮作倒茬，这三种主要的防治方法有着不同的弊端，目前大田生产缺乏高抗或者抗病品种，而且抗病品种选育时间较长，一般需要5到6年。化学药剂的使用较之简单但却效果差、还会对农田造成污染，其主要原因是烟草花叶病毒是完全细胞内寄生，化学药剂很难发挥效果。而轮作倒茬又因为土地限制而难以发挥作用。
为解决上述所存在的问题以及弥补现有技术的空缺，充分提高植物对病毒病免疫能力的提高，本发明一种来源于枯草芽孢杆菌固体发酵产物中菌体蛋白的制备及对烟草花叶病毒病的防治应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够防治烟草花叶病毒病的枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备及防治应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备及防治应用，其特征在于：所涉及的枯草芽孢杆菌DR-22，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,
分类命名：枯草芽孢杆菌；Bacillus subtilis；
保藏号：CGMCC No.19784；
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
保藏日期：2020年5月08日。
一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备，所述的枯草芽孢杆菌株DR-22，菌株保藏号为CGMCC NO：19784。
一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌株活化，将低温保存的枯草芽孢杆菌置于平板培养基上活化，在26℃下培养24h，制得活化菌株；
(2)扩增培养，将步骤(1)制得的活化菌株再次接种于100mlLB液体培养基中，在29℃下，150r/min振荡培养12h，制得该菌剂的种子液；
(3)发酵培养，将步骤(2)制得的种子液按照1％的接种量接种于固体培养基中进行发酵，在30℃下，200r/min进行恒温培养，当观察至其活孢子数≥1000亿/克时，停止发酵，制得具有防治烟草花叶病毒病的枯草芽孢杆菌菌剂。
优选地，所述步骤(1)所述的平板培养基组分如下，均为重量百分比：胰蛋白胨3％，酵母浸粉1.5％，氯化钠1.5％。
优选地，所述步骤(2)中所述的LB培养基组分如下，均为重量百分比：胰蛋白胨3.0％，酵母提取物1.5％，氯化钠1.5％，琼脂粉3.5％，葡萄糖0.5％，余量为水，PH：7.2。
优选地，所述步骤(3)中所述的固体培养基组分如下，均为重量百分比：玉米粉3.0％，黄豆粉3.0％，氯化钠0.5％，磷酸二氢钾0.3％，葡萄糖1.0％，碳酸铵0.3％余量为水PH：7.2。
优选地，所述菌体蛋白制备：发酵菌体、烘干、粉碎过筛、浸提沉淀、等电点酸沉淀、离心收集沉淀、干燥去除水分、菌体蛋白，其步骤(4)制备的菌体烘干在39℃下烘40h，烘干后粉碎过筛为60目。
优选地，所述步骤(4)浸提沉淀为正己烷以1:5的料液比对菌体粉进行浸提沉淀，时间为3h，之后过滤，保留沉淀则为脱脂后菌体蛋白，重复3次。
优选地，所述步骤(4)等电点酸沉淀为用3mol/L HCl溶液调节5倍稀释沉淀后的蛋白质溶液pH值至3.80，静置40min后，在3500r/min的转速下离心处理15min，收集沉淀，干燥为低温干燥，干燥温度为28°，干燥时间72h。
一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的防治应用，其特征在于，对于烟草花叶病毒病具有防治能力，其不仅仅能防治烟草花叶病毒病，还能够促进烟草生长。
优选地，该菌剂的使用方法为，将其在使用前需要稀释500倍即就是按照500：1的比例将其稀释，同时使用灌根和叶面喷雾技术进行烟草栽培能够使其效果最大化。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明是一种有益微生物芽孢杆菌菌体蛋白，通过诱导植物抗性、提高植物免疫功能来防治烟草花叶病毒病，本发明一种来源于枯草芽孢杆菌固体发酵产物中菌体蛋白的制备及对烟草花叶病毒病的防治应用，由于该菌具有生长速度快、产孢量高、抗逆性强、蛋白分泌多等特点，利用本发明制备的菌体蛋白工艺简单、菌体蛋白获取率高，并且该菌体蛋白具有高效的诱导植物抗病毒病特性，本发明为有益微生物的进一步挖掘利用和烟草花叶病毒病的生物防治提供了一条新的途径，本发明能够减少化学农药的使用，达到降低农药污染和病原菌产生抗性等有着重大意义，因此，本发明是一种绿色高效的环境友好型的生物防治制剂。
附图说明
图1为本发明制备的步骤流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备，所述的枯草芽孢杆菌株DR-22，菌株保藏号为CGMCC NO：19784。
一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备，其主要包括以下步骤：
(1)菌株活化，将低温保存的枯草芽孢杆菌置于平板培养基上活化，在26℃下培养24h，制得活化菌株；
(2)扩增培养，将步骤(1)制得的活化菌株再次接种于100mlLB液体培养基中，在29℃下，150r/min振荡培养12h，制得该菌剂的种子液；
(3)发酵培养，将步骤(2)制得的种子液按照1％的接种量接种于固体培养基中进行发酵，在30℃下，200r/min进行恒温培养，当观察至其活孢子数≥1000亿/克时，停止发酵，制得具有防治烟草花叶病毒病的枯草芽孢杆菌菌剂。
其步骤(1)所述的平板培养基组分如下，均为重量百分比：胰蛋白胨3％，酵母浸粉1.5％，氯化钠1.5％；
其步骤(2)中所述的LB培养基组分如下，均为重量百分比：胰蛋白胨3。0％，酵母提取物1.5％，氯化钠1.5％，琼脂粉3.5％，葡萄糖0.5％，余量为水，PH：7.2；
其步骤(3)中所述的固体培养基组分如下，均为重量百分比：玉米粉3.0％，黄豆粉3.0％，氯化钠0.5％，磷酸二氢钾0.3％，葡萄糖1.0％，碳酸铵0.3％余量为水PH：7.2。
(4)菌体蛋白制备：发酵菌体→烘干→粉碎过筛→浸提沉淀→等电点酸沉淀→离心收集沉淀→干燥去除水分→菌体蛋白.
其步骤(4)制备的菌体烘干在39℃下烘40h，烘干后粉碎过筛为60目。
其步骤(4)浸提沉淀为正己烷以1∶5的料液比对菌体粉进行浸提沉淀，时间为3h，之后过滤，，保留沉淀则为脱脂后菌体蛋白，重复3次。
其步骤(4)等电点酸沉淀为用3mol/L HCl溶液调节5倍稀释沉淀后的蛋白质溶液pH值至3.80，静置40min后，在3 500r/min的转速下离心处理15min，收集沉淀。
其步骤(4)的干燥为低温干燥，干燥温度为28°，干燥时间72h。
本实施例一，制得的本发明得到一种用于防治烟草花叶病毒病的枯草芽孢杆菌菌体蛋白，是优选步骤所制备的，其能够最大化的发挥出本发明一种用于防治烟草花叶病毒病的生物防治效果。
实施例二：
一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的防治应用
1、试验地点：
试验地点位于陕西省商洛市洛南县烟草种植区，进行田间试验。
2、试验材料：
①发明枯草芽孢杆菌菌体蛋白的500倍稀释液；(2)市售化学农药：(1)24％毒消、(2)2％宁南霉素；(3)无菌水(CK对照)。烟草为普通的烤烟品种云烟87。
3、试验处理：
待烟草幼苗生长3-9周后，选择长势均匀一致的烟草植株使用各种试剂进行叶面喷雾并结合灌根技术进行烟草的培育，这是由于此阶段为烟草生长早期，较易被烟草花叶病毒病感染，在此阶段使用叶面喷雾和灌根处理能够起到更好的防治烟草花叶病毒病的作用。
此次试验我们将试验田中的烟草数量为300株，每种处理方式划分3个小组实验田，每组为100株烟草苗株。
通过进行灌根和叶面喷雾后每隔15天进行一次调查，连续调查3次，将三次的平均防效为最终防效，且在最后一次我们分析烟叶内烟草花叶病毒病的含量值，来从另一方面描述本发明枯草芽孢杆菌菌体蛋白的作用。
4、病情分级：
病情分级标准：
0级，全株无病；
1级，心叶叶脉透明并轻微花叶或少数叶面花叶；
3级，全株的叶片花叶，少数叶片变形或叶脉变黑；
5级，全株2/3叶片花叶变形，或有小褪绿斑，或植株较健株矮1/2左右；
7级，全株叶片花叶，有大褪绿斑，或植株较健株严重矮化，仅有健株的1/4-1/3高；
计算公式：
病情指数＝∑(级值*该级叶片数)/最高级*调查总叶片数*100％
防治效果＝(对照病指-处理病指)/对照病指*100％
对所得结果进行方差分析，新复级差用Duncan法检验所得数据的显著性。
通过试验我们能够发现本发明的一种枯草芽孢杆菌菌体蛋白能够有效的防治烟草花叶病毒病，其防治效果能够达到73.76％。具体试验数据如下表1、表2所示。
表1各种试剂对烟草花叶病毒病防治的效果
Figure BDA0002812837230000081
表2 各种试剂对烟草花叶病毒病的防治
Figure BDA0002812837230000082
Figure BDA0002812837230000091
实施例三：
一种用于防治烟草花叶病毒病的枯草芽孢杆菌菌体蛋白的应用
1、试验材料：
发明枯草芽孢杆菌菌体蛋白的500倍稀释液；市售化学农药：40％乙烯利水剂；无菌水(CK对照)。烟草为普通的烤烟品种云烟87。
2、试验处理：
本实施例通过使用上述三种不同的试剂结合灌根和叶面喷雾技术，进行烟草培育，将烟草移栽前，按照每株5ml的将每株烟草进行浸泡，充分浸泡后将烟草移栽种植进行观察在成长期进行株高观察，将最终的每株重量等数据数据进行比较。
通过上述试验我们能够发现，本发明枯草芽孢杆菌菌体蛋白对烟草生长提升具有很明显的效果，可达到38.45％，具体试验结果如下表3。
表三 各种试剂对烟草的品质提升
Figure BDA0002812837230000101
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (9)

1.一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备，所述的枯草芽孢杆菌株DR-22，菌株保藏号为CGMCC NO：19784，包括以下步骤：
(1)菌株活化，将低温保存的枯草芽孢杆菌置于平板培养基上活化，在26℃下培养24h，制得活化菌株；
(2)扩增培养，将步骤(1)制得的活化菌株再次接种于100mlLB液体培养基中，在29℃下，150r/min振荡培养12h，制得该菌剂的种子液；
(3)发酵培养，将步骤(2)制得的种子液按照1％的接种量接种于固体培养基中进行发酵，在30℃下，200r/min进行恒温培养，当观察至其活孢子数≥1000亿/克时，停止发酵，制得具有防治烟草花叶病毒病的枯草芽孢杆菌菌剂。
2.根据权利要求书1所述的一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备，其特征在于，所述步骤(1)所述的平板培养基组分如下，均为重量百分比：胰蛋白胨3％，酵母浸粉1.5％，氯化钠1.5％。
3.根据权利要求书1所述的一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备，其特征在于，所述步骤(2)中所述的LB培养基组分如下，均为重量百分比：胰蛋白胨3.0％，酵母提取物1.5％，氯化钠1.5％，琼脂粉3.5％，葡萄糖0.5％，余量为水，PH：7.2。
4.根据权利要求书1所述的一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备，其特征在于，所述步骤(3)中所述的固体培养基组分如下，均为重量百分比：玉米粉3.0％，黄豆粉3.0％，氯化钠0.5％，磷酸二氢钾0.3％，葡萄糖1.0％，碳酸铵0.3％余量为水PH：7.2。
5.根据权利要求书1所述的一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备，其特征在于，所述菌体蛋白制备：发酵菌体、烘干、粉碎过筛、浸提沉淀、等电点酸沉淀、离心收集沉淀、干燥去除水分、菌体蛋白，其步骤(4)制备的菌体烘干在39℃下烘40h，烘干后粉碎过筛为60目。
6.根据权利要求书1所述的一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备，其特征在于，所述步骤(4)浸提沉淀为正己烷以1:5的料液比对菌体粉进行浸提沉淀，时间为3h，之后过滤，保留沉淀则为脱脂后菌体蛋白，重复3次。
7.根据权利要求书1所述的一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的制备，其特征在于，所述步骤(4)等电点酸沉淀为用3mol/L HCl溶液调节5倍稀释沉淀后的蛋白质溶液pH值至3.80，静置40min后，在3500r/min的转速下离心处理15min，收集沉淀，干燥为低温干燥，干燥温度为28°，干燥时间72h。
8.根据权利要求书1所述的一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的防治应用，其特征在于，对于烟草花叶病毒病具有防治能力，其不仅仅能防治烟草花叶病毒病，还能够提升烟草生长。
9.根据权利要求书8所述的一种枯草芽孢杆菌发酵产物中菌体蛋白的防治应用，其特征在于，该菌剂的使用方法为，将其在使用前需要稀释500倍即就是按照500：1的比例将其稀释，同时使用灌根和叶面喷雾技术进行烟草培育能够使其效果最大化。
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