CN111849839A - 一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液的制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物农药技术领域，具体涉及一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液的制备和应用，包括以下步骤：活化培养：将枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌原种斜面接种到平板培养基上活化培养，在温度为28℃下培养72h；种子培养：在温度为28℃下培养72h；发酵：将发酵种子液按发酵培养基体积6％的量接种入发酵罐，在28℃下培养60h，搅拌速度为130rpm，通气量7％；菌剂制备：在各自发酵液按照1：1的比例混合后中添加0.3％的活性剂充分混匀。本发明具有防治烟草根结线虫的功能，尤其对番茄根结线虫和烟草根结线虫，结合灌根技术防治根结线虫效率可95.50％％，且对根结线虫幼虫的杀虫率可达91.63％。
Description
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，具体涉及一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液的制备和应用。
背景技术
根结线虫是一类植物内寄生线虫，无严格的宿主特异性，能侵染多种农作物，严重危害农业生产，每年造成全球数千元亿美元的损失。根结线虫在全世界广泛分布，寄主范围广泛，它除直接危害外，还能传播细菌和真菌病害，造成许多经济作物的更大损失。
在我国，随着连作时间的延长，土壤传播的根结线虫病危害日趋严重，成为农业生产的主要限制因素之一；根结线虫病的防治目前多采用化学防治、轮作及抗病品种，但效果均不太理想，且存在诸多弊端。如目前使用的化学杀线虫剂多为剧毒或高毒、高残留农药，对土壤微生物、植物、水源和大气层带来严重污染或破坏，同时病菌和线虫抗药性问题也日益突出，而且药物在植物体内残留会间接对人类造成危害；因此急需开发对环境友好，对人畜无毒的防治线虫病害的有益微生物菌剂。
本发明是以弥补上述技术空缺，提出的一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液，具有防治烟草根结线虫(尤其在番茄根结线虫和烟草根结线虫)的功效，是以所述的枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌经活化培养、种子培养和发酵制备得到的液体菌剂，活孢子数可达20亿/ml，且本发明所述的枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌是一种绿色无害的生物菌，具有定值和竞争能力强，杀线虫效果明显，并和灌根技术相结合，具有使用简单的特点，因此，本发明在新的生物农药研发方面和应用方面都具有重要的理论和实践意义。。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液的制备和应用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
提供一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液的制备，制备过程包括活化培养、种子培养、发酵和液体菌剂制备，所述制备过程具体如下：
步骤一：活化培养：将枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌原种斜面接种到平板培养基上活化培养，在温度为28℃下培养72h，得活化的平板菌落；
步骤二：种子培养：将活化后的平板菌种接种到液体培养基中，在温度为28℃下培养72h，得发酵种子液；
步骤三：发酵：将发酵种子液按发酵培养基体积6％的量接种入发酵罐，在28℃下培养60h，搅拌速度为130rpm，通气量7％，在检测到活孢子数≥20亿活孢子/ml的时候，停止发酵，即得到枯草芽孢杆菌发酵菌液和苏云金芽孢杆菌发酵菌液；
步骤四：菌剂制备：在各自发酵液按照1：1的比例混合后中添加0.3％的活性剂充分混匀，得到目标物液体菌剂。
进一步的，步骤一中所述的活化培养的培养基的成分及其重量百分比为：蛋白胨2.1％，酵母浸膏0.8％，NaCl1.2％，琼脂粉3.3％，葡萄糖1.2％，余量为水，PH为7.1。
进一步的，步骤二中所述的液体培养基的成分及其重量百分比为：蛋白胨1.3％，酵母浸膏0.8％，NaCl 1.5％，葡萄糖0.7％余量为水，ph为6.9。
进一步的，步骤三中所述的发酵培养基的成分及其重量百分比为：豆饼粉2.2％，可溶性淀粉1.7％，酵母浸膏1.4％，葡萄糖0.8％NaCNO30.04％、CaCO30.18％，余量为水，PH为7.2。
进一步的，步骤四中所述的活性剂为体积百分比2.6％的腐殖酸钾、体积百分比0.4％的壳聚糖。
进一步的，所述枯草芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.19784，所述苏云金芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.19877。
一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液的应用，所述的一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液应用于防治烟草根结线虫病。
进一步的，所述复合微生物菌剂的应用具体如下：
步骤1：向搅拌容器内加入一定量的复合微生物菌剂；
步骤2：向步骤1的搅拌容器中加入液态水，且液态水与复合微生物菌剂的比例为50:1，之后进行搅拌混合；
步骤3：将步骤2中混合得到的液体进行灌根处理。
本发明的有益效果：
本发明枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌为活性成分的制剂对人畜无毒，并且具有很强的环境适应性和环境友好性，从而具有较高的安全性，同时枯草芽孢杆菌寄生根结线虫的卵，致死卵的成活，以及所述的苏云金芽孢杆菌分泌的毒蛋白可以直接杀死根结线虫的幼虫，具有较高的防治效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明的制备流程图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液的制备，制备过程包括活化培养、种子培养、发酵和液体菌剂制备，制备过程具体如下：
步骤一：活化培养：将枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌原种斜面接种到平板培养基上活化培养，在温度为28℃下培养72h，得活化的平板菌落；
步骤二：种子培养：将活化后的平板菌种接种到液体培养基中，在温度为28℃下培养72h，得发酵种子液；
步骤三：发酵：将发酵种子液按发酵培养基体积6％的量接种入发酵罐，在28℃下培养60h，搅拌速度为130rpm，通气量7％，在检测到活孢子数≥20亿活孢子/ml的时候，停止发酵，即得到枯草芽孢杆菌发酵菌液和苏云金芽孢杆菌发酵菌液；
步骤四：菌剂制备：在各自发酵液按照1：1的比例混合后中添加0.3％的活性剂充分混匀，得到目标物液体菌剂。
其中，步骤一中的活化培养的培养基的成分及其重量百分比为：蛋白胨2.1％，酵母浸膏0.8％，NaCl1.2％，琼脂粉3.3％，葡萄糖1.2％，余量为水，PH为7.1。
其中，步骤二中的液体培养基的成分及其重量百分比为：蛋白胨1.3％，酵母浸膏0.8％，NaCl 1.5％，葡萄糖0.7％余量为水，ph为6.9。
其中，步骤三中的发酵培养基的成分及其重量百分比为：豆饼粉2.2％，可溶性淀粉1.7％，酵母浸膏1.4％，葡萄糖0.8％NaCNO30.04％、CaCO30.18％，余量为水，PH为7.2。
其中，步骤四中的活性剂为体积百分比2.6％的腐殖酸钾、体积百分比0.4％的壳聚糖。
其中，枯草芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.19784，苏云金芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.19877。
一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液的应用，该一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液应用于防治烟草根结线虫病；
其中，复合微生物菌剂的应用具体如下：
步骤1：向搅拌容器内加入一定量的复合微生物菌剂；
步骤2：向步骤1的搅拌容器中加入液态水，且液态水与复合微生物菌剂的比例为50:1，之后进行搅拌混合；
步骤3：将步骤2中混合得到的液体进行灌根处理。
实施例2
一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液对根结线虫的毒杀作用
步骤一：采用贝曼漏斗法进行根结线虫的分离，获得根结线虫的二龄幼虫；
步骤二：将分离的根结线虫添加到本发明液体菌剂的100倍稀释液中，以等量的清水为对照；
步骤三：室温放置1h观测线虫存活和死亡数量。
试验结果如表一：
| 对照组 | 实验组 | |
| 期初数 | 800 | 800 |
| 试验存活数 | 767 | 67 |
| 试验死亡数 | 33 | 733 |
| 死亡率 | 4.13％ | 91.63％ |
| 防治效果 | 95.50％ |
结果表明，在对照中，根结线虫二龄幼虫的死亡率是4.13％，而本发明的液体菌剂的100倍稀释液的处理根结线虫二龄幼虫的死亡率达到了91.63％，防治效果可达95.50％。由此可见，以枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌为活性成分的液体菌剂对根结线虫二龄幼虫具有强烈的毒杀效果。
实施例3
一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液对烟草根结线虫的防治作用
步骤一：采用烟草品种为红花烟草，根结线虫接种方式为病土接种，烤烟移栽时每株烟施用一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液的制备和应用5ml，以不施用制剂为对照；
步骤二：移栽后60天挖根调查烟草根结线虫病的病情指数，在移栽期间处理组用菌液进行灌根处理，对照组用清水进行灌根处理。
经过一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液的制备和应用处理的烟草根结线虫病情指数为14.23，而没有施用该制剂的空白对照病情指数达到了88.96，由此可见，以枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌为活性成分的制剂对烟草根结线虫病的防治效果为84.01％。
实施例4
一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液对番茄根结线虫的防治作用
步骤一：采用番茄品种为市售普通番茄，将一片番茄种植地一分为二；
步骤二：一组使用100倍稀释后的复合菌液，对照组用清水进行灌根处理。
经过复合菌液处理的番茄根结线虫病情指数为16.72，而没有施用该制剂的空白对照病情指数达到了83.54，由此可见，以枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌为活性成分的制剂对番茄根结线虫病的防治效果为79.98％。
以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液的制备，其特征在于，制备过程包括活化培养、种子培养、发酵和液体菌剂制备，所述制备过程具体如下：
步骤一：活化培养：将枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌原种斜面接种到平板培养基上活化培养，在温度为28℃下培养72h，得活化的平板菌落；
步骤二：种子培养：将活化后的平板菌种接种到液体培养基中，在温度为28℃下培养72h，得发酵种子液；
步骤三：发酵：将发酵种子液按发酵培养基体积6％的量接种入发酵罐，在28℃下培养60h，搅拌速度为130rpm，通气量7％，在检测到活孢子数≥20亿活孢子/ml的时候，停止发酵，即得到枯草芽孢杆菌发酵菌液和苏云金芽孢杆菌发酵菌液；
步骤四：菌剂制备：在各自发酵液按照1：1的比例混合后中添加0.3％的活性剂充分混匀，得到目标物液体菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液的制备，其特征在于，步骤一中所述的活化培养的培养基的成分及其重量百分比为：蛋白胨2.1％，酵母浸膏0.8％，NaCl1.2％，琼脂粉3.3％，葡萄糖1.2％，余量为水，PH为7.1。
3.根据权利要求1所述的一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液的制备，其特征在于，步骤二中所述的液体培养基的成分及其重量百分比为：蛋白胨1.3％，酵母浸膏0.8％，NaCl 1.5％，葡萄糖0.7％余量为水，ph为6.9。
4.根据权利要求1所述的一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液的制备，其特征在于，步骤三中所述的发酵培养基的成分及其重量百分比为：豆饼粉2.2％，可溶性淀粉1.7％，酵母浸膏1.4％，葡萄糖0.8％NaCNO30.04％、CaCO30.18％，余量为水，PH为7.2。
5.根据权利要求1所述的一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液的制备，其特征在于，步骤四中所述的活性剂为体积百分比2.6％的腐殖酸钾、体积百分比0.4％的壳聚糖。
6.根据权利要求1所述的一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液的制备，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.19784，所述苏云金芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.19877。
7.一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液的应用，其特征在于，所述的一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液应用于防治烟草根结线虫病。
8.根据权利要求7所述的一种用于防治根结线虫病的两种复合菌液的应用，其特征在于，所述复合微生物菌剂的应用具体如下：
步骤1：向搅拌容器内加入一定量的复合微生物菌剂；
步骤2：向步骤1的搅拌容器中加入液态水，且液态水与复合微生物菌剂的比例为50:1，之后进行搅拌混合；
步骤3：将步骤2中混合得到的液体进行灌根处理。
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