CN108220207A - 一种复合微生物制剂及其在防治根结线虫中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，公开了一种复合微生物制剂，其包括苏云金芽孢杆菌，球形芽孢杆菌，寡孢节丛孢菌，吸水链霉菌。本发明复合微生物制剂杀虫效果好，能够有效地防治根结线虫，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种复合微生物制剂及其在防治根结线虫中的应用。
背景技术
根结线虫（Meloidogyne）是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫。根结线虫在全世界广泛分布，寄主范围广，是危害农作物的重要病原物之一。根结线虫病是世界第二大土传病害，每年对全世界作物造成严重的经济损失口。目前国际上已报道的根结线虫有80多种，我国报道有29种，主要寄生在蔬菜、粮食作物、经济作物、果树、观赏植物及杂草等2000多种寄主上。植物受害严重，其危害已超过细菌、病毒，是仅次于真菌的第二大植物病害。病害一旦发生，一般减产10％，严重的高达75％。根结线虫是诱发植物产生病害的重要诱因之一。
过去几十年，化学防治根结线虫是主要的防治措施并取得明显的防效，但化学防治对人类和环境造成严重危害。因此，采用非化学手段防治根结线虫逐渐成为研究者关注的热点问题，其中微生物拮抗菌等技术在农业生产中己得到应用并取得一定的效果。目前发现，淡紫拟青霉和寡孢节丛孢菌对根结线虫卵有很强的寄生能力，是目前较有效的防治根结线虫的天敌真菌，但是单一的菌株很难对根结线虫进行有效杀灭，活性相对较低。
一系列研究结果表明，生防菌剂的混合施用对植物寄生线虫的防治有着光明的前景与单菌制剂相比，一些特定微生物的联合运用能够提高植物本身生长活力或产量，减少线虫的群体数量，抑制线虫对植物根部的侵入。混合生防菌剂的潜在优点有: ( 1) 对病原物或线虫有多重作用机制; ( 2) 能够影响目标病原物生活周期中的更多阶段; ( 3) 在植物生长过程中不同时期可以有不同生防菌发生作用; ( 4) 在不同土壤中，其防效改变不大，但土壤要适合微生物的生长。选择复合生防制剂中的菌株较为关键，如果选择不慎，反而会起到相互拮抗的反作用，降低杀灭根结线虫的能力，并非所有混合菌都具有极高的活性来稳定抑制病害；只有生防菌剂中的微生物只有相互亲和协同才能产生好的生防效果。
发明内容
本发明要提供一种复合微生物制剂及其在防治根结线虫中的应用，以克服现有技术复合生防制剂存在防治效果不理想、菌株协同性能差等缺陷。
为了克服现有技术存在的问题，本发明采用如下技术方案，
一种复合微生物制剂，其包括苏云金芽孢杆菌，球形芽孢杆菌，寡孢节丛孢菌，吸水链霉菌。
进一步地，
所述微生物制剂按照如下工艺制备而得：
步骤1）将苏云金芽孢杆菌种子液和球形芽孢杆菌种子液按照1:1的体积比混合，然后按照8%体积比的接种量接入到发酵培养基中，28℃培养24h，得到苏云金芽孢杆菌-球形芽孢杆菌混合发酵液；
步骤2）将寡孢节丛孢菌种子液按照10%体积比的接种量接入到发酵培养基中，30℃培养48h，得到寡孢节丛孢菌发酵液；
步骤3）将吸水链霉菌种子液按照6%体积比的接种量接入到发酵培养基中，30℃培养36h，得到吸水链霉菌发酵液；步骤4）将苏云金芽孢杆菌-球形芽孢杆菌混合发酵液、寡孢节丛孢菌发酵液、吸水链霉菌发酵液按照2-3:4-7:1-2的体积比混合均匀，得到液体菌剂；
步骤5）将液体菌剂经过冷冻干燥制备成微生物干粉，即得。
优选地，
所述苏云金芽孢杆菌为ATCC13367，所述球形芽孢杆菌为ATCC4525，所述寡孢节丛孢菌为ATCC24927，所述吸水链霉菌为ATCC29253。
优选地，
所述步骤1）中，所述发酵培养基的配方为：玉米淀粉10g/L、葡萄糖8g/L、豆饼粉5g/L、硫酸铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.1mg/L。
优选地，
所述步骤2）中，所述发酵培养基的配方为：玉米淀粉12g/L、糖蜜10g/L、酵母膏2g/L、磷酸氢二钾0.5g/L和硫酸镁0.1g/L。
优选地，
所述步骤3）中，所述发酵培养基的配方为：玉米淀粉16g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、硝酸钾1.0g/L、硫酸镁0.8g/L、氯化钠0.5g/L和硫酸亚铁0.1g/L。
需要说明的是，本发明种子培养以及发酵罐培养方式是本领域常规技术，限于篇幅，并不详述。
本发明所用的耗材均可以从商业途径购买获得。
本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
本发明从众多菌类中选择四种菌株，其杀虫机理不完全相同，能够协同杀虫，配伍合理，共生协调，互不拮抗，制备工艺也相对简单，应用前景广阔；寡孢节丛孢菌可产生三维菌网来捕获杀灭线虫，在线虫密度低时，有一定的防治效果，但是线虫密度高时，杀伤效果下降明显；吸水链霉菌能够分泌毒素，杀灭根结线虫；苏云金芽孢杆菌和球形芽孢杆菌可以共生，相互促进产生杀虫物质，而且能够与根结线虫进行营养与空间竞争。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种复合微生物制剂，其包括苏云金芽孢杆菌，球形芽孢杆菌，寡孢节丛孢菌，吸水链霉菌；
具体按照如下工艺制备而得：
将苏云金芽孢杆菌种子液（1×108cfu/ml）和球形芽孢杆菌种子液（1×108cfu/ml）按照1:1的体积比混合，然后按照8%体积比的接种量接入到发酵培养基中，28℃培养24h，得到苏云金芽孢杆菌-球形芽孢杆菌混合发酵液；所述发酵培养基的配方为：玉米淀粉10g/L、葡萄糖8g/L、豆饼粉5g/L、硫酸铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.1mg/L；
将寡孢节丛孢菌种子液（1×107cfu/ml）按照10%体积比的接种量接入到发酵培养基中，30℃培养48h，得到寡孢节丛孢菌发酵液；所述发酵培养基的配方为：玉米淀粉12g/L、糖蜜10g/L、酵母膏2g/L、磷酸氢二钾0.5g/L和硫酸镁0.1g/L；
将吸水链霉菌种子液（1×107cfu/ml）按照6%体积比的接种量接入到发酵培养基中，30℃培养36h，得到吸水链霉菌发酵液；所述发酵培养基的配方为：玉米淀粉16g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、硝酸钾1.0g/L、硫酸镁0.8g/L、氯化钠0.5g/L和硫酸亚铁0.1g/L；
将苏云金芽孢杆菌-球形芽孢杆菌混合发酵液、寡孢节丛孢菌发酵液、吸水链霉菌发酵液按照2:4:1的体积比混合均匀，得到液体菌剂；
将液体菌剂经过冷冻干燥制备成微生物干粉，即得。
所述苏云金芽孢杆菌为ATCC13367，所述球形芽孢杆菌为ATCC4525，所述寡孢节丛孢菌为ATCC24927，所述吸水链霉菌为ATCC 29253；
实施例2
一种复合微生物制剂，其包括苏云金芽孢杆菌，球形芽孢杆菌，寡孢节丛孢菌，吸水链霉菌；
具体按照如下工艺制备而得：
将苏云金芽孢杆菌种子液（1×108cfu/ml）和球形芽孢杆菌种子液（1×108cfu/ml）按照1:1的体积比混合，然后按照8%体积比的接种量接入到发酵培养基中，28℃培养24h，得到苏云金芽孢杆菌-球形芽孢杆菌混合发酵液；所述发酵培养基的配方为：玉米淀粉10g/L、葡萄糖8g/L、豆饼粉5g/L、硫酸铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.1mg/L；
将寡孢节丛孢菌种子液（1×107cfu/ml）按照10%体积比的接种量接入到发酵培养基中，30℃培养48h，得到寡孢节丛孢菌发酵液；所述发酵培养基的配方为：玉米淀粉12g/L、糖蜜10g/L、酵母膏2g/L、磷酸氢二钾0.5g/L和硫酸镁0.1g/L；
将吸水链霉菌种子液（1×107cfu/ml）按照6%体积比的接种量接入到发酵培养基中，30℃培养36h，得到吸水链霉菌发酵液；所述发酵培养基的配方为：玉米淀粉16g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、硝酸钾1.0g/L、硫酸镁0.8g/L、氯化钠0.5g/L和硫酸亚铁0.1g/L；
将苏云金芽孢杆菌-球形芽孢杆菌混合发酵液、寡孢节丛孢菌发酵液、吸水链霉菌发酵液按照3:7:2的体积比混合均匀，得到液体菌剂；
将液体菌剂经过冷冻干燥制备成微生物干粉，即得。
所述苏云金芽孢杆菌为ATCC13367，所述球形芽孢杆菌为ATCC4525，所述寡孢节丛孢菌为ATCC24927，所述吸水链霉菌为ATCC29253；
实施例3
根结线虫防治实验的操作方法
设置制剂组别：
实验组为实施例1；对照组1: 仅采用苏云金芽孢杆菌-球形芽孢杆菌混合发酵液和寡孢节丛孢菌发酵液，其余同实施例1；对照组2：仅采用苏云金芽孢杆菌-球形芽孢杆菌混合发酵液和吸水链霉菌发酵液，其余同实施例1；对照组3：仅采用寡孢节丛孢菌发酵液和吸水链霉菌发酵液，其余同实施例1；对照组4：仅采用苏云金芽孢杆菌-球形芽孢杆菌混合发酵液，其余同实施例1。
制剂预处理：
首先将制剂进行活化，然后加入20（记为A组）、40（记为B组）倍重量的无菌水制备成菌悬液；
操作流程：
按照常规培养获得花生根结线虫悬液，用无菌水稀释至800条/ml，然后取10ml置于培养皿中，分别添加各组别稀释后的菌悬液1ml，混匀，25℃静置处理24小时；取处理液点到载玻片上，置于光学显微镜下计数死亡线虫数及线虫总数（线虫僵直不动视为死亡），计算死亡率。每个处理均设置3个重复，取平均值。具体实验结果见表1：
表1
| 组别 | A组死亡率% | B组死亡率% |
| 对照组1 | 93.7 | 79.4 |
| 对照组2 | 96.3 | 82.8 |
| 对照组3 | 98.0 | 81.3 |
| 对照组4 | 84.1 | 53.5 |
| 实验组 | 100 | 94.6 |
同样的方法对甜菜根结线虫进行了测试，具体实验结果见表2：
表2
| 组别 | A组死亡率% | B组死亡率% |
| 对照组1 | 95.1 | 83.8 |
| 对照组2 | 93.8 | 84.2 |
| 对照组3 | 91.6 | 79.6 |
| 对照组4 | 79.8 | 57.1 |
| 实验组 | 100 | 97.9 |
结论：分别采用常见的花生根结线虫以及甜菜根结线虫进行了灭虫活性检测，发现，采用20倍水对制剂进行稀释，其中实验组的杀虫率达到100%，对照组1-3可达到90%以上，对照组4最低，仅为84.1%；采用40倍水对制剂进行稀释，其中实验组对花生根结线虫和甜菜根结线虫杀虫率分别为94.6%和97.9%，对照组1-3为80%左右，对照组4最低，低于60%；上述结果提示，本发明采用的四种菌株配伍协同效果较好，采用不同的杀虫机理，能够有效防治根结线虫，市场应用前景广阔。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种复合微生物制剂，其包括苏云金芽孢杆菌，球形芽孢杆菌，寡孢节丛孢菌，吸水链霉菌。
2.根据权利要求1所述的复合微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂按照如下工艺制备而得：
步骤1）将苏云金芽孢杆菌种子液和球形芽孢杆菌种子液按照1:1的体积比混合，然后按照8%体积比的接种量接入到发酵培养基中，28℃培养24h，得到苏云金芽孢杆菌-球形芽孢杆菌混合发酵液；
步骤2）将寡孢节丛孢菌种子液按照10%体积比的接种量接入到发酵培养基中，30℃培养48h，得到寡孢节丛孢菌发酵液；
步骤3）将吸水链霉菌种子液按照6%体积比的接种量接入到发酵培养基中，30℃培养36h，得到吸水链霉菌发酵液；步骤4）将苏云金芽孢杆菌-球形芽孢杆菌混合发酵液、寡孢节丛孢菌发酵液、吸水链霉菌发酵液按照2-3:4-7:1-2的体积比混合均匀，得到液体菌剂；
步骤5）将液体菌剂经过冷冻干燥制备成微生物干粉，即得。
3.根据权利要求2所述的复合微生物制剂，其特征在于，所述苏云金芽孢杆菌为ATCC13367，所述球形芽孢杆菌为ATCC4525，所述寡孢节丛孢菌为ATCC24927，所述吸水链霉菌为ATCC29253。
4.根据权利要求2所述的复合微生物制剂，其特征在于，所述步骤1）中，所述发酵培养基的配方为：玉米淀粉10g/L、葡萄糖8g/L、豆饼粉5g/L、硫酸铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.1mg/L。
5.根据权利要求2所述的复合微生物制剂，其特征在于，所述步骤2）中，所述发酵培养基的配方为：玉米淀粉12g/L、糖蜜10g/L、酵母膏2g/L、磷酸氢二钾0.5g/L和硫酸镁0.1g/L。
6.根据权利要求2所述的复合微生物制剂，其特征在于，所述步骤3）中，所述发酵培养基的配方为：玉米淀粉16g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、硝酸钾1.0g/L、硫酸镁0.8g/L、氯化钠0.5g/L和硫酸亚铁0.1g/L。
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