CN106472572A - 一种微生物杀菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微生物杀菌剂及其制备方法和应用。该杀菌剂的制备方法为，将香菇发酵液用萃取剂萃取，浓缩至膏状物，再与助剂按质量体积比1g：5mL配制而成。本发明制得的香菇发酵液萃取物杀菌剂含有天然的抗菌活性代谢产物，且具有广谱抗细菌和抗真菌活性，可用于抑制大肠杆菌、烟草青枯菌、白色念球菌、烟草链格孢菌和烟草疫霉，以及用于制备食品防腐剂或生物农药。本发明制备方法高效，得到的杀菌剂为微生物源杀菌剂，具备低毒、低残留的优点。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种微生物杀菌剂及其制备方法和应用，属于农药技术领域。
背景技术
高等真菌含有多种抑菌活性代谢物质并被认为是天然无毒的。近年来，随着人们对有机食品的需求的增大和对环境问题的重视，人们越来越意识到生物农药和生物杀菌剂的重要性，也开始热衷于天然无毒害的生物杀菌剂的开发和应用。
从食用菌子实体的提取抑菌活性物质的研究较多，而从食用菌发酵液中分离抑菌活性物质的研究较少。有研究报道凤尾菇、灵芝、金针菇、紫芝、雷丸等的发酵液具有比较广谱的抗菌活性。这些具有抗菌活性的天然产物，对人体是无毒害的，可以作为食品添加剂、生物农药、防腐剂的开发对象。因此，以食(药)用真菌为出发菌株进行医药、食品防腐剂、饲料添加剂等项目的开发，不但意义重大而且前景诱人。
目前，对于香菇杀菌活性物质的研究多集中在子实体，如有报道香菇多糖对烟草灰霉病等病原菌有较好的抑菌活性。也有报道香菇发酵液的抑菌活性，但对香菇发酵液进行萃取制备杀菌剂，却未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术中存在的问题，提供一种高效、低毒、低残留的微生物源杀菌剂及其制备方法与应用，该杀菌剂以香菇发酵液萃取物为活性物质，制备方法简单。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种微生物杀菌剂，其特征在于，它是由香菇发酵液萃取浓缩物和助剂按照质量体积比1g：5mL超声混合而得的分散性良好的乳剂。
按上述方案，优选地，所述香菇发酵液萃取浓缩物为香菇发酵液乙酸乙酯相萃取浓缩物或香菇发酵液正丁醇相萃取浓缩物；所述助剂为体积比为1:9的吐温-80和蒸馏水的混合物。
本发明还提供了上述微生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，它包括下述步骤：
1)将香菇菌种于PDA培养基上活化培养两次，每次活化培养的温度为28℃，时间为7天，得活化后的香菇菌种备用；
2)在液体完全培养基上接种步骤1)得到的活化后的香菇菌种，在28℃恒温条件下，静置1天后于150r/min摇床再培养8天，得香菇液体菌种；
3)在香菇发酵培养基中接种步骤2)得到的香菇液体菌种，在28℃恒温条件下，于150r/min摇床再发酵培养15天，过滤，得香菇发酵液，再在50℃条件下，减压浓缩至原体积的1/10，得香菇发酵液浓缩液；
4)对步骤3)得到的香菇发酵液浓缩液进行萃取，将萃取液在50℃条件下减压浓缩至膏状物，得香菇发酵液萃取浓缩物；
5)将步骤4)得到的香菇发酵液萃取浓缩物与助剂混合，得香菇发酵液萃取物杀菌剂。
按上述方案，优选地，步骤2)中所述液体完全培养基的体积为100mL，所述活化后的香菇菌种的用量为3-5块直径为7～8mm的菌饼。
按上述方案，优选地，步骤3)中，所述香菇液体菌种与所述香菇发酵培养基的体积比为6～10:100。
按上述方案，优选地，步骤4)具体为：
将所述香菇发酵液浓缩液用乙酸乙酯等体积超声波萃取5～8次后，合并萃取液，再在50℃条件下减压浓缩至膏状物，得香菇发酵液乙酸乙酯相萃取浓缩物；或者，
将所述香菇发酵液浓缩液用乙酸乙酯等体积超声波萃取5～8次后，合并乙酸乙酯萃取液，再取乙酸乙酯萃余液用正丁醇等体积超声波萃取5～8次，合并正丁醇萃取液，然后分别将乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液在50℃条件下减压浓缩至膏状物，分别获得香菇发酵液乙酸乙酯相萃取浓缩物和香菇发酵液正丁醇相萃取浓缩物。
按上述方案，优选地，步骤5)中所述香菇发酵液萃取浓缩物与助剂的质量体积比为1g:5mL。
按上述方案，优选地，所述助剂是体积比为1:9的吐温-80和蒸馏水组成的混合物。
本发明还提供了上述微生物杀菌剂的应用，其特征在于，可用于抑制大肠杆菌、烟草青枯菌、白色念球菌和链格孢菌菌丝，或者用于制备食品防腐剂或生物农药。
本发明制得的香菇发酵液萃取物杀菌剂的抑菌原理在于：本发明杀菌剂中的主要杀菌成分可能为呋喃酮、甲基呋喃、酯类、醛类等。
相比于现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明在萃取时采用了超声波混合，保证萃取剂与待萃取溶液充分混合，同时有效提高萃取效率，提高了杀菌组分的浓度，从而提高了杀菌效果。
2、本发明制得的香菇发酵液萃取物杀菌剂含有天然的抗菌活性代谢产物，且具有广谱抗细菌和抗真菌活性，可用于制备食品防腐剂和生物农药。
3、本发明制备方法高效，得到的杀菌剂为微生物源杀菌剂，具备低毒、低残留的优点。
4、现有技术中制备杀菌剂时助剂往往采用无水乙醇，其在用于大田栽培植物防病时对植物存在毒害的隐患，而本发明助剂采用吐温-80，其为一种表面活性剂，对生物危害小，对环境友好，此外，还提高了杀菌剂的分散性和稳定性效果。
5、本发明的杀菌剂对烟草青枯菌、烟草链格孢菌和烟草疫霉的抑制效果显著，具有开发烟草病害专用杀菌剂的潜力。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例中，如无具体说明采用的试剂均为市售化学试剂。
实施例1
香菇发酵液萃取物杀菌剂的制备，具体步骤如下：
1)配制PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato Dextrose Agar Medium，PDA)：马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂18g,蒸馏水1000ml,pH自然)，分装试管，在121℃,0.1MPa条件下,高温湿热灭菌20min,搁置斜面备用。将香菇菌种(采购于湖北省武汉市华中农业大学菌种实验中心)接种于PDA斜面，于28℃活化培养7天，再将已活化的菌种转接至已倒好的PDA培养基培养皿中，于28℃活化培养7天，作为活化的香菇菌种备用。
2)配制液体完全培养基(培养基配方：葡萄糖20g,蛋白胨2g,酵母膏2g,KH2PO40.46g,K2HPO4 1g,MgSO4·7H2O 0.5g.蒸馏水1000mL,pH自然)，250mL的锥形瓶分装100mL液体完全培养基，灭菌后备用。每瓶接平板活化的香菇菌种(直径7.68mm菌饼5块)，在28℃的恒温摇床上静置1天后，150r/min摇床，28℃培养8天，作为香菇液体菌种备用。
3)配制香菇发酵培养基(培养基配方：葡萄糖20g,蛋白胨2g,酵母膏2g,KH2PO40.46g,K2HPO4 1g,MgSO4·7H2O 0.5g.蒸馏水1000mL,pH自然)，500mL的锥形瓶分装200mL香菇发酵培养基,灭菌后备用。每瓶接入液体菌种，接种量为6％(12mL)，150r/min恒温摇床，28℃,发酵培养15天，用四层纱布过滤，取滤液得香菇发酵液备用。
4)用旋转蒸发仪对收集到的2L香菇发酵液在50℃进行减压浓缩，浓缩至原体积的1/10(200mL)，先用乙酸乙酯等体积萃取8次，每次萃取时均采用超声波清洗仪(频率40kHz,功率100W)处理10min，保证乙酸乙酯与发酵浓缩液充分混合，萃取终点以乙酸乙酯不改变颜色为准,合并乙酸乙酯萃取液，再用正丁醇对乙酸乙酯萃余液等体积萃取8次，每次萃取时均采用超声波清洗仪(频率40kHz,功率100W)处理10min，保证正丁醇与发酵浓缩液充分混合，萃取终点以正丁醇不改变颜色为准,合并正丁醇萃取液，将萃取所得的乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液分别用旋转蒸发仪在50℃进行减压浓缩，浓缩至膏状物，再将得到的1.076g乙酸乙酯相膏状物与0.538mL吐温-80、4.842mL蒸馏水混合，将得到的2.226g正丁醇相膏状物与1.133mL吐温-80、10.197蒸馏水混合，分别配制成浓度均为200mg/mL的香菇发酵液乙酸乙酯萃取物杀菌剂和香菇发酵液正丁醇萃取物杀菌剂。
效果实施例1
采用圆形滤纸片扩散法，分别测定本发明实施例1获得的香菇发酵液乙酸乙酯萃取物杀菌剂和香菇发酵液正丁醇萃取物杀菌剂对大肠杆菌(Escherichia coli)、烟草青枯菌(Ralstonia solanacearum)和白色念球菌(Candida albicans)进行抑菌活性，具体步骤如下：
1、配制三组固体培养基平板(每组9个平板)，具体如下：
第一组(用于测试大肠杆菌)：牛肉膏蛋白胨培养基(配方：蛋白胨10g,牛肉膏3g,NaCl 5g,琼脂18g,蒸馏水1000mL；pH7.0)；
第二组(用于测试烟草青枯菌)：牛肉浸膏蛋白胨(Beef extract Peptone Agar,BPA)培养基(配方：牛肉膏3g，蛋白胨5g，酵母抽提物0.5g,葡萄糖10g，琼脂18g，蒸馏水1000mL；pH7.0)；
第三组(用于测试白色念球菌)：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato DextroseAgar Medium,PDA)(配方：马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂18g,蒸馏水1000mL；pH7.2-7.4)；
具体如表1所示。
表1
| 组号 | 培养基 | 待测细菌或真菌 | 每组平板个数 |
| 第一组 | 牛肉膏蛋白胨培养基 | 大肠杆菌 | 9 |
| 第二组 | 牛肉浸膏蛋白胨培养基 | 烟草青枯菌 | 9 |
| 第三组 | 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 | 白色念球菌 | 9 |
2、涂平板
每组每个固体培养基平板上分别加入200μL相应待测细菌或真菌的菌悬液(106-108CFU/mL)并用涂布棒涂布均匀，得三组共计27个含菌平板。
3、采用圆形滤纸片扩散法进行抑菌活性测定
用已灭菌的镊子将已灭菌的直径为4mm的圆形滤纸片贴入各含菌平板上，每组含菌平板再分为3个处理(每个处理3个平行)：分别用微量吸液管向滤纸片上加入吐温-80水溶液(空白对照)、实施例1制得的香菇发酵液乙酸乙酯萃取物杀菌剂和香菇发酵液正丁醇萃取物杀菌剂各10μL。
将含大肠杆菌平板组(第一组)置于恒温培养箱中于37℃倒置培养24h，将含烟草青枯菌平板组(第二组)置于28℃恒温培养箱中倒置培养36-48h，将含白色念球菌的平板组(第三组)置于28℃恒温培养箱中培养36-48h。用十字交叉法测量抑菌圈直径，结果取平均值，结果见表2。
表2
实验结果表明(如表2所示)，香菇发酵液乙酸乙酯萃取物杀菌剂和香菇发酵液正丁醇萃取物杀菌剂均对大肠杆菌、烟草青枯菌和白色念球菌的生长有良好的抑制作用，而且香菇发酵液乙酸乙酯萃取物杀菌剂的抗菌活性强于香菇发酵液正丁醇萃取物杀菌剂，抑菌圈均达到21mm以上，可见香菇发酵液萃取物的抗菌活性效果良好。
效果实施例2
按照植物病害研究法推荐的生长速率测定法，测定实施例1获得的香菇发酵液乙酸乙酯萃取物杀菌剂和香菇发酵液正丁醇萃取物杀菌剂对烟草链格孢菌和烟草疫霉的抑菌活性，具体方法如下：
第一组：将3个已灭菌的装有95mL马铃薯蔗糖琼脂培养基的锥形瓶，冷却至60℃左右，分别加入5mL的香菇发酵液乙酸乙酯萃取物杀菌剂、5mL的香菇发酵液正丁醇萃取物杀菌剂和5mL的吐温-80水溶液(作为对照)，然后分别倒入培养皿中，待培养基冷却后在每个培养皿中心接种直径7.68mm的烟草链格孢菌的菌饼，每个处理设5个平行；
第二组：将3个已灭菌的装有95mL燕麦琼脂培养基(Oatmeal Agar,OA，配方：燕麦20g,琼脂18g,迹量盐溶液1ml，,蒸馏水1000mL；迹量盐溶液配方：七水硫酸亚铁0.1g,四水氯化锰0.1g,七水硫酸锌0.1g,定容至100mL)的锥形瓶，冷却至60℃左右，分别加入5mL的香菇发酵液乙酸乙酯萃取物杀菌剂、5mL的香菇发酵液正丁醇萃取物杀菌剂和5mL的吐温-80水溶液(作为对照)，然后分别倒入培养皿中，待培养基冷却后在每个培养皿中心接种直径7.68mm的烟草疫霉的菌饼，每个处理设5个平行；
将以上2组各培养皿倒置于28℃恒温培养箱中培养，每隔两天观察并记录菌丝的生长情况，用十字交叉法测量菌落生长直径，用下述公式计算菌丝生长抑制率：
菌丝生长抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100测试结果如表3所示。
表3
实验结果表明(表3)，香菇发酵液乙酸乙酯萃取物杀菌剂和香菇发酵液正丁醇萃取物杀菌剂对烟草链格孢菌和烟草疫霉丝均表现良好的抑制作用，而且香菇发酵液乙酸乙酯萃取物杀菌剂抑制菌丝生长的活性强于香菇发酵液正丁醇萃取物杀菌剂。随着培养时间的延长，香菇发酵液乙酸乙酯萃取物杀菌剂和香菇发酵液正丁醇萃取物杀菌剂对链格孢菌菌丝的抑制作用均呈下降趋势，但均保持在71％以上。
显然，上述实施例仅仅是为了清楚地说明所做的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或者变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种微生物杀菌剂，其特征在于，它是由香菇发酵液萃取浓缩物和助剂按照质量体积比1g：5mL超声混合而制成的分散性良好的乳剂。
2.根据权利要求1所述的微生物杀菌剂，其特征在于，所述香菇发酵液萃取浓缩物为香菇发酵液乙酸乙酯相萃取浓缩物或香菇发酵液正丁醇相萃取浓缩物，所述助剂为体积比为1:9的吐温-80和蒸馏水的混合物。
3.一种微生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，它包括下述步骤：
1)将香菇菌种于PDA培养基上活化培养两次，每次活化培养的温度为28℃，时间为7天，得活化后的香菇菌种备用；
2)在液体完全培养基上接种步骤1)得到的活化后的香菇菌种，在28℃恒温条件下，静置1天后于150r/min摇床再培养8天，得香菇液体菌种；
3)在香菇发酵培养基中接种步骤2)得到的香菇液体菌种，在28℃恒温条件下，于150r/min摇床再发酵培养15天，过滤，得香菇发酵液，再在50℃条件下，减压浓缩至原体积的1/10，得香菇发酵液浓缩液；
4)对步骤3)得到的香菇发酵液浓缩液进行萃取，将萃取液在50℃条件下减压浓缩至膏状物，得香菇发酵液萃取浓缩物；
5)将步骤4)得到的香菇发酵液萃取浓缩物与助剂混合，得香菇发酵液萃取物杀菌剂。
4.根据权利要求3所述的微生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述液体完全培养基的体积为100mL，所述活化后的香菇菌种的用量为3-5块直径为7～8mm的菌饼。
5.根据权利要求3所述的微生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述香菇液体菌种与所述香菇发酵培养基的体积比为6～10:100。
6.根据权利要求3所述的微生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，步骤4)具体为：
将所述香菇发酵液浓缩液用乙酸乙酯等体积超声波萃取5～8次后，合并萃取液，再在50℃条件下减压浓缩至膏状物，得香菇发酵液乙酸乙酯相萃取浓缩物；或者，
将所述香菇发酵液浓缩液用乙酸乙酯等体积超声波萃取5～8次后，合并乙酸乙酯萃取液，再取乙酸乙酯萃余液用正丁醇等体积超声波萃取5～8次，合并正丁醇萃取液，然后分别将乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液在50℃条件下减压浓缩至膏状物，分别获得香菇发酵液乙酸乙酯相萃取浓缩物和香菇发酵液正丁醇相萃取浓缩物。
7.根据权利要求3所述的微生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，步骤5)中所述香菇发酵液萃取浓缩物与助剂的质量体积比为1g：5mL。
8.根据权利要求8所述的微生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述助剂是体积比为1：9的吐温-80和蒸馏水组成的混合物。
9.权利要求1～2任一项所述的微生物杀菌剂的应用，其特征在于，可用于抑制大肠杆菌、烟草青枯菌、白色念球菌、烟草链格孢菌和烟草疫霉。
10.权利要求1～2任一项所述的微生物杀菌剂的应用，其特征在于，可用于制备食品防腐剂或生物农药。
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