CN106957870B - 一种复合生物制剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于防治土传病害的复合生物制剂，包含匍枝根霉和绿色木霉通过液体深层发酵得到的混合发酵液。此外还公开了其用于防治土传病害优选是枯萎病和黄萎病的用途。本发明利用液体深层发酵技术，两种微生物繁殖速度很快，且具有极高的胞外分泌活性；可以实现单纯复合无法达到的技术效果，同时可以快速获得大量菌体和孢子。本发明的复合生物制剂对链格孢属真菌具有较强的杀菌活性，因此可以有效防治枯萎病或黄萎病等土传病害。与肥料组分一起使用时，还能够显著提高土壤稳定性和孔隙度。

Description

一种复合生物制剂及其用途
技术领域
本发明属于生物技术领域；涉及一种复合生物制剂及其用途，尤其涉及一种用于防治土传病害的复合生物制剂及其用途。
背景技术
植物土传病害是指生活在土壤中的病原菌在条件适宜的情况下，从植物根部或茎部侵染植物，从而导致植株的萎蔫、枯死的病害。常见的土传病害主要有以下几种：苗期常见土传病害包括由腐霉菌引起的猝倒病、由立枯丝核菌引起的立枯病等；成株期常见的突出病害种类包括由镰刀菌引起的瓜类的枯萎病、由轮枝菌引起的茄子黄萎病、由欧文氏菌引起的大白菜细菌性软腐病、由瓜果腐霉菌引起的腐霉根腐病、由根肿病菌引起的根肿病，以及由辣椒疫霉引起的辣椒疫病、由假单胞杆菌引起的番茄细菌性青枯病、由根结线虫引起的根结线虫病等。在这些病害种类中，枯萎病和黄萎病是影响最为广泛的两类代表性土传病害，可危害瓜类、豆科、花卉等100多种植物。
土传病原菌的传播有多种途径，通常危害植物的根和茎，并引发植株的系统性病害。土传病发病程度主要取决于侵染的病原菌数量。一个地区病原菌基数越高，发病较重。作物生长前期发生病害，导致幼苗根腐烂，或者，茎腐烂猝倒；幼苗很快就会死亡，严重影响作物生产。作物生长后期发生病害，一般年份减产20-30％，严重年份减产50-60％，甚至绝收。土传病害发病后，比较难以防治。因为病菌藏在土壤中越冬，很难被杀死；来年继续侵害作物，并且随着种植年限的延长而不断积累。土传病害的发生导致出现土壤环境恶化、作物产量下降和品质降低等一系列不良现象。此外，由于我国很长时期内忽视有机肥而大量施用化肥，加速了土壤微生物区系紊乱的发生。因此，土传病害逐年加重，已经成为影响农业可持续发展的一个重要限制因素，如何解决土传病害显得越来越重要。
土传病害尤其是枯萎病和黄萎病的防治方法较多，主要分为物理防治、化学防治和生物防治。化学防治是目前最主要的防治方法，见效快，成本低，方法简单，杀虫抗菌谱广。然而，长期施用化学农药，不仅污染环境，降低土壤修复能力，而且还使病原菌产生抗性，使土壤理、化、生、生化性状发生较大变化。物理防治包括土壤暴晒、水蒸气消毒、淹水等方法，针对少数作物品种具有一定效果。然而，物理防治耗费劳动力大，主要应用于设施农业。生物防治则是利用生物或其代谢产物控制病虫害的发生，主要包括：以虫治虫、以菌治虫及利用拮抗作用、交叉保护和信息化学物质等方法。它具有无污染、保护生态平衡以及较好的防治效果等特点，被称为绿色防治方法。通过生物防治的方法防治枯萎病和黄萎病已成为国内外学者的研究焦点。事实证明，生物防治是现在和将来防治土传病害的发展方向，符合农业可持续发展的要求。
针对生物防治，各国研究人员已经分离出许多生防菌(主要分为细菌类生防菌、真菌类生防菌、放线菌类生防菌)，同时研发出生物菌剂、生物有机肥等对枯萎病有较好防治效果的生物防治方法。这其中，利用真菌类生防菌的生物防治方法尤为重要。在真菌类生防菌中，链格孢属(Alternaria sp.)真菌是导致枯萎病发生的主要真菌。
链格孢属真菌对环境和寄主的适应性很强，在自然界中广泛分布。目前全世界已报道的链格孢菌有500多个种，其中90％以上的种是兼性寄生于不同科的植物特别是农作物上，可引起包括玉米、小麦、烟草、马铃薯、番茄、苹果、梨等几十种农作物的病害，造成田间和产后损失。根据报道，链格孢属真菌导致番茄枯萎病、苹果褐斑病、甜瓜叶斑病、西葫芦叶斑病、卷心菜黑斑病、烟草赤星病、人参链格孢菌、小麦叶斑病、大白菜黑斑病、马铃薯早疫病、番茄早疫病、花椒早疫病、茄子早疫病、龙葵早疫病、鸭梨黑斑病、葡萄穗轴褐枯病、杏果实黑斑病、樱桃黑色轮斑病、棉花黄萎病、茄子黄萎病等作物病害。
以前，链格孢属真菌的防治主要依赖的是化学药剂。研究表明，铜制剂是控制链格孢属真菌的有效药剂，但是使用铜制剂会影响果实表面，降低品质并且可能导致病原菌的系统抗性。随着人们对环境保护和绿色食物的关注，使用植物提取物的的抑菌成分研究变得越来越热门。许牡丹等对13种植物丙酮提取液对链格孢菌进行抑菌实验，结果表明只有苦参、甘草、枸杞、金钱草的提取物对链格孢菌抑菌效果明显，其他植物没有抑制作用。此外，应用生物防治链格孢属目前已取得一定的成果。防治链格孢属真菌病害的农用抗生素首推日本的多氧霉素和我国的多抗霉素。多抗霉素是一种胞嘧啶核苷类抗生素，产生菌为可可链霉菌，主要组分为polyoxin A和polyoxin B，其作用位点是真菌的细胞壁，对烟草赤星病、苹果斑点落叶病、梨黑斑病等有特效。Pichard等从花椰种子上分离到Bacilluspolymyxa，该菌可以产生抗生素起到控制花椰菜黑斑病的作用，用无菌上清液进行种子处理亦能减少病害的发生。木霉(Trichoderma spp.)是世界上在植物病害物防治中应用最多的微生物类群之一。王革等筛选到了对烟草赤星病有明显拮抗作用。
目前，大多数有益或生防微生物是从土壤中筛选出来的，而且对于单一生防菌的研究及应用已经取得了较好的防治效果。然而单一生防菌在实际生产应用中的效果不稳定，限制了其商品化进程。
近几年来，大量研究表明，利用两种甚至多种生防微生物制作成的微生物菌剂可以克服单一生防菌的缺点。发明人已经利用枯草芽孢杆菌和拟康氏木霉混合菌防治植物病害，并在此基础上开发出一系列产品。由于防效显著、防病谱广，被用户称为“傻瓜”农药。例如，中国专利ZL201110292116.3和中国专利ZL201110292342.1分别公开了一种作物病害防治复合生物制剂和一种复合生物土壤改良剂，均包含枯草芽孢杆菌发酵液、拟康氏木霉发酵液、水溶性甲壳素、黄腐酸钾。上述产品对黄瓜黄萎病菌和西瓜枯萎病菌具有较好的防治效果。
然而，在上述生物制剂或土壤改良剂中，枯草芽孢杆菌发酵液和拟康氏木霉发酵液必须为单独发酵所得。如果采用混合发酵，则两种真菌的生长繁殖行为互相干扰，导致菌丝致密度不如单独发酵之和，同时产孢量也难以尽如人意。这将大大影响植物病害的防治效果。
因此，为了防治上述植物病害，迫切需要寻找一种用于防治土传病害的复合生物制剂。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供一种用于防治土传病害的复合生物制剂。发明人惊奇地发现，当两种特定的微生物混合发酵后，化学成分发生了改变，抗菌活性也随之增强。该复合生物制剂具有稳定、定殖能力强的特点，并且利用微生物之间的协同作用，提高发酵液的菌丝致密度和产孢量，进而提高植物病害的防治效果。
为实现上述目的，本发明拟采取以下技术方案：一种用于防治土传病害的复合生物制剂，包含匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)和绿色木霉(Trichoderma viride)的混合发酵液。
根据本发明所述的复合生物制剂，其中，所述匍枝根霉保藏号为：CGMCC No.8435；保藏名称为：匍枝根霉PF102；保藏日期为：2013年11月5日；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。匍枝根霉的抗逆性极强，在快速繁殖过程中，可以产生多种分解土壤有机质和土壤有效成分的活性物质，例如：维生素、氨基酸、糖化酶、蛋白酶、淀粉酶等。匍枝根霉可以产生大量的胞外活性物质例如：氨基酸类、核酸类、维生素、鞘脂类等多种化合物，它们具有分解有机质，抑制有害微生物，促进植物根系生长等作用；匍枝根霉还可以外分泌多种抑菌物质，其对多种病原菌有抑制活性，具有光谱性，且抗逆性强，既可防病，又能促进植株生长。
根据本发明所述的复合生物制剂，其中，所述绿色木霉保藏号为：CGMCC No.8434；保藏名称为：绿色木霉PF1；保藏日期为：2013年11月5日；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。绿色木霉分布广泛，其分泌物具有促进植物生长和杀菌效果，具有极大的改善土壤潜力的菌株。绿色木霉具有丰富的菌丝，其菌丝可以缠绕土壤微粒，进而提高土壤的稳定性和通透性，打破土壤板结和硬化，绿色木霉还可分泌丰富的胞外高分子多糖和糖蛋白及高活性的特殊酶系，调节土壤酸碱平衡，促进土壤释放养分、促进植物根系对营养成分的吸收。
根据本发明所述的复合生物制剂，其中，所述混合发酵是将匍枝根霉的孢子悬浮液和绿色木霉的孢子悬浮液按照一定重量比例同时接种到发酵罐中进行液体深层发酵。
根据本发明所述的复合生物制剂，其中，所述匍枝根霉的孢子悬浮液按照如下方法制备：首先，用接种环将冷藏保存的菌种接种于平板PDA培养基，转接3代；然后用接种环挑取边缘菌丝转接于PDB培养基中，培养温度为20℃～35℃，培养时间为5～15天，发酵液过滤得到匍枝根霉的孢子悬浮液，活孢子浓度为(5～9)×108个/ml。
根据本发明所述的复合生物制剂，其中，所述PDA培养基为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL。
根据本发明所述的复合生物制剂，其中，所述PDB培养基为：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL。
根据本发明所述的复合生物制剂，其中，所述培养温度优选为22℃～32℃，更优选为25℃～30℃，以及最优选为28℃。
根据本发明所述的复合生物制剂，其中，所述培养时间优选为6～14天，更优选为7～13天，更加优选为8～12天，以及最优选为10天。
根据本发明所述的复合生物制剂，其中，所述过滤为100μm筛过滤。
根据本发明所述的复合生物制剂，其中，所述绿色木霉的孢子悬浮液按照如下方法制备：首先，用接种环将冷藏保存的菌种接种于平板PDA培养基，转接3代；然后用接种环挑取边缘菌丝转接于PDB培养基中，培养温度为20℃～35℃，培养时间为5～15天，发酵液过滤得到绿色木霉的孢子悬浮液，活孢子浓度为(5～9)×108个/ml。
根据本发明所述的复合生物制剂，其中，所述PDA培养基为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL。
根据本发明所述的复合生物制剂，其中，所述PDB培养基为：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL。
根据本发明所述的复合生物制剂，其中，所述培养温度优选为22℃～32℃，更优选为25℃～30℃，以及最优选为28℃。
根据本发明所述的复合生物制剂，其中，所述培养时间优选为6～14天，更优选为7～13天，更加优选为8～12天，以及最优选为10天。
根据本发明所述的复合生物制剂，其中，所述过滤为100μm筛过滤。
根据本发明所述的复合生物制剂，其中，所述发酵罐盛有PDB培养基或麸皮培养基；所述液体深层发酵的温度为25℃～35℃，优选为28℃～32℃，以及最优选为30℃；所述液体深层发酵的时间为24h～20天，优选为36h～15天，更优选为48h～12天，以及最优选为48h～10天。
根据本发明所述的复合生物制剂，其中，所述PDB培养基为：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL。
根据本发明所述的复合生物制剂，其中，所述匍枝根霉的孢子悬浮液和绿色木霉的孢子悬浮液的重量比例为1：1至1：10。优选地，所述匍枝根霉的孢子悬浮液和绿色木霉的孢子悬浮液的重量比例为1：2至1：8；更优选地，所述匍枝根霉的孢子悬浮液和绿色木霉的孢子悬浮液的重量比例为1：3至1：6；以及，最优选地，所述匍枝根霉的孢子悬浮液和绿色木霉的孢子悬浮液的重量比例为1：4。
根据本发明所述的复合生物制剂，应用形式为土壤改良剂、生物肥料、叶面喷剂或根部喷剂。在上述产品中，优选进一步包含作物营养成分。
根据本发明所述的复合生物制剂，其中，所述作物营养成分包括，但不限于，水溶性甲壳素、黄腐酸钾和腐熟有机质的任意一种或多种。其中，水溶性甲壳素具有“植物疫苗”的称号，连续使用可诱导农作物自身产生对病害的抗性因子，降低病害发生率，显著减少农药使用量。此外还有极强叶面附着性能，可促根壮苗，促进果实成熟。水溶性甲壳素的分子量M为(1～5)×105，黏度100～200mPas，脱乙酯度DAC≥90％，纯度≥90％。黄腐酸钾具有高负载量及生理活性，其螯合常量及微量营养物质可以使其更好地为植物利用，激发植物微观生物活性，能够缓释肥料，提高植物对营养的吸收，促进植物发芽生长，加速沉淀分解，增强抗涝性。甲壳素和黄腐酸钾以其不同的结构形态进行螯合，起到相互促进作用，更有利于土壤结构的改善。黄腐酸钾规格为：细度＜120目，水可溶物＞99.7wt％，水溶性黄腐酸＞50wt％，氧化钾9.5-10wt％，氮2.5-3.0wt％，磷0.5-0.8wt％，有机质50-60wt％。腐熟有机质同样是本领域熟知的作物营养成分。为提高本制剂在施用初期的萌发率，可适当添加常用腐熟有机质。
根据本发明所述的复合生物制剂，其中，当包含所述作物营养成分时，有利地，所述作物营养成分为复合生物制剂重量的2～20wt％。在一个实施方式中，基于复合生物制剂的总重量计，所述匍枝根霉和绿色木霉的混合发酵液为70～98wt％，水溶性甲壳素为0.5～2wt％，黄腐酸钾为0.5～2wt％。根据本发明所述的复合生物制剂使用量为视其地力一般为100～5000ml/亩，优选为200～4500ml/亩，更优选为300～4000ml/亩，更加优选为400～3000ml/亩，以及最优选为500～2500ml/亩。
另一方面，本发明还提供了所述的复合生物制剂在防治土传病害优选是枯萎病或黄萎病的用途。
根据本发明所述的用途，其中，所述土传病害优选为链格孢属真菌导致的土传病害。
根据本发明所述的用途，其中，所述土传病害选自番茄枯萎病、苹果褐斑病、甜瓜叶斑病、西葫芦叶斑病、卷心菜黑斑病、烟草赤星病、人参链格孢菌、小麦叶斑病、大白菜黑斑病、马铃薯早疫病、番茄早疫病、花椒早疫病、茄子早疫病、龙葵早疫病、鸭梨黑斑病、葡萄穗轴褐枯病、杏果实黑斑病、樱桃黑色轮斑病、棉花黄萎病、茄子黄萎病。
根据本发明所述的用途，其中，使用时，将上述复合生物制剂稀释成适宜浓度，定植前喷于土壤表面后翻耕，或者灌根，或者喷施于作物叶面。
根据本发明所述的用途，其中，所述稀释倍数为100～500倍。优选地，所述稀释倍数为100～400倍；更优选地，稀释倍数为100～300倍；以及，最优选地，所述稀释倍数为100～200倍。
令人惊奇地发现，在液体深层发酵后，取混合发酵液中一小块菌丝体接种于PDA平板上，28℃培养4天后发现既出现了匍枝根霉的白色菌丝和黑色孢子，也出现了绿色木霉的菌丝和绿色孢子。这证明混合发酵后两种真菌在发酵液中均存活。
发明人还发现，在液体深层发酵后，取混合发酵液中一小块菌丝体在400倍显微镜下观察，并与匍枝根霉和绿色木霉单独发酵液中的菌丝进行对比。结果表明，混合发酵液中的菌丝更加致密，产孢子量更多。这种现象可能是因为匍枝根霉的加入导致绿色木霉生长繁殖加快，并产生次生代谢物。高效液相色谱法(HPLC)证实了上述结果。
与现有技术相比，本发明具有下列有益技术效果：
(1)本发明的复合生物制剂具有稳定、定殖能力强的特点，并且利用微生物之间的协同作用，不仅导致混合发酵液相对于单独发酵液或者单独发酵液的简单混合产生了质变(产生新的或更多的拮抗物质)，同时也产生了量变(菌丝更加致密，产孢子量更多)，进而提高植物病害的防治效果；
(2)本发明的复合生物制剂在液体深层发酵过程中两种微生物繁殖速度很快且具有极高的胞外分泌活性，不仅实现了单纯复合无法达到的技术效果，同时也实现了大规模化生产，大幅度的减轻了劳动投入，并可以快速获得大量菌体和孢子，降低了生产成本，使用方便；
(3)与肥料组分一起使用时，本发明的复合生物制剂能够改善土壤微生物菌群结构，促进植物根系的生长，增强根系对营养成分的吸收能力，并且可与土壤微粒牢固地附着和缠绕，提高土壤稳定性和孔隙度；
(4)本发明的复合生物制剂对链格孢属真菌具有较强的杀菌活性，因此可以有效防治枯萎病或黄萎病等土传病害。
附图说明
图1是本发明实施例1与比较例1-2所得发酵液的HPLC图谱(自上向下依次为：实施例1、比较例2和比较例1)。
图2是实施例1-3和比较例1-2所得样品对苹果链格孢菌抑制效果图(图2-1：对照组；图2-2：比较例1；图2-3：比较例2；图2-4：实施例2；图2-5：实施例1；图2-6：实施例3)。
图3是本发明实施例1和比较例1-2发酵液中的菌丝体在400倍显微镜下观察所得图像(左右为一对，由下至上依次为实施例1、比较例1和比较例2)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
通过下述实施方式将有助于理解本发明，但不能限制本发明的范围。
实施例1：
匍枝根霉的孢子悬浮液按照如下方法制备：首先，用接种环将冷藏保存的菌种接种于平板PDA培养基，所述PDA培养基为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，转接3代；然后用接种环挑取边缘菌丝转接于PDB培养基中，所述PDB培养基为：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL，培养温度为28℃，培养时间为10天，发酵液过滤得到匍枝根霉的孢子悬浮液，活孢子浓度为(5～9)×108个/ml。
所述绿色木霉的孢子悬浮液按照如下方法制备：首先，用接种环将冷藏保存的菌种接种于平板PDA培养基，所述PDA培养基为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，转接3代；然后用接种环挑取边缘菌丝转接于PDB培养基中，所述PDB培养基为：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL，培养温度为28℃，培养时间为10天，发酵液过滤得到绿色木霉的孢子悬浮液，活孢子浓度为(5～9)×108个/ml。
将匍枝根霉的孢子悬浮液和绿色木霉的孢子悬浮液按照重量比例1：4同时接种到发酵罐中进行液体深层发酵；所述发酵罐盛有PDB培养基；所述PDB培养基为：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL；所述液体深层发酵的温度为30℃；所述液体深层发酵的时间为48h。最终得到本发明实施例1的复合生物制剂。取发酵液中一小块菌丝体在400倍显微镜下观察，结果参见图1。
抗菌活性采用对峙实验测定，具体方法如下：在超净工作台上将苹果链格孢菌用灭菌后的接种器(Φ5mm)接种到PDA培养基的一侧，同时将实施例1的复合生物制剂接种到PDA培养基的另一侧，28℃恒温培养，每个处理设三到四个平行，观察记录抑制效果，用十字交叉法测量苹果链格孢菌的菌落半径，以只接种苹果链格孢菌的平板作对照。28℃恒温培养5-6天后，计算生防微生物对苹果链格孢菌的抑菌率，计算方法如下：抑菌率(％)＝[(对照组菌落半径-实验组菌落半径)/对照组菌落半径]×100。结果参见图2。
用滤纸过滤本发明实施例1的复合生物制剂，5000r/min离心，收集上清液。用滤器(滤膜Φ0.22um)过滤，然后用所得发酵液和固体PDA培养基按照1:1的比例混合均匀，倒入培养皿中。用灭菌的打孔器制成苹果链格孢菌菌饼接种到含发酵液的培养基中央(每皿一块菌饼，菌丝面朝下)每个处理设3-4个平行，并设对照组。28℃恒温培养5-6天后，用十字交叉法测菌落直径，计算真菌菌丝生长相对抑制率，比较抑制结果。计算公式如下：相对抑制率(％)＝(对照组菌落平均直径-实验组菌落平均直径)/(对照组菌落平均直径-菌饼直径)×100。结果参见表1。
将一部分实施例1的复合生物制剂经离心过滤去除固体杂质后进行浓缩、净化，得到色谱分析样品。用高效液相色谱法对样品进行分析。结果参见图3。
实施例2：
将匍枝根霉的孢子悬浮液和绿色木霉的孢子悬浮液按照重量比例1：1同时接种到发酵罐中进行液体深层发酵；其余步骤和工艺参数同实施例1。最终得到本发明实施例2的复合生物制剂。
按照与实施例1相同的方法测定其对苹果链格孢菌的抑菌率和相对抑制率(％)。结果参见图2和表1。
实施例3：
将匍枝根霉的孢子悬浮液和绿色木霉的孢子悬浮液按照重量比例1：9同时接种到发酵罐中进行液体深层发酵；其余步骤和工艺参数同实施例1。最终得到本发明实施例3的复合生物制剂。
按照与实施例1相同的方法测定其对苹果链格孢菌的抑菌率和相对抑制率(％)。结果参见图2和表1。
比较例1：
匍枝根霉的孢子悬浮液按照如下方法制备：首先，用接种环将冷藏保存的菌种接种于平板PDA培养基，所述PDA培养基为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，转接3代；然后用接种环挑取边缘菌丝转接于PDB培养基中，所述PDB培养基为：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL，培养温度为28℃，培养时间为10天，发酵液过滤得到匍枝根霉的孢子悬浮液，活孢子浓度为(5～9)×108个/ml。
将匍枝根霉的孢子悬浮液接种到发酵罐中进行液体深层发酵；所述发酵罐盛有PDB培养基；所述PDB培养基为：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL；所述液体深层发酵的温度为30℃；所述液体深层发酵的时间为48h。最终得到比较例1的复合生物制剂。
按照与实施例1相同的方法测定其对苹果链格孢菌的抑菌率和相对抑制率(％)；并且按照与实施例1相同的方法用高效液相色谱法对样品进行分析。结果参见图1-3和表1。
比较例2：
所述绿色木霉的孢子悬浮液按照如下方法制备：首先，用接种环将冷藏保存的菌种接种于平板PDA培养基，所述PDA培养基为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，转接3代；然后用接种环挑取边缘菌丝转接于PDB培养基中，所述PDB培养基为：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL，培养温度为28℃，培养时间为10天，发酵液过滤得到绿色木霉的孢子悬浮液，活孢子浓度为(5～9)×108个/ml。
将绿色木霉的孢子悬浮液接种到发酵罐中进行液体深层发酵；所述发酵罐盛有PDB培养基；所述PDB培养基为：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL；所述液体深层发酵的温度为30℃；所述液体深层发酵的时间为48h。最终得到比较例2的复合生物制剂。
按照与实施例1相同的方法测定其对苹果链格孢菌的抑菌率和相对抑制率(％)；并且按照与实施例1相同的方法用高效液相色谱法对样品进行分析。结果参见图1-3和表1。
比较例3：
匍枝根霉的孢子悬浮液按照如下方法制备：首先，用接种环将冷藏保存的菌种接种于平板PDA培养基，所述PDA培养基为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，转接3代；然后用接种环挑取边缘菌丝转接于PDB培养基中，所述PDB培养基为：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL，培养温度为28℃，培养时间为10天，发酵液过滤得到匍枝根霉的孢子悬浮液，活孢子浓度为(5-9)×108个/ml。
所述绿色木霉的孢子悬浮液按照如下方法制备：首先，用接种环将冷藏保存的菌种接种于平板PDA培养基，所述PDA培养基为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，转接3代；然后用接种环挑取边缘菌丝转接于PDB培养基中，所述PDB培养基为：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL，培养温度为28℃，培养时间为10天，发酵液过滤得到绿色木霉的孢子悬浮液，活孢子浓度为(5～9)×108个/ml。
将匍枝根霉的孢子悬浮液和绿色木霉的孢子悬浮液按照重量比例1：4简单混合，得到比较例3的复合生物制剂。
按照与实施例1相同的方法测定其对苹果链格孢菌的抑菌率和相对抑制率(％)。结果参见表1。
图1是本发明实施例1与比较例1-2所得发酵液的HPLC图谱(自上向下依次为：实施例1、比较例2和比较例1)。从图1可以看出，本发明实施例1的混合发酵不是单一微生物发酵成分的简单加合，而是有新物质的产生。这种现象可能是因为匍枝根霉的加入导致绿色木霉生长繁殖加快，并产生次生代谢物。图1充分反映出本发明的复合生物制剂的质变现象。发明人还测定了比较例3所得发酵液的HPLC曲线，出峰位置与比较例1和2一致性极高，基本相当于后者的简单叠加。
图2是实施例1-3和比较例1-2所得样品对苹果链格孢菌抑制效果图(图2-1：对照组；图2-2：比较例1；图2-3：比较例2；图2-4：实施例2；图2-5：实施例1；图2-6：实施例3)。从图中可以看出，相对于对照组，尽管匍枝根霉和绿色木霉对苹果链格孢菌均有不同程度的抑制效果；然而，本发明实施例1-3的复合生物制剂对苹果链格孢菌的抑制效果显著更优。
表1是实施例1-3和比较例1-3所得样品原液随着时间变化对苹果链格孢菌的抑菌率。
表1
时间/天 2 3 4 5 6
实施例1 57.0％ 58.8％ 57.2％ 56.4％ 55.9％
实施例2 63.2％ 65.7％ 67.1％ 65.5％ 66.3％
实施例3 57.4％ 57.1％ 56.8％ 56.6％ 56.1％
比较例1 53.9％ 51.7％ 53.2％ 51.4％ 51.0％
比较例2 14.7％ 7.6％ 13.3％ 15.4％ 16.8％
比较例3 52.2％ 51.5％ 50.5％ 51.1％ 52.0％
从表1可以看出，本发明实施例1-3的混合发酵液不仅比比较例1-2的单独发酵液的抑菌能力强，而且比比较例3的单独发酵液简单混合的抑菌能力强。而且，在实施例2中，匍枝根霉的孢子悬浮液和绿色木霉的孢子悬浮液的混合比例为1：4时，所得复合生物制剂对苹果链格孢菌的抑菌率最高。
图3是本发明实施例1和比较例1-2发酵液中的菌丝体在400倍显微镜下观察所得图像(左右为一对，由下至上依次为实施例1、比较例1和比较例2)。结果表明，与匍枝根霉和绿色木霉单独发酵液中的菌丝相比，本发明实施例1混合发酵液中的菌丝更加致密，产孢子量更多。这种现象可能是因为匍枝根霉的加入导致绿色木霉生长繁殖加快，并产生次生代谢物。这与前面的HPLC结果一致。图3充分反映出本发明的复合生物制剂的量变现象。
从以上结果可以看出，本发明将匍枝根霉的孢子悬浮液和绿色木霉的孢子悬浮液按照一定重量比例同时接种到发酵罐中进行液体深层发酵，不仅导致混合发酵液相对于单独发酵液或者单独发酵液的简单混合产生了质变(产生新的或更多的拮抗物质)，同时也产生了量变(菌丝更加致密，产孢子量更多)。这种质变和量变导致本发明所得复合生物制剂对苹果链格孢菌的抑菌效果显著提高。
也就是说，本发明的复合生物制剂不仅体现了匍枝根霉和绿色木霉的协同效应，而且体现出混合液体深层发酵的独特效果。这种效果是单独的微生物菌株所无法达到的，并且也不是两种微生物菌株效果的简单叠加。在液体深层发酵过程中的两种微生物繁殖速度很快且具有极高的胞外分泌活性，利用液体深层发酵技术不仅实现了单纯复合无法达到的技术效果，同时也实现了大规模化生产，大幅度的减轻了劳动投入，并可以快速获得大量菌体和孢子，降低了生产成本，使用方便。
进一步地，本发明通过将80重量份的实施例2的复合生物制剂与2重量份的水溶性甲壳素和2重量份的黄腐酸钾制成土壤改良剂1，使其用于作物生长，研究该土壤改良剂对改善土壤的理化性质和枯萎病防治效果的影响。
试验实施例1
试验组1为施用1000ml/亩的本发明土壤改良剂1(稀释100倍)，试验组2为施用1000ml/亩的含相同有效孢子数量的单一绿色木霉发酵液制剂，翻耕前均匀喷施于土壤表面，对照组喷洒等量清水，后续追肥处理相同，小区面积100㎡，小麦收获后测定计算土壤理化性质。结果如表2所示。
表2
土壤容重(g/cm3) pH
对照组 1.77 5.2
试验组1 1.42 6.7
试验组2 1.49 6.2
结果表明，施用本发明土壤改良剂1和绿色木霉菌制剂后相对于对照组土壤容重下降，pH值接近中性，土壤酸化状况得到逆转，适于作物生长，土壤改良剂1的效果优于单一绿色木霉菌制剂。
试验实施例2
试验组1为定植前土壤表面喷洒1000ml/亩的本发明土壤改良剂1(稀释100倍)，试验组2喷施等量具有相同有效菌体数量的现有绿色木霉菌和枯草芽孢杆菌复合制剂，对照组喷施等量清水。由于土壤中的微生物不仅可以调节植株生长，而且在土壤肥力的保持和提高以及能量转化和物质循环等方面具有重要作用，因此是土壤质量的重要指标。结果如表3所示。
表3
放线菌(cfu/g) 细菌(cfu/g) 真菌(cfu/g)
对照组 3.4×106 2.3×106 3.9×103
试验组1 4.5×106 6.7×106 4.2×104
试验组2 3.7×106 4.2×106 6.3×103
结果表明，本发明土壤改良剂1和相同有效菌体数量的绿色木霉菌和枯草芽孢杆菌复合制剂相比于对照组处理均提高了土壤中微生物数量，增加了微生物多样性，且本发明土壤改良剂1对细菌和真菌的数量提升最为显著，明显高于试验组2。
试验实施例3
挑选160棵大小相同、长势一致的番茄植株，分为四组同时接种枯萎病原菌。试验组1和2分别用稀释100倍、200倍的本发明土壤改良剂1进行喷施，对照组喷施含相同有效菌体数量的枯草芽孢杆菌单一菌种的制剂。结果如表4所示。
表4
发病率(％) 病指(％) 防治效果(％)
对照组 2 3 94.6
试验组1 8 8 85.3
试验组2 20 20 66.4
结果表明，与普通枯草芽孢杆菌制剂相比，本发明的生物制剂对枯萎病的防治效果显著提高，其中100倍液防治效果最佳，其次为200倍液。
以上田间试验实施例结果表明，与肥料组分一起使用时，本发明的复合生物制剂能够改善土壤微生物菌群结构，促进植物根系的生长，增强根系对营养成分的吸收能力，并且可与土壤微粒牢固地附着和缠绕，提高土壤稳定性和孔隙度；此外，本发明的复合生物制剂可以有效防治枯萎病或黄萎病等土传病害。
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种复合生物制剂在抑制苹果链格孢菌中的应用，其特征在于，所述复合生物制剂包含匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)和绿色木霉(Trichoderma viride)的混合发酵液；
其中，所述混合发酵是将匍枝根霉的孢子悬浮液和绿色木霉的孢子悬浮液按照一定重量比例同时接种到发酵罐中进行液体深层发酵；
其中，所述发酵罐盛有PDB培养基或麸皮培养基；所述液体深层发酵的温度为25℃～35℃；所述液体深层发酵的时间为24 h～20天；
其中，所述匍枝根霉的孢子悬浮液和绿色木霉的孢子悬浮液的重量比例为1：1至1：10；
其中，应用形式为土壤改良剂、生物肥料、叶面喷剂或根部喷剂；
其中，所述复合生物制剂还包含作物营养成分；所述作物营养成分包括水溶性甲壳素和黄腐酸钾；
其中，基于所述复合生物制剂的总重量计，所述匍枝根霉和绿色木霉的混合发酵液为70～98wt％，水溶性甲壳素为0.5～2wt％，黄腐酸钾为0.5～2wt％。
2.根据权利要求1所述的复合生物制剂在抑制苹果链格孢菌中的应用，其中，所述匍枝根霉或绿色木霉的孢子悬浮液按照如下方法制备：首先，用接种环将冷藏保存的菌种接种于平板PDA培养基，转接3代；然后用接种环挑取边缘菌丝转接于PDB培养基中，培养温度为20℃～35℃，培养时间为5～15天，发酵液过滤得到匍枝根霉或绿色木霉的孢子悬浮液，活孢子浓度为5×108～9×108个/ml。
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