CN101864377B - 防治梨枯梢病害的生防菌株sm16 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种防治梨枯梢病害的生防菌株SM16，属于植物保护技术领域。该菌是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，将该菌接种于培养液中，30℃250rpm发酵20～24小时，然后6000rpm离心10min，取湿菌与菌体保藏液按1∶40(g/ml)配成菌剂，成品中活菌总浓度为1×10 9～1×10 12cfu/ml。果园使用时，于梨花25％和75％开放时，菌剂兑水稀释至1×10 8cfu/ml喷施花表面。该菌剂对梨枯梢病害防效达57-68％以上。

Description

防治梨枯梢病害的生防菌株SM16
一、技术领域
本发明涉及一种防治梨枯梢病的枯草芽孢杆菌生防菌株SM16，属于果树病害防控技术领域，专用于梨枯梢病害无公害防治。
二、背景技术
梨枯梢病害是由欧文氏属细菌引起病害，该病对于梨产业影响较大。病菌在梨树花期初侵染，受侵染花器产生水渍状病斑，不久萎焉变黑枯死。在潮湿条件下，受侵染花器、果柄、叶柄等组织上有菌脓渗出。感染的梨枝梢萎焉枯死，枯叶不脱落。枝梢枯萎发展较快，条件适宜时，几天内即可扩展15-30cm以上，造成整枝死亡。有时，病害仅局限于簇芽或新梢，在簇芽或新梢与二年生枝梢交界处形成溃疡斑，可能为病菌越冬提供场所。该病害目前在我国发生面积及区域较小，但危害十分严重。梨枯梢将成为影响我国梨产业的重要病害之一。
目前，化学防治梨枯梢病害主要以农用链霉素为主要，其防效能达到80％左右。但是，农用链霉素的长期单一使用已导致使用次数和用药浓度增加，也提高了病原菌产生对农用链霉素抗性的风险。同时，由于链霉素的广谱性，大量使用不但破坏了微生态环境，而且导致非靶标抗性。欧盟已经禁止了农用链霉素在农业中的使用，并将农产品中农用链霉素残留作为农产品进出口贸易中的壁垒。非化学性防治措施目前已成为防治梨枯梢的核心，其中对环境友好、无农残、防效较好的生物防治则为最有前途的方法之一。国外利用拮抗细菌生物防治由欧文氏病菌引起的植物病害研究报道较多，生防菌主要集中在假单胞菌属、芽孢杆菌属及泛菌属。在美国，P.fluorescens A506、P.agglomeransE325、Bacillus subtilis QST713正在进行农药登记；在欧盟，生防菌剂Serenade 和Biopro 
Figure GSA00000051832900013
已被产业化用来防治由欧文氏病菌引起的梨树病害。现有技术中按照本实验室的菌体保藏液专利(公开专利号CN1358838，公开日：2002年7月17日)方法，菌体可室温保存2～3年。
三、发明内容
技术问题：本发明的目的是生物防治梨产业潜在危害较大的梨枯梢病害，通过室内离体和果园试验，筛选得到的枯草芽孢杆菌SM16的菌剂防治该病害效果较好，防效可达50％以上。
技术方案
一种防治梨枯梢病害的生防菌株SM16，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，2009年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.3127。
生防菌株SM16用于制备生防菌剂的方法为：
1)将该菌株接种到LB培养液中30℃培养180rpm振荡培养，12～16小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；
2)当培养至OD值在0.5～0.8之间时，将种子菌液以1∶100体积比加入装有发酵培养液的200L发酵罐中，30℃250rpm振荡培养20～24小时，发酵液pH值维持在7.0，溶氧量20％，通气量5-7m3/小时，罐压0.05-0.1KPa。然后6000rpm离心10min，每1000ml培养液获得13～16g湿菌，每克湿菌含4×1010～1015个菌体，取湿菌与菌体保藏液按1g∶40ml配成菌剂，成品中活菌总浓度为1×109～1×1012cfu/ml。其中：
种子培养LB培养液配方：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为7.0；
发酵培养液配方：麦芽糖2.5g/L，玉米粉5g/L，黄豆粉5g/L，胰蛋白胨5g/L，二水氯化钙0.5g/L，一水硫酸锰0.5g/L，磷酸氢二钾1g/L，调节pH值为7.0；
菌体保藏液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，还含有浓度为0.001mol/L的Tween20非离子型表面活性剂。
有益效果
本发明的优点和积极效果表现在：本发明是专门针对梨枯梢病害开发的生防制剂。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于梨的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于梨的出口贸易。
温室离体花试验显示，生防菌SM16生防菌剂喷雾至自然发病花表面，能有效防治病害，防效达66.81％(表1)；室内离体叶片试验显示，SM16生防菌剂能有效抑制自然发病梨嫩叶上病斑的延伸(图2.)；自然发病果园试验中，喷雾生防菌剂SM16防效显著，高达60-70％(表2)。
该菌剂用湿菌与本实验室的菌体保藏液(属本实验室已授权专利，专利号ZL02112559.7，公开专利号CN1358838，公开日：2002年7月17日)按1∶40(g/ml) 配成菌剂，可室温保存2～3年。该菌剂于梨花盛开前稀释喷雾防治病害，也可以将菌剂原液涂布于梨枯梢病害引起的溃疡斑上，有效抑制梨枯梢病原菌的越冬。
四、附图说明
图1.生防菌剂SM16离体花防治效果
(A.清水处理对照组；B.生防菌剂SM16处理组)
图2.生防菌剂SM16离体叶片防治效果
(A.清水处理对照组；B.生防菌剂SM16处理组)
图3.生防菌剂SM16果园防治效果
(A.清水处理对照组；B.生防菌剂SM16处理组)
五、具体实施方式
一种防治梨枯梢病害的生防菌株SM16，分离于江苏省镇江市水稻田中，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，细胞杆状，成链状排列，端口成圆形，芽孢椭圆或圆形，单芽孢，兼性好氧，能利用鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖、乳糖、甘露醇、木糖、麦芽糖、D-果糖、D-甘露糖、山梨糖，最适生长温度35-37℃，菌落成乳白色，边缘整齐，表面有皱褶、隆起，菌落表面干燥，G+，菌落不透明，M.R试验、V.P试验、过氧化氢酶试验均为阳性，可利用丙二酸盐。
生防菌株SM16用于制备生防菌剂的方法为：
1)将该菌株接种到LB培养液中30℃培养180rpm振荡培养，12～16小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零，LB培养液配方：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为7.0；
2)当培养至OD值在0.5～0.8之间时，将种子菌液以1∶100体积比加入装有发酵培养液的200L发酵罐中，30℃250rpm振荡培养20～24小时，发酵液pH值维持在7.0，溶氧量20％，通气量5-7m3/小时，罐压0.05-0.1KPa。然后6000rpm离心10min，每1000ml培养液获得13～16g湿菌，每克湿菌含4×1010～1015个菌体，取湿菌与菌体保藏液按1g∶40ml配成菌剂，成品中活菌总浓度为1×109～1×1012cfu/ml。发酵培养液配方：麦芽糖2.5g/L，玉米粉5g/L，黄豆粉5g/L，胰蛋白胨5g/L，二水氯化钙0.5g/L，一水硫酸锰0.5g/L，磷酸氢二钾1g/L，调节pH值为7.0。菌体保藏液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，还含有浓度为0.001mol/L的Tween20非离子型表面活性剂。
下面将结合试验相关结果图，进行实施方案解释：
(1)离体花试验
自然发病梨园中选取开花数为25％的花束，室内培养评价生防菌剂SM16的防病潜 能。花梗浸在10％的蔗糖溶液中，生防菌培养后灭菌水调至108CFU/ml细喷雾至花束表面约形成水层；100％湿度保湿3天后，统计各处理发病情况并计算防效。
(2)离体叶片试验
自然发病梨园采集叶片进行离体试验。叶片置于托盘后喷雾接种108CFU/ml的生防菌剂SM16，20μl，试验设立喷雾清水作为对照组。处理后保湿3天后，观察叶片发病情况。
(5)果园防治试验
生防菌株剂SM16发酵制成生防菌剂后稀释其浓度为108CFU/ml用手动喷雾器细喷雾至花器上。梨树开花25％期，第一次喷雾防治；梨树开花75％期，第二次喷雾防治。试验以农用链霉素为化学药剂处理组。各处理5次重复，处理组随机排列。梨枯梢病害为自然发病，10天后调查各处理病害严重度统计防治效果。
试验结果：
(1)离体花试验
生防剂SM16喷雾处理3天后，统计各处理花束总数和发病花束数，计算生防菌的防治效果为66.81％。生防菌剂SM16处理组花束发病较少，而清水对照组花束全部发病，变黑。见图1。
表1.温室离体花试验防治效果
Figure GSA00000051832900041
(2)离体叶片试验
处理3天后，观察叶片发病情况结果显示，自然发病叶片只做清水处理对照组叶片变黑腐烂而生防菌剂SM16处理组叶片发病情况较轻，与清水处理对照组差异显著。结果如图2.
(3)生防菌剂SM16果园防治梨枯梢效果
梨树花期喷雾防治2次，能有效控制病害发生，防治效果达67.97％，与农用链霉素效果相当，见表2.建议梨产业中可用生防菌剂SM16替代农用链霉素或者交替使用。统计观察发现，自然发病梨树：花全部受侵染脱落，嫩叶也萎焉、变黑，湿度大时可见 明显菌脓出现。处理组中，梨花正常授粉长出幼果。部分花受病原菌侵染死亡，有些花瓣出现枯死，但不会影响其正常坐果。可见生防菌SM16效果较好(图3.)。
表2.生防菌剂SM16果园防治效果
Figure GSA00000051832900051

Claims (4)

1.一种防治梨枯梢病生防菌株SM16，是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，2009年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.3127。
2.权利要求1所述生防菌株SM16制备的生防菌剂。
3.权利要求2所述生防菌剂在防治梨枯梢病害的应用。
4.权利要求1所述生防菌株SM16用于制备生防菌剂的方法，包括：
1)将该菌株接种到LB培养液中30℃培养180rpm振荡培养，12～16小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；
2)当培养至OD值在0.5～0.8之间时，将所获得的菌液以1∶100体积比加入装有发酵培养液的200L发酵罐中，30℃250rpm振荡培养20～24小时，发酵液pH值维持在7.0，溶氧量20％，通气量5-7m3/小时，罐压0.05-0.1Kpa；然后6000rpm离心10min，每1000ml培养液获得13～16g湿菌，每克湿菌含4×1010～1015个菌体，取湿菌与菌体保藏液按1g∶40ml配成菌剂，成品中活菌总浓度为1×109～1×1012cfu/ml；其中，
LB培养液配方：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为7.0；
发酵培养液配方：麦芽糖2.5g/L，玉米粉5g/L，黄豆粉5g/L，胰蛋白胨5g/L，二水氯化钙0.5g/L，一水硫酸锰0.5g/L，磷酸氢二钾1g/L，调节pH值为7.0；
菌体保藏液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，还含有浓度为0.001mol/L的Tween20非离子型表面活性剂。
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