CN1255143A - 控制植物疾病和黄瓜十二星叶甲的芽孢杆菌新型菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及表现杀昆虫、抗真菌和抗细菌活性的产抗生素和产代谢物枯草芽孢杆菌菌株。此新型菌株的上清液有效的杀虫、抗真菌和抗细菌剂。本发明也包含上清液中产生的溶剂可萃取的小分子量(< 10, 000道尔顿)的具黄瓜十二星叶甲活性的代谢物。本发明也包含保护或治疗植物免受真菌和细菌侵染以及黄瓜十二星叶甲侵袭的方法,包括给植物施用有效量的产生抗生素/代谢物的新型枯草芽孢杆菌菌株、由该新型枯草芽孢杆菌菌株产生的抗生素/代谢物或其组合,最好进一步包括另一种产生抗生素的细菌菌株和/或化学杀虫剂。本发明也包括单独使用从新型枯草芽孢杆菌菌株培养物获得的全肉汤培养物或上清液或与化学杀虫剂和/或其它生物防治制剂联合使用预防或治疗真菌和细菌侵染的方法。本发明也包含命名为agrastatin的新型抗真菌和抗细菌化合物以及含A型伊枯草菌素、制磷脂菌素、枯草菌表面活性剂和agrastatin的新型组合物。本发明也提供治疗或保护植物免受真菌和细菌侵染以及黄瓜十二星叶甲侵袭的方法,包括施用新型agrastatin和包含A型伊枯草菌素、制磷脂菌素、枯草菌表面活性剂和agrastatin的新型组合物。

Description

控制植物疾病和黄瓜十二星叶甲的芽孢杆菌新型菌株
发明领域
本发明属于生物杀虫剂领域。更具体地，本发明涉及能够抑制广谱真菌和细菌植物疾病并具有针对黄瓜十二星叶甲的活性的新型枯草芽孢杆菌菌株AQ713的发现。本发明也涉及仅包含此新型芽孢杆菌菌株及由此菌株产生的抗生素和代谢物或与其它化学和生物杀虫剂混合的杀真菌、杀细菌和杀虫组合物。相关申请的相互参考
本发明是1997年5月9日提交的序列号08/853,753的部分继续申请。发明背景
多年来，已知多种微生物具有生物学活性，因此可用于控制植物疾病。尽管在鉴定和发展具有农学和园艺学意义的控制多种植物疾病的生物杀虫剂领域已取得进展，但现在所用的大多数杀虫剂仍然是合成化合物。大多数这些化学杀真菌剂被EPA划分为致癌剂，对野生生物和其它非靶向物种有毒。另外，病原体也可发展出对化学杀虫剂的抗性[见例如，Schwinn等，第244页，植物病理学进展：致病疫霉，马铃薯晚疫病的病因(Academic Press，San Diego 1991)]。
每年250,000,000-300,000,000美元的化学杀虫剂用于控制黄瓜十二星叶甲侵袭。这些化学杀虫剂的多数对人类、野生生物和其它非靶向物种是有毒的。并且某些也在地下水中发现。发展新的化学杀虫剂花费100百万美元。
生物控制提供了对合成化学杀真菌剂有吸引力的替代方法。生物杀虫剂(活的生物和由这些生物天然产生的化合物)更为安全，更容易生物降解并且发展成本更低。
筛选方案已经鉴定了某些表现抗真菌活性的芽孢杆菌种类(芽孢杆菌种类包括枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌)菌株(见例如，Stabb等(1990)应用环境微生物学60：4404-4412)。已证明这些菌株产生对由Phytophthora medicaginis、烟草疫霉、P.aphanidermatum或小核盘菌(见Stabb等，同上)引起的土传猝倒病有效的两种抗生素兼性霉素A和/或Kanosamine[Milner等(1996)，应用环境微生物学，62：3061-3066]。兼性霉素A是水溶性的、酸稳定的线性氨基多元醇分子(见He等(1994)Tetra.Lett.35(16)2499-2502)。
授予Handelsman等的美国专利5,049,379描述了兼性霉素A如何在苜蓿和大豆中对猝倒病起作用。当用蜡状芽孢杆菌ATCC53522包被种子时，根腐真菌的致病活性受到抑制。相似地，将某些蜡状芽孢杆菌菌株的孢子制剂运用于大豆种子或种子周围的土壤在某些田间可提高大豆产量。(见Osburne等(1995)Am.Phytopathol.Soc.79(6)：551-556)。施用生物杀虫剂的方法在本领域众所周知并且包括例如可湿性粉末、dry flowable、有效制剂的微囊化、来自合适培养物的抗生素组分的液体或固体制剂。(见例如，授予Rossall的美国专利5,061,495或授予Handelsman的美国专利5,049,379)。
Smith等(1993)植物疾病77(2)139-142报道了用产生兼性霉素的蜡状芽孢杆菌菌株UW85，可抑制引起Cottony Cucumber Leak的土传真菌Pythium aphanidermatum的活性。Leifert等(1995)应用细菌学杂志78：97-108报道了用两个芽孢杆菌菌株，枯草芽孢杆菌CL27和短小芽孢杆菌CL45制备抗葡萄孢和抗链格孢的抗生素。全肉汤培养物和无细胞滤液在体外测试中对葡萄孢和短小芽孢杆菌有活性，在体内小植物测试中对Astilbe有活性。Leifert等(1997)的美国专利5,597,565公开了枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌在抑制引起收获后疾病的真菌方面特别有效。他们也公开了无细胞培养物滤液中产生的抗生素的存在及它们在不同pH值时的活性，但他们未鉴定这些化合物。
Rossall(1994)的美国专利5,344,647公开了具有广泛抗真菌活性的枯草芽孢杆菌。Sholberg等(1995)Can.J.Microbiol 41：247-252、Swinburne等(1975)Trans.Brit.Mycol.Soc.65：211-217、Singh和Deverall(1984)Trans.Br.Mycol.Soc.83：487-490和Ferreira等(1991)植物病理学81：283-287、Baker等(1983)植物病理学73：1148-1152公开了芽孢杆菌种类和枯草芽孢杆菌作为真菌植物病原体的生物防治剂的用途。Baker等(1983)植物病理学73：1148-1152也报道了将抗真菌的枯草芽孢杆菌用于植物病原体。Pusey等(1988)植物疾病72：622-626；Pusey和Robins(美国专利5,047,239)以及Mckeen等(1986)植物病理学76：136-139公开了用枯草芽孢杆菌控制收获后果腐病。Mckeen等，同上，也表明与低分子量的伊枯草菌素环肽相似的抗生素参与了枯草芽孢杆菌的杀真菌活性。
Liu等(1995)美国专利5,403,583公开了巨大芽孢杆菌，ATCC55000和控制真菌植物病原体立枯丝核菌的方法。Islam和Nandi(1985)植物疾病和保护杂志92(3)：241-246公开了对稻胡麻斑病的致病因子Drechslera oryzae有拮抗作用的巨大芽孢杆菌。相同作者，Islam和Nandi(1985)植物疾病和保护杂志92(3)233-240也公开了巨大芽孢杆菌对Drechslera oryzae、链格孢和粉红镰孢的体外拮抗作用。他们讨论了培养物滤液中的三种成分。活性最强的抗生素在水和甲醇中高度可溶，在255mn处有UV峰，260nm处有肩，证明它是多氧菌素样脂肽。Cook((1987)Proceedings Beltwide CottonProduction-机械化研究会议，Cotton Council，Memphis，第43-45页)公开了用巨大芽孢杆菌的悬浮液降低由棉根腐病的致病因子多主瘤梗孢杀死的棉植株数量。
Berdy记录了巨大芽孢杆菌的抗生素产生[抗生素化合物CRC手册，第I-XIV卷，(CRC出版社公司，Boca Raton，FL 1980-87)]，他报道了低哺乳动物毒性肽抗生素如安丝菌素-PDM-O、巨大杆菌素、巨杆菌素、五肽、homopeptides的制备。
已知芽孢杆菌可产生抗真菌和抗细菌的次生代谢物(Korzybski等(1978))。Wisconsin和cornell大学的研究者已鉴定了由芽孢杆菌种类产生的新型杀真菌化合物兼性霉素A(He等(1994)Tetra.Lett.35(16)：2499-2502)。由相同菌株产生的第二种杀真菌代谢物最近鉴定为已知的氨基糖Kanosamine(Milner等(1996)应用环境微生物学62：3061-3065)。
另一类以前描述的芽孢杆菌代谢物是伊枯草菌素类的环脂肽，其中某些是强有力的杀真菌剂。这些制剂是由具有7个α氨基酸和一个具脂肪族侧链的β氨基酸的环形八肽组成。有几类氨基酸序列顺序和组成不同的伊枯草菌素。它们列于下文表1中。总的来说，一套相关分子的差异在于脂肪族残基的长度和分支。当针对酿酒酵母进行检测时，发现抗霉枯草菌素是活性最强的制剂(LC50＝10μg/ml)，然后是伊枯草菌素A和芽孢霉素L(二者的LC50＝30μg/ml)(Beeson等(1979)抗生素杂志32(8)：828-833)。据报道这些环脂肽的作用方式是由于与真菌膜相互作用产生允许必需离子释放的跨膜通道(Latoud等(1986)Biochem.Biophys.Acta 856：526-535)。伊枯草菌素C对包括产黄青霉的真菌无活性(Peypoux等(1978)Tetrahedron34：1147-1152)。表1  伊枯草菌素家族抗生素的结构
  抗生素   L-Asz(X1)     X4     X5     X6     X7
伊枯草菌素A   L-Asn     L-Gln   L-Pro     D-Asn   L-Ser
伊枯草菌素C   L-Asp     L-Gln   L-Pro     D-Asn   L-Ser
  芽孢霉素D   L-Asn     L-Pro   L-Glu     D-Ser   L-Thr
  芽孢霉素L   L-Asp     L-Ser   L-Gln     D-Ser   L-Thr
  芽孢霉素F   L-Asn     L-Gln   L-Pro     D-Asn   L-Thr
  抗霉枯草菌素   L-Asn     L-Gln   L-Pro     D-Ser   L-Asn
一个USDA的研究小组通过合成许多氨基酸链长度不同的类似物研究了伊枯菌素的结构/活性关系。研究者报道伊枯草菌素活性随着脂肪酸侧链长度和以异＞正常＞反异顺序的末端分支而升高(Bland等(1995)Proc.Plant Growth Regulation Soc.Am.第22版：105-107)。根据他们对多种产生伊枯草菌素的芽孢杆菌菌株的工作，他们也认为“从天然产物获得的伊枯草菌素的量不足以有商业可行性”。
从蜡状芽孢杆菌中分离的另一类环脂肽是制磷脂菌素。这些化合物属于酰化的十肽家族，其结构示于图1(Nishikiori等(1986)抗生素杂志39(6)：755-761)。这些化合物最初是作为猪胰磷脂A2的抑制剂分离的(Umezawa等(1986)抗生素杂志39(6)：737-744)，但后来发现可抑制包括葡萄孢、pyricularia和链格孢的某些植物致病真菌(Yamada等(1990)Nippon Noyaku Gakkaishi 15(1)：95-96)。Yamada也报道了由相同枯草芽孢杆菌菌株产生的伊枯草菌素A和制磷脂菌素之间的协同作用。
已进行了发酵改进方面的工作以提高在液体中(Phae和Shoda(1991)发酵生物工程杂志71：118-121)；Ohno等(1993)发酵生物工程杂志75：463-465)和固态发酵中(Ohno等(1992)Biotech.Lett.14(9)：817-822；Ohno等(1995)发酵生物工程杂志5：517-519)伊枯草菌素的产量。也有报道紧密相关的本身无活性的枯草菌表面活性剂与由相同枯草芽孢杆菌菌株产生的伊枯草菌素之间的协同作用(Hiraoka等(1992)普通应用微生物学杂志38：635-640)。共同调节伊枯草菌素A和枯草菌表面活性剂生物合成的基因的核苷酸序列已经发表(Huang等(1993)发酵生物工程杂志76(6)：445-450)。对产生伊枯草菌素的菌株的田间工作集中于土壤处理以控制丝核菌(Asaka和Shoda(1996)应用环境微生物学62：4081-4085)；没有伊枯草菌素叶田间施用的报道。
由枯草芽孢杆菌产生的另一个具有特别的表面活性剂活性的环脂肽化合物是枯草菌表面活性剂(Kaninuma等(1969)农业生物化学33：973-976)。枯草菌表面活性剂含有通过内酯环与具有LLDLLDL序列的七肽部分连接的C14或C15β-羟脂肪酸(Arima等(1968)生物化学和生物物理研究通讯31：488-494)。Sandrin等((1990)Biotechnol.Appl.Biochem 12：370-375)发现产生枯草菌表面活性剂和伊枯草菌素A、芽孢菌素F和L以及抗霉枯草菌素的枯草芽孢杆菌菌株。
由本发明人发现的新型微生物AQ713原来认为是巨大芽孢杆菌的菌株，现在鉴定为枯草芽孢杆菌，产生A伊枯草菌素、制磷脂菌素、枯草菌表面活性剂。以前未曾报道微生物脂肽此种组合的产生。另外，本发明人也发现AQ713也产生新近描述的称为“agrastatin”的化合物。所有上述三种已知化合物与新型agrastatin的组合也是新的。
一个常用的生物杀虫剂是革兰氏阳性菌苏云金芽孢杆菌。已知杀虫的苏云金芽孢杆菌菌株在孢子形成过程中产生对某些昆虫和线虫的目和种有特异毒性的晶体蛋白(见如美国专利4,999,192和5,208,017)。由苏云金芽孢杆菌产生的蛋白内毒素也可作为针对黄瓜十二星叶甲和其它甲虫的杀虫剂(如美国专利5,187,091；Johnson，T.J.等(1993)，经济昆虫学杂志86：330-333)。已证明苏云金芽孢杆菌内毒素作为纯化晶体、洗涤的细胞沉淀和表达的蛋白有效。Warren等(WO96/10083)公开了在蜡状芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的营养阶段产生的非内毒素蛋白。这些称为Vip1和vip2的营养蛋白对黄瓜十二星叶甲有很强的活性(northern和western)(Estruch等(1997)，自然生物技术15：137-141和Mullins等(1997)，应用环境微生物学63(印刷中)。
已证明一种称为β外毒素的苏云金芽孢杆菌热稳定代谢物具有杀虫特性。Burgjeron和Biache(1979)Entomophaga 11：279-284报道了对马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata)有活性的β外毒素。另外，已知的苏云金芽孢杆菌β外毒素表现非特异性的杀虫活性，不仅杀死线虫，也杀死蝇、粘虫、螨和黄瓜十二星叶甲。δ外毒素与β外毒素结构相似，对马铃薯叶甲有活性(Agrauer等(1991)J.EntomolSci.26：206-213)。α外毒素对Musca Domestica的幼虫有毒性(Cluthy(1980)FEMS Microbiol.Lett.8：1-7)。γ外毒素是多种蛋白水解酶、壳多糖酶和蛋白酶。γ外毒素的毒性作用只有与β外毒素或δ内毒素联合才得以表现。Forsberg等(1976)“苏云金芽孢杆菌：其在环境质量中的作用，”National Research Council ofCanada。Stonard等(1994)ACS Symposium Series 551：25报道了在蜡状芽孢杆菌菌株上清液中对黄瓜十二星叶甲有活性的水溶性次生代谢物。
未见有关具有杀真菌和黄瓜十二星叶甲活性的芽孢杆菌菌株的记载。也没有已知的由枯草芽孢杆菌产生的小于10,000分子量的可在非极性溶剂中萃取的代谢物。发明内容
本发明提供原先鉴定为巨大芽孢杆菌的新型产抗生素和产代谢物枯草芽孢杆菌菌株，也表现广泛的杀真菌和杀细菌活性并且表现黄瓜十二星叶甲活性。本发明也提供了来自此新型枯草芽孢杆菌的对黄瓜十二星叶甲有活性的新型代谢物。本发明也提供了治疗或保护植物免受真菌和细菌侵染的方法，包括施用有效量的产抗生素枯草芽孢杆菌的步骤。产抗生素枯草芽孢杆菌可作为全肉汤培养物中的悬浮液或作为从产抗生素芽孢杆菌菌株的全肉汤培养物得到的含抗生素的上清液提供。本发明也提供治疗或保护植物根免受黄瓜十二星叶甲侵袭的方法，包括施用有效量的新型产代谢物枯草芽孢杆菌的步骤。此新型产代谢物枯草芽孢杆菌可作为全肉汤培养物中的悬浮液或作为从此微生物的全肉汤培养物得到的含代谢物的上清液或纯化的代谢物提供。本发明也提供了由新型菌株AQ713产生的新型化合物agrastatin或含伊枯草菌素A、制磷脂菌素、枯草菌表面活性剂和agrastatin的化合物新型组合。附图简述
图1表示制磷脂菌素抗生素的结构。
图2表示AQ713代谢物的HPLC层析谱。实施本发明的模式
本发明提供了原先鉴定为巨大芽孢杆菌具有广泛抗真菌和抗细菌活性的新型枯草芽孢杆菌菌株AQ713或其突变体及抗真菌和抗黄瓜十二星叶甲活性的新型联合。此新型菌株命名为AQ713并且为专利程序的目的在Budapest条约关于微生物保藏国际认可的规定下于1997年3月7日以注册号B21661贮存于NRRL。本发明也包括用这样的细菌菌株或从这样的细菌菌株中获得的含抗生素的上清液或纯抗生素预防或治疗植物真菌和细菌疾病的方法。本发明也包括用AQ713的细菌悬浮液或含代谢物的AQ713培养物的上清液或来自AQ713菌株的纯化代谢物处理植物根或土壤以控制黄瓜十二星叶甲幼虫的方法。本发明也包括溶剂可萃取的对黄瓜十二星叶甲有活性的分子量小于10,000道尔顿的代谢物。本发明进一步包括由此新型微生物产生的新型化合物agrastatin。本发明也包括含A型伊枯草菌素、制磷脂菌素、枯草菌表面活性剂和agrastatin的新型组合物。定义
如此处所用的，“生物防治”定义为用第二种生物控制病原体或昆虫。已知的生物防治机制包括通过与真菌竞争根表面空间控制根腐病的肠细菌。细菌毒素如抗生素已用于控制病原体。可分离毒素并将其直接用于植物或施用细菌物种使其原位产生毒素。
术语“真菌(单数)”或“真菌(复数)”包括多种无叶绿素的具核的产生孢子的生物。真菌的例子包括酵母、霉菌、霉、锈菌和蘑茹。
术语“细菌”包括不具有明显核的任何原核生物。
“杀真菌的”指物质提高真菌死亡率或抑制真菌生长的能力。
“抗生素”包括任何能够杀死或抑制微生物的物质。可由微生物或通过合成方法或半合成方法产生抗生素。因此，这个术语包括抑制或杀死真菌的物质，例如兼性霉素A或Kanosamine。
“抗真菌”包括任何能够杀死或抑制真菌生长的物质。
术语“培养”指生物在各种培养基上或各种培养基中的繁殖。“全肉汤培养物”指包括细胞和培养基的液体培养物。“上清液”指当细胞通过离心、过滤、沉降或其它本领域熟知的方法去除时剩余的液体培养液。
“有效量”是足以获得有益或希望结果的量。有效量可以一次或多次给药施用。就治疗和保护而言，“有效量”指足以减轻、稳定、逆转、减缓或延迟真菌或细菌疾病状态的量。
如此处所用的，术语“昆虫”包括“昆虫纲”中的所有生物。“成年前的”昆虫指成年状态前生物的任何形式，包括例如卵、幼虫和若虫。“杀昆虫的”指物质提高昆虫死亡率或抑制其生长的能力。“杀线虫”指物质提高线虫死亡率或抑制其生长的能力。“杀虫”指物质提高昆虫、线虫和螨死亡率或抑制其生长的能力。
“阳性对照”指已知具有杀虫活性的化合物。“阳性对照”包括但不限于商业上可得到的化学杀虫剂。术语“阴性对照”指已知无杀虫活性的化合物。阴性对照的例子是水或乙酸乙酯。
术语“溶剂”包括在溶液中保留另一种物质的液体。“溶剂可萃取的”指在溶剂中溶解的，然后可从溶剂中分离的任何化合物。溶剂的例子包括但不限于诸如乙酸乙酯的有机溶剂。
术语“代谢物”指任何具有杀虫活性的化合物、物质或微生物发酵的副产品。如上文定义的抗生素是对微生物特异性地有活性的代谢物。
术语“agrastatin”指具有下列结构的一组新型化合物：
Figure A9880495300131
其中R1是支链或直链脂肪族侧链C8-C20；X是Ala或Val；R2是乙酸或酯衍生物；并且Glx是Gln或Glu。这些化合物具有抗细菌和抗真菌活性以及抗黄瓜十二星叶甲活性。
我们描述了原先鉴定为巨大芽孢杆菌的具有广泛抗真菌和抗细菌活性并且也杀死或抑制黄瓜十二星叶甲幼虫的产生代谢物和抗生素的新型枯草芽孢杆菌菌株。另一方面，本发明提供治疗或保护植物免受真菌和细菌侵染的方法，包括施用有效量的从本发明的枯草芽孢杆菌AQ713的全肉汤培养物获得的上清液。上清液可通过本领域熟知的方法包括离心、过滤、沉降等获得。
另一方面，本发明包含治疗或保护植物免受真菌和细菌侵染的方法，包括施用有效量的新型枯草芽孢杆菌菌株的全肉汤培养物。
另一方面，本发明包含治疗或保护植物免受真菌和细菌疾病侵染的方法，包括施用有效量的由新型枯草芽孢杆菌菌株产生的抗生素。
另一方面，本发明提供治疗或保护植物根免受黄瓜十二星叶甲侵袭的方法，包括施用有效量的从本发明的枯草芽孢杆菌AQ713的全肉汤培养物获得的上清液。上清液可通过本领域熟知的方法包括离心、过滤、沉降等获得。
另一方面，本发明包含治疗或保护植物免受黄瓜十二星叶甲侵袭的方法，包括施用有效量的新型枯草芽孢杆菌菌株的全肉汤培养物。
另一方面，本发明包含治疗或保护植物根免受黄瓜十二星叶甲侵袭的方法，包括施用有效量的由新型枯草芽孢杆菌菌株产生的代谢物。
为了获得本发明组合物的良好分散和附着，用有助于分散和粘附的成分配制全肉汤培养物、上清液和/或代谢物/抗生素是有益的。适当配方对于本领域技术人员是已知的。
本发明的组合物可配制成可湿性粉末、颗粒等，或在合适的介质中胶囊化等，其它制剂的例子包括但不限于可溶性粉末、可湿性颗粒、dry flowables、aqueous flowable、可湿性可分散的颗粒、可乳化的浓缩液和水悬浮液。其它适当制剂为本领域技术人员熟知。
在本发明的另一方面中，提供了一组命名为“agrastatin”的新型化合物。这些化合物表现出抗真菌和抗细菌活性以及抗黄瓜十二星叶甲活性。
在本发明的另一方面中，提供了含有A型伊枯草菌素、制磷脂菌素、枯草菌表面活性剂和agrastatin的新型组合。
在本发明的另一方面中，提供了治疗或保护植物免受真菌和细菌疾病侵染的方法，包括施用有效量的含有A型伊枯草菌素、制磷脂菌素、枯草菌表面活性剂和agrastatin的化合物新型组合。
在此引用的所有专利和公开文献作为整体引用作为参考。提供下面的实施例详细说明本发明。这些实施例不构成限制。实施例实施例1 AQ713菌株的特征
根据Bochner(1989)自然339：157-158中描述的以利用Biolog微量培养板系列(Biolog，Inc，Hayward，CA)为基础鉴定分离物。Biolog微量培养板由用对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌有用的95种不同碳底物板的预先填充和干燥的系列孔组成。分离物于28℃在液体培养基中生长，24小时后将洗涤的细胞悬浮液(0.85％盐溶液)接种在GPMicroplate(Biolog，Inc.)的每个系列孔中。在28℃经过24小时后，评估碳利用反应。将底物利用模式与Biolog革兰氏阳性数据库(release 3.50)比较并根据最近似物种分离。Biolog结果得出与巨大芽孢杆菌的相似性指数为0.883。
由美国典型培养物保藏中心，Rockyille，Md对AQ713进行更为广泛的鉴定。送交的分离物为：未知；菌株AQ713分离物鉴定为：根据可得到的生理和生化数据，此菌株与枯草芽孢杆菌最近似。细胞形态：发现游动细胞为单个的，具有在中间或近端区形成的一个内生孢子。细胞为革兰氏阳性均匀染色。菌落形态：菌落是不透明和不规则的，有凸形隆起、粗糙暗淡表面和锯齿形边缘。AQ713的特征数据：
杆 + 菌落不透明 +
杆直 + 菌落边缘光滑 -
杆弯曲 - 菌落锯齿形 +
细胞单个 + 菌落裂片形 -
细胞链 - 菌落圆形 -
末端尖形 - 菌落不规则 +
末端圆形 + 菌落根状 -
末端方形 - 菌落低凸起 +
内生孢子形成 + 菌落高凸起 -
孢子囊膨大 - 菌落扁平 -
一个孢子/细胞 + 菌落隆起 -
孢子圆形 - 菌落闪光 -
孢子圆柱状 + 菌落暗淡 +
孢子卵形 + 菌落干燥 -
孢子中间 + 菌落平滑 -
孢子末端 - 菌落粗糙 +
孢子近末端 + 可溶性棕色色素 -
革兰氏染色 + 可溶性黑色色素 -
革兰氏阳性 + 可溶性黄色色素 -
革兰氏阴性 - 不溶性棕色色素 -
革兰氏可变 - 不溶性黑色色素 -
液泡存在 - 不溶性黄色色素 -
菌落半透明 - 不溶性桔黄色色素 -
菌落透明 - 不溶性红色色素 -
细胞游动 + 乳糖产酸 -
在15℃生长 + 乳糖产气 -
在20℃生长 + 甘露醇产酸 -
在26℃生长 + 甘露醇产气 -
在30℃生长 + 甘露糖产酸 -
在37℃生长 + 甘露糖产气 -
在45℃生长 + 蔗糖产酸 弱
在50℃生长 弱 酸延迟＞14天 弱
在55℃生长 - 蔗糖产气 -
在60℃生长 - 海藻糖产酸 -
在65℃生长 - 海藻糖产气 -
过氧化氢酶 + 木糖产酸 -
氧化酶 + 木糖产气 -
酪蛋白水解 + 需氧菌 -
明胶液化 + 兼性 -
马尿酸盐水解 - 微需氧细菌 +
卵磷酯酶降解 - 厌氧菌 -
淀粉水解 + 密闭硝酸盐产气 -
Tween 80水解 + 密闭葡萄糖产气 -
酪氨酸分解 - 吲哚 -
在2％NaCl中生长 + 硝酸盐转变成亚硝酸盐 +
在5％NaCl中生长 + 硝酸酸转变成气体 -
在7％NaCl中生长 + 亚甲蓝还原 +
在10％NaCl中生长 + 亚甲蓝再氧化 -
在0.2％叠氮钠中生长 V 石蕊牛奶酸 -
在pH4.5中生长 + 石蕊牛奶凝结 -
在pH6.0中生长 + 石蕊牛奶碱 +
阿拉伯糖产酸 - 石蕊牛奶还原 +
阿拉伯糖产气 - 石蕊牛奶胨化 +
纤维二糖产酸 弱 VP(5198)阳性 +
酸延迟＞14天 弱 VP(5331)阳性 +
纤维二糖产气 - pH VP5198 6.0或更低 -
果糖产酸 + pH VP5198 6.5-7.5 +
酸延迟＞14天 - pH VP5198 8.0或更高 -
果糖产气 + 柠檬酸利用 +
葡萄糖产酸 + 丙酸盐利用 -
酸延迟＞14天 - 丙酸盐利用 -
葡萄糖产气 -
意见：根据可得到的生理和生物化学数据，此菌株与枯草芽孢杆菌最近似。主要特征结果
  特征鉴定测试   菌株AQ713   枯草芽孢杆菌
  膨胀大的孢子囊     -     -
    厌氧生长     微需氧     微需氧
    VP反应     +     +
    VP的pH     7.0     5.0-8.0
    最高生长温度     55℃     45-55℃
    7％NaCl生长     +     +
    葡萄糖产酸     +     +
    阿拉伯糖产酸     -     +
    木糖产酸     -     +
    甘露醇产酸     -     +
    酪蛋白分解     +     +
    酪氨酸分降     -     -
    柠檬酸利用     +     +
    丙酸盐利用     -     -
参考：Gordon，R.E.，W.C.Haynes和C.H.IV.Pang，1973，芽孢杆菌属，美国农业部427号手册，Washington C.C.。实施例2 AQ713针对黄瓜十二星叶甲的活性
在芽孢杆菌培养基中培养芽孢杆菌样品。培养基2含5％蛋白胨、5％葡萄糖、3％酵母提取物、3％麦芽提取物、1.5％Proflo棉花种子提取物(59％蛋白、4.26％脂肪、6.73％灰分、3.19％纤维和微量棉子酚；用水平衡)、10％大豆粉和0.5％MgSO4×7H2O。培养基3含相同的成分，除了含20％蛋白胨和3.4％KH2PO4和4.3％K2HPO4。生长一天的划线培养物用于接种250ml带挡板的摇瓶。于29℃以200rpm摇动摇瓶5天。为了测定杀昆虫活性，以5,200rpm离心35ml肉汤培养物20分钟；上清用于下文所述的微量测定。
在96孔微量培养板上进行测定。每个孔中含固体琼脂基质、检测生物和阳性对照或阴性对照或按照实施例1所述获得的新型芽孢杆菌菌株的上清液。
为了测定杀虫活性，根据Marrone等(1985)经济昆虫学杂志78：290-293制备用于微量培养板孔的琼脂基质。为分析杀线虫活性，普通琼脂(1.5％)用在孔中代替。
用1ppm的Avid(除虫菌素)溶液作为阳性对照。用去离子水作为阴性对照。每个分析中测试样品或对照两份。将在培养基1、2或3中培养的40μl上清液样品或全培养物分装在每个样品孔中。将平板放在通风厨中干燥约2-3小时直到琼脂溶液干燥。
测试生物是成年前的黄瓜十二星叶甲(DiabrotcaUndecimpunctata)、成年前的German蟑螂(Blatella germanica)、成年前的粘虫(Spodoptera exigua)、成年前的蝇(Drosophilamelanogaster)或线虫Caenorhabditis elegans的N2株。将检测生物稀释于0.1％琼脂中至浓度为每25μl分装在每孔的琼脂中含5个生物。用不透气物质如Mylar密封微量培养板并且用针式型压力器对每个孔通气。平板于27℃培养最多7天。
培养后，通过观察线虫死亡率或幼虫发育程度记录孔情况。对含全部死亡或生长障碍幼虫的样品孔给出分数1，对含某些死亡和其它严重生长障碍幼虫的样品孔给出分数2，对含存活但生长障碍幼虫的孔给出分数3，对不含死幼虫的样品孔给出分数4，每个样品内计算重复实验的平均数。结果总结于表2和3。表2：AQ713全肉汤培养物针对昆虫害虫的分数评估
C.elegans  黄瓜十二星叶甲  甜菜粘虫    果蝇    阳性对照    阴性对照
培养基2培养基3  NT        1.0             4.0         4.0     1.0         4.0NT        2.0             4.0         4.0     1.0         4.0
NT＝未检测表3：AQ713上清液针对昆虫害虫的分数评估
C.elegans  黄瓜十二星叶甲  甜菜粘虫  果蝇  德国蟑螂  阳性对照  阴性对照
培养基2培养基3  4.0        3.0            4.0       4.0    4.0      1.0       4.04.0        4.0            4.0       4.0    4.0      1.0       4.0
这些实验表明AQ713在两种培养基中作为全肉汤培养物都有活性，在培养基2中活性最高。只有AQ713在培养基2中生长时上清液才有活性。实施例3对黄瓜十二星叶甲有活性的AQ713代谢物的化学特性
在培养基2中培养50ml AQ713。向每一培养物添加50ml乙酸乙酯，混合物在分开的漏斗中摇动2分钟。移去水层，将有机层收集在含有硫酸镁的瓶中。然后将有机滤液过滤到圆底烧瓶中，将溶剂移到rotovap上。
为了进行生物测定，将干燥的有机提取物重新溶解在2.5ml丙酮中。取出40μl等分试样，以70％丙酮/水稀释至800μl。这是有机提取物的10x浓缩液。进行系列稀释以获得作用于新生黄瓜十二星叶甲的样品和7天后记录的新生幼虫(根据上文制备的微量培养板中每孔为1)死亡百分率。结果记录在表4中。表4：AQ713乙酸乙酯提取物对黄瓜十二星叶甲的活性
          样品   死亡百分率
    AQ713：    有机提取物10X有机提取物5X有机提取物1X全肉汤培养物70％丙酮/水水     8993651002759
这些结果表明AQ713产生杀死黄瓜十二星叶甲的溶剂可萃取的代谢物。
为了测定活性代谢物的分子量，50ml AQ713培养物在培养基2中生长。将1ml放在微量离心管中并以12,000rpm离心15分钟。回收上清液。将500微升上清液放在10,000道尔顿分子量Centricon滤纸上面。根据厂商说明(12,000rpm，35分钟)离心。收集滤液，通过离心和洗涤滤纸回收存留物。测定样品上清液、滤液和存留物对新生黄瓜十二星叶甲幼虫(含昆虫食物的96孔板，Marrone等，见上文；每孔40μl样品，每个样品8个孔，1只幼虫/孔)的活性。实验结果示于表5。表5：AQ713截流物的分子量
    死亡百分数针对黄瓜十二星叶甲
    AQ713：     上清液    43滤液      63存留物    17
这些结果表明上清液和滤液有活性，因此代谢物的分子量小于10,000道尔顿。实施例4对植物病原体有活性的AQ713代谢物的化学特性
在培养基2中培养50ml AQ713。向每一培养物添加50ml乙酸乙酯，混合物在分开漏斗中摇动2分钟。移去水层，将有机层收集在含有硫酸镁的瓶中。然后将有机滤液过滤到圆底烧瓶中，将溶剂移到rotovap上。
为了进行生物测定，将干燥的有机提取物重新溶解在2.5ml丙酮中。取出40μl等分试样，以70％丙酮/水稀释至800μl。这是有机提取物的10X浓缩液。用终极腐霉和灰葡萄孢进行96孔板植物病原体分析(下述)以测定有机提取物的活性。全肉汤培养物为100％控制(记数1)，但10X有机提取物得到对此两种植物病原体的控制(记数4)。这表明活性抗生素，与AQ713产生的有黄瓜十二星叶甲活性的代谢物不同，在诸如乙酸乙酸的有剂溶剂中是不可萃取的。
本发明提供新型化合物agrastatin A的分离的进一步测试。通过首先用等体积的乙酸乙酯抽提肉汤培养物两次并分层来制备发酵肉汤培养物的丁醇提取物。然后用等体积的丁醇抽提水组分两次。合并丁醇提取物，用旋转蒸发器去除溶剂。冷冻干燥得到的提取物获得粉末。
将粉末溶解在80％乙腈/水溶液中并进行超声处理。将此溶液上样到用甲醇活化并用80％乙腈/水溶液平衡的C-18固相提取(SPE)柱体上。用80％ACN/水洗脱SPE柱体，收集洗脱液并去除溶剂。用HPLC进一步纯化洗脱液。采用具有如下乙腈+0.05％TFA/水+0.05％TFA溶剂梯度的C-18 HPLC柱(1cm×25cm)(210nm处紫外测定)：0-20分钟，33％ACN；20-30分钟，40％ACN；30-45分钟，45-55％ACN；以及45-63分钟，55％ACN。
AQ713的HPLC层析谱表明了伊枯草菌素、伊枯草菌素样化合物(制磷脂菌素和agrastatin)及枯草菌表面活性剂的存在，见图1。结合NMR数据和LC质谱学数据鉴定伊枯草菌素A2、A3、A4、A7和A6并与文献中的数值比较。通过用HPLC和LC质谱学与购买的枯草菌表面活性剂标准比较鉴定枯草菌表面活性剂。
经氨基酸分析和LC质谱学结合鉴定伊枯草菌素样化合物是制磷脂菌素和新型agrastatin的混合物。也收集了命名为agrastatin A的新型化合物之一(HPLC峰20)的广泛NMR数据。发现agrastatin A含下列氨基酸；Thr；3 Glu；Ala；Val；2 Tyr和Orn。Val的存在和Ile的缺失使它与制磷脂菌素不同。据测定agrastatin A的分子量为1448，与如下结构一致：
Figure A9880495300231
1H NMR证实了脂肪酸部分的直链性质。通过详细的TOCSY和ROESY数据分析鉴定环肽中氨基酸的位置。
Agrastatin B(HPLC峰26)的质谱学和氨基酸分析表明其结构与制磷脂菌素B2相似，但Val替换了Ala残基。结构如下所示：实施例5体外培养物(96孔板)中AQ713针对植物病原体的活性
为测定AQ713是否对真菌致病疫霉、终极腐霉、灰葡萄孢、立枯丝核菌、Alternaria Solani有效，进行下列实验。用琼脂培养基(土豆葡萄糖琼脂(PDA，Difco)填充96孔板(平底，每孔400微升，Nuncbrand)。在液体YPG-1培养基(0.4g酵母、0.1％KH2PO4、0.5％MgSO4×7H2O、1.5％葡萄糖)中培养致病疫霉培养物3天。对于其它真菌来说，从培养皿表面刮下孢子，将0.1-0.2ml去离子水等分试样和病原体的孢子悬浮液(浓度约为2×106孢子/ml)涂在琼脂上。
如实施例2所述，在培养基2或3中培养AQ713 72小时。以5,200rpm离心全肉汤培养物20分钟以获得上清液。将真菌植物病原体吸到96孔板中(8孔/病原体)。记录每8个孔中真菌生长的有无。向每孔中加入约40μl AQ713上清液或20μl全肉汤培养物。“1”表示真菌生长的完全抑制。“4”表示没有真菌生长的抑制。结果示于表6。表6：真菌生长的体外抑制(96孔板)AQ713上清液           培养基2          培养基3
                  记数             记数致病疫霉               1                1终极腐霉               1                1灰葡萄孢               1                1立枯丝核菌             4                1Alternaria solani      1                1AQ713整个肉汤Colletotrichum cocodes 1                NTAlternaria             1                NTbrassicicola灰葡萄孢               1                NT瓜枝孢                 1                NTMonilinia fructicola   1                NT梨黑星菌               1                NT立枯丝核菌             1                NTAlternaria solani      1                NTNT：未测试
结果表明AQ713具有广泛的体外杀真菌范围而且全肉汤培养物和上清液活性都很高。在培养基3中而不是在培养基2中的上清液对立枯丝核菌有活性。实施例6  体外培养物中AQ713针对植物病原体的活性(区域分析)
为了测定AQ713在琼脂扩散(区域)分析中的活性，将植物病原体孢子涂布在10cm培养皿的土豆葡萄糖脂表面。从琼脂上去掉7.0mm的孔并将100μl在培养基2中生长的AQ713上清液放在孔中。通过以4200rpm离心40分钟制备上清液。将上清液以4200rpm再离心40分钟。典型的结果为在孔的周围无病原体生长的区域和/或病原体生长降低的区域。以毫米测量并记录区域大小。结果示于表7。表7.真菌植物病原体生长的体外抑制(区域实验)
    Alternariabrassicicola     灰葡萄孢     Moniliniafructicola
区域大小(mm) AQ713上清液     16     23     14
AQ713全肉汤培养物     22     15     18
实施例7  AQ713针对细菌植物病原体的活性
如实施例6建立标准的琼脂扩散实验。将每种细菌病原体的菌苔涂布在培养皿的表面。在每个孔中放入100μl在培养基2中生长的AQ713全肉汤培养物。以厘米测量区域的大小。表8.细菌植物病原体的体外抑制(区域实验)AQ713全肉汤培养物：                      抑制区域(mm)燕麦食酸菌西瓜亚种                        18丁香假单胞菌蕃茄致病变种                  11野油菜黄单胞菌野油菜致病变种              18胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种          11密执安棍状杆菌密执安亚种                  22AQ713对所有体外测试的细菌植物病原体都有活性。实施例8  植物测试中AQ713针对植物病原体的活性
测试了AQ713在菜豆和geranium叶上针对灰霉病(灰葡萄孢)的活性，在蕃茄幼苗针对Alternaria Solani的活性以及针对莴苣霜霉病(Bremia Lactucae)的活性。
对于A.Solani而言，用AQ713全肉汤培养物(培养基2)喷洒种在6盆中的2-3叶阶段蕃茄幼苗至流出。喷洒后，令幼苗干燥(约1.5小时)。然后用5.0×104孢子/ml喷洒幼苗。用塑料圆顶覆盖幼苗并在Percival培养箱中于28℃放置。无AQ713、有和无病原体孢子的水作为阴性对照和阳性病原体对照。四天后读取测试结果。在A.Solani水对照上，整个叶片上有均匀损伤，子叶脱离并受到严重侵染(5级＝完全侵染，无控制)。AQ713处理的植物在真叶上散布着几处轻微损伤。子叶连接但有一些小的损伤(1级)。阴性对照未受侵染。
用放在装有水并在圆顶下的瓶中并按上述放置的脱离的蕃茄幼苗(茎从地面处折断)进行第二次测试。如上所述喷洒植物，四天后记录A.solani的症状。阴性对照上没有症状。在阳性对照上，幼苗上遍布均匀的损伤。对AQ713处理评为1级(很少或没有损伤)。两天后，阳性对照中的植物遭到破坏，而经AQ713处理的幼苗是基本上干净的，与阴性对照(水喷洒的植物)看上去相同。
对于针对灰葡萄孢的测试，通过用13×100培养管的口挤压每个叶片损伤菜豆的第一片真叶。每个叶片受到两次损伤/叶。用AQ713全肉汤培养物(培养基2)或仅用水或仅用病原体喷洒叶片。当干燥时，再用灰葡萄孢孢子(0.8×106孢子/ml)喷洒。将叶片放在覆盖有塑料圆顶的平板上，在Percival培养箱中于18-20℃放置。五天后，阳性对照(仅用病原体处理)在直径约25mm的区域内腐烂。阴性对照(仅用水处理)没有腐烂。AQ713在叶受损伤的8个圆圈中7个没有侵染。受到侵染的圆圈周围的两个位置有轻微侵染。
对于盘梗霉测试，将莴苣种子种植在8厘米高和宽的小塑料植物condominium中的含有泥碳、perlite和蛭石的灭菌potting mix层中。莴苣发芽后(一星期)，用AQ713肉汤培养物或上清液样品喷洒莴苣幼苗。令植物干燥，然后将从受侵染的莴苣幼苗中得到的霜霉孢子喷洒到幼苗上。将塑料覆盖物放在植物上并在Percival培养箱中于18-20℃培养。一星期后，评估测试。AQ713不能阻止由盘梗霉引起的莴苣幼苗霜霉病。实施例9  AQ713针对植物疾病的效力(温室测试)葡萄霜霉病
AQ713在400L发酵罐中的以大豆为基础的培养基中生长48小时。用手提式喷雾器将用无菌水稀释成0.5X和0.25X浓度的400L发酵物的整个肉汤喷洒葡萄(栽培品种Chardonnay)至流出。当叶干燥时，第二次喷洒植物。干燥后，用引起葡萄霜霉病的病原体Plasmoparaviticola接种植物。基于0至100％控制的等级估计疾病控制百分率，从而评估每株植物。100％对照是没有可见损伤的植物。化学杀真菌剂丙氨灵作为比较。结果如下：
AQ713 0.5X全肉汤培养物       97.7％对照
AQ713 0.25X全肉汤培养物      100％对照
丙氨灵30ppm                  100％对照
丙氨灵10ppm                  98.3％对照
丙氨灵1ppm                   80％对照结果显示AQ713与化学杀真菌剂同样有效地控制葡萄霜霉病。实施例10 AQ713针对南瓜白粉病的效力
AQ713在400L发酵罐中的以大豆为基础的培养基中生长48小时。用手提式喷雾器将用无菌水稀释成0.5X和0.25X浓度的400L发酵物的全肉汤培养物喷洒南瓜(Crookneck和Acorn)至流出。干燥后，用南瓜白粉病病原体单丝壳接种植物。每一剂量处理两株植物。喷洒全肉汤培养物干燥的粉末进行测试。喷洒400L发酵肉汤培养物并干燥以去除水分。如上所述，将10％和2.5％喷洒干粉溶液喷洒到植物上至流出。以从0至5的评分对白粉病的发病进行评估。5级是100％疾病而0级为无疾病。结果示于下面表9中。
                                 表9
检测的悬浮液 Acorn南瓜植物1 Acorn南瓜植物2 Crookneck南瓜植物1 Crookneck南瓜植物2
AQ713 IX全肉汤培养物     0     0     0     0
AQ713 0.5X全肉汤培养物     0     0     0     0
AQ713 10％喷洒干粉     0     0     0     0
AQ713 2.5％喷洒干粉     0     0     0.5     1
AQ713全肉汤培养物和喷洒干粉提供几乎完全的南瓜白粉病控制。实施例11  温室中AQ713针对晚疫病、灰霉病、葡萄白粉病、谷物白粉病、sheath blight和稻瘟病的效力
AQ713在250ml摇瓶中的以大豆为基础的培养基中生长72小时。疾病、致病病原体和宿主列在下面表10中。全肉汤培养物在下文表11中所示的植物上进行检测。
                            表10
    疾病     植物病原体     宿主
    晚疫病     致病疫霉     蕃茄
    灰霉病     灰葡萄孢     胡椒
Sheath Blight     立枯丝核菌     水稻
    稻瘟病     Pyricularia oryzae     水稻
    白粉病     Uncinula necator     葡萄
    白粉病     Drysihe graminis f.种类graminis     小麦
用手提式喷雾器将每种肉汤以1X浓度喷洒至检测植物上，使其干燥，然后再喷洒一次。每种疾病和处理有三株植物受到处理。干燥后，用病原体接种植物。基于0至100％控制的等级估价疾病控制百分率，从而评估每株植物。100％对照是指没有可见损伤的植物。化学杀真菌剂作为比较。疾病指数是未经处理对照疾病的严重性。
                                       表11
致病疫霉 灰葡萄孢 E.graminis U.necator P.oryzae 立枯丝核菌
AQ713 70 100 84 100 100 100
丙氨灵30ppm 100
丙氨灵10ppm 77
丙环唑10ppm 87
丙环唑5ppm 57
丙环唑0.5ppm 100
丙环唑0.2ppm 54
腈菌唑30ppm 100
腈菌唑10ppm 100
戊菌隆50ppm 100
戊菌隆10ppm 100
苯菌灵10ppm 100
苯菌灵40ppm 77
疾病指数％ 80 95 70 50 60 80
AQ713针对所有检测的病原体表现与化学杀真菌剂相当的活性。实施例12   AQ713针对Brassica霜霉病的效力
芽孢杆菌菌株AQ713在10L发酵罐中的以大豆为基础的培养基中生长48小时。用以压缩空气推动的艺术家毛刷将1X强度的全肉汤培养物喷洒在三周龄的花椰菜上。每种处理喷洒15-25个幼苗/盆的三份。也以250ppm和125ppm的比率将来自Zeneca的azoxystrobin杀真菌剂QuadrisTM喷洒在植物上(每种处理三株)。在AQ713和Quadris喷洒物干燥后将霜霉Peronospora parasitica的孢子悬浮液以1-5×104孢子/ml喷洒在Brassica植物上。将植物于15-17℃放置24小时进行侵染，然后将幼苗于20-24℃培养6天。将盆放回到15-17℃过夜以使病原体的孢子形成，直到对测试进行分级。基于0至100％的等级估价疾病控制百分率，从而评估每株植物。100％对照指没有孢子形成损伤的植物。在重复花盆之间得到的平均结果示于下面的表12。表12
  12月23日得到的读数     12月30日得到的读数   1月6日得到的读数
NT713全肉汤培养物     100     90     75
Quadris 250ppm     100     NT     NT
Quadris 125ppm     NT     100     100
    水对照     0     0     0
NT＝未测试AQ713控制的霜霉可持续三周。实施例13  AQ713和商业化杀真菌剂的协同作用
AQ713在10L发酵罐中的以大豆为基础的培养基中生长72小时。用无菌水将细菌培养物稀释为0.5X和0.25X浓度。用以压缩空气推动的艺术家毛刷将1X、0.5X和0.25X浓度的培养物喷洒到三周龄的胡椒上。每种处理喷洒三株植物。将来自Zeneca的azoxystrobin杀真菌剂QuadrisTM以500ppm、250ppm和125ppm的浓度喷洒在植物上(每种处理三株)。另外，将Quadris加AQ713全肉汤培养物以1∶1比率的组合喷洒在胡椒植物上(每种处理三株)。含和不含Quadris的处理列于下文表13中。在AQ713和Quadris喷洒物干燥后，将灰葡萄孢、灰霉以1×106孢子/ml的孢子悬浮液喷洒在胡椒上。将植物在20-22℃放置3天，然后对测试进行分级。灰霉病的发病率以0至5分级。5级表示100％疾病而0级表示没有疾病。结果示于下面表13。表13
处理 分级重复1 分级重复2 分级重复3 分级平均值
AQ713 IX 0.5 0.5 1.5 0.8
AQ713 0.5X 2.0 2.5 2.0 2.2
AQ713 0.25X 3.0 3.0 2.0 2.7
Quadris 500ppm 4.0 3.5 4.0 3.8
Quadris 250ppm 2.5 3.5 3.0 3.0
AQ713 1X+Quardis 500ppm 0.5 1.0 1.0 0.8
AQ713 1X+Quadris 250ppm 1.0 1.0 0.5 0.8
AQ713 0.5X+Quadris 250ppm 0.5 1.0 1.0 0.8
AQ713 0.25X+Quadris 250ppm 0.5 1.0 2.5 1.3
水对照 4.0 5.0 5.0 4.7
水对照 5.0 5.0 5.0 5.0
结果清楚地表明Quadris和AQ713的结合比单独使用Quadris或AQ713更显著地控制灰霉病。

Claims (32)

1.枯草芽孢杆菌菌株AQ713，NRRL注册号B21661及其突变体的分离的纯培养物。
2.一种由权利要求1的枯草芽孢杆菌菌株产生的代谢物，表现针对黄瓜十二星叶甲的活性，是溶剂可萃取的并且具有小于10,000道尔顿的分子量。
3.一种从权利要求1的枯草芽孢杆菌菌株AQ713培养物获得的上清液，具有抗真菌和抗细菌活性和抗黄瓜十二星叶甲的活性。
4.含有权利要求1的枯草芽孢杆菌菌株AQ713全肉汤培养物和化学杀真菌剂的组合物。
5.含有权利权利要求1的枯草芽孢杆菌菌株AQ713全肉汤培养物和生物或化学杀虫剂的组合物。
6.权利要求5的组合物，进一步包含化学杀真菌剂。
7.含有权利要求2的代谢物和化学杀真菌剂的组合物。
8.含有权利要求2的代谢物和生物或化学杀虫剂的组合物。
9.权利要求8的组合物，进一步含化学杀真菌剂。
10.含有权利要求3的上清液和化学杀真菌剂的组合物。
11.含有权利要求3的上清液和生物或化学杀虫剂的组合物。
12.权利要求11的组合物，进一步包含化学杀虫剂。
13.一种保护或治疗植物和果实免受真菌和细菌侵染和黄瓜十二星叶甲侵袭的方法，包括施用有效量的权利要求1的枯草芽孢杆菌菌株。
14.一种保护或治疗植物和果实免受真菌和细菌侵染和黄瓜十二星叶甲侵袭的方法，包括施用有效量的权利要求2的代谢物。
15.一种保护或治疗植物和果实免受真菌和细菌侵染和黄瓜十二星叶甲侵袭的方法，包括施用有效量的权利要求3的上清液。
16.一种保护或治疗植物和果实免受真菌和细菌侵染和黄瓜十二星叶甲侵袭的方法，包括施用有效量的权利要求4、5、6、7、8、9、10、11或12的组合物。
17.权利要求13、14或15的方法，其中侵染由至少一种选自致病疫霉、立枯丝核菌、终极腐霉、灰葡萄孢、Alternaria solani、Colletotrichum cocodes、Alternaria brassicicola、瓜枝孢、Monilinia fructicola、梨黑星菌、燕麦食酸菌、丁香假单胞菌、野油菜黄单胞菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、密执安棍状杆菌、Plasmoparaviticola、Sphaerotheca fuliginea、Uncinula necator和寄生霜霉的微生物引起。
18.权利要求16的方法，其中侵染由至少一种选自致病疫霉、立枯丝核菌，终极腐霉、灰葡萄孢、Alternaria solani、Colletotrichumcocodes、Alternaria brassicicola、瓜枝孢、Moniliniafructicola、梨黑星菌、燕麦食酸菌、丁香假单胞菌、野油菜黄单胞菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、密执安棍状杆菌、plasmopara viticola、sphaerothec fuliginea、Uncinula necator和寄生霜霉的微生物引起。
19.权利要求13的方法，其中枯草芽孢杆菌菌株AQ713以全肉汤培养物施用。
20.权利要求13的方法，其中枯草芽孢杆菌菌株AQ713以上清液施用。
21.权利要求19的方法，其中枯草芽孢杆菌菌株AQ713以可湿性粉末、颗粒、flowables或微胶囊施用。
22.权利要求20的方法，其中的枯草芽孢杆菌菌株AQ713以可湿性粉、颗粒、flowables或微胶囊施用。
23.权利要求13、14或15的方法，其中植物的根或根周围的土壤得到处理。
24.权利要求16的方法，其中对植物根或根周围土壤进行处理。
25.一种化合物，具有以下结构式：
其中R1为C8-C20的支链或直链脂肪族侧链；X为Ala或Val，R2为乙酸或酯衍生物，Glx为Gln或Glu。
26.一种化合物，具有以下结构式：
Figure A9880495300041
27.一种化合物，具有以下结构式：
Figure A9880495300042
28.含有A型伊枯草菌素、制磷脂菌素和枯草菌表面活性剂的组合物。
29.权利要求28的组合物，进一步包含agrastatin。
30.一种保护或治疗植物和果实免受真菌和细菌侵染和黄瓜十二星叶甲侵袭的方法，包括施用有效量的权利要求23、24、25、26或27的组合物。
31.权利要求30的方法，其中侵染由至少一种选自致病疫霉、立枯丝核菌、终极腐霉、灰葡萄孢、Alternaria solani、Colletotrichumcocodes、Alternaria brassicicola、瓜枝孢、Moniliniafructicola、梨黑星菌、燕麦食酸菌、丁香假单胞菌、野油菜黄单胞菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、密执安棍状杆菌、plasmopara viticola，Sphaerotheca fuliginea、Uncinula necator和寄生霜霉的微生物引起。
32.一种保护或治疗植物免受黄瓜十二星叶甲侵袭的方法，包括将有效量的权利要求23、24、25或26的组合物施用于植物的根或根周围的土壤。
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