ES2268774T3 - Nueva cepa de bacillus destinada a luchar contra las enfermedades de las plantas y del gusano de las raices del maiz. - Google Patents

Nueva cepa de bacillus destinada a luchar contra las enfermedades de las plantas y del gusano de las raices del maiz. Download PDF

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Abstract

La invención se refiere a una nueva cepa de Bacillus subtilis productora de antibióticos y productora de metabolitos que exhibe actividad insecticida, antifungal y antibacteriana. El material flotante de esta nueva cepa contiene agentes insecticidas, antifungales y antibacterianos efectivos. En la invención también se incluye un metabolito activo contra el gusano de la raíz del maíz de pequeño peso molecular (< 10000 daltons) que puede extraerse mediante un solvente que se produce en el material flotante. También se incluyen en la invención procedimientos para proteger o tratar plantas contra infecciones fungales y bacterianas y contra infestaciones por el gusano de la raíz del maíz que comprenden el paso de aplicar a la planta una cantidad efectiva de la nueva cepa del Bacillus subtilis productor de antibiótico-metabolito, el antibiótico-metabolito producido por la nueva cepa del Bacillus subtilis o una combinación de los mismos comprende además opcionalmente otra cepa bacteriana productora de antibiótico y/o un pesticida químico. La invención también incluye procedimientos para prevenir o tratar infecciones fungales y bacterianas usando el caldo de cultivo completo o el material flotante obtenido del cultivo de la nueva cepa del Bacillus subtilis sólo o en combinación con pesticidas químicos y/o otros agentes de biocontrol. La invención también incluye nuevos compuestos antifungales y antibacterianos denominados agrastatinas y una nueva combinación que comprende una iturina de tipo A, una plipastatina, una surfactina y una agrastatina. Se presentan procedimientos para el tratamiento o la protección de plantas contra infecciones fungales y bacterianas y contra infestaciones por el gusano de la raíz del maíz que comprenden la administración de las nuevas agrastatinas y la nueva combinación que comprende una iturina de tipo A, una plipastatina, una surfactina y una agrastatina.

Description

Nueva cepa de Bacillus destinada a luchar contra las enfermedades de las plantas y del gusano de las raíces del maíz.
Campo de la invención
La presente invención se halla en el campo de los biopesticidas. Más concretamente, esta invención se relaciona con el descubrimiento de que una nueva cepa de Bacillus subtilis, AQ713, puede inhibir un amplio abanico de enfermedades bacterianas y fúngicas de plantas y también tener actividad contra el gusano de las raíces del maíz. La invención se relaciona también con composiciones fungicidas, bactericidas e insecticidas que contienen esta nueva cepa de Bacillus y con los antibióticos y metabolitos producidos por esta cepa, ya sean solos o en combinación con otros pesticidas químicos y biológicos.
Antecedentes de la invención
Durante una serie de años, se ha sabido que diversos microorganismos exhiben actividad biológica como para ser útiles en el control de enfermedades de las plantas. Aunque se han hecho progresos en el campo de la identificación y el desarrollo de pesticidas biológicos para controlar diversas enfermedades de plantas de importancia agronómica y hortícola, la mayor parte de los pesticidas en uso son aún compuestos sintéticos. Muchos de estos fungicidas químicos son clasificados como carcinógenos por la EPA y son tóxicos para la vida salvaje y otras especies que no son su objetivo. Además, los patógenos pueden desarrollar resistencia a pesticidas químicos (véase, v.g., Schwinn y col., p. 244, ADVANCES IN PLANT PATHOLOGY: PHYTOPHTHORA INFESTANS, THE CAUSE OF LATE BLIGHT OF POTATO (Academic Press, San Diego, 1991).
Cada año se usan 250-300 millones de dólares de pesticidas químicos para controlar las infestaciones por el gusano de las raíces del maíz. Muchos de estos pesticidas químicos son tóxicos para humanos, para la vida salvaje y para otras especies que no constituyen su objetivo. Además, algunos han sido encontrados en el agua freática. Los nuevos insecticidas químicos cuestan \textdollar100 millones de desarrollar.
El control biológico ofrece una alternativa a los fungicidas químicos sintéticos. Los biopesticidas (organismos vivos y los compuestos naturalmente producidos por estos organismos) pueden ser más seguros, más biodegradables y menos caros de desarrollar.
Los programas de rastreo han identificado ciertas cepas de Bacillus spp (Bacillus spp. incluye B. subtilis, B. cereus, B. mycoides y B. thuringiensis) que exhiben actividad antifúngica. (Véase, v.g., Stabb y col. (1990), Applied Environ. Microbiol. 60: 4404-4412). Estas cepas han mostrado producir zwittermicina-A y/o kanosamina (Milner y col. (1996), Appl. Environ. Microb. 62: 3061-3066), dos agentes antibióticos que son efectivos contra la enfermedad del suelo del perecimiento por exceso de humedad, causada por Phytophthora medicaginis, P. nicotianae, P. aphanidermatum o Sclerotinia minor (véase Stabb y col., antes citado). La zwittermicina-A es una molécula de aminopoliol lineal hidrosoluble y estable a ácidos (véase He y col. (1994), Tetra. Lett. 35(16), 2499-2502.
La Patente EE.UU. Nº 5.049.379 de Handelsman y col. describe cómo la zwittermicina-A controla el perecimiento por exceso de humedad en alfalfa y sojas. Cuando se revestía la semilla con B. cereus ATCC 53522, la actividad patogénica del hongo de la podredumbre de la raíz resulta inhibida. De forma similar, se ha visto que la aplicación de formulaciones basadas en esporas de ciertas cepas de B. cereus a semillas de soja o al suelo que rodea las semillas mejora el rendimiento de la soja en los sitios de campo. (Véase Osburne y col. (1995), Am. Phytopathol. Soc. 79(6): 551-556). Los métodos de aplicación de biopesticidas son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, polvos humectables, fluidos secos, microencapsulación de agentes efectivos y formulaciones líquidas o sólidas de fracciones antibióticas de cultivos adecuados. (Véanse, v.g., la Patente EE.UU. Nº 5.061.495 de Rossall o la Patente EE.UU. Nº 5.049.379 de Handelsman).
Smith y col. (1993), Plant Disease 77(2), 139-142, describen que la actividad del hongo del suelo, Pythium aphanidermatum, que causa pérdida algodonosa del pepino, puede ser suprimida usando la cepa de B. cereus UW85 productora de zwittermicina. Leifert y col. (1995), J. Appl. Bacteriol. 78: 97-108, describen la producción de antibióticos anti-Botrytis y anti-Alternaria por dos cepas de Bacillus, B. subtilis CL27 y B. pumilis CL 45. La totalidad de los filtrados de caldos y libres de células eran activos contra Botrytis y Alternaria en pruebas in vitro y eran activos contra Botrytis en pruebas con pequeñas plantas in vivo sobre Astilbe. Leifert y col. (1997), Patente EE.UU. Nº 5.597.565, describen B. subtilis, B. pumilis y B. polymyxa que son particularmente efectivos en la inhibición de hongos causantes de la enfermedad post-cosecha. También describen la presencia de antibióticos producidos en el filtrado de cultivo libre de células y su actividad a diferentes valores de pH, pero no identifican estos
compuestos.
Rossall (1994), Patente EE.UU. Nº 5.344.647, describe cepas de Bacillus subtilis con amplia actividad antifúngica. Sholberg y col. (1995), Can. J. Microbiol. 41: 247-252; Swinburne y col. (1975), Trans. Brit. Mycol. Soc. 65: 211-217; Singh y Deverall (1984), Trans. Br. Mycol. Soc. 83: 487-490, y Ferreira y col. (1991), Phytopathology 81: 283-287. Baker y col. (1983), Phytopathology 73: 1148-1152, describen el uso de Bacillus spp. y de Bacillus subtilis como agentes de biocontrol de patógenos fúngicos de plantas. Baker y col. (1983), Phytopathology 73: 1148-1152, también hablan sobre un Bacillus subtilis antifúngico para uso sobre patógenos de plantas. Pusey y col. (1988), Plant Dis. 72: 622-626, Pusey y Robins (Patente EE.UU. Nº 5.047.239) y McKeen y col. (1986), Phytopathology 76: 136-139, describen el control de la podredumbre de los frutos post-cosecha usando B. subtilis. McKeen y col., antes citado, han mostrado que antibióticos similares a los polipéptidos cíclicos de iturina de bajo peso molecular contribuyen a esta actividad fungicida de B. subtilis.
Liu y col. (1995), Patente EE.UU. Nº 5.403.583, describen un Bacillus megaterium, ATCC 55000, y un método para controlar el patógeno fúngico de plantas Rhizoctonia solani. Islam y Nandi (1985), Journal of Plant Diseases and Protection 92(3): 241-246, describen un Bacillus megaterium con antagonismo hacia Drechslera oryzae, el agente causal de la mancha marrón del arroz. Los mismos autores, Islam y Nandi (1985), Journal of Plant Diseases and Protection 92(3), 233-240, también describen el antagonismo in vitro de B. megaterium contra Drechslera oryzae, Alternaria alternata y Fusarium roseum. Discuten tres componentes en el filtrado de cultivo. El antibiótico más activo era altamente soluble en agua y metanol, con un pico UV a 255 nm y un hombro a 260 nm, el cual mostró ser un lipopéptido de tipo polioxina. Cook ((1987) Proceedings Beltwide Cotton Production - Mechanization Research Conference, Cotton Council, Memphis, pp. 43-45), describe el uso de una suspensión de Bacillus megaterium para reducir el número de plantas de algodón muertas por Phymatotrichum omnivorum, una causa de podredumbre de la raíz del algodón.
La producción de antibiótico de B. megaterium ha sido registrada por Berdy (CRC Handbook of Antibiotic Compounds, Vol. I-XIV (CRC Press, Inc., Boca Ratón, FL, 1980-87), que describe la producción de antibióticos peptídicos tóxicos para pequeños mamíferos, tales como ansamitocina-PDM-O, bacimetrina, megacina, pentapéptido y homopéptidos.
Se sabe que los bacilos producen metabolitos secundarios antifúngicos y antibacterianos (Korzybski y col. (1978)). Los investigadores de la Universidad de Wisconsin y Cornell han identificado un nuevo compuesto fungicida, la zwittermicina A, producido por Bacillus sp. (He y col., (1994), Tetra. Lett. 35(16): 2499-2502). Se identificó recientemente un segundo metabolito fungicida por producido por la misma cepa como el conocido aminoácido kanosamina (Milner y col. (1996), Appl. Environ. Microb. 62: 3061-3065).
Otro grupo de metabolitos de Bacillus previamente descritos son los lipopéptidos cíclicos de la clase iturina, algunos de los cuales son potentes agentes fungicidas. Estos agentes consisten en un octapéptido cíclico con siete \alpha-aminoácidos y un \beta-aminoácido con una cadena lateral alifática. Existen varios grupos de iturinas que difieren en el orden y el contenido de la secuencia de aminoácidos. Éstos son mostrados en la Tabla 1 siguiente. En general, se produce una serie de moléculas relacionadas con diferencias en la longitud y la ramificación del residuo de aminoácido alifático. Cuando se estudia frente a Saccharomyces cerevisiae, la micosubtilina resultó ser el agente más activo (CL_{50} = 10 \mug/ml), seguido de la iturina-A y de la bacilomicina L (ambos con una CL_{50} = 30 \mug/ml) (Beeson y col. (1979), J. Antibiotics 32(8): 828-833). Se ha descrito que el modo de acción de estos lipopéptidos cíclicos es debido a la interacción con las membranas fúngicas, creando canales de transmembrana que permiten la liberación de iones vitales (Latoud y col. (1986), Biochem. Biophys. Acta 856: 526-535). La iturina-C es inactiva frente a hongos, incluyendo Penicillium chrysogenum (Peypoux y col. (1978), Tetrahedron 34: 1147-1152).
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1 Estructura de la familia de antibióticos iturina
Antibiótico L-Asz(X1) X4 X5 X6 X7
Iturina A L-Asn L-Gln L-Pro D-Asn L-Ser
Iturina C L-Asp L-Gln L-Pro D-Asn L-Ser
Bacilomicina D L-Asn L-Pro L-Glu D-Ser L-Thr
Bacilomicina L L-Asp L-Ser L-Gln D-Ser L-Thr
Bacilomicina F L-Asn L-Gln L-Pro D-Asn L-Thr
Micosubtilina L-Asn L-Gln L-Pro D-Ser L-Asn
1 
\vskip1.000000\baselineskip
Un grupo de investigación en el USDA ha investigado la relación estructura/actividad de las iturinas sintetizando una serie de análogos que difieren en la longitud de la cadena de aminoácidos. Los investigadores describieron que la actividad de las iturinas aumentaba con la longitud de la cadena lateral de ácido graso y la ramificación terminal en el orden iso>normal>anteiso (Bland col. (1995), Proc. Plant Growth Regulation Soc. Am. 22º: 105-107). También afirman que las "cantidades de iturinas obtenidas de producción natural son inadecuadas para ser comercialmente viables" en base a su trabajo con una serie de cepas de Bacillus productoras de iturinas.
Otros grupos de lipopéptidos cíclicos aislados de B. cereus son las plipastatinas. Estos compuestos son una familia de decapéptidos acilados, cuyas estructuras aparecen mostradas en la Figura 1 (Nishikiori y col. (1986), J. Antibiotics 39(6): 755-761). Estos compuestos fueron originalmente aislados como inhibidores de la fosfolipasa pancreática porcina A_{2} (Umezawa y col. (1986), J. Antibiotics 39(6): 737-744), pero se vio después que inhibían algunos hongos patógenos de plantas, incluyendo Botrytis, Pyricularia y Alternaria (Yamada y col. (1990), Nippon Noyaku Gakkaishi 15(1): 95-96). Yamada describió también un efecto sinérgico observado entre la iturina A y las plipastatinas, ambas producidas por la misma cepa de B. subtilis.
Se ha trabajado sobre perfeccionamientos en la fermentación para aumentar la producción de las iturinas en fermentaciones en estado tanto líquido (Phae y Shoda (1991), J. Ferment. Bioeng., 71: 118-121); Ohno y col. (1993), J. Ferment. Bioeng. 75: 463-465) como sólido (Ohno y col. (1992), Biotech. Lett. 14(9): 817-822; Ohno y col. (1995), J. Ferment. Bioeng. 5: 517-519). Existe un informe de sinergia entre las surfactinas estrechamente relacionadas, que son en sí mismas inactivas, y las iturinas producidas por la misma cepa de B. subtilis (Hiraoka y col. (1992), J. Gen. Appl. Microbiol. 38: 635-640). Se ha publicado la secuencia nucleotídica para el gen que co-regula la biosíntesis de iturina A y surfactina (Huang y col. (1993), J. Ferment. Bioeng. 76(6): 445-450). El trabajo de campo sobre cepas productoras de iturinas se ha concentrado en el tratamiento de suelos para el control de Rhizoctonia (Asaka y Shoda (1996), Appl. Environ. Microbiol. 62: 4081-4085) y no se han descrito aplicaciones de campo foliares de
iturinas.
Otro compuesto lipopeptídico cíclico producido por B. subtilis es la surfactina, que posee una actividad surfactante excepcional (Kaninuma y col. (1969), Agric. Biol. Chem. 33: 973-976). La surfactina contiene un \beta-hidroxiácido graso C14 o C15 unido por un anillo de lactona a un resto heptapeptídico con una secuencia LLDLLDL (Arima y col. (1968), Biochem. Res. Commun. 31: 488-494). Sandrin y col. ((1990), Biotechnol. Appl. Biochem. 12: 370-375) hallaron cepas de B. subtilis que producían tanto surfactina como iturina A, las bacilomicinas F y L y micosubtilina.
El nuevo microorganismo AQ713 descubierto por los inventores, que previamente se pensaba que era una cepa de Bacillus megaterium y se ha identificado ahora como una cepa de Bacillus subtilis, produce iturinas A, plipastatinas y surfactinas. La producción de esta combinación de lipopéptidos por un microorganismo no ha sido previamente descrita. Además, los inventores han descubierto que AQ713 también produce un grupo recién descubierto de compuestos denominados "agrastatinas". La combinación de los tres compuestos anteriores conocidos con las nuevas agrastatinas es también novedosa.
Un biopesticida comúnmente usado es la bacteria gram positiva Bacillus thuringiensis. Se sabe que las cepas pesticidas de B. thuringiensis producen proteínas cristalinas durante la esporulación, que son específicamente tóxicas para ciertos ordenes y especies de insectos y nemátodos (véanse, v.g., las Patentes EE.UU. Nº 4.999.192 y 5.208.017). Las endotoxinas proteicas producidas por B. thuringiensis actúan también como agentes insecticidas contra el gusano de la raíz del maíz y otros escarabajos (v.g., Patente EE.UU. Nº 5.187.091; Johnson, T.J. y col. (1993), J. Economic Entomology 86: 330-333). Se ha visto que las endotoxinas de B. thuringiensis son efectivas como cristales purificados, pellas de células lavadas y proteínas expresadas. Warren y col. (WO 96/10083) describen proteínas no endotoxinas producidas durante el estadío vegetativo de Bacillus cereus y B. thuringiensis. Estas proteínas vegetativas, llamadas Vip1 y Vip2, tienen una potente actividad contra el gusano de la raíz del maíz (norte y oeste) (Estruch y col. (1997), Nature Biotechnology 15: 137-141, y Mullins y col. (1997), Appl. Environ. Microbiol. 63 (en
impresión).
Un metabolito termoestable de B. thuringiensis, llamado beta-exotoxina, ha mostrado también tener propiedades pesticidas. Burgjeron y Biache (1979), Entomophaga 11: 279-284, describen una beta-exotoxina que es activa contra el escarabajo de la patata de Colorado (Leptinotarsa decemlineata). Además, la conocida beta-exotoxina de B. thuringiensis exhibe actividad pesticida inespecífica, matando no sólo nemátodos, sino también moscas, gusanos soldado, ácaros y gusanos de la raíz del maíz. La sigma-exotoxina tiene una estructura similar a la beta-exotoxina y es activa contra el escarabajo de la patata de Colorado (Argauer y col. (1991), J. Entomol. Sci. 26: 206-213). La alfa-exotoxina es tóxica contra larvas de Musca domestica (Cluthy (1980), FEMS Microbiol. Lett. 8: 1-7). Las gamma-exotoxinas son diversas enzimas proteolíticas, quitinasas y proteasas. Los efectos tóxicos de las gamma-exotoxinas se expresan solamente en combinación con beta-exotoxina y delta-endotoxina. Forsberg y col. (1976), "Bacillus thuringiensis: Its effects in Environmental Quality", National Research Council of Canada. Stonard y col. (1994), ACS Symposium Series 551: 25, describen un metabolito secundario hidrosoluble activo contra el gusano de la raíz del maíz en el sobrenadante de una cepa de Bacillus cereus.
No existen cepas documentadas de Bacillus con actividad a la vez fungicida y sobre el gusano de la raíz del maíz. No existen metabolitos conocidos producidos por Bacillus subtilis que tengan un peso molecular menor de 10.000 y que sean extraíbles en un solvente no polar.
Descripción de la invención
Se presenta una nueva cepa productora de antibióticos y productora de metabolitos de Bacillus subtilis, previamente identificada como Bacillus megaterium, que exhibe una amplia actividad fungicida y bactericida y que exhibe también actividad sobre el gusano de la raíz del maíz. También se presenta un nuevo metabolito del nuevo B. subtilis con actividad sobre el gusano de la raíz del maíz. También se presenta un método de tratamiento o de protección de las plantas frente a infecciones fúngicas y bacterianas consistente en la etapa de aplicar una cantidad efectiva del Bacillus subtilis productor de antibiótico. El Bacillus subtilis productor de antibiótico puede ser presentado como una suspensión en un cultivo en caldo completo o como sobrenadante que contiene antibiótico obtenido de un cultivo en caldo completo de la cepa productora de antibiótico de Bacillus. También se presenta un método de tratamiento o protección de las raíces de las plantas frente a infestaciones por el gusano de la raíz del maíz consistente en la etapa de aplicar una cantidad efectiva del nuevo Bacillus subtilis productor de metabolitos. El nuevo Bacillus subtilis productor de metabolitos puede presentarse como una suspensión en un cultivo en caldo completo o como un sobrenadante que contiene metabolitos.
También se presentan nuevos compuestos, las agrastatinas, producidos por la nueva cepa AQ713 y una nueva combinación de compuestos consistente en iturina A, una plipastatina, una surfactina y una agrastatina.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la estructura de los antibióticos plipastatina.
La Figura 2 muestra el cromatograma de HPLC de metabolitos de AQ713.
Modos de llevar a cabo la invención
La presente invención proporciona una nueva cepa, AQ713, de Bacillus subtilis, previamente identificada como un Bacillus megaterium, o sus mutantes con la amplia actividad antifúngica y antibacteriana y la nueva combinación de actividad antifúngica y anti-gusano de la raíz del maíz. Esta nueva cepa es designada como AQ713 y fue depositada en la NRRL el 7 de Marzo de 1997 bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con Fines de Procedimiento de Patente bajo el Nº de Acceso B21661. La invención incluye también métodos de prevención y tratamiento de enfermedades fúngicas y bacterianas en plantas usando dichas cepas bacterianas o sobrenadantes que contienen antibióticos o antibióticos puros obtenidos de dichas cepas bacterianas, donde dichos antibióticos están contenidos en una composición según se define en las reivindicaciones. La invención incluye también métodos de tratamiento de las raíces de las plantas o del suelo para controlar las larvas del gusano de la raíz del maíz con una suspensión bacteriana de AQ713 o un sobrenadante que contiene metabolitos de un cultivo de AQ713. La invención incluye además nuevos compuestos, las agrastatinas, producidos por el nuevo microorganismo. También se incluye una nueva combinación consistente en una iturina de tipo A, una plipastatina, una surfactina y una agrastatina.
Definiciones
Tal como se usa aquí, "control biológico" se define como control de un patógeno o insecto mediante el uso de un segundo organismo. Los mecanismos conocidos de control biológico incluyen bacterias entéricas que controlan la podredumbre de la raíz compitiendo con los hongos por el espacio sobre la superficie de la raíz. Se han usado toxinas bacterianas, tales como antibióticos, para controlar patógenos. La toxina puede ser aislada y aplicada directamente a la planta, o se puede administrar la especie bacteriana para que produzca la toxina in situ.
El término "hongo" u "hongos" incluye una amplia variedad de organismos portadores de esporas nucleados que están desprovistos de clorofila. Como ejemplos de hongos, se incluyen levaduras, mohos filamentosos, añublos, mohos y setas.
El término "bacteria" incluye cualquier organismo procariótico que no tenga un núcleo diferenciado.
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"Fungicida" significa la capacidad de una substancia para aumentar la mortalidad o inhibir la tasa de crecimiento de los hongos.
"Antibiótico" incluye cualquier substancia que sea capaz de matar o inhibir un microorganismo. Los antibióticos pueden ser producidos por un microorganismo o por un procedimiento sintético o un procedimiento semisintético. El término, por lo tanto, incluye una substancia que inhibe o mata hongos, por ejemplo zwittermicina-A o kanosa-
mina.
"Antifúngico" incluye cualquier substancia que sea capaz de matar o inhibir el crecimiento de hongos.
El término "cultivo" se refiere a la propagación de organismos sobre o en medios de varios tipos. "Cultivo en caldo completo" se refiere a un cultivo líquido que contiene tanto células como medio. "Sobrenadante" se refiere al caldo líquido que queda cuando se separan las células que han crecido en caldo por centrifugación, filtración, sedimentación u otros medios bien conocidos en la técnica.
Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para producir resultados beneficiosos o deseados. Una cantidad efectiva puede ser administrada en una o más administraciones. En términos de tratamiento y protección, una "cantidad efectiva" es aquella cantidad suficiente para mejorar, estabilizar, revertir, enlentecer o retrasar la progresión de los estados de la enfermedad fúngica o bacteriana.
Tal como se usa aquí, el término "insectos" incluye todos los organismos de la clase "Insecta". Insectos "preadultos" se refiere a cualquier forma de un organismo antes del estadío de adulto, incluyendo, por ejemplo, huevos, larvas y ninfas. "Insecticida" se refiere a la capacidad de una substancia para aumentar la mortalidad o inhibir la velocidad de crecimiento de los insectos. "Nematocida" se refiere a la capacidad de una substancia para aumentar la mortalidad o inhibir la tasa de crecimiento de los nemátodos. "Pesticida" se refiere a la capacidad de una substancia para aumentar la mortalidad o inhibir la tasa de crecimiento de insectos, nemátodos y ácaros.
"Control positivo" significa un compuesto que se sabe tiene actividad pesticida. "Controles positivos" incluye, aunque sin limitación, pesticidas químicos comercializados. El término "control negativo" significa un compuesto que se sabe no tiene actividad pesticida. Son ejemplos de controles negativos el agua o el acetato de etilo.
El término "solvente" incluye cualquier líquido que mantenga otra substancia en solución. "Extraíble con solventes" se refiere a cualquier compuesto que se disuelva en un solvente y que pueda ser entonces aislado del solvente. Como ejemplos de solventes, se incluyen, aunque sin limitación, solventes orgánicos como el acetato de etilo.
El término "metabolito" se refiere a cualquier compuesto, substancia o subproducto de una fermentación de un microorganismo que tenga actividad pesticida. Antibiótico, según se define aquí, es un metabolito específicamente activo contra un microorganismo.
El término "agrastatinas" se refiere a un grupo de nuevos compuestos que tienen las siguientes estructuras:
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donde R_{1} es una cadena lateral alifática ramificada o lineal C8-C20, X es Ala o Val, R_{2} es un acetato o un derivado éster y Glx es Gln o Glu. Estos compuestos tienen actividad antibacteriana y antifúngica, así como actividad anti-gusano de la raíz del maíz.
Describimos una nueva cepa productora de metabolitos y de antibióticos de Bacillus subtilis, previamente identificada como Bacillus megaterium, que tiene amplia actividad antifúngica y antibacteriana y que también mata o impide el desarrollo de las larvas del gusano de la raíz del maíz. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de tratamiento o protección de las plantas frente a infecciones fúngicas y bacterianas, consistente en aplicar una cantidad efectiva de un sobrenadante obtenido de un cultivo en caldo completo de Bacillus subtilis AQ713 dentro de la presente invención. El sobrenadante puede ser obtenido por medios bien conocidos en la técnica, incluyendo centrifugación, filtración, sedimentación y similares.
En otro aspecto, la invención incluye un método de tratamiento o protección de las plantas frente a infecciones fúngicas y bacterianas, consistente en aplicar una cantidad efectiva del caldo completo de la nueva cepa de Bacillus subtilis.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de tratamiento o de protección de las raíces de las plantas frente a infestaciones por el gusano de la raíz del maíz, consistente en aplicar una cantidad efectiva de un sobrenadante obtenido de un cultivo en caldo completo de Bacillus subtilis AQ713 dentro de la presente invención. El sobrenadante puede ser obtenido por métodos bien conocidos en la técnica, tales como centrifugación, filtración, sedimentación y similares.
En otro aspecto, la invención incluye un método de tratamiento o de protección de las plantas frente a las infestaciones por el gusano de la raíz del maíz, consistente en aplicar una cantidad efectiva del caldo completo de la nueva cepa de Bacillus subtilis.
Con objeto de conseguir una buena dispersión y adhesión de composiciones en la presente invención, puede ser ventajoso formular el cultivo en caldo completo, el sobrenadante y/o el metabolito/antibiótico con componentes que ayuden a la dispersión y a la adhesión. Las formulaciones adecuadas serán conocidas para los expertos en la
técnica.
Las composiciones de la presente invención pueden ser formuladas como polvos humectables, gránulos y similares, o pueden ser microencapsuladas en un medio adecuado y similar. Como ejemplos de otras formulaciones, se incluyen, aunque sin limitación, polvos solubles, gránulos humectables, fluidos secos, fluidos acuosos, gránulos dispersables humectables, concentrados emulsionables y suspensiones acuosas. Otras formulaciones adecuadas serán conocidas para los expertos en la técnica.
En aún otro aspecto de la presente invención, se presenta un nuevo grupo de compuestos denominados "agrastatinas". Estos compuestos exhiben actividad antibacteriana y antifúngica además de actividad anti-gusano de la raíz del maíz.
En aún otro aspecto de la presente invención, se presenta una nueva combinación consistente en una iturina tipo A, una plipastatina, una surfactina y una agrastatina.
En otro aspecto de la presente invención, se presentan métodos de tratamiento o de protección frente a enfermedades fúngicas y bacterianas, consistentes en aplicar una cantidad efectiva de una nueva combinación de compuestos consistente en una iturina de tipo A, una plipastatina, una surfactina y una agrastatina.
Los siguientes ejemplos son facilitados para ilustrar la invención. Estos ejemplos no han de ser considerados como limitativos.
Ejemplos Ejemplo 1 Caracterización de la Cepa AQ713
Se identificó el aislado en base a la utilización del panel de microplacas Biolog (Biolog, Inc., Hayward, CA), como se describe en Bochner (1989), Nature 339: 157-158. La microplaca Biolog está constituida por pocillos en panel prellenados y secos con 95 diferentes placas de substratos de carbono disponibles para bacterias gram positivas y gram negativas. Se cultivó el aislado en medio líquido a 28ºC y después de 24 horas se inoculó una suspensión de células lavadas (solución salina al 0,85%) en cada pocillo del panel de una Microplaca GP (Biolog, Inc.). Después de 24 h a 28ºC, se valoraron las reacciones de utilización del carbono. Se compararon entonces los perfiles de utilización del substrato con la Base de Datos Gram-Positiva Biolog (emisión 3.50) y se aislaron a la especie similar más próxima. Los resultados Biolog dieron un índice de similitud de 0,883 con Bacillus megaterium.
Se realizo una caracterización más exhaustiva de AQ713 por la American Type Culture Collection, Rockville, Md.
Aislado presentado como: Desconocido; Cepa AQ 713.
Aislado identificado como: Utilizando los datos fisiológicos y bioquímicos disponibles, esta cepa se parece más estrechamente a Bacillus subtilis.
Morfología celular: Las células móviles se encuentran aisladamente, con una endospora formada en la región central o subterminal. Las células se tiñen uniformemente como Gram positivo.
Morfología de la colonia: Las colonias son opacas e irregulares con elevación convexa, una superficie áspera y apagada y margen erosionado.
Datos de caracterización de la Cepa AQ 713
Bacilos + Colonia opaca +
Bacilos rectos + Colonia entera -
Bacilos curvados - Colonia erosionada +
Células simples + Colonia lobulada -
Células encadenadas - Colonia circular -
Extremos afilados - Colonia irregular +
Extremos redondeados + Colonia rizoide -
Extremos cuadrados - Colonia baja convexa +
Endospora formada + Colonia alta convexa -
Esporangio hinchado - Colonia plana -
Una espora/célula + Colonia elevada -
Espora redondeada - Colonia brillante -
Espora cilíndrica + Colonia apagada +
Espora oval + Colonia seca -
Espora central + Colonia lisa -
Espora terminal - Colonia áspera +
Espora subterminal + Pigmento marrón soluble -
Tinción Gram + Pigmento negro soluble -
Gram positiva + Pigmento amarillo soluble -
Gram negativa - Pigmento marrón insoluble -
Gram variable - Pigmento negro insoluble -
Presencia de vacuolas - Pigmento amarillo insoluble -
Colonia translúcida - Pigmento naranja insoluble -
Colonia transparente - Pigmento rojo insoluble -
Células móviles + Ácido a partir de lactosa -
Crecimiento a 15ºC + Gas a partir de lactosa -
Crecimiento a 20ºC + Ácido a partir de manitol -
Crecimiento a 26ºC + Gas a partir de manitol -
Crecimiento a 30ºC + Ácido a partir de manosa -
Crecimiento a 37ºC + Gas a partir de manosa -
Crecimiento a 45ºC + Ácido a partir de sacarosa Débil
Crecimiento a 50ºC Débil Ácido retrasado > 14 días Débil
(Continuación)
Crecimiento a 55ºC - Gas a partir de sacarosa -
Crecimiento a 60ºC - Ácido a partir de trehalosa -
Crecimiento a 65ºC - Gas a partir de trehalosa -
Catalasa + Ácido a partir de xilosa -
Oxidasa + Gas a partir de xilosa -
Hidrólisis de caseína + Aerobia -
Licuación de gelatina + Facultativo -
Hidrólisis de hipurato - Microaerófila +
Degradación de lecitinasa - Anaerobia -
Hidrólisis de almidón + Gas a partir de nitrato sellado -
Hidrólisis de Tween 80 + Gas a partir de glucosa sellada -
Descomposición de tirosina - Indol -
Crecimiento en NaCl 2% + Nitrato a nitrito +
Crecimiento en NaCl 5% + Nitrato a gas -
Crecimiento en NaCl 7% + Reducción del azul de metileno +
Crecimiento en NaCl 10% + Reoxidación del azul de metileno -
Crecimiento en azida Na 0,2% V Leche de Limus ácida -
Crecimiento a pH 4,5 + Coagulación de la leche de Limus -
Crecimiento a pH 6,0 + Leche de Limus alcalina +
Ácido a partir de arabinosa - Reducción de la leche de Limus +
Gas a partir de arabinosa - Peptonización de la leche de Limus +
Ácido a partir de celobiosa Débil Positiva a VP (5198) +
Ácido retrasado > 14 días Débil Positiva a VP (5331) +
Gas a partir de celobiosa - pH VP 5198 6,0 ó menos -
Ácido a partir de fructosa + pH VP 5198 6,5 – 7,5 +
Ácido retrasado > 14 días - pH VP 5198 8,0 ó más -
Gas a partir de fructosa + Utilización de citrato +
Ácido a partir de glucosa + Utilización de propionato -
Ácido retrasado > 14 días - Utilización de propionato -
Gas a partir de glucosa -
Comentarios:
Utilizando los datos fisiológicos y bioquímicos disponibles, esta cepa se parece más estrechamente a Bacillus subtilis.
Resultados clave de caracterización
Pruebas de caracterización Cepa AQ 713 Bacillus subtilis
Esporangio hinchado - -
Crecimiento anaerobio Microaerófilo Microaerófilo
Reacción VP + +
pH de VP 7,0 5,0 - 8,0
Temperatura máxima de crecimiento 55ºC 45-55ºC
Crecimiento en NaCl 7% + +
Ácido a partir de glucosa + +
Ácido a partir de arabinosa - +
Ácido a partir de xilosa - +
Ácido a partir de manitol - +
Descomposición de la caseína + +
Descomposición de la tirosina - -
Utilización de citrato + +
Utilización de propionato - -
Referencia
Gordon, R.E., W.C. Haynes y C.H.N. Pang. 1973. The Genus Bacillus. Handbook Nº 427, U.S. Department of Agriculture, Washington, D.C.
Ejemplo 2 Actividad de AQ713 frente al gusano de la raíz del maíz
Se cultivaron muestras de Bacillus en un medio de cultivo de Bacillus. El medio 2 contenía un 5% de peptona, un 5% de dextrosa, un 3% de extracto de levadura, un 3% de extracto de malta, un 1,5% de extracto de semillas de algodón proflo (59% de proteína, 4,26% de grasa, 6,73% de cenizas, 3,19% de fibra y cantidades traza de gosipol; el resto es agua), un 10% de harina de soja y un 0,5% de MgSO_{4} x 7H_{2}O. El medio 3 contenía los mismos ingredientes, excepto por un 20% de peptona y un 3,4% de KH_{2}PO_{4} y un 4,3% de K_{2}HPO_{4}. Se usaron cultivos en raya de un día para inocular matraces agitados protegidos de 250 ml. Se agitaron los matraces a 200 rpm a 29ºC durante 5 días. Para estudiar la actividad insecticida, se centrifugaron 35 ml de caldo de cultivo a 5.200 rpm durante 20 minutos y se usó el sobrenadante en un microensayo como se describe a continuación.
Se realizaron los ensayos en microplacas de 96 pocillos. Cada pocillo contenía un substrato de agar sólido, un organismo de ensayo y un control positivo o un control negativo o sobrenadante obtenido como se describe en el Ejemplo 1 de la nueva cepa de Bacillus.
Para estudiar la actividad insecticida, se preparó una placa de substrato de agar para los pocillos de la microplaca según Marrone y col. (1985), J. Econ. Entomol. 78: 290-293. Para estudiar la actividad nematocida, se usó en su lugar agar simple (1,5%) en los pocillos.
Se usó una solución de 1 ppm de Avid® (avermectina) como control positivo. Se usó agua desionizada como control negativo. Se usaron dos réplicas de muestra de ensayo o de control para cada ensayo. Se dispensaron 40 \mul de muestra de sobrenadante o de caldo entero cultivado en medio 1, 2, ó 3 en cada pocillo de muestra. Se pusieron entonces las placas en una campana de humos para secarlas durante aproximadamente 2-3 horas hasta que se secó la solución de agar.
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Los organismos de ensayo eran gusanos de la raíz del maíz (Diabrotica undecimpunctata) preadultos, cucarachas Alemanas (Blatella germanica) preadultas, gusanos soldado de la remolacha (Spodoptera exigua) preadultos, moscas (Drosophila melanogaster) preadultas o la cepa N2 del nemátodo Caenorhabditis elegans. Los organismos de ensayo fueron diluidos en agar al 0,1% a una concentración de aproximadamente 5 organismos por 25 \mul de agar dispensado en cada pocillo. Se selló la microplaca con una substancia estanca al aire, tal como Mylar®, y se ventiló cada pocillo con una prensa de pasador. Se incubaron las placas a 27ºC durante 7 días.
Tras la incubación, se puntuaron los pocillos observando la mortalidad de neonatos o el grado de desarrollo larvario. Se dio a los pocillos de muestra que contenían larvas todas muertas o con desarrollo detenido una puntuación de 1, se dio a los pocillos que contenían algunas larvas muertas y otras con grave detención del desarrollo una puntuación de 2, se puntuaron las larvas vivas, pero con desarrollo detenido como 3 y los pocillos de muestra que no contenían larvas muertas recibieron una puntuación de 4. Se halló la media de las puntuaciones entre las réplicas en cada muestra. En las Tablas 2 y 3 se resumen los resultados.
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TABLA 2 Puntuación de AQ713 frente a plagas de insectos en caldo completo
C. elegans Gusano de la Gusano soldado Mosca de Control Control
raíz del maíz de la remolacha la fruta positivo negativo
Medio 2 NE 1,0 4,0 4,0 1,0 4,0
Medio 3 NE 2,0 4,0 4,0 1,0 4,0
NE = no estudiado 
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TABLA 3 Puntuación de AQ713 frente a plagas de insecto en sobrenadante
C. elegans Gusano de la raíz Gusano soldado de Mosca de Cucaracha Control Control
del maíz la remolacha la fruta Alemana positivo negativo
Medio 2 4,0 3,0 4,0 4,0 4,0 1,0 4,0
Medio 3 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 1,0 4,0
Estas pruebas muestran que AQ713 era activa en ambos medios como caldo de cultivo completo, con la mejor actividad en el medio 2. El sobrenadante sólo era activo cuando se cultivaba AQ713 en medio 2.
Ejemplo 3 Propiedades químicas del metabolito AQ713 activo contra el gusano de la raíz del maíz
Se cultivaron 50 ml de AQ713 en medio 2. Se añadieron a cada cultivo 50 ml de acetato de etilo y se agitó la mezcla en un embudo separador durante 2 minutos. Se eliminó la capa acuosa y se recogió la capa orgánica en una botella que contenía sulfato de magnesio. Se filtró entonces el filtrado orgánico en un matraz de fondo redondo y se eliminó el solvente en el rotovap.
Para el bioensayo, se redisolvió el extracto orgánico seco en 2,5 ml de acetona. Se retiró una alícuota de 40 \mul y se diluyó a 80 \mul con acetona al 70%/agua. Ésta es una concentración 10X del extracto orgánico. Se realizaron diluciones seriadas para obtener muestras sobre gusanos de la raíz del maíz neonatos con registro del porcentaje de mortalidad de las larvas neonatas (1 por pocillo en una placa de microtitulación preparada como antes) después de 7 días. En la Tabla 4 se dan los resultados.
TABLA 4 Actividad de extractos de acetato de etilo de AQ713 contra el gusano de la raíz del maíz
Muestra Porcentaje de mortalidad
AQ713: Extracto orgánico 10X 89
Extracto orgánico 5X 93
Extracto orgánico 1X 65
Caldo completo 100
Acetona 70%/agua 27
Agua 59
Los resultados muestran que AQ713 produce un metabolito extraíble con solvente que mata los gusanos de la raíz del maíz.
Para determinar el rango de peso molecular del metabolito activo, se cultivó un cultivo de 50 ml de AQ713 en medio 2. Se puso 1 ml en un tubo de microcentrífuga y se centrifugó a 12.000 rpm durante 15 minutos. Se retiró el sobrenadante. Se pusieron 500 microlitros de sobrenadante encima de un filtro Centricon de 10.000 daltons de peso molecular. Se incubaron éstos según las instrucciones del fabricante (12.000 rpm durante 35 minutos). Se recogió el filtrado y se recuperó el retenido por centrifugación y lavado del filtro. Se estudiaron muestras del sobrenadante, del filtrado y del retenido contra larvas de gusano de la raíz del maíz neonatas (placa de 96 pocillos con dieta de insectos, Marrone y col., antes citado, como antes; 40 \mul de muestra por pocillo y 8 pocillos por cada muestra, 1 larva/pocillo). En la Tabla 5 se muestran los resultados de la prueba.
TABLA 5 Corte de peso molecular de AQ713
Porcentaje de mortalidad contra el
gusano de la raíz del maíz
AQ713: sobrenadante 43
filtrado 63
retenido 17
Los resultados muestran que el sobrenadante y el filtrado eran activos, por lo que el peso molecular del metabolito es menor de 10.000 daltons.
Ejemplo 4 Propiedades químicas del metabolito AQ713 activo contra patógenos de plantas
Se cultivaron 50 ml de AQ713 en medio 2. Se añadieron a cada cultivo 50 ml de acetato de etilo y se agitó la mezcla en un embudo separador durante 2 minutos. Se eliminó la capa acuosa y se recogió la capa orgánica en una botella que contenía sulfato de magnesio. Se filtró entonces el filtrado orgánico en un matraz de fondo redondo y se eliminó el solvente en el rotovap.
Para el bioensayo, se redisolvió el extracto orgánico seco en 2,5 ml de acetona. Se retiró una alícuota de 40 \mul y se diluyó a 800 \mul con acetona al 70%/agua. Ésta es una concentración 10X del extracto orgánico. Se llevó a cabo un ensayo en placa de 96 pocillos (descrito a continuación) para patógenos de plantas con Pythium ultimum y Botrytis cinerea para determinar la actividad del extracto orgánico. El caldo completo dio un 100% de control (puntuación de 1), pero el extracto orgánico 10X no dio control de los dos patógenos de plantas (puntuación de 4). Esto indica que los antibióticos activos, a diferencia de los metabolitos activos sobre el gusano de la raíz del maíz, producidos por AQ713 no son extraíbles en un solvente orgánico, tal como acetato de etilo.
Otras pruebas permitieron el aislamiento de un nuevo compuesto, la agrastatina A. Se preparó un extracto en butanol del caldo de fermentación extrayendo primeramente el caldo dos veces con igual volumen de acetato de etilo y separando las capas. Se extrajo entonces la fracción acuosa dos veces con igual volumen de butanol. Se combinaron los extractos de butanol y se eliminó el solvente con un evaporador rotatorio. Se obtuvo un polvo liofilizando el extracto resultante.
Se disolvió el polvo en acetonitrilo al 80%/agua y se sonicó. Se aplicó la solución a un cartucho de extracción en fase sólida ("SPE") C-18 que había sido activado con metanol y equilibrado con acetonitrilo al 80%/agua. Se eluyó el cartucho SPE con ACN al 80%/agua y se recogió este eluyente y se eliminaron los solventes. Se purificó aún el eluyente por HPLC. Se usó una columna de HPLC C-18 (1 cm x 25 cm) (detección UV a 210 nm) con un gradiente de solvente de acetonitrilo + 0,05% TFA/agua + 0,05% TFA como sigue: 0-20 minutos, 33% ACN; 20-30 minutos, 40% ACN; 30-45 minutos, 45-55% ACN, y 45-63 minutos, 55% ACN.
Un cromatograma de HPLC de AQ713 muestra la presencia de iturinas, compuestos de tipo iturina (plipastatinas y agrastatinas) y surfactinas, véase la Figura 1. Las iturinas A2, A3, A4, A7 y A6 fueron identificadas por una combinación de datos de RMN y datos de espectrometría de masas LC y comparación con los valores de la literatura. Las surfactinas fueron identificadas con patrones de surfactinas comprados por HPLC y por espectrometría de masas
LC.
Los compuestos de tipo iturina fueron determinados como una mezcla de plipastatinas y las nuevas agrastatinas por una combinación de análisis de aminoácidos y espectrometría de masas LC. También se recogieron datos de RMN amplios para uno de los nuevos compuestos (pico de HPLC 20), denominado agrastatina A. Se vio que la agrastatina A contenía los siguientes aminoácidos: Thr, 3 Glu, Pro, Ala, Val, 2 Tyr y Orn. Esta constitución difiere de la plipastatina a en la presencia de Val y la pérdida de Ile. El peso molecular de la agrastatina A fue determinado como de 1.448, que corresponde a la siguiente estructura:
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3 
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La naturaleza de cadena lineal de la porción de ácido graso fue confirmada por ^{1}H RMN. La posición de los aminoácidos en el péptido cíclico fue determinada por análisis detallado de los grupos de datos TOCSY y ROESY.
La espectrometría de masas y el análisis de aminoácidos de la agrastatina B (pico de HPLC 26) sugieren que su estructura es similar a la plipastatina B2, con la substitución del residuo Ile con Val. A continuación se muestra la estructura:
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4 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5 Actividad de AQ713 frente a patógenos de plantas en cultivo in vitro (placa de 96 pocillos)
Para determinar si AQ713 es efectiva frente a los hongos, Phytophthora infestans, Pythium ultimum, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani y Alternaria solani, se realizaron los siguientes experimentos. Se llenaron placas de 96 pocillos (de fondo plano, 400 microlitros por pocillo, marca Nunc) con un medio de agar (agar dextrosa de patata) (PDA, Difco). Se cultivaron cultivos de Phytophthora infestans durante tres días en medio YPG-1 líquido (0,4 g de levadura, 0,1% de KH_{2}PO, 0,5% de MgSO_{4} x 7 H_{2}O, 1,5% de glucosa). Para los otros hongos, se rasparon esporas de la superficie de placas de Petri y se extendieron sobre el agar alícuotas de 0,1-0,2 ml de agua desionizada y suspensión de esporas (concentración aproximadamente 2 x 10^{6} esporas/ml) de patógeno.
Se cultivó AQ713 durante 72 horas en el medio 2 ó 3 como se describe en el Ejemplo 2. Para obtener sobrenadantes, se centrifugó el cultivo en caldo completo a 5.200 rpm durante 20 minutos. Se pipetearon los patógenos de plantas fúngicos sobre las placas de 96 pocillos (8 pocillos/patógeno). Se registró la presencia o ausencia de crecimiento fúngico para cada uno de 8 pocillos. Se añadieron aproximadamente 40 \mul de sobrenadante de AQ713 ó 20 \mul de caldo completo a cada pocillo. Una puntuación de "1" significa inhibición completa del crecimiento fúngico. Una puntuación de "4" significa que no hay inhibición del crecimiento fúngico. En la Tabla 6 se muestran los
resultados.
TABLA 6 Inhibición in vitro del crecimiento fúngico (placa de 96 pocillos)
Sobrenadante AQ713 Medio 2 Puntuación Medio 3 Puntuación
\hskip0.5cm Phytophthora infestans 1 1
\hskip0.5cm Pythium ultimum 1 1
\hskip0.5cm Botrytis cinerea 1 1
\hskip0.5cm Rhizoctonia solani 4 1
\hskip0.5cm Alternaria solani 1 1
Caldo completo AQ713
\hskip0.5cm Colletotrichum cocodes 1 NE
\hskip0.5cm Alternaria brassicicola 1 NE
\hskip0.5cm Botrytis cinerea 1 NE
\hskip0.5cm Cladosporium cucumerinum 1 NE
\hskip0.5cm Monilinia fructicola 1 NE
\hskip0.5cm Venturia pyrina 1 NE
\hskip0.5cm Rhizoctonia solani 1 NE
\hskip0.5cm Alternaria solani 1 NE
NE No estudiado
Los resultados muestran que AQ713 tiene un amplio espectro fungicida in vitro y que tanto el caldo completo como el sobrenadante son altamente activos. El sobrenadante era activo sobre Rhizoctonia solani en medio 3, pero no en medio 2.
Ejemplo 6 Actividad de AQ713 frente a patógenos de plantas en cultivo in vitro (ensayo de zona)
Para determinar la actividad de AQ713 en un ensayo de difusión en agar (zona), se extendieron esporas de patógenos de plantas sobre la superficie de agar dextrosa de patata en placas de Petri de 10 cm. Se retiraron del agar pocillos de 7,0 mm y se puso en el pocillo una muestra de 100 \mul del sobrenadante de Q713 cultivado en medio 2. Se preparó el sobrenadante centrifugando a 4.200 rpm durante 40 minutos. Se centrifugó entonces de nuevo el sobrenadante a 4.200 rpm durante otros 40 minutos. Los resultados típicos consistían en una zona sin crecimiento y/o con crecimiento reducido del patógeno alrededor del pocillo. El tamaño de la zona en milímetros fue medido y registrado. En la Tabla 7 se muestran los resultados.
TABLA 7 Inhibición in vitro del crecimiento de patógenos fúngicos de plantas (prueba de zona)
Alternaria brassicicola Botrytis cinerea Monilinia fructicola
Sobrenadante AQ713
Tamaño de zona (mm) 16 23 14
Caldo completo AQ713 22 15 18
Ejemplo 7 Actividad de AQ713 contra patógenos de plantas bacterianos
Se estableció un ensayo de difusión en agar estándar como en el ejemplo 6. Se extendió una capa de cada patógeno bacteriano sobre la superficie de una placa de Petri. Se pusieron 100 \mul de caldo completo de AQ713 cultivado en medio 2 en cada pocillo. Se midió el tamaño de la zona en milímetros.
TABLA 8 Inhibición in vitro de patógenos bacterianos de plantas (prueba de zona)
Caldo completo AQ713: Zona de inhibición (mm)
\hskip0.5cm Acidovorax avenae subsp. citrulli 18
\hskip0.5cm Pseudomonas syringae pv. Tomate 11
\hskip0.5cm Xanthomonas campestris pv. Campestris 18
\hskip0.5cm Erwinia carotovora subsp. carotovora 11
\hskip0.5cm Clavibacter michiganense subsp. michiganense 22
AQ713 era activo frente a todas las especies de patógenos bacterianos de plantas estudiadas in vitro.
Ejemplo 8 Actividad de AQ713 frente a patógenos de plantas en pruebas con plantas
Se estudió la actividad de AQ713 frente al moho gris, Botrytis cinerea, sobre judías y hojas de geranio, Alternaria solani sobre plantones de tomate y añublo velloso de la lechuga, Bremia lactucae.
Para A. solani, se pulverizaron plantones de tomate en el estadío de 2-3 hojas plantados en paquetes de 6 hasta escurrir con caldo completo de AQ713 (medio 2). Después de la pulverización, se dejó que los plantones se secaran (aproximadamente 1,5 horas). Se pulverizaron entonces los plantones con 5,0 x 10^{4} esporas/ml. Se cubrieron los plantones con una cúpula de plástico y se mantuvieron a 28ºC en una incubadora Percival. Se usó agua sin AQ713, con y sin esporas del patógeno, como control negativo y control positivo de patógenos. A los cuatro días se leyó la prueba. En el control de agua de A. solani, había lesiones uniformes sobre todas las hojas y los cotiledones estaban sueltos y gravemente infectados (puntuación de 5 = infección completa, sin control). Las plantas tratadas con AQ713 tenían unas cuantas lesiones ligeras sobre las hojas verdaderas. Los cotiledones estaban sujetos, pero con algunas lesiones pequeñas (puntuación de 1). El control negativo no estaba infectado.
Se estableció una segunda prueba usando plantones de tomate sueltos (tallos rotos a nivel del suelo) colocados en jarras de mampostería llenas de agua puestas bajo cúpulas y guardadas como antes. Se pulverizaron las plantas como antes y se registraron los síntomas de A. solani cuatro días después. No hubo síntomas sobre el control negativo. Sobre el control positivo, había lesiones uniformes sobre los plantones. El tratamiento con AQ713 fue puntuado como 1 (pocas o ninguna lesión). A los dos días, las plantas en el control positivo estaban destruidas, pero los plantones tratados con AQ713 estaban virtualmente limpios y parecían los mismos que los controles negativos (plantas pulverizadas con agua).
Para la prueba sobre Botrytis cinerea, se hirieron las primeras hojas verdaderas de una planta de judía presionando la boca de un tubo de cultivo de 13 x 100 sobre cada hoja. Cada hoja recibió dos heridas/hoja. Se pulverizaron las hojas con caldo completo de AQ713 (medio 2) o agua sola o el patógeno solo. Cuando se secaron, se pulverizaron de nuevo con esporas de B. cinerea (0,8 x 10^{6} esporas/ml). Se pusieron las hojas en semilleros de cajón cubiertos con cúpulas de plástico y se guardaron a 18-20ºC en una incubadora Percival. Cinco días después, el control positivo (patógeno solo) se había podrido en un área de aproximadamente 25 mm de diámetro. El control negativo (agua sola) no presentaba podredumbre. AQ713 no mostró infecciones sobre 7 de 8 círculos en que las hojas estaban heridas. El que estaba infectado tenía una ligera infección en dos localizaciones alrededor del círculo.
Para la prueba con Bremia, se plantaron semillas de lechuga en una capa de mezcla para macetas esterilizada que contenía turba, perlita y vermiculita en pequeños condominios de plantas de plástico transparente de aproximadamente 8 centímetros de alto y de ancho. Después de germinar la lechuga (una semana), se pulverizaron los plantones de lechuga con la muestra de caldo o de sobrenadante de AQ713. Se dejó que las plantas se secaran y luego se pulverizó una suspensión de esporas de añublo velloso de plantones de lechuga infectados sobre los plantones. Se pusieron las cubiertas de plástico sobre las plantas y se incubaron a 18-20ºC en una incubadora Percival. Una semana más tarde se evaluó la prueba. AQ713 no previno el añublo velloso de Bremia sobre plantones de lechuga.
Ejemplo 9 Eficacia de AQ713 contra enfermedades de plantas (prueba de invernadero) Añublo velloso de la uva
Se cultivó AQ713 en un medio basado en soja en un fermentador de 400 litros durante 48 horas. Se pulverizaron plantas de uva (variedad Chardonnay) con un pulverizador manual hasta el escurrimiento con caldo completo de la operación de fermentación de 400 litros diluido con agua estéril a concentraciones 0,5X y 0,25X. Cuando se secó el follaje, se pulverizaron las plantas por segunda vez. Después de secar, las plantas fueron inoculadas con el patógeno que causa el añublo velloso de la uva, Plasmopara viticola. Se trataron tres plantas por cada dosis. Se evaluó cada planta estimando el porcentaje de control de la enfermedad en base a una escala del 0 al 100% de control. El 100% de control es una planta sin lesiones visibles. Se usó un fungicida químico, metalaxilo, como comparación. Los resultados fueron los siguientes:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 AQ713 caldo completo 0,5X \+  \hskip1cm  \+ 97,7% de
control\cr  AQ713 caldo completo 0,25X  \+ \+ 100% de control\cr 
Metalaxilo 30 ppm  \+ \+ 100% de control\cr  Metalaxilo 10 ppm \+ \+
98,3% de control\cr  Metalaxilo 1 ppm  \+ \+ 80% de
control\cr}
Los resultados demuestran que AQ713 efectuaba el control del añublo velloso de la uva del mismo modo que el fungicida químico.
Ejemplo 10 Eficacia de AQ713 contra el añublo pulverulento de la calabaza
Se cultivó AQ713 en un medio basado en soja en un fermentador de 400 litros durante 48 horas. Se pulverizaron plantas de calabaza (Crookneck y Acorn) con un pulverizador manual hasta el escurrimiento con caldo completo de la operación de fermentación de 400 litros y una muestra diluida con agua estéril a una concentración 0,5X. Después de secar, las plantas fueron inoculadas con el patógeno del añublo pulverulento de la calabaza, Sphaerotheca fuliginea. Se trataron dos plantas por cada dosis. También se estudió polvo deshidratado por aspersión del caldo completo. Se deshidrató por aspersión el caldo de la fermentación de 400 litros para eliminar el agua. Se pulverizaron soluciones de polvo deshidratado por aspersión al 10% y al 2,5% sobre las plantas hasta el escurrimiento como antes. Se valoró la incidencia de la enfermedad del añublo pulverulento según una puntuación de 0 a 5. La puntuación de 5 es un 100% de enfermedad, mientras que la puntuación de 0 es ausencia de enfermedad. En a Tabla 9 siguiente se muestran los resultados.
TABLA 9
Suspensión de ensayo Calabaza Acorn Calabaza Acorn Calabaza Crookneck Calabaza Crookneck
Planta 1 Planta 2 Planta 1 Planta 2
AQ713 caldo 0 0 0 0
completo 1X
AQ713 caldo 0 0 0 0
completo 0,5X
AQ713 polvo 0 0 0 0
deshidratado por
aspersión 10%
AQ713 polvo 0 0 0,5 1
deshidratado por
aspersión 2,5%
El caldo completo de AQ713 y el polvo deshidratado por aspersión proporcionaron un control casi completo del añublo pulverulento de la calabaza.
Ejemplo 11 Eficacia de AQ713 sobre el añublo tardío, el moho gris, el añublo pulverulento de la uva, el añublo pulverulento de los cereales, el añublo de las vainas y el tizón del arroz en el invernadero
Se cultivó AQ713 en un medio basado en soja durante 72 horas en un matraz en agitación de 250 ml. En la siguiente Tabla 10 se indican la enfermedad, el patógeno causante y el hospedador. Este cultivo en caldo completo fue estudiado sobre las plantas según se muestra en la siguiente Tabla 11.
TABLA 10
Enfermedad Patógeno de las plantas Hospedador
Añublo tardío Phytophthora infestans Tomate
Hongo gris Botrytis cinerea Pimiento
Añublo de las vainas Rhizoctonia solani Arroz
Tizón del arroz Pyricularia oryzae Arroz
Añublo pulverulento Uncinula necator Uva
Añublo pulverulento Drysiphe graminis f. sp. graminis Trigo
Se pulverizó cada caldo hasta el escurrimiento a una concentración 1X sobre las plantas de ensayo con un pulverizador manual, se dejaron secar y se pulverizaron después por segunda vez. Se trataron tres plantas por cada enfermedad y tratamiento. Después de secar, las plantas fueron inoculadas con los patógenos. Cada planta fue evaluada estimando el porcentaje de control de enfermedad en base a una escala del 0 al 100% de control; el 100% de control se refiere a una planta sin lesiones visibles. Se usaron fungicidas químicos para hacer la comparación. El índice de enfermedad es la gravedad de la enfermedad sobre el control no tratado.
TABLA 11
P. infestans B. cinerea E. graminis U. necator P. oryzae R. solani
AQ713 70 100 84 100 100 100
Metalaxilo 30 ppm 100
Metalaxilo 10 ppm 77
Propiconazol 10 ppm 87
Propiconazol 5 ppm 57
Propiconazol 0,5 ppm 100
Propiconazol 0,2 ppm 54
Miclobutanilo 30 ppm 100
Miclobutanilo 10 ppm 100
Pencicurón 50 ppm 100
Pencicurón 10 ppm 100
Benomilo 100 ppm 100
Benomilo 40 ppm 77
Índice de enfermedad (%) 80 95 70 50 60 80
AQ713 mostró actividad equivalente a los fungicidas químicos en todos los patógenos estudiados.
Ejemplo 12 Eficacia de AQ713 contra el añublo velloso de Brassica
Se cultivó la cepa de Bacillus AQ713 en u fermentador de diez litros en un medio basado en soja durante 48 horas. Se pulverizó el cultivo en caldo completo a una concentración 1X sobre plantas de coliflor y de coles de Bruselas de tres semanas de edad en el estadío de cotiledones completos con un aerógrafo de dibujante impulsado por aire comprimido. Se pulverizaron tres réplicas de 15-25 plantones/tiesto por tratamiento. Se pulverizo también Quadris™, un fungicida de azoxiestrobina de Zeneca, sobre las plantas (tres por tratamiento) a proporciones de 250 ppm y de 125 ppm. Se pulverizó una suspensión de esporas de añublo velloso, Peronospora parasitica, a 1-5 x 10^{4} esporas/ml, sobre plantas de Brassica después de secarse las pulverizaciones de AQ713 y de Quadris. Se mantuvieron las plantas a 15-17ºC durante 24 horas para la infección y se incubaron luego los plantones a 20-24ºC durante seis días. Se devolvieron los tiestos a 15-17ºC durante la noche ara permitir la esporulación del patógeno hasta valorar la prueba. Se evaluó cada planta estimando el porcentaje de control de la enfermedad en base a una escala del 0 al 100% de control. El 100% de control es una planta sin lesiones esporulantes. En la siguiente Tabla 12 se muestran los resultados promediados a través de los tiestos de réplicas.
TABLA 12
Lectura tomada el Lectura tomada el Lectura tomada el
23 de Diciembre 30 de Diciembre 6 de Enero
Caldo completo AQ713 100 90 75
Quadris 250 ppm 100 NE NE
Quadris 125 ppm NE 100 100
Control de agua 0 0 0
NE = No estudiado
AQ713 controlaba el añublo velloso efectivamente durante tres semanas de duración.
Ejemplo 13 Sinergismo de AQ713 y un fungicida comercial
Se cultivó AQ713 en un fermentador de diez litros en un medio basado en soja durante 72 horas. Se diluyó el cultivo bacteriano con agua estéril a concentraciones 0,5X y 0,25X. Se pulverizó el cultivo a concentraciones 1X, 0,5X y 0,25X sobre plantas de pepino de tres semanas de edad con un aerógrafo de dibujante impulsado por aire comprimido. Se pulverizaron tres plantas por tratamiento. Se pulverizó también Quadris™, un fungicida de azoxiestrobina de Zeneca, sobre las plantas (tres por tratamiento) a concentraciones de 500 ppm, 250 ppm y 125 ppm. Además, se pulverizaron combinaciones de Quadris más el cultivo en caldo completo de AQ713 en una proporción 1:1 sobre plantas de pepino (tres por tratamiento). En la siguiente Tabla 13 se señalan los tratamientos con y sin Quadris. Se pulverizó una suspensión de esporas de Botrytis cinerea, hongo gris, a 1 x 10^{6} esporas/ml sobre las plantas de pepino después de secarse las pulverizaciones de AQ713 y Quadris. Se mantuvieron las plantas a 20-22ºC durante 3 días hasta que se valoró la prueba. Se valoró la incidencia de enfermedad del moho gris con una puntuación de 0 a 5. La puntuación de 5 indica un 100% de enfermedad, mientras que la puntuación de 0 indica ausencia de enfermedad. Los resultados son mostrados en la siguiente Tabla 13.
TABLA 13
Tratamiento Puntuación Réplica 1 Puntuación Réplica 2 Puntuación Réplica 3 Puntuación media
AQ713 1X 0,5 0,5 1,5 0,8
AQ713 0,5X 2,0 2,5 2,0 2,2
AQ713 0,25X 3,0 3,0 2,0 2,7
Quadris 500 ppm 4,0 3,5 4,0 3,8
Quadris 250 ppm 2,5 3,5 3,0 3,0
AQ713 1X + 0,5 1,0 1,0 0,8
Quadris 500 ppm
TABLA 13 (continuación)
Tratamiento Puntuación Réplica 1 Puntuación Réplica 2 Puntuación Réplica 3 Puntuación media
AQ713 1X + 1,0 1,0 0,5 0,8
Quadris 250 ppm
AQ713 0,5X + 0,5 1,0 1,0 0,8
Quadris 250 ppm
AQ713 0,25X + 0,5 1,0 2,5 1,3
250 ppm
Control de agua 4,0 5,0 5,0 4,7
Control de agua 2 5,0 5,0 5,0 5,0
Los resultados demuestran claramente que las combinaciones de Quadris y AQ713 controlan la enfermedad del moho gris significativamente mejor que Quadris o AQ713 por sí solos.

Claims (12)

1. Cepa de Bacillus subtilis AQ713 depositada en NRRL con Nº de Acceso B-21661 o un mutante de dicha cepa, donde el mutante exhibe actividad antifúngica y antibacteriana y actividad contra el gusano de la raíz del maíz.
2. La cepa de la reivindicación 1, que es la cepa de Bacillus subtilis AQ713 depositada en NRRL con Nº de Acceso B-21661.
3. Un cultivo en caldo completo de la cepa de la reivindicación 1 ó 2.
4. Un sobrenadante obtenido de un cultivo de la cepa de la reivindicación 1 ó 2 que exhibe actividad antifúngica y antibacteriana y actividad contra el gusano de la raíz del maíz.
5. Una composición consistente en
(i)
la cepa de a reivindicación 1 ó 2,
(ii)
el cultivo en caldo completo de la reivindicación 3 ó
(iii)
el sobrenadante de la reivindicación 4
y un fungicida químico o un pesticida biológico o químico.
6. La composición de la reivindicación 5, que además incluye un fungicida químico.
7. Un método de protección o de tratamiento de plantas y frutos frente a infecciones fúngicas o bacterianas o a infestaciones por el gusano de la raíz del maíz, consistente en aplicar una cantidad efectiva de la cepa de la reivindicación 1 ó 2, del cultivo en caldo completo de la reivindicación 3, del sobrenadante de la reivindicación 4 ó de la composición de la reivindicación 5 ó 6.
8. El método de la reivindicación 7, donde las infecciones están causadas por al menos un microorganismo seleccionado entre el grupo consistente en Phytophthora infestans, Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, Botrytis cinerea, Alternaria solani, Colletotrichum cocodes, Alternaria brassiciola, Cladosporium cucumerinum, Monilinia fructicola, Venturia pyrina, Acidovorax avenae, Pseudomonas syringae, Xanthomonas campestris, Erwinia carotovora, Clavibacter michiganense, Plasmopara viticola, Sphaerotheca fuliginea, Uncinula necator y Peronospora parasitica.
9. El método de la reivindicación 7 ó 8, donde la cepa es aplicada como polvos humectables, gránulos, fluidos o microencapsulaciones.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, donde la cepa de la reivindicación 1 ó 2, el cultivo en caldo completo de la reivindicación 3, el sobrenadante de la reivindicación 4 o el sobrenadante de la reivindicación 5 ó 6 son aplicados a las raíces de las plantas o al suelo alrededor de las raíces.
11. Una composición consistente en una iturina A, una plipastatina, una surfactina y una agrastatina, donde dichos compuestos son obtenibles de una cepa de la reivindicación 1 ó 2.
12. Un método de protección o de tratamiento de las plantas y de los frutos frente a infecciones fúngicas o bacterianas, consistente en aplicar una cantidad efectiva de la composición de la reivindicación 11 o una composición que contiene un compuesto que tiene la fórmula
5
o un compuesto que tiene la fórmula
6
donde R_{1} es una cadena lateral alifática ramificada o lineal C8-C20, X es Ala o Val, R_{2} es un acetato o un derivado éster y Glx es Gln o Glu.
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