ES2527673T3 - Procedimiento para usar una cepa de Bacillus subtilis para potenciar la salud animal - Google Patents
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Abstract
Una composición que comprende Bacillus subtilis QST713 (número de acceso NRRL: B21661) o un mutante de Bacillus subtilis QST713, en donde el mutante tiene todas las características identificativas de Bacillus subtilis QST173, en donde el mutante tiene una identidad de secuencia de ADN para Bacillus subtilis QST713 de al menos un 95 % para potenciar la salud de un animal distinto de insecto y distinto de ser humano, en donde se incrementa la eficacia de la utilización alimentaria o ganancia de peso del animal distinto de insecto y distinto de ser humano.
Description
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12-01-2015
alimento de los peces) en una cantidad eficaz para potenciar la salud del pez. Dichas cantidades eficaces pueden estar entre aproximadamente 104 y aproximadamente 1010 CFU Bacillus subtilis QST713 por ml de agua para cría, o en otro modo de realización entre aproximadamente 105 y aproximadamente 109 CFU Bacillus subtilis QST713 por ml de agua para cría, o aún en otro modo de realización entre aproximadamente 106 y aproximadamente 108 CFU Bacillus subtilis QST713 por ml de agua para cría.
Los siguientes ejemplos se dan mayoritariamente con fines ilustrativos y no limitantes de la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1 -Estudios in vitro de la eficacia de preparaciones libres de células de QST713 frente a patógenos de animales
Se sometieron a prueba preparaciones libres de células de QST713 para determinar la actividad antimicrobiana frente a Clostridia (Clostridia perfringens ATCC13124 y dos cepas aisladas ambientales de Clostridia perfringens); Listeria (Listeria moncytogenes ATCC 19116 y 19111, Listeria seeligeri ATCC 35968 y Listeria welshimeri ATCC 35897); Salmonella (Salmonella enterica ATCC 10398, Salmonella arizonae ATCC 13314 y Salmonella bongori ATCC 43975); y E. coli, usando las técnicas de Kirby-Bauer y de concentración inhibidora mínima (MIC).
Se prepararon preparaciones libres de células haciendo crecer QST713 en medio correspondiente al medio en el que se hizo crecer el patógeno objetivo, como se muestra en la tabla 1, a continuación, centrifugando el cultivo durante 15 minutos a 3000 rpm a 23 C y filtrándolo a través de una unidad de filtro Nalgene de 0,45 μm. Para someter a prueba la estabilidad térmica, se calentó una parte de la preparación libre de células hasta 50 ºC durante una hora antes de cada uno de las pruebas de Kirby-Bauer y MIC.
Tabla 2
- Género
- Especie/ATCC Medio de crecimiento Condiciones para crecimiento
- Clostridia
- Perfringens ATCC 13124 Medio de Clostridial reforzado (n.º cat. Oxoid CM0149). Crecimiento durante la noche en el recipiente AnaeroPak como antes con 1 bolsita de MGC Anaero-Indicator (n.º cat. Remel 68-3001)
- Clostridia
- Cepa aislada ambiental de Perfringens Igual que antes Igual que antes
- Clostridia
- Cepa aislada ambiental de Perfringens Igual que antes Igual que antes
- Listeria
- monocytogenes ATCC 19116 Caldo de infusión de cerebro-corazón Durante la noche a 37 ºC
- Listeria
- monocytogenes ATCC 19111 Igual que antes Igual que antes
- Listeria
- seeligeri ATCC 35968 Igual que antes Igual que antes
- Listeria
- welshimeri ATCC 35897 Igual que antes Igual que antes
- Salmonella
- enterica ATCC 10398 Caldo con triptona y soja Igual que antes
- Salmonella
- arizonae ATCC 13314 Igual que antes Igual que antes
- Salmonella
- bongori ATCC 43975 Igual que antes Igual que antes
En los experimentos de Kirby-Bauer, se sumergieron 2 mm de discos de papel de filtro estéril en sobrenadante de QST713 y se secaron al aire bajo condiciones estériles. A continuación, se colocaron estos discos sobre césped del patógeno objetivo, se incubaron durante la noche y se midieron las zonas de inhibición. Se observaron las zonas de inhibición para los objetivos Clostridia y Listeria.
En la técnica de MIC, se inocularon pocillos de placas de microlitro con 75 ul de cada patógeno objetivo, se diluyeron hasta 1 x 105. La preparación libre de células descrita anteriormente se añadió a cada pocillo a diluciones finales de 1:2, 1:10 y 1:50. Las placas se incubaron durante la noche a 37 ºC y OD600 y se leyeron con un lector de microvaloración Wallach. La preparación libre de células (con tratamiento térmico y sin tratamiento térmico) era significativamente eficaz frente a los objetivos Clostridia y Listeria e inhibió el crecimiento de Salmonella y E. coli, aunque no se observaron zonas de inhibición para estos dos últimos patógenos sobre placas de Kirby-Bauer. Los datos para Clostridia, Listeria y Salmonella se muestran en las figuras 1-6.
Ejemplo 2 -Estudios in vitro de la eficacia de QST713 frente a varias bacterias
Se sometió a prueba una formulación en polvo de Bacillus subtilis QST713 para determinar la eficacia frente a varias cepas aisladas ambientales de las siguientes bacterias: Clostridium perfringens, Escherichia coli, Samonella
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enteritidis, Campylobacter jejuni y Listeria monocytogenes. Se preparó esta formulación en polvo fermentando Bacillus subtilis QST713, concentrando el caldo de fermentación, y secando, como se describe anteriormente en la Descripción detallada de la invención. Tenía un 14,6 % de caldo concentrado, seco, y 85,4 % de productos inertes de formulación (elegidos de las posibilidades descritas anteriormente) y contenía como mínimo aproximadamente 7,3 x 5 109 CFU Bacillus subtilis/gramo y como máximo aproximadamente 1x 1010 CFU Bacillus subtilis/gramo. Esta formulación se denominará Composición 1. Se prepararon soluciones madre de la composición 1 añadiendo 0,2 gramos del polvo formulado a 1,8 ml de agua destilada estéril, de modo que la solución contenía aproximadamente 1x10 CFU Bacillus subtilis por ml. Se sembraron los organismos de prueba para agar con triptano y soja con sangre de oveja al 5 % con hasta cuatro organismos sembrados para una placa de agar individual cada uno en una línea 10 individual que biseca la placa de agar. Se dejó que los organismos se secaran durante la noche. A continuación, se sembraron las placas inoculadas con la suspensión de QST713 formulada descrita anteriormente, que se cultivó perpendicular a los organismos de prueba. Se incubaron las cepas aisladas Clostridium perfringens y Campylobacter jejuni en una atmósfera de gas Campy (10 % CO2, 5 % O2, 8 % N2) a 41 ± 2 C durante la noche. Las otras cepas aisladas, que son aerobias, se incubaron en 36±2 durante la noche sin gas Campy. La QST713 provocó la inhibición 15 de varios de las cepas aisladas de Clostridium perfringens, Salmonella enteritidis, Campylobacter jejuni y Listeria monocytogenes, aunque no provocó la inhibición de E. coli. Además, en algunos casos, la Bacillus subtilis QST713 mostró un crecimiento excesivo competitivo agresivo de las bacterias patógenas. Los resultados se resumen en la tabla a continuación. Se midieron las zonas de inhibición informadas en la tabla, desde el borde del crecimiento de Bacillus hasta el comienzo del crecimiento del organismo de prueba. Además, las fotografías de las placas de
20 Clostridium perfringens y Campylobacter jejuni se muestran en las figuras 7 y 8, respectivamente.
Tabla 3
- Nombre del cultivo
- ID cepa aislada Atmósfera y temperatura Zona de inhibición (mm) Comentarios
- Clostridium perfringens
- CL-2 Gas Campy, 41 ºC 0 Ligera inhibición del crecimiento aunque en ninguna zona, aglomeración de Bacillus
- CL-3
- 3
- CL-14
- 0 Aglomeración de Bacillus
- CL-15
- 0 Aglomeración de Bacillus
- Escherichia coli O157
- EC-80 Aerobio, 36 ºC 0
- EC-81
- 0
- EC-82
- 0
- Salmonella enteritidis
- SE27 Aerobio, 36 ºC 0
- SE28
- 2
- SE29
- 1
- SE03
- 1
- SE09
- 1
- SE22
- 0
- Campylobacter jejuni
- Cj-1 Gas Campy, 41 ºC 1 Aglomeración de Bacillus
- Cj-2
- 0 Ligera inhibición del crecimiento aunque en ninguna zona, aglomeración de Bacillus
- NCj1
- 0 Aglomeración de Bacillus
- NCj2
- 1
- Listeria monocytogenes
- LM1 Aerobio, 36 ºC 2
Ejemplo 3 -Estudios in vivo de QST713 en pollos de engorde
Se añadió la composición 1 a las dietas de iniciación y finalización de los pollos de engorde y se observaron la ganancia de peso y la eficacia del pienso. Se separaron aleatoriamente 252 pollos de engorde Jumbo Cornish Cross 25 en cuatro grupos y se les dio una de las dietas enumeradas a continuación.
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- •
- Dieta basal sólo -control
- •
- Dieta basal + 0,05 % de CALSPORIN® (0,5 g/kg; 106 CFU/g) (designada como CS en la tabla a continuación)
- •
- Dieta basal + 0,05 % de Composición 1 (0,5 g/kg; 106 CFU/g) (designada como Comp. 1 -10 en la tabla a continuación)
5 • Dieta basal + 0,0005 % de Composición 1 (0,5 mg/kg; 103 CFU/g) (designada como Comp. 1-103 en la tabla a continuación)
La dieta basal consistía en la siguiente dieta de iniciación durante los días 1-22 y la siguiente dieta de finalización durante los días 22-42.
Tabla 4 -Composición de ingredientes de las dietas basales de iniciación (d 1 a 21) y finalización (d 22 a 42) para los 10 pollos de engorde
- Ingrediente %
- Iniciador Finalización
- Maíz
- 45,6 49,2
- Harina de soja (48 % CP)
- 23,5 16,8
- Granos secos de destilería
- 5,0 5,0
- Harina de gluten de maíz
- 2,0 4,0
- Harina de pescado
- 1,0 2,5
- Harina de alfalfa
- - 0,5
- Vitamina, mineral, otro
- 22,9 22,0
Los resultados a continuación en la tabla 5 muestran que la composición 1 mejoró la ganancia de peso de las aves al nivel de 106 CFU/g. Se mejoró la eficacia del pienso durante el periodo de los días 21-42 y para el periodo de crecimiento global (1-42 días). En el gráfico a continuación, ADG se refiere al promedio de ganancia diaria, ADFI se refiere al promedio de la ingesta de pienso diaria.
15 Tabla 5 -Efecto del tratamiento dietético sobre el rendimiento de pollos de engorde
- Tratamiento
- Apartado
- Control CS Comp. 1-106 Comp. 1-103
- Peso corporal, g
- d 1
- 40,5 ± 0,43 40,0 ± 0,40 40,8 ± 0,43 40,7 ± 0,43
- d 21
- 861,8 ±22,3 815,6 ±20,3 880,0 ± 22,3 842,3 ± 22,3
- d 42
- 2494,4±66,7 2469,0± 60,9 2617,0 ±66,7 2460,3 ± 66,7
- ADG, g
- d 1-21
- 39,8 ±0,89 37,7±0,81 39,8±0,89 38,9 ±0,89
- d 21-42
- 77,9 ±3,18 77,5 ±2,90 82,5 ±3,18 78,3 ±3,18
- d 1-42
- 58,4 ±1,46 57,8 ±1,33 61,3 ±1,46 57,9 ±1,46
- ADFI, g
- d 1-21
- 57,3±1,15 55,9 ±1,05 59,4 ±1,15 57,6 ±1,15
- d 21-42
- 156,6 ±3,56 158,3 ±3,25 155,3 ±3,56 158,7±3,56
- d 1-42
- 105,2 ±2,30 104,9 ±2,10 106,6 ±2,30 106,7 ±2,30
- Ganancia:Pienso, g/g
- d 1-21
- 0,69 ±0.015 0,67± 0.014 0,66 ±0.015 0,67± 0.015
- d 21-42
- 0,50 ± 0.024 0,50 ± 0.022 0,52 ± 0.024 0,49 ± 0.024
- d 1-42
- 0,50 ±0.022 0,51 ±0.020 0,52 ± -0.022 0,48 ± 0.022
- Mortalidad, n
- 1,2 ±0,51 1,2±0,46 1,4 ±0,51 1,4 ±0,51
Ejemplo 4 -Estabilidad de QST713 en el procedimiento de granulado de pienso
Para determinar la estabilidad de Bacillus subtilis QST713 durante el procedimiento de granulado de pienso, se prepararon pellas de pienso que contenían la composición 1 y se sometieron a prueba las muestras a varias temperaturas. El pienso de control contenía los ingredientes mostrados en la tabla 6, mientras que el pienso
20 experimental se complementó con un 8 % de la composición 1.
11
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imagen1
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