BR112015028692B1

BR112015028692B1 - Aditivo de alimentação e composição farmacêutica para prevenção ou terapia de mastite de vacas

Info

Publication number: BR112015028692B1
Application number: BR112015028692-5A
Authority: BR
Inventors: Nobuhisa Ashida; Tomokazu Imabayashi; Hisashi Aso
Original assignee: Asahi Biocycle Co., Ltd
Priority date: 2013-05-17
Filing date: 2014-05-16
Publication date: 2022-03-03
Also published as: AU2014266266B2; EP3031464A4; BR112015028692A8; JP6415430B2; EP3031464A1; EP3031464B1; US10251918B2; CN105358166A; JP2018165272A; NZ715248A; WO2014185516A1; AU2014266266A1; JPWO2014185516A1; TW201524512A; TWI687224B; US20160120919A1; CN105358166B

Abstract

AGENTE PREVENTIVO OU TERAPÊUTICO PARA MASTITE DE ANIMAL RUMINANTE. A presente invenção refere-se a uma substância ou processo para prevenção ou tratamento de mastite em animais ruminantes, particularmente em vacas leiteiras. São especificamente providos: um agente preventivo ou terapêutico, um aditivo de alimentação, uma alimentação, e uma composição farmacêutica para mastite de animal ruminante, caracterizado por compreender, como um ingrediente ativo, uma bactéria do gênero Bacillus tendo a propriedade de ser capaz de aumentar ou manter portão 2 de célula dendrítica de sangue CD172a+ CD11c+ em vacas.

Description

Campo Técnico

[0001] A presente invenção refere-se a um agente preventivo ou terapêutico, um aditivo de alimentação, uma alimentação, ou uma composição farmacêutica para a prevenção ou terapia de mastite em animais ruminantes, como vacas, compreendendo bactérias do gênero Bacillus tendo uma certa propriedade como um ingrediente ativo. Antecedentes da Técnica

[0002] Mastite é a inflamação de tecidos mamários, e a maioria de suas causas são devido à infecção de bactérias, como Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus, e Pseudomonas aeruginosa. Particularmente, mastite em vacas é um problema importante para fazendeiros de laticínios, como descrito abaixo.

[0003] Mastite é grosseiramente dividida em mastite clínica e mastite subclínica (também referida como mastite não clínica). Na mastite clínica, anormalidades macroscópicas, tais como intumescimento vermelho, febre, e dor da mama ou a contaminação de leite com coágulos são observadas, enquanto na mastite subclínica, inflamação ocorre na glândula mamária sem anormalidades como em mastite clínica. A mastite subclínica é muito maior na porcentagem de ocorrência, e cerca de 25 a 50% de vacas leiteiras são ditas sofrerem da doença.

[0004] Com relação ao início de mastite em vacas, a presente situação é que não é tomada uma contra medida suficiente de prevenção de mastite antes de seu início ou terapia de vacas afetadas com mastite, o que é um grande problema na indústria de leite. De acordo com “o número de vacas tendo acidentes de doenças classificados por tipos de doenças” reportado em Statistical Tables of Livestock Mutual Relief, 2009 no Japão, cerca de 1 410 000 vacas tiveram doenças urinárias, das quais cerca de 90 por cento tiveram mastite. Também no número de vacas tendo morte ou acidentes de desuso classificados por tipos de doença, 9% de cerca de 160 000 tiveram doenças urinárias. Assim, no ano fiscal de 2009 sozinho, vacas afetadas com mastite foram cerca de 420 000 em número, e o número de vacas descartadas totaliza 15 000. Em adição, o início de mastite reduz qualidade de leite e rendimento de leite, resultando em incalculável perda econômica. Terapia para mastite é realizada através de administração de antibióticos; entretanto, tal terapia frequentemente não resulta em cura completa e atualmente não existe outro processo que não isolamento. Mesmo se a administração de antibiótico conduziu a uma cura completa, leite durante sua administração não pode ser transportado; assim, perda econômica devido a mastite é dita ser estimada a cerca de cem bilhões de yen no Japão. Em adição à perda econômica direta, a carga de trabalho e o custo de prescrição associado com a terapia de vacas infectadas com mastite não são desprezíveis. Ainda, efeitos colaterais são concebíveis, tal como que vacas leiteiras tendo o início de mastite têm uma probabilidade extremamente alta de terem o início de mastite durante o subsequente período de lactação após liberação e que vacas leiteiras afetadas com mastite têm estro. Como tal, em adição a um meio para prevenção ou terapia eficaz de mastite procurado na indústria de leite, há uma urgente necessidade de estabelecimento de uma técnica para prevenção, ou supressão de recorrência de mastite.

[0005] Várias propostas foram feitas para a prevenção ou terapia de mastite em animais ruminantes, tais como vacas. Entre estes agentes preventivos ou terapêuticos propostos, alguns exemplos usando micro-organismos para a prevenção ou terapia de mastite foram em particular reportados.

[0006] Por exemplo, Literatura de Patente 1 mostra uma composição para a prevenção ou terapia de mastite em vacas, compreendendo uma composição de cultura obtida em uma cultura de um micro-organismo pertencendo ao gênero Aureobasidium como um ingrediente ativo.

[0007] A Literatura de patente 2 mostra uma composição para a prevenção ou terapia de mastite de gado, compreendendo células de levedura de padeiro viáveis ou seus conteúdos como um ingrediente ativo.

[0008] Outros exemplos do uso de um agente bacteriano viável em vacas leiteiras incluem o uso de Natokin-L (bactéria de ácido láctico e Bacillus subtilis), pulverizado bacteriano Miyairi (bactéria de ácido butírico), Biosuri (bactéria de ácido láctico, bactéria de sacarificação, e bactéria de ácido butírico), e Bovactin (bactéria de ácido láctico e bactéria de ácido butírico) para a prevenção / terapia de diarreia simples (Literatura de Não Patente1). A Tabela 2 nesta literatura descreve que a incidência de mastite foi diminuída através do uso de um agente bacteriano viável; entretanto, não é mostrado o que era o agente bacteriano. Neste sentido, entre os agentes bacterianos viáveis listados na Tabela 1 da literatura, “Biosuri” é agora usado em 80 a 90% dos casos de administração de agente bacteriano viável para vacas leiteiras; assim, o agente bacteriano viável usado na Tabela 2 é presumido ser provavelmente “Biosuri”. Agentes bacterianos viáveis incluindo Biotop (Bacillus subtilis) são conhecidos por terem efeitos, como a diminuição drástica de ocorrência de timpanismo, estimulação de apetite, e tornando o pelo brilhante, assim como efeitos, como diminuição de número de vacas excretando Salmonella (Literatura de Não Patente 2).

[0009] Em adição o mesmo requerente como o requerente deste pedido de patente ensina o uso de células viáveis de Bacillus subtilis como um agente para aperfeiçoamento de eficiência de utilização de alimentação para animais ruminantes (Literatura de Patente 3). O aperfeiçoamento da eficiência de utilização nesta literatura é o aperfeiçoamento da eficiência de absorção de digestão, que aperfeiçoa rendimento de leite e qualidade de leite em vacas leiteiras. O mesmo requerente como o requerente deste pedido de patente também ensina um aditivo de alimentação preparado através de mistura de Bacillus subtilis cepa C-3102 com vitaminas, minerais, aminoácidos e semelhantes (Literatura de Patente 4). Além disso, Lieratura de Patente 5 descreve o uso de Bacillus subtilis para redução de crescimento de bactérias patogênicas entéricas em animais, tais como animais ruminantes. Entretanto, Literaturas de Patente 3, 4 e 5 não descrevem que Bacillus subtilis é útil para a prevenção e terapia de mastite em vacas. Literatura da Técnica Anterior Literatura de Patente Literatura de Patente 1

[0010] Publicação de Patente JP (Kokai) No. 2012-126657 A Literatura de Patente 2

[0011] Publicação de Patente JP (Kokai) No. 2001-224317 A Literatura de Patente 3

[0012] Publicação Internacional WO 2011/115306 Literatura de Patente 4

[0013] Publicação de Patente JP (Kokai) No. 64-86842 A (1989) Literatura de Patente 5

[0014] Publicação de Patente JP (Kohyo) No. 2012-502920 A Literatura Não Patente Literatura não patente 1

[0015] Yasunori Saito, Journal of Clinical Veterinary Medicine, Sep. 2010, vol. 28, no. 9 Literatura não patente 2

[0016] Nissan Johhoh (Nissan Information), vol. 34, Aug. 2006, Nissan Gosei Kogyo Co., Ltd. Sumário da Invenção Problema a ser resolvido pela invenção

[0017] Como descrito em Antecedentes da Técnica, há uma forte necessidade de um meio para prevenção ou eficaz terapia de mastite de vacas na indústria de leite.

[0018] Assim, um objeto da presente invenção é prover um agente ou composição farmacêutica ou um processo para prevenção e/ou terapia de mastite de vaca.

Meios para resolver o problema

[0019] Os presentes inventores verificaram que certas bactérias do gênero Bacillus exercem um efeito preventivo de mastite sendo providas (ou administradas ou ingeridas) para vacas, especialmente vacas leiteiras e ainda que as bactérias aperfeiçoam um efeito terapêutico sobre mastite após seu início.

[0020] Assim, a presente invenção abrange as seguintes características. [1] Um agente preventivo ou terapêutico para mastite de animal ruminante, compreendendo, como um ingrediente ativo, uma bactéria de gênero Bacillus tendo a propriedade de (1) descrito abaixo: (1) ser capaz de aumentar ou manter portão 2 de célula dendrítica de sangue CD172a+ CD11c+ em uma vaca. [2] O agente preventivo ou terapêutico de acordo com [1], onde a bactéria de gênero Bacillus ainda tem a propriedade de (2) descrito abaixo: [3] tendo uma atividade de crescimento de Bifidobacterium de Bacillus subtilis cepa C-3102 (número de acesso internacional: FERM BP-1096) é mostrado em 1. [4] O agente preventivo ou terapêutico de acordo com [1] ou [2], onde a bactéria gênero Bacillus tem a propriedade de (3) descrito abaixo: [5] tendo atividades protease e amilase de mais que 0,7 quando ambas, a atividade protease e a atividade amilase de Bacillus subtilis cepa C-3102 (número de acesso internacional: FERM BP-1096) são fixadas em 1. [6] O agente preventivo ou terapêutico de acordo com qualquer um de [1] a [3], onde a bactéria de gênero Bacillus tem a propriedade de (4) descrito abaixo: [7] ser capaz de obter a prevenção ou terapia de mastite quando administrado oralmente a uma vaca em uma dose de 1x105 células / dia / animal ou mais.

[0021] O agente preventivo ou terapêutico de acordo com qualquer de [1] a [4], onde o animal ruminante é uma vaca. [6] O agente preventivo ou terapêutico de acordo com qualquer um de [4] a [5], onde a administração oral na propriedade (4) é realizada por um período de 1 mês antes de liberação de vaca a 3 meses após a liberação. [7] O agente preventivo ou terapêutico de acordo com qualquer um de [1] a [6], onde a bactéria de gênero Bacillus é uma bactéria Bacillus subtilis. [8] O agente preventivo ou terapêutico de acordo com [7], onde a bactéria Bacillus subtilis é Bacillus subtilis cepa C-3102 (número de acesso internacional: FERM BP-1096), ou uma variante da cepa C-3102 tendo a propriedade (1), as propriedades (1) e (2), as propriedades (1) e (3), as propriedades (1) a (3), as propriedades (1) e (4), as propriedades (1), (3), e (4), ou as propriedades (1) a (4). [9] Um aditivo de alimentação para a prevenção ou terapia de mastite em animal ruminante, compreendendo o agente preventivo ou terapêutico de acordo com qualquer um de [1] a [8] como um ingrediente ativo. [10] O aditivo de alimentação de acordo com [9], ainda compreendendo um antibiótico para a terapia de mastite. [11] Uma alimentação tendo um aperfeiçoado efeito preventivo ou terapêutico sobre mastite de animal ruminante, compreendendo uma quantidade eficaz do aditivo de alimentação de acordo com [9] ou [10] para a prevenção ou terapia de mastite de animal ruminante. [12] Um processo de aperfeiçoamento de um efeito preventivo ou terapêutico de uma alimentação para animais ruminantes sobre mastite de animal ruminante, compreendendo adição de uma quantidade eficaz do aditivo de alimentação de acordo com [9] ou [10] para a prevenção ou terapia da mastite de animal ruminante, à alimentação para animais ruminantes. [13] Uma composição farmacêutica para a prevenção ou terapia de mastite de animal ruminante, compreendendo uma bactéria de gênero Bacillus como um ingrediente ativo, tendo a propriedade de (1) descrito abaixo: (1) sendo capaz de aumentar ou manter portão 2 de célula dendrítica de sangue CD172a+ CD11c+ em uma vaca, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável. [14] A composição farmacêutica para a prevenção ou terapia de acordo com [13], onde a bactéria do gênero de Bacillus ainda tem a propriedade de (2) descrito abaixo: [15] tendo uma atividade de crescimento de Bifidobacterium de mais que 0,8 quando a atividade de crescimento de Bifidobacterium de Bacillus subtilis cepa C-3102 (número de acesso internacional: FERM BP-1096) é fixado como 1. [16] A composição farmacêutica para a prevenção ou terapia de acordo com [13] ou [14], onde a bactéria de gênero Bacillus tem a propriedade de (3) descrito abaixo: (3) tendo atividades protease e amilase de mais que 0,7 quando ambas, a atividade protease e a atividade amilase de Bacillus subtilis cepa C-3102 (número de acesso internacional: FERM BP-1096) são fixadas em 1. [17] A composição farmacêutica para a prevenção ou terapia de acordo com qualquer um de [13] a [15], onde a bactéria do gênero Bacillus tem a propriedade de (4) descrito abaixo: (4) sendo capaz de obter a prevenção ou terapia de mastite quando administrada oralmente a uma vaca em uma dose de 1x105 células / dia / animal ou mais. [18] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [13] a [16], onde o animal ruminante é uma vaca. [19] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [13] a [17], onde a vaca é uma vaca leiteira saudável, uma vaca leiteira com o risco de início de mastite, uma vaca leiteira afetada com mastite, ou uma vaca leiteira tendo uma história de mastite. [20] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [16] a [18], onde a administração na propriedade (4) é realizada por um período de 1 mês antes de liberação de vaca ou 3 meses após a liberação. [21] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [13] a [19], onde a bactéria gênero Bacillus é uma bactéria Bacillus subtilis. [22] A composição farmacêutica de acordo com [20], onde a bactéria Bacillus subtilis é Bacillus subtilis cepa C-3102 (número de acesso internacional: FERM BP-1096), ou uma variante da cepa C-3102 tendo a propriedade de (1), as propriedades (1) e (2), as propriedades (1) e (3), as propriedades (1) a (3), as propriedades (1) e (4), as propriedades (1), (3), e (4), ou as propriedades (1) a (4). [23] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [13] a [21], ainda compreendendo um antibiótico para a terapia de mastite. [24] Um processo para a prevenção ou terapia de mastite em um animal ruminante, compreendendo administração ou provimento de agente preventivo ou terapêutico de acordo com qualquer um de [1] a [8], o aditivo de alimentação de acordo com [9] ou [10], a alimentação de acordo com [11], ou a composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [13] a [22] a um animal ruminante em necessidade da mesma. [25] O processo de acordo com [23], ainda compreendendo administração de um antibiótico para a terapia de mastite, se necessário.

Efeito de Invenção

[0022] A presente invenção provê bactérias do gênero Bacillus tendo uma certa propriedade, tendo um alto efeito preventivo ou terapêutico na prevenção ou terapia de mastite em animais ruminantes, preferivelmente vacas, mais preferivelmente, vacas leiteiras. Mesmo após os sintomas serem melhorados através de terapia com antibiótico, vacas leiteiras tendo uma história de mastite são conhecidas terem uma probabilidade extremamente alta do início de mastite após cada subsequente liberação; entretanto, o agente preventivo ou terapêutico da presente invenção provê a inesperada eficácia, isto é, que, quando administrado oralmente ou alimentado para as vacas a partir de 1 mês antes de liberação, o agente pode suprimir eficazmente o subsequente início de mastite em vacas e pode, na maioria dos casos, tornar as vacas completamente livres de sintomas.

Breve Descrição de Desenhos

[0023] Fig. 1: Esta figura mostra os painéis demonstrando um aumento em portão 2 de célula dendrítica de sangue CD172a+ CD11c+ em vacas que está correlacionado com o efeito da bactéria Bacillus subtilis usada como um ingrediente ativo na presente invenção sobre melhora de mastite. O painel A mostra esquematicamente as posições ou áreas aproximadas de portão 2 de célula dendrítica de sangue positiva- C172a positiva-CD11c (quando mastite é melhorada, intensidade de expressão de ambas CD172a e CD11c aumentam) e portão 3 (a intensidade de expressão de CD172a é menor quando comparada ao portão 2 de célula) que são detectadas dentro de portão 1 no primeiro quadrante (direita superior). Painel B mostra os resultados das análises de citometria de fluxo de cor dual de células dendríticas de sangue CD172a+ CD11c+ em vacas com mastite crônica (controle), e painel C mostra os resultados de análise de citometria de fluxo de cor dual de células dendríticas de sangue CD172a+ CD11c+ nas vacas leiteiras da seção de teste às quais o agente preventivo ou terapêutico da presente invenção foi administrado (número de vacas: 23: dia 9 após liberação (esquerda) e número de vacas: 15 dia 8 após liberação (direita)). O Painel D mostra os resultados de análise de citometria de fluxo de cor dual de células dendríticas de sangue CD172a+ CD11c+ em vacas leiteiras controles às quais a bactéria Bacillus subtilis não foi administrada (número de vacas 94: dia 8 após liberação (esquerda) e número de vacas 902: dia 10 após liberação (direita)). Modo para Realização de Invenção

[0024] A presente invenção será descrita abaixo em mais detalhes. 1. Agente Preventivo ou Terapêutico

[0025] A presente invenção provê um agente preventivo ou terapêutico para mastite de animal ruminante, compreendendo uma bactéria do gênero Bacillus tendo uma certa propriedade como descrito abaixo, preferivelmente uma bactéria Bacillus subtilis, como um ingrediente ativo.

[0026] A mastite, as bactérias de gênero Bacillus, e o agente preventivo serão descritos abaixo. [1] Mastite

[0027] A mastite aqui usada é mastite em animais ruminantes, preferivelmente vacas, vacas leiteiras, e esta doença inclui mastite clínica e mastite subclínica (também referida como mastite não clínica). Como descrito Nos Antecedentes da Técnica acima, na mastite clínica, anormalidades macroscópicas, como o intumescimento vermelho, febre, e dor da mama ou a contaminação de leite com coágulos são observados, enquanto na mastite subclínica, inflamação ocorre na glândula mamária sem anormalidade como em mastite clínica. A mastite subclínica é muito maior na porcentagem de ocorrência, e cerca de 25 a 50% de vacas leiteiras são ditas sofrerem da doença. A mastite clínica é facilmente completamente curada através de medição com antibiótico, enquanto a mastite subclínica é intratável e não tem cura eficaz, e assim o único meio é tomar medidas, como isolamento de animal infectado.

[0028] Particularmente, em vacas leiteiras tendo o início da mastite acima, especialmente mastite subclínica, a quantidade de secreção de leite e a qualidade de leite são reduzidas e o uso de um agente quimioterapêutico tal como um antibiótico torna a expedição de leite impossível, causando grande perda econômica.

[0029] O agente preventivo ou terapêutico da presente invenção é efetivo contra não somente mastite crônica mas também mastite subclínica. Devido nenhum remédio efetivo para a prevenção ou terapia de mastite subclínica ter sido previamente reportado, o agente preventivo ou terapêutico ou semelhante da presente invenção é importante na indústria de laticínios (leite).

[0030] Como aqui usado, o termo "animal ruminante“ inclui animais de gado, tais como vacas, cabras e carneiros. Particularmente, animais ruminantes secretando / produzindo leite, por exemplo, vacas e cabras são preferíveis. As vacas são preferivelmente vacas leiteiras (por exemplo, espécie Holstein, espécie Jersey, espécie Guernsey, espécie Ayrshire, espécie Kerry, espécie Dairy Shorthorn, espécie Red Danish, e espécie Simmental), especialmente vacas leiteiras saudáveis, vacas leiteiras com o risco de início de mastite, vacas leiteiras afetadas com mastite, ou vacas leiteiras tendo uma história de mastite. O agente preventivo da presente invenção é efetivo especialmente para vacas leiteiras saudáveis, vacas leiteiras com o risco de início de mastite, ou vacas leiteiras saudáveis tendo uma história de mastite, e pode ser usado como um agente terapêutico em vacas leiteiras afetadas com mastite. [2] Bactéria de Gênero Bacillus

[0031] O agente preventivo ou terapêutico da presente invenção compreende, como um ingrediente ativo, uma bactéria do gênero Bacillus tendo as propriedades (1) e opcionalmente (2), como descritas abaixo: (1) a bactéria de gênero Bacillus é capaz de aumentar ou manter portão 2 de célula dendrítica de sangue CD172a+ CD11c+ em uma vaca, e (2) a bactéria de gênero Bacillus tem uma atividade de crescimento de Bifidobacterium de mais que 0,8 quando a atividade de crescimento de Bifidobacterium de Bacillus subtilis cepa C-3102 (número de acesso internacional: FERM BP-1096) é fixado em 1.

[0032] Qualquer uma bactéria de gênero Bacillus tendo as propriedades de (1) e opcionalmente (2) acima pode ser usada como um ingrediente ativo do agente preventivo ou terapêutico da presente invenção.

[0033] Para a propriedade (1) acima, células dendríticas de sangue CD172a+ CD11c+ são células apresentando antígeno, e células positivas-CD172a e positivas CD11c movendo-se através de sangue e regulando imunidade local. Estas células podem ser separadas como células positivas-CD172a e positivas-CD11c através de um sistema de classificação de célula ativada magnética (processo MACS) usando anticorpo anti-CD11c ligado à pérola magnética e anticorpo anti- CD172a ligado á pérola, magnética e uma coluna de separação MACS após coleta de uma população de linfócitos a partir de sangue periférico através de centrifugação de peso específico (2300 rpm, 30 minutos) usando Lympholite-H e ainda separando monócitos, células B, e células T, e as células dendríticas de sangue CD172a+ CD11c+ ainda podem ser analisadas através de um processo de citometria de fluxo de cor dual. As verificações observaram que as células dendríticas de sangue CD172a+ CD11c+ consistiram em 2 populações de células características mostradas dentro de portão 1 no primeiro quadrante em Painel A de Figura 1 (portões 2 e 3) e entre estas populações de células, particularmente portão 2 foi diminuído em vacas afetadas com, ou não tendo se recuperado de, mastite e aumentadas em vacas tendo se recuperado de, ou não tendo o início de, doença através de administração de bactéria Bacillus subtilis da presente invenção; assim, foi verificado, pela primeira vez, que as células dendríticas de sangue CD172a+ CD11c+ foram correlacionadas com a presença ou ausência do início de, ou a presença ou ausência de recuperação de, mastite.

[0034] A partir das verificações acima, é pensado que quando exposição a bactérias ou semelhante causando mastite ocorre em um período quando o risco de ter o início de mastite é alto (um período dentro de 3 meses após liberação, especialmente dentro de cerca de 1 mês após liberação, um aumento no portão 2 de célula dendrítica de sangue CD172a+ CD11c+ evita mastite. Em outras palavras, O agente preventivo ou terapêutico da presente invenção aumenta o portão 2 de célula dendrítica de sangue CD172a+ CD11c+ de um sujeito por administração dependendo do ambiente (por exemplo, situação de contato de bactérias ou dano). Ao contrário, para as vacas afetadas com mastite, o portão 2 de célula dendrítica de sangue CD172a+ CD11c+ não pode ser aumentado para o período da doença. Estabelecido de outro modo, como aqui usado, „sendo capaz de aumentar ou manter portão 2 de célula dendrítica de sangue CD172a+ CD11c+“ como uma das propriedades de bactérias de gênero Bacillus, tal como Bacillus subtilis, significa aumentando, ou mantendo, em um alto nível, a proporção do portão 2 de célula dendrítica de sangue CD172a+ CD11c+ para total de células dendríticas de sangue de um animal de interesse comparada a sua proporção no início de mastite em um período quando o risco de ter o início de mastite é alto, pelo que formando um ambiente imune apropriado para prevenção de início de mastite.

[0035] Para a propriedade (2) acima, o Bacillus subtilis utilizável na presente invenção tem uma característica de ter uma atividade de crescimento de Bifidobacterium de mais que 0,8, preferivelmente mais que 0,9, mais preferivelmente 1 ou mais, quando a atividade de crescimento de Bifidobacterium de Bacillus subtilis cepa C-3102 (número de acesso internacional: FERM BP-1096) é fixado em 1. A atividade de crescimento de Bifidobacterium tem um aspecto associado com aperfeiçoamento imune e não foi previamente reportado estar associado com atividade de crescimento de célula dendrítica; entretanto, se o Bacillus subtilis tem capacidade equivalente (da ordem de 80%) a ou maior que a atividade de crescimento de Bifidobacterium de Bacillus subtilis cepa C-3102, ele é esperado ter um efeito preventivo ou terapêutico sobre mastite através de atividade de crescimento de célula dendrítica.

[0036] A bactéria Bacillus subtilis utilizável na presente invenção ainda pode ter as propriedades de (3) e/ou (4) descritas abaixo: (3) a bactéria Bacillus subtilis tem atividades protease e amilase de mais que 0,7 quando ambas, a atividade protease e a atividade amilase de Bacillus subtilis cepa C-3102 (número de acesso internacional: FERM BP-1096) são fixadas em 1, e/ou (4) a bactéria Bacillus subtilis é capaz de obter a prevenção ou terapia de mastite quando administrada oralmente a uma vaca em uma dose de 1x105 células / dia / animal ou mais.

[0037] Para a propriedade (3), a bactéria de gênero Bacillus utilizável na presente invenção tem uma característica de poder evitar ou melhorar mastite quando administrada oralmente a vacas em uma dose de 1x106 células / dia / animal ou mais, preferivelmente 1x107 células / dia / animal ou mais, mais preferivelmente 1x108 células / dia / animal ou mais, ainda mais preferivelmente 1x109 células / dia / animal ou mais, mais preferivelmente 6x109 células / dia / animal ou mais. Aqui, a dose é o número de células viáveis de bactérias do gênero Bacillus ingeridas por dia por animal, e ingestão em um animal pode ser realizada uma vez por dia ou uma pluralidade de vezes, por exemplo, 2 a 4 vezes por dia, em doses divididas. A administração oral é realizada por um período de 1 mês antes de liberação de vaca a 3 meses após a liberação, e a presença de recuperação a partir de, ou melhora de mastite pode ser confirmada através de uso de um aumento em células dendríticas de sangue CD172a+ CD11c+, particularmente o portão 2 mostrado na Figura 1, no sangue periférico, como um indicador, ou através de determinação baseada em verificações a partir de diagnóstico por um doutor de animais.

[0038] Para a propriedade (4), a bactéria de gênero Bacillus pode ter uma característica de ter atividades protease e amilase de mais que 0,7, preferivelmente mais que 0,8, mais preferivelmente mais que 0,9, mais preferivelmente 1 ou mais, quando ambas, a atividade protease e a atividade amilase de Bacillus subtilis cepa C-3102 (número de acesso internacional: FERM BP-1096) são fixadas em 1. A atividade protease e a atividade amilase podem ser medidas através de um processo como descrito, por exemplo, em Exemplos descritos abaixo. Entre bactérias de gênero Bacillus conhecidas como agentes bactérias viáveis, Bacillus subtilis, por exemplo, Bacillus subtilis cepa C-3102, tem altas atividades protease e amilase (ver Tabela 3 descrita abaixo).

[0039] Exemplos das bactérias de gênero Bacillus tendo as propriedades de (1) e opcionalmente (2) incluem bactérias Bacillus subtilis, bactérias Bacillus licheniformis, e bactérias Bacillus amiloliquefaciens. Seus exemplos específicos incluem Bacillus subtilis cepa C-3102 (número de acesso internacional: FERM BP-1096), variantes da cepa C-3102 tendo a propriedade (1), as propriedades (1) e (2), as propriedades (1) e (3), as propriedades (1) a (3), as propriedades (1) e (4), as propriedades (1), (3), e (4), ou as propriedades (1) a (4), e tipos de linhagens de Bacillus subtilis. As bactérias de gênero Bacillus são preferivelmente Bacillus subtilis cepa C-3102 e variantes da cepa C-3102.

[0040] Bacillus subtilis cepa C-3102 foi domesticamente depositada em 25 de dezembro de 1985 no Depositário de Organismos de Patente Internacional, National Institute od Advanced Industrial Science and Technology em Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Ibaraki, Japão (código postal: 305-8566) [em depósito, 1-1-3 Higashi, Yatabe, Tsukuba, Ibaraki, Japão (código postal: 305)] sob o No. de acesso FERM P-8584, e foi transferida para o depósito internacional em 28 de junho de 1986 no mesmo instituto sob o número de acesso FERM BP-1096 (no momento de transferência) (publicação de patente JP (Kokai) No. 62232343 A (1987)). A cepa C-3102 também comercializada sob a marca registrada “Calsporin“ pelo presente requerente.

[0041] A variante de Bacillus subtilis cepa C-3102 pode ser obtida através de indução artificial de mutação da cepa, por exemplo, através de cultura sob irradiação com raio de alta energia, tal como luz ultravioleta ou raio X, ou através de cultura na presença de um mutageno, tal como nitrosoguanidina, N-etil-N-nitroso ureia, ou nitrosamina, isolamento de uma colônia de variante, e ainda realização de verificação de que a variante é um mutante, por exemplo, através de comparação de sequência de nucleotídeos de rDNA (comumente usado para classificação bacteriana) da variante com a sequência de cepa C3102, e confirmação de que a variante tem a propriedade (1), as propriedades (1) e (2), as propriedades (1) e (3), as propriedades (1) a (3), as propriedades (1) e (4), as propriedades (1), (3), e (4), ou as propriedades (1) a (4).

[0042] As bactérias de gênero Bacillus utilizáveis na presente invenção podem ser usadas diretamente na forma de sua cultura; ou, se necessário, as bactérias podem ser obtidas como um produto seco através de separação ou concentração de componentes de célula bacteriana através de um meio de separação, tal como centrifugação ou filtração, seguido por uso, por exemplo, de um processo de secagem, tal como liofilização, secagem térmica a vácuo, ou secagem de espargimento. Bacillus subtilis pode ser cultivada sob condições de cultura convencionais para aqueles versados na técnica.

[0043] O meio para cultura para Bacillus subtilis contém pelo menos fonte de carbono, fonte de nitrogênio, e sais inorgânicos.

[0044] Exemplos da fonte de carbono incluem sacarídeos, como sorbitol, glicose, amido, dextrina, ciclodextrina, amilose, amilopectina, pululano, oligossacarídeos, glicerina, e extrato de malte ou mosto de cerveja. Estas fontes de carbono podem ser usadas sozinhas ou em uma mistura de duas ou mais.

[0045] Exemplos da fonte de nitrogênio incluem compostos orgânicos de nitrogênio, como extrato de carne, extrato de malte, extrato de levedura peptona, polipeptona, hidrolisado de proteína, soja em pó, caseína de leite, aminoácidos, e licor de infusão de milho, e/ou sais de amônio, como amônia, nitrato de amônio, sulfato de amônio, e cloreto de amônio, nitratos, como nitrato de sódio, e compostos inorgânicos de nitrogênio, como ureia. As fontes de nitrogênio podem ser usadas sozinhas ou em uma mistura de duas ou mais.

[0046] Os sais inorgânicos podem ser, por exemplo, fosfato, cloridrato, sulfato, e acetato de magnésio, manganês, cálcio, sódio, potássio, cobre, ferro e zinco.

[0047] O meio pode ser um meio comercial ou um caldo nutriente.

[0048] A cultura pode ser realizada sob condições de cultura bem conhecidas. A temperatura de cultura é tipicamente 20 a 45oC, preferivelmente 35 a 42oC, e o pH do meio apropriado para a cultura é tipicamente 6,0 a 9,0, preferivelmente 6,5 a 8,5; entretanto, as condições não são limitadas a estas faixas. [3] Agente Preventivo ou Terapêutico

[0049] O agente preventivo ou terapêutico da presente invenção contém uma bactéria de gênero Bacillus (células viáveis), preferivelmente bactéria Bacillus subtilis, mais preferivelmente Bacillus subtilis cepa C-3102 ou sua variante, tendo a propriedade (1), as propriedades (1) e (2), as propriedades (1) e (3), as propriedades (1) a (3), as propriedades (1) e (4), as propriedades (1), (3), e (4), ou as propriedades (1) a (4), como um ingrediente ativo.

[0050] O teor de bactéria de gênero Bacillus ou bactérias no agente preventivo é tipicamente 0,001 a 95,0% em peso, por exemplo, 0,1 a 40% em peso em termos de células bacterianas secas; e o agente preventivo pode conter, por exemplo, 1x105 a 6x109 células ou mais da bactéria ou bactérias.

[0051] O agente preventivo ou terapêutico é para administração ou alimentação oral e está na forma de um sólido, um semissólido, ou um líquido; especificamente o agente está na forma de pulverizados, grânulos, pílulas, pelotas, comprimidos, cápsulas, ou semelhantes para o sólido, na forma de um gel ou semelhante para o semissólido, e na forma de uma suspensão ou semelhante para o líquido. Em adição às células bacterianas como um ingrediente ativo, o agente preventivo ou terapêutico pode conter substâncias para prescrição para uma formulação, por exemplo, um veículo (por exemplo, um excipiente ou um diluente) e opcionalmente um aditivo ou aditivos.

[0052] Exemplos do veículo podem incluir lactose, manitol, sorbitol, xilitol, celulose microcristalina, amido, fosfato de dicálcio, água purificada, gelatina, ágar, alginato de sódio, e carragenina.

[0053] Exemplos do aditivo incluem, mas não são limitados a um ligante, um desintegrante, um lubrificante, um material de enchimento, um aditivo de deslizamento, um tensoativo, um antioxidante, um fungicida, e um espessante.

[0054] Exemplos do ligante incluem amido glicolato de sódio, goma tragacanto, acácia, polivinil pirrolidona, amido de milho, gelatina, celulose pulverizada, celulose microcristalina, sorbitol, amido, polivinil pirrolidona, capolímeros de polivinil pirrolidona e derivados vinila, hidroxi propil celulose e hidroxipropil metil celulose.

[0055] Exemplos do desintegrante incluem amido de milho, amido de batata, amido glicolato de sódio, carboximetil celulose de sódio, carboximetil celulose de cálcio, croscarmelose de sódio, crospovidona, polivinil pirrolidona, metil celulose, celulose microcristalina, hidroxipropil celulose substituída com alquila inferior, amido pré-gelatinizado, e alginato de sódio.

[0056] Exemplos do lubrificante incluem estearato de magnésio, ácido esteárico, polietileno glicol, talco e sílica.

[0057] Exemplos do aditivo de deslizamento incluem dióxido de silício, talco, estearato de cálcio, estearato de zinco, estearil fumarato de sódio, e estearato de magnésio.

[0058] Exemplos do tensoativo incluem lauril sulfato de sódio e polisorbato 80.

[0059] Exemplos de outros componentes incluem aminoácidos, vitaminas, minerais, corantes (astaxantina, cantaxantina e semelhantes), e enzimas (por exemplo, amilase, protease, xilanase, celulase, beta-glicanase, e lipase).

[0060] O teor total do veículo e o aditivo no agente terapêutico ou preventivo é o valor obtido através de subtração de porcentagem de teor (%) do ingrediente ativo (células bacterianas secas) de 100%.

[0061] O agente preventivo ou terapêutico da presente invenção pode ser usado para a prevenção e, em alguns exemplos, terapia de mastite em um animal ruminante, preferivelmente uma vaca, mais preferivelmente uma vaca leiteira.

[0062] A prevenção de mastite pode ser realizada através de administração oral ou alimentação de bactéria ou bactérias de gênero Bacillus, como bactéria ou bactérias Bacillus subtilis, tendo a propriedade acima ou as propriedades em uma dose de 1x105 a 6x109 células / dia ou mais a uma vaca, tal como uma vaca leiteira durante o período de pelo menos 1 mês antes de liberação a 3 meses após liberação. Quando administrada ou alimentada, a bactéria ou bactérias podem ser administradas em uma dose total de 1x105 a 6x109 células / dia ou mais, uma vez por dia ou várias vezes por dia em doses divididas, por exemplo, 2 vezes na manhã e noite cada dia, ou o agente preventivo em uma tal dose pode ser alimentado sendo misturado em uma alimentação, um drinque, ou semelhantes. Por exemplo, quando Calsporin é alimentado para vacas, 40 g (1,5x108 CFU)/dia de pulverizado de Calsporin podem ser providos, por exemplo, em doses de 20 g na manhã e 20 g na noite, através de mistura em uma alimentação. Para vacas tais como vacas leiteiras, particularmente, uma alimentação grossa, tal como feno, ou uma alimentação concentrada é frequentemente provida como uma alimentação; assim, o agente preventivo é preferivelmente misturado nestas alimentações. Para administração a uma vaca, o agente pode ser administrado ou alimentado para a vaca tendo a experiência do início de mastite no passado para acentuadamente suprimir o início de mastite na vaca na qual o início de mastite é esperado. 2. Aditivo de Alimentação e Alimentação

[0063] A presente invenção ainda provê um aditivo de alimentação contendo o agente preventivo ou terapêutico acima.

[0064] O aditivo de alimentação da presente invenção pode ser produzido através de mistura de agente preventivo ou terapêutico com outros componentes opcionais aprovados constituindo o aditivo de alimentação de modo que o aditivo contenha uma quantidade eficaz da bactéria ou bactérias de gênero Bacillus, como uma bactéria ou bactérias Bacillus subtilis, para prevenção de mastite em um animal ruminante. Aqui, a quantidade eficaz de bactéria ou bactérias de gênero Bacillus, tal como bactéria ou bactérias Bacillus subtilis, é uma quantidade tal que o animal pode ingerir 1x105 a 6x109 células / dia ou mais das bactérias.

[0065] Um aditivo de alimentação é geralmente uma substância para proporcionar uma desejada função a uma alimentação de animal; no caso da presente invenção, a função é conduzir a prevenção ou terapia, supressão, ou mitigação de mastite em animais ruminantes, particularmente vacas, mais preferivelmente vacas leiteiras.

[0066] O aditivo de alimentação ainda pode conter um antibiótico para a terapia de mastite. Por exemplo, "Kachiku Kyosai Yakkohbetsu Yakka Kijun Hyo (The List of Drug Price Standards Classified by Drug Effects, Livestock Mutual Relief), Ver. 2011" lista, como antibióticos, antibióticos cepham, antibióticos penicilina, e antibióticos macrolido, que são efetivos contra bactérias, tais como Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus, e Pseudomonas aeruginosa, conhecidas como bactérias causadoras de mastite, por exemplo, antibióticos, como eritromicina, cloridrato de oxitetraciclina, sódio dicloxacilina, cefazolina, sódio cefuroxima, sódio nafcilina, benzil penicilina procaína, sulfato de di-hidro estreptomicina, sulfato de canamicina, sódio cefapirina, glicirrizinato de mono amônio, e cefalonium, ou uma mistura de uma pluralidade destes antibióticos.

[0067] Em adição a um ingrediente ativo, o aditivo de alimentação pode conter componentes, tal como um veículo (um excipiente ou um diluente) e um aditivo ou aditivos, para formação de agente. O veículo e os aditivos são aqueles exemplificados acima usados para a produção de agente preventivo ou terapêutico da presente invenção. O aditivo de alimentação pode ter qualquer uma das formas de um sólido, um semissólido, e um líquido; ele preferivelmente tem a forma sólida e pode ser produzido, por exemplo, na forma de pulverizados, grânulos, pílulas, comprimidos e cápsulas.

[0068] A presente invenção ainda provê um processo para aperfeiçoamento de um efeito preventivo ou terapêutico sobre mastite de animal ruminante em uma alimentação para animais ruminantes, compreendendo adição de uma quantidade eficaz do aditivo de alimentação descrito acima para a prevenção ou terapia da mastite à alimentação para animais ruminantes.

[0069] Para a terapia de mastite em vacas e outros animais, agentes terapêuticos para mastite listados no "Kachiku Kyosai Yakkohbetsu Yakka Kijun Hyo (The List of Drug Price Standards Classified by Drug Effects)" (Japan Veterinary Products Association) têm sido convencionalmente usados, e antibióticos são usados como os principais agentes terapêuticos; entretanto, estes agentes não evitaram a recorrência da doença. O agente preventivo ou terapêutico da presente invenção ou um aditivo de alimentação contendo o agente pode complementar a terapia antibiótica.

[0070] Devido o agente preventivo ou terapêutico da presente invenção ter as características únicas acima, a presente invenção também refere-se a uma alimentação tendo um efeito preventivo ou terapêutico aperfeiçoado sobre mastite de animal ruminante, compreendendo uma quantidade eficaz do aditivo ou aditivos de alimentação descritos acima para a prevenção ou terapia da mastite de animal ruminante.

[0071] Diferente de alimentações conhecidas, a alimentação da presente invenção é caracterizada por compreender uma quantidade eficaz de bactéria ou bactérias de gênero Bacillus, tais como bactérias Bacillus subtilis, para prevenção de mastite de animal ruminante. Alimentações conhecidas antes de depósito do presente pedido de patente não estavam no mercado para a prevenção (ou terapia) de mastite porque não foi reconhecido que bactéria ou bactérias de gênero Bacillus, como bactéria ou bactérias Bacillus subtilis, têm uma ação ou efeito preventivo (ou terapêutico) sobre mastite de animal ruminante.

[0072] A alimentação inclui alimentações grossas contendo principalmente (por exemplo, forragem verde, grama seca, e palha de arroz de silagem) e alimentações concentradas ricas em amido e proteínas (também referidas como uma mistura de alimentação) (por exemplo, cereais, tais como milho, soja, farelo de arroz, farelo de trigo, centeio, e milho, e tortas de óleo vegetal, como torta de óleo de soja, torta de óleo de semente de colza, e torta de óleo de semente de algodão), e uma mistura adequada destes componentes de alimentação é alimentada para animais ruminantes, tais como vacas. Em adição, vitaminas (vitaminas A, D3, E, B1, B2, B6, B12, C, e K3, inositol, biotina, ácido pantotênico, niacina, colina, ácido fólico, e semelhantes), aminoácidos, sal de dieta, e outros minerais podem ser adicionados. Para componentes de alimentação, aqueles descritos, por exemplo, em Japan Standard Feed Ingredients Chart (edited by National Agriculture and Food Research Organization, Japan) também podem ser usados.

[0073] A alimentação preferivelmente contém 1x105 a 6x109 células / dia ou mais da bactéria ou bactérias Bacillus subtilis em uma quantidade ingerível por um animal; assim, o aditivo de alimentação da presente invenção pode ser misturado em uma alimentação de modo a prover uma tal quantidade de células bacterianas. 3. Composição farmacêutica e processo para prevenção ou terapia de mastite

[0074] A presente invenção ainda provê uma composição farmacêutica para a prevenção ou terapia de mastite de animal ruminante, compreendendo uma bactéria de gênero Bacillus, tal como bactéria Bacillus subtilis, como um ingrediente ativo, tendo a propriedade (1), as propriedades (1) e (2), as propriedades (1) e (3), as propriedades (1) a (3), as propriedades (1) e (4), as propriedades (1), (3), e (4), ou as propriedades (1) a (4), em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0075] A bactéria de gênero Bacillus, tal como bactéria Bacillus subtilis, como um ingrediente ativo é a mesma como a bactéria como o ingrediente ativo do agente preventivo ou terapêutico, e pode ser usada como o ingrediente ativo da composição farmacêutica da presente invenção contanto que seja uma bactéria de gênero Bacillus, tal como bactéria Bacillus subtilis, tendo a propriedade (1) e opcionalmente (2), isto é, tendo a propriedade de ser capaz de aumentar portão 2 de célula CD172a+ CD11c+ nas células dendríticas de sangue de uma vaca, tal como uma vaca leiteira, como a propriedade (1) e, opcionalmente, a propriedade de ter uma atividade de crescimento de Bifidobacterium de mais que 0,8, preferivelmente mais que 0,9, mais preferivelmente 1 ou mais, quando a atividade de crescimento de Bifidobacterium de Bacillus subtilis cepa C-3102 (número de acesso internacional: FERM BP-1096) é fixada em 1 como a propriedade (2).

[0076] Em adição às propriedades (1) e opcionalmente (2), a bactéria de gênero Bacillus, tal como bactéria Bacillus subtilis, pode ter a propriedade de ter atividades protease e amilase de mais que 0,7, preferivelmente mais que 0,8, mais preferivelmente mais que 0,9, mais preferivelmente 1 ou mais, quando ambas, a atividade protease e a atividade amilase de Bacillus subtilis cepa C-3102 (número de acesso internacional: FERM BP-1096) são fixadas em 1 como a propriedade (3), e/ou a propriedade de ser capaz de obter a prevenção ou terapia de mastite quando administrada oralmente a uma vaca em uma dose de 1x105 a 6x109 células / dia / animal ou mais como a propriedade (4).

[0077] Na presente invenção, a vaca é, por exemplo, uma vaca leiteira saudável, uma vaca leiteira com o risco de início de mastite, uma vaca leiteira tendo uma história de mastite, ou uma vaca leiteira afetada com mastite. Nestas vacas leiteiras, a composição da presente invenção pode obter prevenção ou terapia. Além disso, em uma vaca tendo realmente o início de mastite, a composição da presente invenção pode ser usada para a terapia, ou supressão, mitigação ou melhora de mastite.

[0078] Exemplos da bactéria de gênero Bacillus incluem Bacillus subtilis cepa C-3102 (número de acesso internacional: FERM BP-1096), variantes da cepa C-3102 tendo a propriedade ou propriedades acima, e tipos de linhagens de Bacillus subtilis; entretanto, qualquer uma das bactérias de gênero Bacillus pode ser uma bactéria utilizável na presente invenção contanto que seja uma cepa de gênero Bacillus tendo a propriedade (1), as propriedades (1) e (2), as propriedades (1) e (3), as propriedades (1) a (3), as propriedades (1) e (4), as propriedades (1), (3), e (4), ou as propriedades (1) a (4).

[0079] O teor de bactéria ou bactérias de gênero Bacillus, tal como bactéria ou bactérias Bacillus subtilis, na composição farmacêutica da presente invenção pode ser, por exemplo, 1x105 a 6x109 células ou mais como a bactéria ou bactérias. A bactéria ou bactérias são preferivelmente administradas para, ou ingeridas por um animal em uma dose de 1x105 a 6x109 células / dia ou mais; assim, a composição pode ser administrada ou alimentada oralmente uma vez por dia ou uma pluralidade de vezes (por exemplo, 2 a 4 vezes) por dia em doses divididas.

[0080] A composição farmacêutica opcionalmente pode conter um agente terapêutico para mastite (um antibiótico ou semelhante). O agente terapêutico para mastite pode ser qualquer um dos agentes terapêuticos para mastite listado no "Kachiku Kyosai Yakkohbetsu Yakka Kijun Hyo (The List of Drug Price Standards Classified by Drug Effects)" (Japan Veterinary Products Association); especificamente, seus particulares exemplos incluem antibióticos, como antibióticos cepham, antibióticos penicilina, e antibióticos macrolido, efetivos contra bactérias, tais como Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus, e Pseudomonas aeruginosa, conhecidas como bactérias causadoras de mastite, por exemplo, os antibióticos exemplificados acima.

[0081] A composição farmacêutica da presente invenção está na forma de um sólido, um semissólido, ou um líquido; especificamente, a composição está na forma de pulverizados, grânulos, pílulas, pelotas, comprimidos, cápsulas, ou semelhantes para o sólido, na forma de um gel ou semelhante para o semissólido, e na forma de uma suspensão ou semelhante para o líquido. Em adição às células bacterianas como um ingrediente ativo, o agente preventivo pode conter substâncias para prescrição para uma formulação, por exemplo, um veículo farmaceuticamente aceitável (por exemplo, um excipiente ou um diluente) e, em alguns exemplos, um aditivo ou aditivos.

[0082] Exemplos do veículo podem incluir lactose, manitol, sorbitol, xilitol, celulose microcristalina, amido, fosfato de dicálcio, água purificada, gelatina, ágar, alginato de sódio, e carregenina.

[0083] Exemplos do aditivo podem incluir, mas não são limitados a um ligante, um desintegrante, um lubrificante, um material de enchimento, um aditivo de deslizamento, um tensoativo, um antioxidante, um fungicida e um espessante. Estes aditivos podem ser propriamente selecionados a partir do seguinte e adicionados à composição.

[0084] Exemplos do ligante incluem amido glicolato de sódio, goma tragacanto, acácia, polivinil pirrolidona, amido de milho, gelatina, celulose pulverizada, celulose microcristalina, sorbitol, amido, polivinil pirrolidona, copolímeros de vinil pirrolidona e derivados vinila, hidroxi propil celulose e hidroxipropil metil celulose.

[0085] Exemplos do desintegrante incluem amido de milho, amido de batata, amido glicolato de sódio, sódio carboximetil celulose, cálcio carboximetil celulose, sódio croscarmelose, crospovidona, polivinil pirrolidona, metil celulose, celulose microcristalina, hidroxipropil celulose substituída com alquila inferior, amido pré-gelatinizado, e alginato de sódio.

[0086] Exemplos do lubrificante incluem estearato de magnésio, ácido esteárico, polietileno glicol, talco e sílica.

[0087] Exemplos do aditivo de deslizamento incluem dióxido de silício, talco, estearato de cálcio, estearato de zinco, estearil fumarato de sódio, e estearato de magnésio.

[0088] Exemplos do tensoativo incluem lauril sulfato de sódio e polissorbato 80.

[0089] Exemplos de outros componentes incluem aminoácidos, vitaminas, minerais, corantes (por exemplo, astaxantina e cantaxantina), e enzimas (por exemplo, amilase, protease, xilanase, celulase, beta-glicanase e lipase).

[0090] A presente invenção ainda provê um processo para a prevenção ou terapia de mastite em um animal ruminante, compreendendo administração ou alimentação oral de agente preventivo ou terapêutico, o aditivo de alimentação, a alimentação, ou a composição farmacêutica a um animal ruminante em necessidade da mesma.

[0091] Para a prevenção ou terapia de mastite, bactéria ou bactérias de gênero Bacillus, tal como bactéria ou bactérias Bacillus subtilis, são preferivelmente dadas em uma dose de 1x105 a 1x106 células / dia / animal ou mais, preferivelmente 1x107 células / dia / animal ou mais, mais preferivelmente, 1x108 células / dia / animal ou mais, ainda mais preferivelmente 1x109 células / dia / animal ou mais, mais preferivelmente 6x109 células / dia / animal ou mais, para um animal ruminante, tal como uma vaca leiteira durante pelo menos o período de 1 mês antes de liberação a 3 meses após liberação. Para forma de dosagem, as células bacterianas viáveis podem ser administradas na dose acima por dia como a dose total, uma vez por dia ou várias vezes diariamente em doses divididas. Na administração de composição farmacêutica, a composição pode ser alimentada sendo misturada em dietas, tais como alimentações e drinques. Para vacas tais como vacas leiteiras, particularmente, feno ou uma alimentação concentrada é frequentemente provida como uma alimentação; assim, preferivelmente a composição é misturada nestas alimentações. A vaca, particularmente a vaca leiteira, para administração é uma vaca leiteira saudável, uma vaca leiteira com o risco de início de mastite, ou uma vaca leiteira tendo uma história de mastite; o início de mastite pode ser acentuadamente suprimido nestas vacas leiteiras, e a terapia ou mitigação de mastite pode ser obtida em uma vaca leiteira afetada com mastite.

[0092] Em uma vaca confirmada ter o início de mastite, a combinação, se necessário, com um antibiótico (como descrito acima), convencionalmente utilizável para sua terapia pode aumentar a taxa de cura completa e pode encurtar o tempo para cura completa. Um antibiótico efetivo contra bactérias causadoras, tais como Staphylococcus aureus, Escherichi coli, Streptococcus ou Pseudomonas aeruginosa, é administrado a uma vaca afetada com mastite através de um processo, tal como administração intravenosa, administração intramuscular, ou administração oral, enquanto a composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada ao animal antes, durante, ou após a administração de antibiótico.

[0093] O agente preventivo ou terapêutico, o aditivo de alimentação, ou a composição farmacêutica é preferivelmente administrada ou alimentada para um animal através de mistura da mesma em uma alimentação, drinque de animal, ou semelhantes.

[0094] O agente é preferivelmente administrado ou alimentado para um animal de modo que a dose bacteriana viável é de 1x105 a 1x106 células / dia / animal ou mais, preferivelmente 1x107 células / dia / animal ou mais, mais preferivelmente 1x108 células / dia / animal ou mais, ainda mais preferivelmente 1x109 células / dia / animal ou mais, e mais preferivelmente 6x109 células / dia / animal ou mais. Exemplos

[0095] A presente invenção ainda será descrita abaixo em detalhes com referência a Exemplos. Entretanto, estes Exemplos não são pretendidos limitarem o escopo técnico da presente invenção. Exemplo 1 <Tratamento de mastite em vaca leiteira>

[0096] Calsporin (Calpis Co., Ltd., Japão) (ingrediente ativo: Bacillus subtilis cepa C-3102 (FERM BP-1096), 1x1010 células/g) foi alimentado para vacas leiteiras tendo uma história de mastite (número de vacas 23 e 15) durante o prévio período de lactação na seção teste mostrada na Tabela 1 abaixo, por um período de 1 mês antes de liberação a 3 meses após liberação, através de mistura de Calsporin em uma dose bacteriana viável de 6x109/dia ou mais em uma alimentação. Como uma alimentação, Rakunoh Kazoku Max (Zennoh Feed Mills of the Tohoku District Co., Ltd., Japão), Astroliner (preparação de vitamina: Snow Brand, Japão), milho em flocos, e uma alimentação grossa (timothy, aveias, silagem de milho dent, cubo de alfafa feno) foram alimentadas durante o período de lactação, e uma alimentação para o período seco (Trans-Pro, Snow Brand, Japão) e uma alimentação grossa (timothy, aveias) foram alimentadas durante o período seco. Em contraste, para vacas leiteiras tendo uma história do início de mastite (número de vacas 94 e 902) na seção controle mostrada na mesma Tabela 1, Calsporin não foi adicionado a uma alimentação.

[0097] Vacas leiteiras tendo uma história de mastite durante o período de lactação prévio são conhecidas também terem um alto risco de terem o início de mastite durante o presente período. O período de lactação prévio refere-se a um período de após a última liberação a 1 mês antes de liberação durante o presente período; todas as vacas leiteiras usadas no presente experimento são vacas leiteiras tendo uma história de mastite 1 a 3 vezes durante o prévio período de lactação, as quais são vacas que receberam medicação com antibióticos 6 a 23 vezes.

[0098] Os resultados são mostrados na Tabela 1. Em ambas vacas nos. 15 e 23 da seção teste, os resultados mostram que (1) o início de mastite foi ausente; (2) medicação com um antibiótico foi ausente; e (3) a proporção de portão 2 de célula dendrítica de sangue CD172a+ CD11c+ para células dendríticas totais foi pouco aumentada ou diminuída e mantida em um alto nível comparada com aquela para a seção controle durante o período de teste em análise de célula dendrítica. Em contraste, ambas vacas nos. 94 e 902 da seção controle tiveram o início de mastite, receberam terapia com antibióticos, e tiveram tendência a transientemente ou cronicamente terem uma baixa proporção de portão 2 de célula dendrítica de sangue CD172a+ CD11c+ comparada àquela para a seção teste em análise de célula dendrítica. Aqui, os resultados de medição de portão 2 de célula dendrítica de sangue CD172a+ CD11c+ são mostrados na Figura 1 (painéis C e D) e Tabela 2. A proporção de portão 2 de célula dendrítica de sangue CD172a+ CD11c+ para células dendríticas totais aumentou definitivamente em 8 a 10 dias após liberação na seção teste comparada àquela na seção controle. Isto sugere que as vacas da seção teste tiveram imunidade para atacar bactérias causando mastite quando foram expostas às bactérias ou semelhantes, no período no qual elas tiveram um alto risco de mastite após liberação (particularmente, 8 a 10 dias após liberação). Em outras palavras, o pequeno aumento ou diminuição e o aumento como necessário da proporção de portão 2 de célula dendrítica de sangue CD172a+ CD11c+ para células dendríticas totais provavelmente indica que a administração de Bacillus subtilis cepa C-3102 aumentou ou manteve a imunidade no sangue, protegendo contra o início de mastite. Durante o período de teste, o início de mastite não foi observado na seção teste, mas uma ou duas vezes na seção controle, pelo que necessitando terapia com antibióticos. O aumento de portão 2 de célula dendrítica de sangue CD172a+ CD11c+ na seção teste ao redor de 7 dias após liberação (um estágio quando mastite é mais apta a ocorrer) é um indicador mostrando que o agente preventivo ou terapêutico da presente invenção (ingrediente ativo: Bacillus subtilis cepa C-3102) trabalhou eficazmente para a prevenção de mastite. Tabela 2

* Para o dia de coleta de sangue, o dia de liberação é Dia 0, e qualquer dia antes de liberação é expresso por menos (-).

[0099] Na Tabela 2, o indivíduo no. 94 teve o início de mastite duas vezes: uma vez entre os períodos de coleta de sangue 1 e 2 e uma vez entre os períodos 2 e 3. O indivíduo no. 902 teve o início de mastite uma vez entre os períodos 2 e 3. Nos presentes resultados, o indivíduo no. 902 mostrou um fenômeno no qual a proporção de portão 2 de célula dendrítica de sangue CD172a+ CD11c+ foi diminuído devido a tensão e semelhantes em 8 a 10 dias após liberação, provavelmente pelo que tendo o início de mastite. O indivíduo no.94 teve uma baixa proporção de portão 2 de célula dendrítica de sangue CD172a+ CD11c+ a partir de antes de liberação, e a seguir teve uma proporção não suficientemente maior do portão 2 de célula dendrítica de sangue CD172a+ CD11c+ (mesmo quando exposto a bactérias), provavelmente pelo que tendo o início de mastite. Em contraste, os indivíduos recebendo a administração de Bacillus subtilis cepa C-3102 (indivíduos nos. 23 e 15) tiveram uma baixa proporção de portão 2 de célula dendrítica de sangue CD172a+ CD11c+ antes de liberação como é o caso com o indivíduo no. 94, mas teve uma maior proporção do portão 2 de célula dendrítica de sangue CD172a+ CD11c+ em 8 a 10 dias após liberação, também resultando na supressão do início de mastite. Exemplo 2 Caracterização de Bacillus subtilis efetivo para prevenção ou terapia de mastite

[00100] Muitos agentes bacterianos viáveis para vacas são atualmente conhecidos; entretanto, nenhum de tais agentes que tenha mostrado um efeito preventivo ou terapêutico contra mastite é conhecido. A atividade de crescimento de Bifidobacterium, a atividade protease, e a atividade amilase de Bacillus subtilis cepa C-3102 como a bactéria pretendida da presente invenção foram comparadas neste Exemplo com aquelas de linhagens bacterianas em agentes de bactérias viáveis atualmente comercializados. (1) Cepa Bacteriana

[00101] Para linhagens de Bacillus, 8 linhagens de B. Subtilis, 1 cepa de B. Licheniformis, e 2 linhagens de Bacillus sp. mostradas na Tabela 3 a seguir, incluindo uma diferença na forma de colônias foram preparadas. (2) Preparação de suspensão de esporos de cada bactéria

[00102] Cada cepa bacteriana foi aplicada a meio ágar TS e cultivada a 37oC por toda noite. Todas as colônias formadas sobre o meio foram raspadas com uma espátula e suspensas água esterilizada aquecida a 80oC. O resultante foi centrifugado em 300 rpm e temperatura ambiente por 10 minutos e, após remoção de sobrenadante, ressuspenso em água esterilizada aquecida a 80oC. Após realização de operação 2 vezes, o resultante foi suspenso em 5 mL de água esterilizada para obter uma suspensão de esporos de cada cepa bacteriana. (3) Medição de atividade protease secretada

[00103] Um meio ágar TS sódio caseína (1% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japão), caldo de soja tripticase BBL 3%, ágar 2%) foi usado para obter ponto de 1 microlitro da suspensão de esporos de cada cepa bacteriana (cerca de 1x104 CFU/mL) sobre o meio. A seguir, cultura foi realizada a 37oC por 48 horas, seguida por medição de tamanho do halo produzido pela decomposição de caseína ao redor de colônia. O tamanho do halo foi obtido através de medição de distância a partir da borda da colônia para a borda do halo. O experimento foi realizado 3 vezes, e a média de 3 valores medidos e a média de valores de atividade específica em relação à cepa C-3102 Tipo I nos 3 experimentos foram calculadas para cada cepa bacteriana. (4) Medição de atividade amilase

[00104] Um meio ágar TS amido 1% (amido 1% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japão), caldo de soja tripticase BBL 3%, ágar 2%) foi usado para obter ponto de 1 microlitro da suspensão de esporos de cada cepa de bactérias (cerca de 1x104 CFU/mL) sobre o meio. Após cultura ser realizada a 37oC por 48 horas, 2 mL de solução de Lugol estabilizada (Merck) foram adicionados em gotas sobre o meio para manchar amido não degradado, pelo que medindo o tamanho do halo produzido ao redor de colônia. O tamanho do halo foi obtido através de medição de distância a partir da borda da colônia para a borda do halo. O experimento foi realizado 3 vezes, e a média de 3 valores medidos e a média de valores e atividade específica em relação à cepa C-3102 Tipo I nos 3 experimentos foram calculadas para cada cepa bacteriana. (5) Atividade de crescimento de Bifidobacterium

[00105] Em referência ao processo descrito em uma referência (isto é, Kouya T. Et al., J. Biosci. Bioeng. 2007; 103: 464-471), o experimento foi realizado como se segue. Um filtro éster misto de celulose (90 mm de diâmetro e 0,2 micrometro de tamanho de poro (ADVANTEC)) foi colocado sobre meio ágar TS (ágar: 0,75%), e 50 microlitros da suspensão de soro (cerca de 1x109 CFU/mL) foram semeados sobre o filtro e cultivados a 37oC por 24 horas. Após cultura, o filtro foi separado para recuperar o meio, que foi então transferido para um tubo de centrífuga de 50 mL e submetido à centrifugação em 8000 rpm por 15 minutos. O sobrenadante resultante foi filtrado com um filtro de éster misto de celulose de 0,22 μm (ADVANTEC), e 60 microlitros do filtrado foram infiltrados em um disco de papel (10 mm de diâmetro, espesso (ADVANTEC)) colocado sobre meio ágar TPY (3% glicose, 0,4% peptona tripticase, 0,15% peptona protease No.3, 0,25% extrato de levedura, 0,2% K2HPO4, 0,3% KH2PO4, 0,025% MgCl2 6H2O, 0,025% L- cisteína, 0,0005% FeSO4 H2O, 1,5% ágar) no qual Bifidobacterium adolescentis CP2238 foi vertida. O resultante foi submetido a cultura anaeróbica a 37oC por 18 horas em um jarro anaeróbico no qual 3 folhas de Anaero Pack (Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) foram colocadas, e o diâmetro de um círculo de crescimento de Bifidobacterium produzido ao redor de disco de papel foi medido. O experimento foi realizado 2 vezes, e a média de 2 valores medidos e a média de valores de atividade específica em relação à cepa C-3102 Tipo I nos 2 experimentos foram calculadas para cada cepa bacteriana. (6) Resultado

[00106] Os resultados de medição de bactérias testadas são mostrados na Tabela 3. Tabela 3

[00107] Da Tabela 3, foi confirmado que Bacillus subtilis cepa C-3102 teve altas atividades em média para todas as propriedades comparadas àquelas de outras bactérias. Estas propriedades indicam que elas aumentam sobrevivência no trato digestivo de vacas e, ainda, parece que elas aperfeiçoam o crescimento de Bifidobacterium no trato digestivo e pelo que contribuem para aumento de células dendríticas de sangue. Como um resultado, cepa C-3102 pode suprimir infecção bacteriana mesmo quando vacas leiteiras são feridas sobre o mamilo ou semelhante e previne mastite através de supressão de infecção dos vasos de leite, dutos lactíferos, ou glândulas mamárias na mama mesmo se as vacas são infectadas com bactérias. Em adição, a cepa também parece trabalhar eficazmente na terapia de vacas leiteiras afetadas com mastite através de aumento de certas células dendríticas.

[00108] De fato, Bacillus subtilis cepa C-3102 teve um efeito preventivo ou terapêutico contra mastite em vacas leiteiras como descrito em Exemplo 1, e bactérias Bacillus subtilis tendo as atividades similares ou comparáveis àquelas da cepa podem ser esperadas terem a capacidade para aumentar ou manter o portão 2 de célula dendrítica e podem ser esperadas terem um efeito comparável àquele da cepa C3102. Exemplo 3 Terapia de vaca leiteira tendo início de mastite

[00109] Calsporin (Calpis Co., Ltd., Japão) (ingrediente ativo: Bacillus subtilis cepa C-3102 (FERM BP-1096) 1x1010 células/g) foi alimentado para vacas leiteiras durante o período de lactação, tendo uma história de mastite quando elas tiveram o início de mastite durante o período de lactação por um certo período de tempo (vários dias a 1 semana) após início através de mistura de bactérias em uma dose bacteriana viável de 6x109 células / dia ou mais em uma alimentação. Como uma alimentação, Rakunoh Kazoku Max (Zennoh Feed Mills of the Tohoku District Co., Ltd., Japão), Astroliner (preparação de vitamina: Snow Brand Milk Products Co., Ltd.), milho em flocos, e uma alimentação grossa (Timothy, aveias, silagem de milho dente, cubo de feno alfafa) foram providos durante o período de lactação, e uma alimentação para o período seco (Trans-Pro, Snow Brand Seed Co., Ltd., Japão) e uma alimentação grossa (pasto natural, aveias) foram providos durante o período seco. Aplicabilidade Industrial

[00110] A presente invenção pode obter a prevenção de início ou terapia de mastite em animais ruminantes, especialmente vacas, tais como vacas leiteiras; assim ela pode reduzir grandemente a perda econômica devido ao início de mastite de vaca leiteira na indústria de leite e pode ser dita de utilidade industrial extremamente alta. Bactérias Depositadas

[00111] “Bacillus subtilis cepa C-3102” foi depositada domesticamente em 24 de dezembro de 1985 no Depositário de Organismo de Patente Internacional, National Institute od Advanced Industrial Science and Technology em Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japão (código postal: 305-8566) [em depósito, 1-1-3 Higashi, Yatabe, Tsukuba, Ibaraki, Japão (código postal: 305)] sob No. de acesso FERM P-8584, e foi transferida para o depósito internacional em 28 de junho de 1986 no mesmo instituto sob no. de acesso FERM BP-1096 (no momento de transferência). A cepa depositada é atualmente estocada no Depositário de Micro-organismos de Patente, National Institute of Technology and Evaluation (NITE) (NITE-IPOD) (sala 120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu, Chiba, Japão (código postal: 292-0818)).

Claims

1. Aditivo de alimentação para vacas, caracterizado pelo fato de que compreende um produto de cultura contendo Bacillus subtilis cepa C-3102 (número de acesso internacional: FERM BP-1096) em uma quantidade de 1 x 107 células/dia/vaca ou mais como um ingrediente ativo, em que o aditivo de alimentação é fornecido à vaca por um período de 1 mês antes do parto da vaca a 3 meses após o parto para prevenção ou terapia de mastite.

2. Aditivo de alimentação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um antibiótico para terapia de mastite.

3. Aditivo de alimentação de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende Bacillus subtilis cepa C-3102 (número de acesso internacional: FERM BP-1096) em uma quantidade de 1 x 109 células/dia/vaca ou mais.

4. Composição farmacêutica para prevenção ou terapia de mastite de vacas, caracterizada pelo fato de que compreende Bacillus subtilis cepa C-3102 (número de acesso internacional: FERM BP-1096) em uma quantidade de 1 x 109 células/dia/vaca ou mais, e um veículo farmaceuticamente aceitável.