KR20190126309A - 미생물 세포, 이의 생산 방법, 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미생물 세포, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 호기성 세균 세포 및 혐기성 세균 세포뿐만 아니라 효모 세포, 및 이러한 세포를 생산하는 방법, 이러한 세포를 포함하는 사료 첨가제 및 조성물, 및 이러한 세포를 동물에게 투여함을 포함하는 용도에 관한 것이다.
Description
개시내용의 배경
발명의 분야
본 발명은 메가스파에라 엘스데니이(Megasphaera elsdenii) 세포, 엠. 엘스데니이(M. elsdenii) 세포의 생산 방법, 이러한 세포를 포함하는 사료 첨가물 및 조성물, 및 세포를 동물에게 투여함을 포함하여, 예컨대, 개선된 성장 능력 및/또는 건강을 위함을 포함하는 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 호기성 세균, 혐기성 세균, 및 효소 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는, 미생물 세포, 미생물 세포를 생산하는 방법, 미생물 세포를 포함하는 사료 첨가물 및 조성물, 및 미생물 세포를 동물에게 투여함을 포함하여, 예컨대, 개선된 성장 능력 및/또는 건강을 위함을 포함하는 용도에 관한 것이다.
배경
메가스파에라 엘스데니이(즉, 엠. 엘스데니이)는 바람직한 탄소원(carbon source)으로서 락테이트를 이용하고 매년 수백마리의 소와 젖소에게 영향을 미치는 일반적인 소화 장애인, 산증(acidosis)을 예방하는데 도움을 줄 수 있는 비-운동성의, 그람-음성 쌍구균(Gram-negative diplococci)이다.
소와 다른 반추동물이 다량의 전분성 음식(예컨대, 곡물 낟알) 또는 단당(single sugar)을 소화시키는 경우, 위내 기회감염 미생물이 이러한 화합물을 젖산으로 급속하게 발효시킬 수 있다. 젖산은 강력한 유기산이며 젖산 산증(lacticidosis)을 초래할 수 있고, 이는 정상적인 소화 활성을 파괴하여 반추동물내 소화관 내층(lining)에 과도한 손상을 유발할 수 있다. 영향받은 동물은 최적 이하의 능력을 갖는다. 그리고, 대부분의 급성 형태의 젖산산증은 동물의 소화계 및 호흡계에 비가역적 손상뿐만 아니라 증가된 폐사율도 유발할 수 있다.
엠. 엘스데니이는 젖산을 휘발성 지방산(VFA; 예컨대, 부티레이트, 프로피오네이트, 및 아세테이트)으로 전환시키는 세균의 능력에 의해 젖산산증을 제어하는데 도움을 줄 수 있으며, 이는 무해한 유기 화합물이다. 그러나, 반추동물의 위장관내 엠. 엘스데니이 집단은 흔히 산증 위험을 예방하기에는 너무나 낮은 수준으로 존재한다. 따라서, 엠. 엘스데니이 균주로부터의 살아있는 세포의 액체 배양물인, Lactipro®가 반추동물의 위장관내 엘. 엘스데니이의 콜로니화(colonization)의 비율을 증가시키기 위해 개발되었다. 예를 들면, 미국 특허 제7,550,139호를 참고한다. 그러나, 유기체에 의해 필요한 혐기성 조건 하에서 엠. 엘스데니이 생성물을 유지하는 것의 곤란성 및 생산 시설로부터의 엠. 엘스데니이 생성물을, 이후 생성물 속의 엠. 엘스데니이의 생존능(viability)이 유의적으로 감소하게 되는 시간인, 14일내에 최종 사용 부위로 수송하는 것의 곤란성을 포함하는, 엠. 엘스데니이를 함유하는 생성물의 사용을 제한하는 실제적인 구속이 존재한다.
미국 특허 제4,138,498호는 일반적으로 엠. 엘스데니이의 잠재적인 동결건조를 논의하고 있지만, 이는 기존의 상업적인 한계를 극복하기 위해 상업적 규모로 사용될 수 있는 동결-건조된 엠. 엘스데니이를 생산하기 위한 임의의 방법을 제공하지 않는다. 또한, 적어도 하나의 그룹은 혐기성세균, 예를 들면, 엠. 엘스데니이를 포함하는 동결-건조된 미생물이 상업적으로 실제적이지 않음을 최근에 보고하였다. 참고: 예컨대, 제WO 2017/015022호.
따라서, 기존의 한계를 극복하는, 메가스파에라 세포를 생산하는 방법을 포함하여, 메가스파에라 세포 , 예를 들면, 메가스파에라 엘스데니이 세포에 대한 필요성이 존재한다. 또한, 다른 미생물 세포, 예를 들면, 비피도박테리움(Bifidobacterium), 예를 들면, 비. 브레베(B. breve), 락토바실러스(Lactobacillus), 예를 들면, 엘. 플란타룸(L. plantarum), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 예를 들면, 비. 아니말리스(B. animalis) 아종, 락티스(lactis), 페디오코쿠스(Pediococcus), 예를 들면, 피. 악시딜락티시(P. acidilactici), 락토바실러스(Lactobacillus), 예를 들면, 엘. 카세이(L. casei), 바실러스(Bacillus), 예를 들면, 비. 서브틸리스(B. subtilis), 사카로마이세스(Saccharomyces), 예를 들면, 에스. 보울라르디이(S. boulardii) 및 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae), 및 기존의 한계를 극복하는, 상기한 것들을 생산하는 방법에 대한 필요성이 존재한다.
개시내용의 간략한 요약
본 개시내용은 본 개시내용은 (a) 혐기성 조건 하에서 엠. 엘스데니이 세포 및, 카제인, 락테이트, 덱스트로즈, 프럭토즈, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈, 아세테이트, 글리세롤, 소르비톨, 만니톨, 사카로즈, 크실로즈, 몰라세스(molasses), 푸코즈, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 아세트산나트륨, 아라비노즈, 대두 단백질, 가용성 단백질, 라피노즈, 아밀로즈, 전분, 트립톤, 효모 추출물 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 탄소원을 포함하는 성장 배지를 포함하는 배양물을 제조하는 단계, (b) 세포를 혐기성 조건 하에서 수거(harvesting)하는 단계, (c) 세포를 동결시키는 단계, 및 (d) 세포를 동결-건조시키는 단계를 포함하는, 동결-건조된 메가스파에라 엘스데니이 세포를 생산하는 방법에 관한 것이며, 여기서 약 1 x 103 내지 약 1 x 1012 CFU/g의 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포가 생산된다.
특정의 구현예에서, 적어도 2개의 탄소원은 약 50 내지 90%의 제1의 탄소원 및 약 10 내지 50%의 제2의 탄소원으로 이루어지고, 여기서 제2의 탄소원은 제1의 탄소원과는 상이하며, 여기서 100%의 적어도 2개의 탄소원은 제1의 탄소원 및 제2의 탄소원으로 이루어진다.
본 개시내용은 (a) 엠. 엘스데니이 세포 및 성장 배지를 포함하는 배양물을 제조하는 단계, (b) 배양물이 이의 대수 성장기(exponential growth phase)를 종결한 후 및 배양물이 이의 정체 성장기(stationary growth phase)를 개시하기 전 12시간 내에 세포를 혐기성 조건 하에서 수거하는 단계, (c) 세포를 동결시키는 단계, 및 (d) 세포를 동결-건조시키는 단계로서, 여기서 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포가 생산되는 단계를 포함하는, 동결-건조된 메가스파에라 엘스데니이 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
특정의 구현예에서, 수거하는 단계는 원심분리, 여과, 투석, 역 삼투압, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 기술을 포함한다. 특정의 구현예에서, 여과는 접선 유동 여과(tangential flow filtration)를 포함한다.
특정의 구현예에서, 배양물은 액체를 포함하고, 여기서 수거 단계는 약 60% 내지 약 100%의 액체를 제거함을 포함한다.
특정의 구현예에서, 동결은 약 -80℃ 내지 약 -210℃의 온도에서 수행한다.
본 개시내용은 (a) 엠. 엘스데니이 세포 및 성장 배지를 포함하는 배양물을 제조하는 단계, (b) 세포를 수거하는 단계, (c) 세포를 약 -80℃ 내지 약 -210℃의 온도에서 수거 5분 내에 동결시키는 단계, 및 (d) 세포를 동결건조시키는 단계로서, 여기서 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포가 생산되는 단계를 포함하는, 동결-건조된 메가스파에라 엘스데니이 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
특정의 구현예에서, 동결 단계는 엠. 엘스데니이 세포를 포함하는 용기를 액체 질소와 접촉시킴을 포함한다.
특정의 구현예에서, 동결 단계는 세포를 액체 질소와 접촉시킴을 포함한다.
특정의 구현예에서, 동결 단계는 약 -196℃의 온도에서 수행하며 세포를 포함하는 동결된 펠렛(pellet)을 생산하고, 여기서 동결된 펠렛의 직경은 약 0.001 내지 약 0.5 인치이다.
특정의 구현예에서, 수거 전 엠. 엘스데니이 배양물의 pH는 약 4.5 내지 약 7.0이다.
특정의 구현예에서, 약 1 x 103 내지 약 1 x 1012 CFU/g의 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포는 약 25℃의 온도에서 저장 후 적어도 2주 동안 생존가능하다.
특정의 구현예에서, 약 1 x 103 내지 약 1 x 1012 CFU/g의 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포는 약 4℃의 온도에서 적어도 1개월 동안 저장 후 생존가능하다.
특정의 구현예에서, 배양물은 적어도 하나의 동결보호제를 추가로 포함한다.
특정의 구현예에서, 적어도 하나의 동결보호제는 프럭토즈, 글루코즈, 슈크로즈, 분유(milk powder), 영아용 조제분유(infant formula), 스킴 밀크(skim milk), 트레할로즈, 말토덱스트린, 베타인, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정의 구현예에서, 적어도 하나의 동결보호제가 배양물의 약 1% 내지 약 20%(w/v)의 양으로 존재한다.
특정의 구현예에서, 동결-건조된 엠. 엘스데니이는 시판 규모로 생산된다.
특정의 구현예에서, 배양물의 용적은 적어도 약 50 리터이다.
특정의 구현예에서, 약 1 x 103 내지 1 x 1012 CFU/g의 엠. 엘스데니이 세포가 동결-건조 후 생존가능하다.
특정의 구현예에서, 배양물 속의 세포는 엠. 엘스데니이 세포로 이루어진다.
본 개시내용은 임의의 상기 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포를 포함하는 고체 사료 첨가제에 관한 것이다.
특정의 구현예에서, 고체 사료 첨가제는 다른 미생물을 추가로 포함한다.
특정의 구현예에서, 고체 사료 첨가제는 분말, 과립, 입자상 물질(particulate), 펠렛, 케이크, 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정의 구현예에서, 고체 사료 첨가제는 프로바이오틱(probiotic)이다.
본 개시내용은 임의의 상기 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포를 포함하는 조성물 또는 임의의 상기 고체 사료 첨가제에 관한 것이다.
특정의 구현예에서, 조성물을 캅셀제이다.
본 개시내용은 임의의 상기 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 임의의 상기 고체 사료 첨가제, 또는 임의의 상기 조성물을 포함하는 키트(kit)에 관한 것이다.
본 개시내용은 임의의 상기 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 임의의 상기 고체 사료 첨가제, 또는 임의의 상기 조성물을 동물에게 투여함을 포함하여, 동물에게 엠. 엘스데니이 세포를 투여하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용은 유효량의 임의의 상기 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 임의의 상기 고체 사료 첨가제, 또는 임의의 상기 조성물을 동물에게 투여함을 포함하여, 동물의 위장관내 젖산 생산과 관련된 상태 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.
특정의 구현예에서, 장애의 상태는 산증이다.
특정의 구현예에서, 상태 또는 장애는 제일위과산증(ruminal acidosis)이다.
특정의 구현예에서, 상태 또는 장애는 호흡기 질환이다.
특정의 구현예에서, 상태 또는 장애는 제엽염(laminitis)이다.
특정의 구현예에서, 상태 또는 장애는 감염이다.
특정의 구현예에서, 감염은 살모넬라(Salmonella) 또는 캄필로박터(Campylobacter)에 의한 것이다.
본 개시내용은 유효량의 임의의 상기 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 임의의 상기 고체 사료 첨가제, 또는 임의의 상기 조성물을 동물에게 투여함을 포함하여, 동물의 위장관내 기회감염 미생물의 성장을 예방하거나 감소시키는 방법에 관한 것이다.
특정의 구현예에서, 기회감염 미생물은 병원성이다.
특정의 구현예에서, 기회감염 미생물은 살모넬라(Salmonella) 또는 캄필로박터(Campylobacter)이다.
본 개시내용은 유효량의 임의의 상기 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 임의의 상기 고체 사료 첨가제, 또는 임의의 상기 조성물을 동물에게 투여함을 포함하여, 동물의 식이(diet) 속의 식물-유래된 인(plant-derived phosphorous)의 생체이용률(bioavailability)을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용은 동물에게 유효량의 임의의 상기 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 임의의 상기 고체 사료 첨가제, 또는 임의의 상기 조성물을 동물에게 투여함을 포함하여, 동물에서 성장 능력을 증진시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 동물에서 증진된 성장 능력은 사료 섭취, 평균 일당증체량(average daily gain), 사료 요구율(feed conversion ration), 사체 획득(carcass gain), 젖 생산 동물에서 젖 생산, 가금류에서 알 생산, 골 광화(bone mineralization), 또는 이의 조합에 있어서의 증진이다.
특정의 구현예에서, 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 고체 사료 첨가제, 또는 조성물은 사료를 사용하여 동물에게 먹이주기 전에, 이와 동시에, 또는 후에 투여한다.
특정의 구현예에서, 방법은 투여 전에 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포 또는 고체 사료 첨가제를 액체와 혼합하는 단계를 추가로 포함한다.
특정의 구현예에서, 액체는 경구적으로 또는 동물에게 액체를 분무함으로써 투여된다.
특정의 구현예에서, 투여는 엠. 엘스데니이 세포, 사료 첨가제, 또는 조성물의 단일 투여를 포함한다.
특정의 구현예에서, 투여는 엠. 엘스데니이 세포, 사료 첨가제, 또는 조성물의 매일 투여를 포함한다.
특정의 구현예에서, 투여는 엠. 엘스데니이 세포, 사료 첨가제, 조성물의 1일 1회로 1회 이상의 투여를 포함한다.
특정의 구현예에서, 동물은 반추동물이다.
특정의 구현예에서, 반추동물은 소, 양, 염소, 사슴, 버팔로, 및 순록으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정의 구현예에서, 동물은 비-반추동물이다.
특정의 구현예에서, 비-반추동물은 말류, 가금류, 및 돼지류로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정의 구현예에서, 동물은 가금류 동물이다.
특정의 구현예에서, 가금류 동물은 닭, 거위, 오리, 메추라기, 칠면조, 또는 비둘기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정의 구현예에서, 가금류 동물은 영계, 육용종계, 및 산란닭으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정의 구현예에서, 가금류 동물은 닭이다.
특정의 구현예에서, 동물은 말이다.
특정의 구현예에서, 말류(equine)는 말(horse), 조랑말, 당나귀, 또는 노새이다.
본 개시내용은 가금류 동물에게 유효량의 엠. 엘스데니이 세포를 투여함을 포함하여, 가금류 동물의 위장관내 젖산 생산과 관련된 상태 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.
특정의 구현예에서, 상태 또는 장애는 산증이다.
특정의 구현예에서, 상태 또는 장애는 호흡기 질환이다.
특정의 구현예에서, 상태 또는 장애는 감염이다.
특정의 구현예에서, 감염은 살모넬라 또는 캄필로박터에 의한 것이다.
본 개시내용은 가금류 동물에게 유효량의 엠. 엘스데니이 세포를 투여함을 포함하여, 가금류 동물의 위장내 기회감염 미생물의 성장을 예방하거나 감소시키는 방법에 관한 것이다.
특정의 구현예에서, 기회감염 미생물은 병원성이다.
특정의 구현예에서, 기회감염 미생물은 살모넬라 또는 캄필로박터이다.
본 개시내용은 가금류 동물에게 유효량의 엠. 엘스데니이 세포를 투여함을 포함하여, 가금류 동물의 식이 속에서 식물-유래된 인의 생체이용률을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용은 가금류 동물에게 유효량의 엠. 엘스데니이 세포를 투여함을 포함하여, 가금류 동물에서 성장 능력을 증진시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 동물에서 증진된 성장 능력은 사료 섭취, 평균 일당증체량, 사료 요구율, 사체 획득, 알 생산, 골 광화, 또는 이의 조합에 있어서의 증진이다.
특정의 구현예에서, 가금류 동물은, 닭, 거위, 오리, 메추라기, 칠면조, 또는 비둘기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정의 구현예에서, 가금류 동물은 영계, 육용종계, 및 산란닭으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정의 구현예에서, 가금류 동물은 닭이다.
본 개시내용은 말류에게 유효량의 엠. 엘스데니이 세포를 투여함을 포함하여, 말류의 위장관내에서 젖산 생산과 관련된 상태 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.
특정의 구현예에서, 상태 또는 장애는 산증이다.
특정의 구현예에서, 상태 또는 장애는 호흡기 질환이다.
특정의 구현예에서, 상태 또는 장애는 제엽염이다.
특정의 구현예에서, 상태 또는 장애는 감염이다.
특정의 구현예에서, 감염은 살모넬라 또는 캄필로박터에 의한 것이다.
말류에게 유효량의 엠. 엘스데니이 세포를 투여함을 포함하여, 말류의 위장관 속에서 기회감염 미생물의 성장을 예방하거나 감소시키는 방법에 관한 것이다.
특정의 구현예에서, 기회감염 미생물은 병원성이다.
특정의 구현예에서, 기회감염 미생물은 살모넬라 또는 캄필로박터이다.
본 개시내용은 말류에게 유효량의 엠. 엘스데니이 세포를 투여함을 포함하여, 말류의 식이 속의 식물-유래된 인의 생체이용률을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용은 말류에게 유효량의 엠. 엘스데니이 세포를 투여함을 포함하여, 말류에서 성장 능력을 증진시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 동물에서 증진된 성장 능력은 사료 섭취, 평균 일당증체량, 사료 요구율, 사체 획득, 젖 생산, 골 광화, 또는 이의 조합에 있어서의 증진이다.
특정의 구현예에서, 말류는 경마말, 조랑말, 당나귀, 또는 노새이다.
특정의 구현예에서, 사료 첨가제는 엠. 엘스디니이 세포를 포함한다.
특정의 구현예에서, 사료 첨가제는 분말, 과립, 입자상 물질, 펠렛, 케이크, 액체, 겔, 또는 이의 조합이다.
특정의 구현예에서, 조성물은 엠. 엘스데니이 세포 또는 이러한 세포를 포함하는 사료 첨가제를 포함한다.
특정의 구현예에서, 조성물은 캅셀제이다.
특정의 구현예에서, 엠. 엘스데니이 세포는 동결-건조된 세포이다.
특정의 구현예에서, 엠. 엘스데니이 세포는 액체로 투여된다.
특정의 구현예에서, 방법은 사료 첨가제 또는 동결-건조된 세포를 재수화시켜 액체를 생산함을 추가로 포함한다.
특정의 구현예에서, 액체는 경구 섭식(oral gavage)에 의해 또는 동물을 액체로 분무시킴에 의해 투여된다.
특정의 구현예에서, 엠. 엘스데니이 세포는 동물에게 사료를 사용하여 먹이를 주기 전에, 이와 동시에, 또는 후에 투여된다.
특정의 구현예에서, 투여는 엠. 엘스데니이 세포의 단일 투여를 포함한다.
특정의 구현예에서, 투여는 엠. 엘스데니이 세포의 매일 투여를 포함한다.
특정의 구현예에서, 투여는 엠. 엘스데니이 세포의 1일 1회, 1회 이상의 투여를 포함한다.
본 개시내용은 (a) 혐기성 조건 하에서 메가스파에라 세포 및, 카제인, 락테이트, 덱스트로즈, 프럭토즈, 프럭탄, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈, 아세테이트, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 사카로즈, 크실로즈, 몰라세스, 푸코즈, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 아세트산나트륨, 아라비노즈, 대두 단백질, 가용성 단백질, 라피노즈, 아밀로즈, 전분, 트립톤, 효모 추출물, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 탄소원을 포함하는 성장 배지를 포함하는 배양물을 제조하는 단계, (b) 세포를 혐기성 조건 하에서 수거하는 단계, (c) 세포를 동결시키는 단계, (d) 세포를 동결-건조시키는 단계, 및 (e) 세포를 캅셀화하는 단계로서, 여기서 약 1 x 103 내지 약 1 x 1012 CFU/g의 캅셀화된 동결-건조된 메가스파에라 세포가 생산됨을 포함하는, 캡슐화된 동결-건조된 메가스파에라 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
특정의 구현예에서, 방법은 동물에게 캅셀화된 동결-건조된 메가스파에라 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
특정의 구현예에서, 동물에서 성장 능력을 증진시키는 방법은 동물에게 유효량의 캅셀화된 동결-건조된 메가스파에라 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
특정의 구현예에서, 동물에서 증진된 성장 능력은 사료 섭취, 평균 일당증체량, 사료 요구율, 사체 획득, 젖-생산 동물에서 젖 생산, 가금류에서 알 생산, 골 광화, 또는 이의 조합에 있어서의 증진이다.
특정의 구현예에서, 동물의 위장관내 기회감염 미생물의 성장을 예방하거나 감소시키기 위한 방법은 동물에게 유효량의 캅셀화된 동결-건조된 메가스파에라 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
특정의 구현예에서, 조성물은 캅셀화된 동결-건조된 메가스파에라 세포를 포함한다.
본 개시내용은 (a) 혐기성 세균 세포 및, 카제인, 락테이트, 덱스트로즈, 프럭토즈, 프럭탄, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈, 아세테이트, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 사카로즈, 크실로즈, 몰라세스, 푸코즈, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 아세트산나트륨, 아라비노즈, 대두 단백질, 가용성 단백질, 라피노즈, 아밀로즈, 전분, 트립톤, 효모 추출물, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 탄소원을 포함하는 성장 배지를 포함하는 배양물을 혐기성 조건 또는 부분 혐기성 조건 하에서 배양물을 제조하는 단계, (b) 세포를 혐기성 조건 또는 부분 혐기성 조건하에서 수거하는 단계, (c) 세포를 동결시키는 단계, 및 (d) 세포를 동결건조시키는 단계로서, 여기서 약 1 x 103 내지 약 1 x 1012 CFU/g의 동결-건조된 혐기성 세균 세포가 생산되는 단계를 포함하는 동결-건조된 혐기성 세균 세포의 생산 방법에 관한 것이다.
특정의 구현예에서, 방법은 동물에게 동결-건조된 혐기성 세균 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
특정의 구현예에서, 동물에서 성장 능력을 증진시키는 방법은 동물에게 유효량의 동결-건조된 혐기성 세균 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
특정의 구현예에서, 동물에서 증진된 성장 능력은 사료 섭취, 평균 일당증체량, 사료 요구율, 사체 획득, 젖-생산 동물에서 젖 생산, 가금류에서 알 생산, 골 광화, 또는 이의 조합에 있어서의 증진이다.
특정의 구현예에서, 동물의 위장 관 속의 기회감염 미생물의 성장을 예방하거나 감소시키는 방법은 동물에게 유효량의 동결-건조된 혐기성 세균 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
특정의 구현예에서, 조성물은 동결-건조된 혐기성 세균 세포를 포함한다.
본 개시내용은 (a) 혐기성 조건 또는 부분 혐기성 조건 하에서 혐기성 세균 세포 및, 카제인, 락테이트, 덱스트로즈, 프럭토즈, 프럭탄, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈, 아세테이트, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 사카로즈, 크실로즈, 몰라세스, 푸코즈, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 아세트산나트륨, 아라비노즈, 대두 단백질, 가용성 단백질, 라피노즈, 아밀로즈, 전분, 트립톤, 효모 추출물, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 탄소원을 포함하는 성장 배지를 포함하는 배양물을 제조하는 단계, (b) 세포를 혐기성 조건 또는 부분 혐기성 조건하에서 수거하는 단계, (c) 세포를 동결시키는 단계, (d) 세포를 동결-건조시키는 단계, 및 (e) 세포를 캅셀화하는 단계로서, 여기서 약 1 x 103 내지 약 1 x 1012 CFU/g의 캅셀화된 동결-건조된 혐기성 세균 세포가 생산되는 단계를 포함하는, 캅셀화된 동결-건조된 혐기성 세균 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
특정의 구현예에서, 방법은 동물에게 캅셀화된 동결-건조된 혐기성 세균 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
특정의 구현예에서, 동물에서 성장 능력을 증진시키는 방법은 동물에게 유효량의 캅셀화된 동결-건조된 혐기성 세균 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
특정의 구현예에서, 동물에서 증진된 성장 능력이 사료 섭취, 평균 일당증체량, 사료 요구율, 사체 획득, 젖 생산 동물에서 젖 생산, 가금류에서 알 생산, 골 광화, 또는 이의 조합에 있어서의 증진이다.
특정의 구현예에서, 동물의 위장관내에서 기회감염 미생물의 성장을 예방하거나 감소시키기 위한 방법은 동물에게 유효량의 캅셀화된 동결-건조된 혐기성 세균 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
특정의 구현예에서, 조성물은 캅셀화된 동결-건조된 혐기성 세균 세포를 포함한다.
본 개시내용은 (a) 호기성 조건 하에서 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포 및, 카제인, 락테이트, 덱스트로즈, 프럭토즈, 프럭탄, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈, 아세테이트, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 사카로즈, 크실로즈, 몰라세스, 푸코즈, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 아세트산나트륨, 아라비노즈, 대두 단백질, 가용성 단백질, 라피노즈, 아밀로즈, 전분, 트립톤, 효모 추출물, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 탄소원을 포함하는 성장 배지를 포함하는 배양물을 제조하는 단계, (b) 세포를 수거하는 단계, (c) 세포를 동결시키는 단계, 및 (d) 세포를 동결-건조시키는 단계로서, 여기서 약 1 x 103 내지 약 1 x 1012 CFU/g의 동결-건조된 호기성 세균 및/또는 효모 세포가 생산되는 단계를 포함하는, 동결-건조된 호기성 세균 및/또는 효모 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
특정의 구현예에서, 방법은 동물에게 동결-건조된 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
특정의 구현예에서, 동물에서 성장 능력을 증진시키는 방법은 동물에게 유효량의 동결-건조된 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포를 투여함을 포함한다.
특정의 구현예에서, 동물에서 증진된 성장 능력은 사료 섭취, 평균 일당증체량, 사료 요구율, 사체 획득, 젖 생산 동물에서 젖 생산, 가금류에서 알 생산, 골 광화, 또는 이의 조합에 있어서의 증진이다.
특정의 구현예에서, 동물의 위장관내에서 기회감염 미생물의 성장을 예방하거나 감소시키기 위한 방법은 동물에게 유효량의 동결-건조된 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
특정의 구현예에서, 조성물은 동결-건조된 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포를 포함한다.
본 개시내용은 (a) 호기성 조건 하에서 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포 및, 카제인, 락테이트, 덱스트로즈, 프럭토즈, 프럭탄, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈, 아세테이트, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 사카로즈, 크실로즈, 몰라세스, 푸코즈, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 아세트산나트륨, 아라비노즈, 대두 단백질, 가용성 단백질, 라피노즈, 아밀로즈, 전분, 트립톤, 효모 추출물, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 탄소원을 포함하는 성장 배지를 포함하는 배양물을 제조하는 단계, (b) 세포를 호기성 조건 하에서 수거하는 단계, (c) 세포를 동결시키는 단계, (d) 세포를 동결-건조시키는 단계, 및 (e) 세포를 캅셀화하는 단계로서, 여기서 약 1 x 103 내지 약 1 x 1012 CFU/g의 캅셀화된 동결-건조된 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포가 생산되는 단계를 포함하는, 캅셀화된 동결-건조된 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
특정의 구현예에서, 방법은 동물에게 캅셀화된 동결-건조된 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
특정의 구현예에서, 동물에서 성장 능력을 증진시키는 방법은 동물에게 유효량의 캅셀화된 동결-건조된 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
특정의 구현예에서, 동물에서 증진된 성장 능력은 사료 섭취, 평균 일당증체량, 사료 요구율, 사체 획득, 젖 생산 동물에서 젖 생산, 가금류에서 알 생산, 골 광화, 또는 이의 조합에 있어서의 증진이다.
특정의 구현예에서, 동물의 위장관 내에서 기회감염 미생물의 성장을 예방하거나 감소시키기 위한 방법은 동물에게 유효량의 캅셀화된 동결-건조된 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
특정의 구현예에서, 조성물은 캅셀화된 동결-건조된 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포를 포함한다.
도면/도의 간단한 설명
도 1은 대수("Log10") 규모로 밀리리터당 콜로니 형성 단위(colony forming unit)("CFU/mL")로 엠. 엘스데니이 세포의 수율 측면에서 28일의 기간에 걸쳐 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 41125의 액체 배양물의 생존능에 있어서 저장 온도의 효과를 나타낸다.
도 2는 Log10 규모로 CFU/mL에서 엠. 엘스데니이 세포의 수율 측면에서 실온에서 0, 7, 14, 21, 및 28일의 저장 후 엠. 엘스데니이 NCIMB 41125의 액체 배양물의 생존능을 나타낸다.
도 3은 접선유동여과("TFF") 시스템의 개략도를 나타낸다.
도 4는 TFF 시스템을 통한 가공 후 Log10 규모에서 y-축 상의 보유액(retenate)의 CFU/mL의 엠. 엘스데니이 세포의 수율을 나타낸다. x-축은 시스템에 의한 70%, 80%, 또는 90 용적%의 감소를 나타낸다. "표적"은 TFF 공정 후 엠. 엘스데니이 세포의 이론적 회수를 지칭한다. "Conc."은 보유액 속의 엠. 엘스데니이 세포의 실제 회수를 나타내며, 이는 나타낸 용적 감소 후 남아있는 농축된 세포의 용적이다.
도 5는 세포를 -80℃ 또는 액체 질소(LiqN)에서 동결시키고 느린(135 mTorr에서 38 시간) 또는 신속한(250 mTorr에서 18.5 시간) 주기를 사용하여 세포를 동결-건조시킨 후의 세포 손실을 나타낸다. 세포는 동결보호제로서 8% 말토덱스트린/15% 스킴 밀크(M/SM) 또는 8% 트레할로즈/15% 스킴(T/SM)를 가진 배양물의 TFF를 사용한 70%, 80%, 또는 90% 용적 감소 후 보유액로부터의 것이었다.
도 6은 초기 신속한(액체 질소) 또는 느린(-20℃) 동결에 이은 동결 건조(15% 말토덱스트린 및 0% 또는 7.5% 트레할로즈의 존재하에서) 후 엠. 엘스데니이 NCIMB 41125 세포의 수율을 나타낸다.
도 7은 -80℃ 또는 액체 질소(LiqN) 속에서 4% 트레할로즈 또는 7.5% 스킴 밀크의 존재 또는 부재하에서 동결된 엠. 엘스데니이 NCIMB 41125 세포내에서 관찰된 세포 손실을 나타낸다.
도 8은 90% 용적 감소 보유액로부터 수득되거나, 8% 트레할로즈/15% 스킴 밀크 (T/SM) 또는 8% 말토덱스트린/15% 스킴 밀크(M/SM)와 혼합되거나, -80℃ 또는 액체 질소(LiqN) 속에서 동결되고, 신속한 주기를 사용하여 동결-건조되고 혐기성 조건 하에서 24주까지 실온 또는 4℃에서 저장된 동결-건조된 샘플에서 관찰된 세포 손실을 나타낸다.
도 9는 90% 용적 감소 보유액로부터 수득되고, 8% 트레할로즈/15% 스킴 밀크 (T/SM) 또는 8% 말토덱스트린/15% 스킴 밀크(M/SM)와 혼합되고, -80℃ 또는 액체 질소(LiqN) 속에서 동결되며, 신속한 주기를 사용하여 동결-건조되고 혐기성 조건 하에 24주 동안 실온 또는 4℃에서 저장된 동결-건조된 샘플에서 관찰된 세포 손실을 나타낸다. 일반적인 윗첨자가 없는 바아(bar)는 통계적으로 상이하다, P < 0.02.
도 10은 90% 용적 감소 보유액로부터 수득되고, 8% 트레할로즈/15% 스킴 밀크 (T/SM) 또는 8% 말토덱스트린/15% 스킴 밀크(M/SM)와 혼합되며, 액체 질소(LiqN) 속에서 동결되고, 신속한 주기를 사용하여 혐기성 조건 하에 4 또는 25℃에서 12, 16, 20 또는 24주의 저장 후 동결-건조된 비-동결-건조되거나 재수화된 동결-건조된 생성물에서 수행된 성장 곡선을 나타낸다. 광학 밀도(OD)는 0시간 내지 20시간에서 측정된 바와 같이 600 나노미터(nm)에서 나타낸다. 황색 선 = 비-동결-건조됨, 적색 선 = T/SM, 청색 선 = M/SM, 점선 = 4℃에서 저장, 및 실선 = 25℃에서 저장됨.
도 11은 4℃에서 11개월까지 저장된 동결-건조된 바이알(vial)로부터 Log10 규모로 그람당 CFU("CFU/g")의 엠. 엘스데니이를 나타낸다. 각각의 데이타 점은 2개의 상이한 동결 건조 실시로부터 3개 바이알의 평균 수율에 상응한다(총 6개 바이알).
도 12는 상단-드레스 처리(즉, 처리물을 사료내로 혼합하거나 처리물을 사료의 상단에 둠으로써 동물 사료에 첨가된 처리)로서 매일 제공된 동결-건조된 생성물에서 엠. 엘스데니이 농도(CFU/머리/일)를 나타낸다. 샘플링의 주는 x-축에 나타낸다; 샘플링 효과, P < 0.0001. 수평 실선은 매일 전달될 표적 엠. 엘스데니이 농도(CFU/head/일)를 나타낸다.
도 13은 동결-건조된 생성물로 상단-드레스되고 0 내지 4시간 동안 실험실 속의 주위 조건에 실온에서 태양에 대한 직접적인 노출없이(내부) 또는 외부에서 95℉까지의 평균 1일 온도로 태양에 대한 직접적인 노출과 함께(외부) 노출된 분쇄된 옥수수 속의 엠. 엘스데니이 농도(CFU/머리/일)를 나타낸다. 노출 시간 및 저장 조건의 조합된 효과, P = 0.0007; 노출 시간 효과, P < 0.0001; 저장 조건 효과, P < 0.0001.
도 14는 각각의 그룹에 대한 제1의 사료공급 후 26시간에 수득된 반추위 유액 샘플에 있어서 내독소 농도(EU/mL)(반추위 속의 세균 분해물의 지표로서 측정됨)를 나타낸다: 대조군 그룹(엠. 엘스데니이를 제공받지 않음), 비-동결-건조된 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는 50 mL의 엠. 엘스데니이 액체 배양물을 제공받음), 재수화된 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는, 투여 직전 재수화된 동결건조된 배양물을 제공받음), 및 상단-드레스 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는, 투여 직전 재수화된 동결건조된 배양물을 제공받고, 또한 108 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는 1일 상단-드레스로서 혼입된 동결건조된 엠. 엘스데니이를 제공받음). 처리 효과, P = 0.3462.
도 15는 각각의 그룹에 대한 1시간 간격으로 측정된 반추 pH를 나타낸다: 대조군 그룹(엠. 엘스데니이를 제공받지 않음), 비-동결-건조된 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는 50 mL의 엠. 엘스데니이 액체 배양물을 제공받음), 재수화된 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는, 투여 직전 재수화된 동결건조된 배양물을 제공받음), 및 상단-드레스 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는, 투여 직전 재수화된 동결건조된 배양물을 제공받고 108 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는 1일 상단-드레스로서 혼입된 동결건조된 엠. 엘스데니이를 제공받음). 처리 및 일의 조합 효과, P < 0.001, 처리 효과, P < 0.001, 일의 효과, P < 0.001. 평균의 표준 오차(SEM) = 0.041.
도 16은 각각의 그룹에 대한 반추 유액이 접종된 반-정의된 락테이트 배지의 600 nm에서의 광학 밀도에 있어서의 변화를 나타낸다: 대조군 그룹(엠. 엘스데니이를 제공받지 않음), 비-동결-건조된 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는 50 mL의 엠. 엘스데니이 액체 배양물을 제공받음), 재수화된 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는, 투여 직전 재수화된 동결건조된 배양물을 제공받음), 및 상단-드레스 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는, 투여 직전 재수화된 동결건조된 배양물을 제공받고 또한 108 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는 1일 상단-드레스로서 혼입된 동결건조된 엠. 엘스데니이를 제공받음). 처리 및 시간의 조합된 효과, P < 0.02; 처리 효과, P < 0.01; 시간 효과, P < 0.01. SEM = 0.04.
도 17은 각각의 그룹에 대해 혼합된 반추 미생물로 접종된 반-정의된 락테이트 배지의 L-락테이트 농도(mM)에 있어서의 변화를 나타낸다: 대조군 그룹(엠. 엘스데니이를 제공받지 않음), 비-동결-건조된 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는 50 mL의 엠. 엘스데니이 액체 배양물을 제공받음), 재수화된 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는, 투여 직전 재수화된 동결건조된 배양물을 제공받음), 및 상단-드레스 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는, 투여 직전 재수화된 동결건조된 배양물을 제공받고 또한 108 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는 1일 상단-드레스로서 혼입된 동결건조된 엠. 엘스데니이를 제공받음). 상이한 윗첨자를 지닌 a,b,c 바아는 서로 통계적으로 상이하다; P < 0.05.
도 18은 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 41125 세포에서 피타아제 활성을 나타낸다. x-축은 배양 시작("0" 시간)으로부터 및 이후 2시간 간격, 즉, 배양 시작 후 "2", "4", "6", 및 "8" 시간에 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 41125 세포의 배양물로부터 취한 세포 샘플을 나타낸다. 피타아제 활성은 분당 마이크로몰("방출된 P의 μmol/min")로 샘플의 세포 펠렛으로부터 방출된 무기 인의 양으로서 y-축에 나타낸다. 무기 포스페이트(KH2PO4)를 함유하는 배지 속에서 배양된 세포내 피타아제 활성은 연회색으로 나타내는 반면, 피타아제를 함유하는 배지 속에서 배양된 세포내 피타아제 활성은 진회색으로 나타낸다.
도 19는 15일된 구이용 영계로부터의 맹장 샘플에서 살모넬라 농도에 대한 메가스파에라 엘스데니이의 효과를 나타낸다. x-축은 메가스파에라 엘스데니이가 없는("대조군"), 액체 메가스파에라 엘스데니이를 함유하는 병 먹이통(feeder)에 임의로(ad libitum) 자유로이 접근("임의로"), 1일 동결-건조된 메가스파에라 엘스데니이("동결-건조된"), 또는 0일째에 액체 메가스파에라 엘스데니이의 경구 섭식의 처리를 나타낸다. y-축은 처리 그룹에 대해 Log10 규모로 밀리리터당 콜로니 형성 단위(CFU/mL)에 있어서의 살모넬라 농도를 나타낸다.
도 20은 15일된 구이용 닭으로부터의 맹장 샘플 속에서 살모넬라의 발병률을 나타낸다. x-축은 처리 그룹을 나타낸다. y-축은 살모넬라에 대해 양성인 맹장 샘플의 퍼센트를 나타낸다.
도 21은 메가스파에라가 없거나("대조군") 또는 동결-건조된 메가스파에라 엘스데니이("동결-건조된")를 사용하여 처리된 18일된 구이용 닭에서 사료 대 증체량 비(y-축)를 나타낸다. 사료 대 증체량 비는 증가된 총 중량에 대해 소비된 총 사료의 비이다.
도 22는 메가스파에라 엘스데니이로 처리하지 않거나("대조군"), 각각의 7일의 처리 기간 중 1일에 메가스파에라 엘스데니이의 경구 드렌치("드렌치(Drench)")로 처리하거나, 또는 1일 동결-건조된 메가스파에라 엘스데니이("동결-건조된")를 처리한 말로부터의 맹장 샘플에서의 pH를 나타낸다.
도 23은 70% 락테이트 및 30% 글루코즈를 함유하는 반-정의된 배지 상에서 엠. 엘스데니이 균주(NCIMB 41125, ATCC 25940, NCIMB 702261, NCIMB 702262, 및 NCIMB 702410)의 성장을 나타낸다.
도 24는 60% 락테이트 및 40% 글루코즈를 함유하는 반-정의된 배지 상에서 엠. 엘스데니이 균주(NCIMB 41125, ATCC 25940, NCIMB 702261, NCIMB 702262, 및 NCIMB 702410)의 성장을 나타낸다.
도 25는 40% 락테이트 및 60% 글루코즈를 함유하는 반-정의된 배지 상에서 엠. 엘스데니이 균주(NCIMB 41125, ATCC 25940, NCIMB 702261, NCIMB 702262, 및 NCIMB 702410)의 성장을 나타낸다.
도 26은 방법 2를 사용하여 캅셀화되고 실온에서 호기성 환경 속에서 저장된 동결-건조된 엠. 엘스데니이의 안전성을 나타낸다.
도 27은 방법 3을 사용하여 캅셀화되고 실온에서 호기성 환경 속에 저장된 동결-건조된 엠. 엘스데니이의 안전성을 나타낸다.
도 28은 (M.e. + 말토덱스트린)이 들어있거나 말토덱스트린이 없는(M.e.) 마일라 파우치(Mylar pouch)를 40 또는 75℉에서 저장한 동결 건조된 생성물 속에서의 엠. 엘스데니이 NCIMB 41125 농도(Log10 CFU/파우치)를 나타낸다.
도 1은 대수("Log10") 규모로 밀리리터당 콜로니 형성 단위(colony forming unit)("CFU/mL")로 엠. 엘스데니이 세포의 수율 측면에서 28일의 기간에 걸쳐 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 41125의 액체 배양물의 생존능에 있어서 저장 온도의 효과를 나타낸다.
도 2는 Log10 규모로 CFU/mL에서 엠. 엘스데니이 세포의 수율 측면에서 실온에서 0, 7, 14, 21, 및 28일의 저장 후 엠. 엘스데니이 NCIMB 41125의 액체 배양물의 생존능을 나타낸다.
도 3은 접선유동여과("TFF") 시스템의 개략도를 나타낸다.
도 4는 TFF 시스템을 통한 가공 후 Log10 규모에서 y-축 상의 보유액(retenate)의 CFU/mL의 엠. 엘스데니이 세포의 수율을 나타낸다. x-축은 시스템에 의한 70%, 80%, 또는 90 용적%의 감소를 나타낸다. "표적"은 TFF 공정 후 엠. 엘스데니이 세포의 이론적 회수를 지칭한다. "Conc."은 보유액 속의 엠. 엘스데니이 세포의 실제 회수를 나타내며, 이는 나타낸 용적 감소 후 남아있는 농축된 세포의 용적이다.
도 5는 세포를 -80℃ 또는 액체 질소(LiqN)에서 동결시키고 느린(135 mTorr에서 38 시간) 또는 신속한(250 mTorr에서 18.5 시간) 주기를 사용하여 세포를 동결-건조시킨 후의 세포 손실을 나타낸다. 세포는 동결보호제로서 8% 말토덱스트린/15% 스킴 밀크(M/SM) 또는 8% 트레할로즈/15% 스킴(T/SM)를 가진 배양물의 TFF를 사용한 70%, 80%, 또는 90% 용적 감소 후 보유액로부터의 것이었다.
도 6은 초기 신속한(액체 질소) 또는 느린(-20℃) 동결에 이은 동결 건조(15% 말토덱스트린 및 0% 또는 7.5% 트레할로즈의 존재하에서) 후 엠. 엘스데니이 NCIMB 41125 세포의 수율을 나타낸다.
도 7은 -80℃ 또는 액체 질소(LiqN) 속에서 4% 트레할로즈 또는 7.5% 스킴 밀크의 존재 또는 부재하에서 동결된 엠. 엘스데니이 NCIMB 41125 세포내에서 관찰된 세포 손실을 나타낸다.
도 8은 90% 용적 감소 보유액로부터 수득되거나, 8% 트레할로즈/15% 스킴 밀크 (T/SM) 또는 8% 말토덱스트린/15% 스킴 밀크(M/SM)와 혼합되거나, -80℃ 또는 액체 질소(LiqN) 속에서 동결되고, 신속한 주기를 사용하여 동결-건조되고 혐기성 조건 하에서 24주까지 실온 또는 4℃에서 저장된 동결-건조된 샘플에서 관찰된 세포 손실을 나타낸다.
도 9는 90% 용적 감소 보유액로부터 수득되고, 8% 트레할로즈/15% 스킴 밀크 (T/SM) 또는 8% 말토덱스트린/15% 스킴 밀크(M/SM)와 혼합되고, -80℃ 또는 액체 질소(LiqN) 속에서 동결되며, 신속한 주기를 사용하여 동결-건조되고 혐기성 조건 하에 24주 동안 실온 또는 4℃에서 저장된 동결-건조된 샘플에서 관찰된 세포 손실을 나타낸다. 일반적인 윗첨자가 없는 바아(bar)는 통계적으로 상이하다, P < 0.02.
도 10은 90% 용적 감소 보유액로부터 수득되고, 8% 트레할로즈/15% 스킴 밀크 (T/SM) 또는 8% 말토덱스트린/15% 스킴 밀크(M/SM)와 혼합되며, 액체 질소(LiqN) 속에서 동결되고, 신속한 주기를 사용하여 혐기성 조건 하에 4 또는 25℃에서 12, 16, 20 또는 24주의 저장 후 동결-건조된 비-동결-건조되거나 재수화된 동결-건조된 생성물에서 수행된 성장 곡선을 나타낸다. 광학 밀도(OD)는 0시간 내지 20시간에서 측정된 바와 같이 600 나노미터(nm)에서 나타낸다. 황색 선 = 비-동결-건조됨, 적색 선 = T/SM, 청색 선 = M/SM, 점선 = 4℃에서 저장, 및 실선 = 25℃에서 저장됨.
도 11은 4℃에서 11개월까지 저장된 동결-건조된 바이알(vial)로부터 Log10 규모로 그람당 CFU("CFU/g")의 엠. 엘스데니이를 나타낸다. 각각의 데이타 점은 2개의 상이한 동결 건조 실시로부터 3개 바이알의 평균 수율에 상응한다(총 6개 바이알).
도 12는 상단-드레스 처리(즉, 처리물을 사료내로 혼합하거나 처리물을 사료의 상단에 둠으로써 동물 사료에 첨가된 처리)로서 매일 제공된 동결-건조된 생성물에서 엠. 엘스데니이 농도(CFU/머리/일)를 나타낸다. 샘플링의 주는 x-축에 나타낸다; 샘플링 효과, P < 0.0001. 수평 실선은 매일 전달될 표적 엠. 엘스데니이 농도(CFU/head/일)를 나타낸다.
도 13은 동결-건조된 생성물로 상단-드레스되고 0 내지 4시간 동안 실험실 속의 주위 조건에 실온에서 태양에 대한 직접적인 노출없이(내부) 또는 외부에서 95℉까지의 평균 1일 온도로 태양에 대한 직접적인 노출과 함께(외부) 노출된 분쇄된 옥수수 속의 엠. 엘스데니이 농도(CFU/머리/일)를 나타낸다. 노출 시간 및 저장 조건의 조합된 효과, P = 0.0007; 노출 시간 효과, P < 0.0001; 저장 조건 효과, P < 0.0001.
도 14는 각각의 그룹에 대한 제1의 사료공급 후 26시간에 수득된 반추위 유액 샘플에 있어서 내독소 농도(EU/mL)(반추위 속의 세균 분해물의 지표로서 측정됨)를 나타낸다: 대조군 그룹(엠. 엘스데니이를 제공받지 않음), 비-동결-건조된 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는 50 mL의 엠. 엘스데니이 액체 배양물을 제공받음), 재수화된 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는, 투여 직전 재수화된 동결건조된 배양물을 제공받음), 및 상단-드레스 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는, 투여 직전 재수화된 동결건조된 배양물을 제공받고, 또한 108 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는 1일 상단-드레스로서 혼입된 동결건조된 엠. 엘스데니이를 제공받음). 처리 효과, P = 0.3462.
도 15는 각각의 그룹에 대한 1시간 간격으로 측정된 반추 pH를 나타낸다: 대조군 그룹(엠. 엘스데니이를 제공받지 않음), 비-동결-건조된 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는 50 mL의 엠. 엘스데니이 액체 배양물을 제공받음), 재수화된 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는, 투여 직전 재수화된 동결건조된 배양물을 제공받음), 및 상단-드레스 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는, 투여 직전 재수화된 동결건조된 배양물을 제공받고 108 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는 1일 상단-드레스로서 혼입된 동결건조된 엠. 엘스데니이를 제공받음). 처리 및 일의 조합 효과, P < 0.001, 처리 효과, P < 0.001, 일의 효과, P < 0.001. 평균의 표준 오차(SEM) = 0.041.
도 16은 각각의 그룹에 대한 반추 유액이 접종된 반-정의된 락테이트 배지의 600 nm에서의 광학 밀도에 있어서의 변화를 나타낸다: 대조군 그룹(엠. 엘스데니이를 제공받지 않음), 비-동결-건조된 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는 50 mL의 엠. 엘스데니이 액체 배양물을 제공받음), 재수화된 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는, 투여 직전 재수화된 동결건조된 배양물을 제공받음), 및 상단-드레스 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는, 투여 직전 재수화된 동결건조된 배양물을 제공받고 또한 108 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는 1일 상단-드레스로서 혼입된 동결건조된 엠. 엘스데니이를 제공받음). 처리 및 시간의 조합된 효과, P < 0.02; 처리 효과, P < 0.01; 시간 효과, P < 0.01. SEM = 0.04.
도 17은 각각의 그룹에 대해 혼합된 반추 미생물로 접종된 반-정의된 락테이트 배지의 L-락테이트 농도(mM)에 있어서의 변화를 나타낸다: 대조군 그룹(엠. 엘스데니이를 제공받지 않음), 비-동결-건조된 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는 50 mL의 엠. 엘스데니이 액체 배양물을 제공받음), 재수화된 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는, 투여 직전 재수화된 동결건조된 배양물을 제공받음), 및 상단-드레스 그룹(1010 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는, 투여 직전 재수화된 동결건조된 배양물을 제공받고 또한 108 CFU의 엠. 엘스데니이를 함유하는 1일 상단-드레스로서 혼입된 동결건조된 엠. 엘스데니이를 제공받음). 상이한 윗첨자를 지닌 a,b,c 바아는 서로 통계적으로 상이하다; P < 0.05.
도 18은 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 41125 세포에서 피타아제 활성을 나타낸다. x-축은 배양 시작("0" 시간)으로부터 및 이후 2시간 간격, 즉, 배양 시작 후 "2", "4", "6", 및 "8" 시간에 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 41125 세포의 배양물로부터 취한 세포 샘플을 나타낸다. 피타아제 활성은 분당 마이크로몰("방출된 P의 μmol/min")로 샘플의 세포 펠렛으로부터 방출된 무기 인의 양으로서 y-축에 나타낸다. 무기 포스페이트(KH2PO4)를 함유하는 배지 속에서 배양된 세포내 피타아제 활성은 연회색으로 나타내는 반면, 피타아제를 함유하는 배지 속에서 배양된 세포내 피타아제 활성은 진회색으로 나타낸다.
도 19는 15일된 구이용 영계로부터의 맹장 샘플에서 살모넬라 농도에 대한 메가스파에라 엘스데니이의 효과를 나타낸다. x-축은 메가스파에라 엘스데니이가 없는("대조군"), 액체 메가스파에라 엘스데니이를 함유하는 병 먹이통(feeder)에 임의로(ad libitum) 자유로이 접근("임의로"), 1일 동결-건조된 메가스파에라 엘스데니이("동결-건조된"), 또는 0일째에 액체 메가스파에라 엘스데니이의 경구 섭식의 처리를 나타낸다. y-축은 처리 그룹에 대해 Log10 규모로 밀리리터당 콜로니 형성 단위(CFU/mL)에 있어서의 살모넬라 농도를 나타낸다.
도 20은 15일된 구이용 닭으로부터의 맹장 샘플 속에서 살모넬라의 발병률을 나타낸다. x-축은 처리 그룹을 나타낸다. y-축은 살모넬라에 대해 양성인 맹장 샘플의 퍼센트를 나타낸다.
도 21은 메가스파에라가 없거나("대조군") 또는 동결-건조된 메가스파에라 엘스데니이("동결-건조된")를 사용하여 처리된 18일된 구이용 닭에서 사료 대 증체량 비(y-축)를 나타낸다. 사료 대 증체량 비는 증가된 총 중량에 대해 소비된 총 사료의 비이다.
도 22는 메가스파에라 엘스데니이로 처리하지 않거나("대조군"), 각각의 7일의 처리 기간 중 1일에 메가스파에라 엘스데니이의 경구 드렌치("드렌치(Drench)")로 처리하거나, 또는 1일 동결-건조된 메가스파에라 엘스데니이("동결-건조된")를 처리한 말로부터의 맹장 샘플에서의 pH를 나타낸다.
도 23은 70% 락테이트 및 30% 글루코즈를 함유하는 반-정의된 배지 상에서 엠. 엘스데니이 균주(NCIMB 41125, ATCC 25940, NCIMB 702261, NCIMB 702262, 및 NCIMB 702410)의 성장을 나타낸다.
도 24는 60% 락테이트 및 40% 글루코즈를 함유하는 반-정의된 배지 상에서 엠. 엘스데니이 균주(NCIMB 41125, ATCC 25940, NCIMB 702261, NCIMB 702262, 및 NCIMB 702410)의 성장을 나타낸다.
도 25는 40% 락테이트 및 60% 글루코즈를 함유하는 반-정의된 배지 상에서 엠. 엘스데니이 균주(NCIMB 41125, ATCC 25940, NCIMB 702261, NCIMB 702262, 및 NCIMB 702410)의 성장을 나타낸다.
도 26은 방법 2를 사용하여 캅셀화되고 실온에서 호기성 환경 속에서 저장된 동결-건조된 엠. 엘스데니이의 안전성을 나타낸다.
도 27은 방법 3을 사용하여 캅셀화되고 실온에서 호기성 환경 속에 저장된 동결-건조된 엠. 엘스데니이의 안전성을 나타낸다.
도 28은 (M.e. + 말토덱스트린)이 들어있거나 말토덱스트린이 없는(M.e.) 마일라 파우치(Mylar pouch)를 40 또는 75℉에서 저장한 동결 건조된 생성물 속에서의 엠. 엘스데니이 NCIMB 41125 농도(Log10 CFU/파우치)를 나타낸다.
본 발명은 메가스파에라 엘스데니이 세포, 엠. 엘스데니이 세포를 생산하는 방법, 이러한 세포를 포함하는 사료 첨가제 및 조성물, 및 이러한 세포를 동물에게 투여함을 포함하여, 예컨대, 성장 능력 및/또는 건강을 증진시키기 위함을 포함하는 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 미생물 세포, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 호기성 세균, 혐기성 세균, 및 효모, 및 예를 들면, 비피도박테리움(Bifidobacterium), 예를 들면, 비. 브레베(B. breve), 락토바실러스(Lactobacillus), 예를 들면, 엘. 플란타룸(L. plantarum), 비피도박테이룸(Bifidobacterium), 예를 들면, 비. 아니말리스 아종 락티스(B. animalis subsp. lactis), 페디오코쿠스(Pediococcus), 예를 들면, 피. 악시딜락티시(P. acidilactici), 락토바실러스(Lactobacillus), 예를 들면, 엘. 카세이(L. casei), 바실러스(Bacillus), 예를 들면, 비. 서브틸리스(B. subtilis), 사카로마이세스(Saccharomyces), 예를 들면, 에스. 보울라르디이(S. boulardii) 및 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae), 및 미생물 세포를 생산하는 방법, 미생물 세포를 포함하는 사료 첨가제 및 조성물, 및 미생물 세포를 동물에게 투여함을 포함하여, 예컨대, 성장 능력 및/또는 건강을 증진시키기 위함을 포함하는 용도에 관한 것이다.
본원에 언급된 모든 공보, 특허, 및 기타 참고문헌은 각각의 개개 공보 또는 특허원이 참고에 의해 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 나타낸 경우와 같이 모든 목적을 위해 이의 전문이 참고로 포함된다. 또한, 본 출원에서 임의의 참고문헌의 인용 또는 확인은 이러한 참고문헌이 본 발명에 대한 선행 기술로서 이용가능함을 허용하는 것으로 해석되지는 않아야 한다.
전문용어
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 충돌이 있는 경우, 이러한 정의를 포함하여 본 출원이 조절할 것이다. 내용이 달리 요구하지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다.
단락 제목이 사용된 정도까지, 이들이 필수적으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형("하나"("a" "an") 및 그("the"))은 내용이 명확하게 달리 기술하지 않는 한 복수 참고를 포함한다. 예를 들면, 용어 "화합물" 또는 "적어도 하나의 화합물"은 다수의 화합물, 예를 들면, 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 용어("하나" "그" "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은, 본 발명과 관련된 양을 변형시키기 위해 사용되는 경우, 예를 들면, 통상의 시험 및 처리를 통해; 이러한 시험 및 처리에서 우연한 오차를 통해; 제조, 공급원, 또는 본 발명에 사용된 성분의 순도의 차이 등을 통해서 발생할 수 있는 수치적 양에 있어서의 변화를 지칭한다. 용어 "약"에 의해 변형되거나 변형되지 않는 것에 상관없이, 청구범위는 인용된 양의 등가물을 포함한다. 일부 구현예에서, 용어 "약"은 기록된 수치의 ±10%를 의미한다.
본 명세서 전반에 걸쳐서, 본 발명의 다양한 구현예를 범위 양식으로 나타낼 수 있다. 범위 양식의 설명은 단지 편의성 및 간결성을 위한 것이며 본 발명의 영역에 있어서 융통성없는 제한으로 해석되어서는 안된다. 따라서, 범위의 설명은 구체적으로 개시된 모든 가능한 소범위뿐만 아니라 이러한 범위내 개개의 수치를 갖는 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 구체적으로 개시된 소범위, 예를 들면 1 내지 2, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 3, 2 내지 4, 2 내지 5, 2 내지 6, 3 내지 4, 3 내지 5, 3 내지 6 등 뿐만 아니라, 이러한 범위내 각각의 수, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 및 6을 갖는 것으로 고려되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
용어 "포함하다", "포함하는", "포괄하다", "포괄하는", "갖는" 및 이들의 활용은 상호교환적이며 "포함하나 이에 한정되지 않는"을 의미한다. 양태가 언어 "포함하는"과 함께 본원에 기술되어있던 간에, 또한 "로 이루어진" 및/또는 "로 필수적으로 이루어진"의 측면에서 기술되는 어느 곳에서도, 다른 경우에 유사한 양태가 또한 제공됨이 이해된다.
용어 "로 이루어진"은 "포함하고 이에 한정되는"을 의미한다.
용어 "로 필수적으로 이루어진"은 조성물의 규정된 물질, 또는 방법의 규정된 단계, 및 물질 또는 방법의 기본 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가의 물질 또는 단계를 의미한다.
본원에 사용된 경우 용어 "및/또는"은 다른 것의 존재하에 또는 다른 것의 부재하에 2개의 규정된 특징 또는 성분 각각의 특정 개시내용으로서 고려되어야 한다. 따라서, 본원에서 어구, 예를 들면, "A 및/또는 B"에 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A 및 B," "A 또는 B," "A"(단독), 및 "B"(단독)을 포함하는 것으로 의도된다. 유사하게, 어구, 예를 들면, "A, B, 및/또는 C"에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 다음의 양태 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "배양물", "배양하기 위한", 및 "배양하는"은 세포 성장 또는 분열을 허용하는 시험관내(in vitro) 조건 하에서 세포를 항온처리하거나 세포를 살아있는 상태로 유지시킴을 의미한다. 용어 "배양물"은 또한 본원에서 시험관내 조건하에서 배양된 세포(예컨대, 액체 성장 배지에서 배양된 세포)를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로바이오틱"은 하나 이상의 살아있는 미생물(세균 및/또는 효모)를 지칭하며 적절한 양으로 투여되는 경우 동물 또는 대상체에서 유리한 건강, 소화, 및/또는 능력 이점을 부여할 수 있는 다른 성분을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "직접-공급 미생물 생성물(direct-fed microbial product)"은 하나 이상의 살아있는 미생물(세균 및/또는 효모)를 함유하고 사료 혼합물, 1회분 양(boluses), 및/또는 경구 페이스트로 동물 또는 대상체에게 투여될 수 있고, 적절한 양으로 투여된 경우 동물 또는 대상체에서 건강 이점을 부여할 수 있는 다른 성분을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "사료 첨가제"는 영양분(예컨대, 식품(예컨대, 동물 사료)의 품질을 증진시키기 위해, 동물의 능력 및 건강을 증진시키기 위해, 및/또는 식품 또는 식품내 물질의 소화능을 향상시키기 위해) 속에서 단독으로 또는 함께 사용된, 하나 이상의 성분, 생성물, 또는 물질(예컨대, 세포)를 지칭한다. 사료 첨가제는 예를 들면, 프로바이오틱이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "성장 배지" 및 "배양 배지"는 세포의 성장을 뒷받침하는 성분을 함유하는 고체(예컨대, 한천), 반-고체(예컨대, 한천), 또는 액체(예컨대, 브로쓰) 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "수거하다" 및 "수거하는"은 배양물로부터 세포를 수집함을, 예컨대, 배양물로부터의 성장 배지 속에서 세포를 수집하거나, 세포로부터 성장 배지의 양을 제거하거나(예컨대, 액체 배양물 속의 세포를 농축시키거나 성장 배지로부터 세포를 분리함으로써), 또는 세포의 배양을 중지시킴으로써 세포를 수집함을 지칭한다. 이러한 용어는 액체 배양물로부터의 세포를 포함하는 액체의 용적을 수집하거나 제거함을, 예를 들면, 세포가 농축된 용적을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단리된(isolated)"은 단리체가 정제된 정도를 필수적으로 반영하지는 않지만, 천연형 또는 천연 환경으로부터의 단리 또는 분리를 나타낸다. 단리체는 단리된 미생물, 단리된 생물량, 또는 단리된 배양물을 포함하나, 이에 한정되지 않을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유효량"은 목적한 결과를 달성하는 양을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, "치료학적 유효량" 또는 "임상 유효량"은 목적한 치료 결과를 달성하는 양, 예를 들면, 예컨대, 단독으로 또는 다른 성분과 함께 사용되는 양을 지칭한다. 치료학적 결과는 예컨대, 증상의 감소, 연장된 생존, 증진된 이동성 등일 수 있다. 치료학적 결과가 "치유"되는 것일 필요는 없다.
본원에 사용된 바와 같이, "부형제"는 본원에 개시된 바와 같이 사료 첨가제, 식품, 또는 조성물에 목적한 특성을 제공하는데 사용된, 성분, 또는 성분들의 혼합물을 지칭한다. 본 발명의 부형제는 약제학적 조성물에 첨가되는 경우 "약제학적으로 허용되는" 부형제로서 기술될 수 있으며, 부형제가 이상적인 이점/위험 비에 어울리는 목적한 접촉 기간에 걸쳐, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제가 되는 합병증없이 동물(즉, 사람 및 비-사람 동물)의 조직과 접촉하기에 적합한, 건전한 의학적 판단 영역내에 있는, 화합물, 물질, 조성물, 염, 및/또는 투여량 형을 의미한다.
용어 "치료하다", "치료하는", 및 "치료"는 치료학적 치료 및 예방적(prophylactic) 또는 예방 조처(preventative measures) 둘 다를 지칭하며, 여기서 대상은 바람직하지 않은 생리학적 상태, 질환, 또는 장애를 방지하거나 늦추(줄이)거나, 또는 목적한 생리학적 결과(예컨대, 임상적, 의학적, 및/또는 수의학적 결과)를 수득하기 위한 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 유리하거나 목적한 결과는 상태, 질환 또는 장애와 관련된 증상 또는 신호의 완화 또는 제거; 상태, 질환 또는 장애의 정도의 축소; 상태, 질환, 또는 장애의 안정화(즉, 여기서 상태, 질환 또는 장애는 악화되지 않는다); 상태, 질환 또는 장애의 발병 또는 진행의 지연; 상태, 질환, 또는 장애의 완화; 상태, 질환, 또는 장애의 차도(부분적이거나 전체적인지의 여부 및 검출가능하거나 검출불가능한지의 여부); 또는 상태, 질환, 또는 장애의 향상 또는 증진을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 치료는 과도한 부작용없이 생리학적으로 유의적인 반응을 유발시킴을 포함한다. 치료는 또한 치료를 제공받지 않는 경우 예측된 생존과 비교하여 생존을 연장시킴을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "예방하다" 및 "예방하는"은 감염, 질환, 장애, 및/또는 상태의 발병을 부분적으로 또는 완전하게 지연시키고/시키거나; 특수한 감염, 질환, 장애, 및/또는 상태의 하나 이상의 신호, 증상, 특징, 또는 만연(예컨대, 임상적 또는 생리학적 신호, 증상, 특징, 또는 만연)의 발병을 부분적으로 또는 완전하게 지연시키고/시키거나; 감염, 특수한 질환, 장애, 및/또는 상태로부터의 진행을 부분적으로 또는 완전히 지연시키고/시키거나; 감염, 질환, 장애, 및/또는 상태와 관련된 병리학의 발달 위험성을 감소시킴을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "수율"은 살아있거나, 생존가능한 세포의 양, 예를 들면, 특수한 용적(예컨대, 밀리리터당 콜로니 형성 단위("CFU/mL")) 또는 특수한 중량(예컨대, 그램당 CFU("CFU/g"))의 양을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "생존가능한"은 살아있는 유기체 또는 유기체들(예컨대, 살아있는 미생물 세포 또는 살아있는 미생물 세포들)을 지칭한다. "생존능"는 특히 특정 상태하에서 살아있는 능력을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, "정제하다", "정제된", 및 "정제"는 원치않는 성분, 오염 물질, 혼합물 또는 결함으로부터 실질적으로 순수하거나 깨끗하게 만드는 것을 의미한다.
용어 "발명" 및 "개시내용"은 예를 들면, 어구 "본 발명" 또는 "본 개시내용"을 기술하거나 이에 사용되는 경우 상호교환적으로 사용될 수 있다.
용어 "동물" 또는 "대상체"는 동물계(kingdom Animalia)에 속하는 임의의 유기체를 지칭하며 수생 동물 및 육상 동물, 예컨대, 어류; 상업용 어류; 관상용 어류; 어류 유충; 쌍각류; 연체동물; 갑각류(crustaceans); 패류(shellfish); 새우; 새우 유충; 브라인시림프(artemia); 담균층; 브라인 쉬림프(brine shrimp); 여과 섭식(filter feeder); 양서류; 파충류; 포유동물; 사람; 비-사람 동물; 가축 동물; 농장 동물; 동물원 동물; 운동경기 동물; 가축(breeding stock); 경주용 동물(racing animal); 쇼 동물(show animal); 천연 동물(heirloom animal); 희귀 또는 멸종위기 동물; 동반 동물; 애완 동물, 예를 들면, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 랫트, 마우스, 또는 말; 영장류, 예를 들면, 원숭이(예컨대, 세부스(cebus), 레서스(rhesus), 아프리칸 그린(African green), 파타스(patas), 시노몰구스(cynomolgus), 및 세르코피테쿠스(cercopithecus)), 유인원, 오랑우탄, 개코원숭이, 긴팔원숭이, 및 침팬지; 개과 동물, 예를 들면 개 및 늑대; 고양이과, 예를 들면, 고양이, 사자, 및 호랑이; 말류, 예를 들면, 말, 조랑말, 당나귀, 노새, 및 얼룩말; 식용 동물, 예를 들면, 소(cow), 버팔로, 소(cattle), 돼지류, 가금류, 및 양; 유제류, 예컨대, 사슴 및 기린; 조류(즉, 새); 가금류, 예를 들면, 닭, 거위, 오리, 메추라기, 칠면조, 비둘기, 에뮤(emu), 타조, 및 식용 또는 농장 동물로서 사용된 임의의 다른 새, 예를 들면, 구이용 영계, 육용 종계, 및 산란닭; 설치류, 예를 들면, 마우스, 랫트, 햄스터 및 기니 피그 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 동물 사료는 수생동물 사료, 가정동물 사료, 예를 들면, 애완동물 사료, 동물원 동물 사료, 일하는 동물 사료, 가축 사료, 및 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 식품은 동물 사료 및 사람 식품을 포함한다.
별도의 구현예의 맥락에서 기술된, 명확성을 위한, 본 발명의 특정의 특징은 또한 단일 구현예로서 함께 제공될 수 있음이 인식된다. 역으로, 단일 구현예의 맥락에서 기술된, 간결성을 위한, 본 발명의 다양한 특징은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 소조합으로 또는 본 발명의 임의의 다른 기술된 구현예에서 적합하게 제공될 수 있다. 다양한 구현예의 맥락에서 기술된 특정의 특징은 구현예가 이러한 요소없이 이용할 수 없는 한, 이러한 구현예의 필수적인 특징을 고려하지 않아야 한다.
본원에 기술된 것과 유사하거나 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다고 해도, 적합한 방법 및 물질이 하기 기술되어 있다. 물질, 방법 및 실시예는 단지 설명하기 위한 것이며 제한하려는 것이 아니다. 본 발명의 다른 특징 및 장점은 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
메가스파에라 엘스데니이
임의의 균주 또는 균주의 임의의 조합으로부터의 메가스파에라 엘스데니이 세포가 본원에 기술된 발명에 사용될 수 있다.
엠. 엘스데니이 균주 또는 균주들은 스톡 배양 수집기관(예컨대, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)("ATCC®"), 내셔날 컬렉션 오브 인더스트리얼, 푸드 앤드 마린 박테리아(National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria)("NCIMB"), 내셔날 컬렉션 오브 타입 컬쳐스(National Collection of Type Cultures)("NCTC"), 아메리칸 리서치 서비스(American Research Service)("ARC") 컬쳐 컬렉션(즉, "NRRL"), 내셔날 인스티튜트 오브 애니멀 헬쓰(National Institute of Animal Health: NIAH) 컬쳐 컬렉션(culture collection))으로부터 선택될 수 있거나, 천연원으로부터(예컨대, 반추동물의 위장으로부터) 단리한 균주일 수 있다.
배양 수집기관으로부터 선택될 수 있는 엠. 엘스데니이 균주의 예는 표 1에 기탁 번호로 나열된 균주를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 기탁 번호의 대안적인 지정번호가 또한 나타나 있다.
일부 구현예에서, 엠. 엘스데니이 세포는 표 1에서의 임의의 대안적인 지정번호를 포함하는, ATCC® 25940, ATCC® 17752, ATCC® 17753, NCIMB 702261, NCIMB 702262, NCIMB 702264, NCIMB 702331, NCIMB 702409, NCIMB 702410, NCIMB 41125, NCIMB 41787, NCIMB 41788, NRRL 18624, NIAH 1102, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 기탁 번호를 갖는 균주로부터 유래한다.
일부 구현예에서, 엠. 엘스데니이 세포는 반추동물(예컨대, 소)로부터 단리된 균주로부터 유래된다. 참고: 예컨대, 미국 특허 제7,550,139호.
일부 구현예에서, 엠. 엘스데니이 세포는 비-반추동물(예컨대, 사람)으로부터 단리된 균주로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 엠. 엘스데니이 세포는 락테이트 활용(예컨대, 당의 존재하에서 락테이트를 활용하는 균주), 이온투과담체 항생제에 대한 내성, 각각의 높은 성장률, 영구적으로 아세테이트를 생산하는 능력, 5.0 미만 및 4.5 정도로 낮은 pH 값에서의 증식 능력, 휘발성 지방산(VFAs)의 생산, 피타아제 활성, 및 이의 조합에 대해 선택된 균주로부터 유래된다. 참고: 예컨대, 미국 특허 제7,550,139호.
일부 구현예에서, 락테이트 활용을 위해 선택된 균주는 가용성 탄수화물(예컨대, 글루코즈 및/또는 말토즈)의 존재하에서 바람직한 탄소원으로서 락테이트를 활용한다. 락테이트 활용은 예를 들면, 가용성 탄수화물로 보충된 동일한 배지와 비교하여 락테이트를 함유하고 가용성 탄수화물을 결여하는 배지 속에서의 성장을 기반으로 하여, 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 엠. 엘스데니이 세포는 다른 균주와 비교하여 고 성장률을 지닌 균주로부터 유래된다. 상이한 균주의 성장률은 예를 들면, 세포를 액체 배지 속에서 배양하고 시간에 따른 광학 밀도에 있어서의 증가를 모니터링함으로써 측정할 수 있다.
일부 구현예에서, 엠. 엘스데니이 세포는 VFA를 생산할 수 있는 균주로부터 유래되며, 이는 예를 들면, 가스 크로마토그래피로 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, VFA는 살모넬라 및/또는 캄필로박터의 성장을 억제할 수 있는 6-탄소 지방산이다. 일부 구현예에서, VFA는 카프로산이다. 일부 구현예에서, 살모넬라는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 및/또는 살모넬라 본고리(Salmonella bongori)이다. 일부 구현예에서, 살모넬라 혈청형은 살모넬라 티피무리움(Salmonella Typhimurium) 및/또는 엔티리티디스(Entiritidis)이다. 일부 구현예에서, 캄필로박터(Campylobacter)는 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 또는 캄필로박터 콜리(Campylobacter coli)이다.
일부 구현예에서, 엠. 엘스데니이 세포는 피타아제 활성을 지닌 균주로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 엠. 엘스데니이 세포는 메가스파에라 엘스데니이 균주 NCIMB 41125로부터 유래된다. 이러한 메가스파에라 엘스데니이의 균주는 고 특이 성장률(specific growth rate)(0.94 세대/시간)을 가지고, 4.5 내지 6.5 이상의 pH 범위에서 성장할 수 있으며, 이의 바람직한 기질로서 D- 및 L-락테이트를 사용하지만, 또한 글루코즈 및 다른 탄수화물을 활용하는 능력을 가지며, 이오노포어(ionophore)를 견딘다.
일부 구현예에서, 엠. 엘스데니이 세포는 메가스파에라 엘스데니이 균주 NCIMB 41787로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 엠. 엘스데니이 세포는 메가스파에라 엘스데니이 균주 NCIMB 41788로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 엠. 엘스데니이 세포는 메가스파에라 엘스데니이 균주 ATCC® 25940으로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 엠. 엘스데니이 세포는 스톡 컬쳐 컬렉션으로부터 선택된 균주로부터 유래되거나 천연원으로부터 단리된다. 균주로부터 "유래된" 세포는 예를 들면, 서브 단리체(sub isolate), 돌연변이체, 변이체, 또는 재조합 균주와 같은 천연 또는 인공 유도체일 수 있다.
혐기성, 호기성, 및/또는 효모 세포를 포함하는 배양물의 제조
엠. 엘스데니이는 최대 수율 또는 생존능을 수득하기 위해 엄격한 혐기성 조건 하에서 배양되어야만 하는 혐기성 세균이다.
일부 구현예에서, 배양물은 엠. 엘스데니이 세포 및 성장 배지를 포함한다.
일부 구현예에서, 배양물은 엠. 엘스데니이 세포의 하나 이상의 균주를 포함한다. 일부 구현예에서, 배양물은 엠. 엘스데니이 세포의 단일 균주를 포함한다. 일부 구현예에서, 배양물은 엠. 엘스데니이 세포(즉, 엠. 엘스데니이 세포로 이루어진 배양물 속의 세포, 예컨대, 엠. 엘스데니이 세포의 하나 이상의 균주)의 하나 이상의 균주로 이루어진다. 일부 구현예에서, 배양물은 엠. 엘스데니이 세포의 단일 균주로 이루어진다.
일부 구현예에서, 배양물은 메가스파에라 세포 및 성장 배지를 포함한다.
일부 구현예에서, 배양물은 혐기성 세균 세포 및 성장 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 배양물은 비피도박테리움 세포, 예를 들면, 비. 브레베(B. breve), 락토바실러스(Lactobacillus) 세포, 예를 들면, 엘. 플란타룸(L. plantarum), 비피도박테리움 세포, 예를 들면, 비. 아니말리스 아종 락티스(B. animalis subsp. lactis), 페디오코쿠스(Pediococcus) 세포, 예를 들면, 피. 악시딜락티시(P. acidilactici), 락토바실러스(Lactobacillus) 세포, 예를 들면, 엘. 카세이(L. casei) 및 성장 배지를 포함한다.
일부 구현예에서, 배양물은 호기성 세균 세포 및 성장 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 배양물은 바실러스 세포, 예를 들면, 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 성장 배지를 포함한다.
일부 구현예에서, 배양물은 효모 세포 및 성장 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 배양물은 사카로마이세스(Saccharomyces) 세포, 예를 들면, 에스. 보울라르디이(S. boulardii) 및 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae)를 포함한다.
연속 발효(즉, 연속 배양) 또는 배치(batch) 발효(즉, 배치 배양)을 포함하는, 미생물 세포를 접종하고, 성장시키며, 수거하기 위한 다양한 발효 매개변수를 사용할 수 있다. 참고: 예를 들면, 미국 특허 제7,550,139호.
미생물 세포를 위한 성장 배지는 고체, 반-고체 또는 액체일 수 있다. 배지는 성장을 가능하도록 하는 필수 요소 및 구체적인 인자를 제공하는 영양소를 함유할 수 있다. 다양한 미생물 배지 및 변화는 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 배지는 배양 시작, 배양 동안, 또는 간헐적으로/연속적으로, 임의의 시간에 배양물에 가할 수 있다.
성장 배지의 예는 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: (1) 반-정의된 배지, 이는 펩톤, 3 g/L; 효모, 3 g/L; 비타민 용액, 2 mL/L; 무기질 용액, 25 mL/L; 인디고 카르민(indigo carmine)(0.5%), 1 g/L; 12.5% L-시스테인, 2 g/L; 12.5% 황화나트륨, 2 g/L을 함유하고; Na-락테이트(반-정의된 락테이트, SDL), 글루코즈(반-정의된 글루코즈, SDG), 또는 말토즈(반-정의된 말토즈, SDM)가 보충되어 있다; (2) 변형된 보강 클로스트리디움 한천/브로쓰 배지(예비-환원됨), 이는 펩톤, 10 g/L; 소고기 추출물, 10 g/L; 효모 추출물, 3 g/L; 덱스트로즈 5 g/L; NaCl, 5 g/L; 가용성 전분, 1 g/L; L-시스테인 HCl, 0.5 g/L; 아세트산나트륨, 3 g/L; 및 레사주린(0.025%), 4 mL/L을 함유한다; (3) 섬유소제거된 양 혈액이 보충된 트립티카제 대두 한천/브로쓰; (4) 반-정의된 반추 유액이 없는 배지, 이는 Na-락테이트(70%), 10 g/l; 펩톤, 2 g/l; KH2PO4 1 g/l; (NH4)2SO4 3 g/l; MgSO4 7H2O 0.2 g/l; CaCl2.2H2O 0.06 g/l; 비타민(피리독솔하이드로클로라이드, 4 mg/l; 피리독사민, 4 mg/l; 리보플라빈, 4 mg/l; 티아미늄클로라이드, 4 mg/l; 니코틴아미드, 4 mg/l; Ca-D-판토테네이트, 4 mg/l; 4-아미노벤조산, 0.2 mg/l, 바이오틴, 0.2 mg/l, 엽산, 0.1 mg/l 및 시아노코발라민, 0.02 mg/1); Na2S.9H2O, 0.25 g/l; 시스테인, 0.25 g/l; 기포제거제, 0.07 ml/l 및 모넨신, 10 mg/l를 함유하며; 이는 Na-락테이트 및 무기질 용액을 저장기 병에 가하고 60분 동안 오토클레이빙하고, 펩톤을 300 ml의 증류된 H2O 속에 용해하고 별도로 오토클레이빙하며; 비타민 용액 및 2개의 환원제를 미리 여과기 멸균시키며; 이후 오토클레이빙(autoclaving)하고; 저장기 병을 혐기성 가스로 밤새 가스발생시키고; 냉각 후 다른 구성성분을 별도로 가하며; pH를 5N HCl을 사용하여 목적한 값으로 조절함으로써 제조된다; 및 (5) 항온처리된 반추 유액 락테이트("IRFL") 배지, 이는 루세른(lucerne)-을 먹인 양으로부터의 400 ml의 항온처리된 정화된 반추 유액, 371 ml의 증류수, 2 g의 펩톤, 15 g의 한천, 100 ml의 10%(w/v) 나트륨-D, L-락테이트 용액, 100 ml의 0.04% (w/v) 브로모크레졸 퍼플 용액, 및 40 g/l KH2PO4; 120 g/l (NH4)2SO4; 8 g/l MgSO4.7H2O 및 2.4 g/l CaCl2.2H2O를 함유하는 25 ml의 무기질 용액을 함유하며, (여기서 젖산(90% w/v)은 121℃에서 25분 동안 오토클레이빙한 후, 혐기성 가스 혼합물로 가스를 채우면서 50℃ 수욕 속에서 냉각시킨 후, 2 밀리리터의 각각의 Na2S.9H2O(12.5% w/v) 및 시스테인.HCl.H2O(12.5% w/v)를 가함으로써, pH를 5.5로 조절하는데 사용된다.
일부 구현예에서, 배양물은 적어도 하나의 탄소원을 포함하는 성장 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 탄소원은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 카제인, 전분(예컨대, 젤라틴화된 전분 및/또는 가용성 전분), 락테이트(즉, 젖산), 덱스트로즈, 프럭토즈, 프럭탄, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈, 아세테이트, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 사카로즈, 크실로즈, 몰라세스, 푸코즈, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 아세트산나트륨, 아라비노즈, 대두 단백질, 가용성 단백질, 라피노즈, 아밀로즈, 전분, 트립톤, 효모 추출물 및 이의 조합물.
일부 구현예에서, 배양물은 적어도 2개의 탄소원을 포함하는 성장 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 탄소원은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 카제인, 전분 (예컨대, 젤라틴화된 전분 및/또는 가용성 전분), 락테이트(즉, 젖산), 덱스트로즈, 프럭토즈, 프럭탄, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈, 아세테이트, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 사카로즈, 크실로즈, 몰라세스, 푸코즈, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 아세트산나트륨, 아라비노즈, 대두 단백질, 가용성 단백질, 라피노즈, 아밀로즈, 전분, 트립톤, 효모 추출물 및 이의 조합물.
일부 구현예에서, 적어도 2개의 탄소원은 약 1 내지 99%의 제1의 탄소원(예컨대, 본원에 기술된 임의의 탄소원) 및 약 1 내지 99%의 제2의 탄소원(예컨대, 제1의 탄소원과 상이한 본원에 기술된 임의의 탄소원)으로 이루어지며, 여기서 적어도 2개의 탄소원의 100%는 제1의 탄소원 및 제2의 탄소원으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 탄소원은 약 50 내지 60%의 제1의 탄소원 및 약 40 내지 50%의 제2의 탄소원, 약 50 내지 70%의 제1의 탄소원 및 약 30 내지 50%의 제2의 탄소원, 약 50 내지 80%의 제1의 탄소원 및 약 20 내지 50%의 제2의 탄소원, 또는 약 50 내지 90%의 제1의 탄소원 및 약 10 내지 50%의 제2의 탄소원으로 이루어진다. 다른 구현예에서, 적어도 2개의 탄소원은 약 65 내지 75%의 제1의 탄소원 및 약 25 내지 35%의 제2의 탄소원으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1의 탄소원은 락테이트이다.
일부 구현예에서, 엠. 엘스데니이 세포는 약 39 ℃ 내지 약 40℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 또는 약 40℃에서 성장된다.
일부 구현예에서, 미생물 세포는 약 15℃ 내지 약 45℃, 약 20℃ 내지 40℃, 25℃ 내지 35℃, 30℃ 내지 39℃에서 성장된다. 일부 구현예에서, 미생물 세포는 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 또는 약 40℃에서 성장된다.
일부 구현예에서, 미생물 세포는 저장을 위해 약 18℃ 내지 약 25℃로 냉각된다.
일부 구현예에서, 엠. 엘스데니이 세포를 포함하는 배양물의 pH(예컨대, 배양 동안 및/또는 수거 시간에)는 약 4.5 내지 약 7.0, 약 4.5 내지 약 6.5, 약 4.5 내지 약 6.0, 약 4.5 내지 약 5.5, 약 4.5 내지 약 5.0, 약 4.6 내지 약 6.9, 약 4.7 내지 약 6.8, 약 4.8 내지 약 6.7, 약 4.9 내지 약 6.6, 약 5.0 내지 약 7.0, 약 5.0 내지 약 6.5, 약 5.0 내지 약 6.0, 약 5.0 내지 약 5.5, 약 5.1 내지 약 6.9, 약 5.2 내지 약 6.8, 약 5.3 내지 약 6.7, 약 5.4 내지 약 6.6, 약 5.5 내지 약 7.0, 약 5.5 내지 약 6.5, 약 5.1 내지 약 6.4, 약 5.2 내지 약 6.3, 약 5.3 내지 약 6.2, 약 5.4 내지 약 6.1, 약 5.5 내지 약 6.0, 약 5.0 내지 약 6.1, 약 5.0 내지 약 6.2, 약 5.0 내지 약 6.3, 약 5.0 내지 약 6.4, 약 5.1 내지 약 6.5, 약 5.2 내지 약 6.5, 약 5.3 내지 약 6.5, 또는 약 5.4 내지 약 6.5이다.
일부 구현예에서, 미생물 세포를 포함하는 배양물의 pH(예컨대, 배양 동안 및/또는 수거 시간에)는 약 4.0 내지 약 9.0, 약 4.5 내지 약 8.5, 약 5.0 내지 약 8.0, 약 5.5 내지 약 7.5, 약 6.0 내지 약 7.0이다.
미생물 세포를 배양하기 위해, 혐기성 조건을 유지하는 상이한 크기 및 설계의 발효기를 사용할 수 있다. 발효기는 예를 들면, 엠. 엘스데니이 세포의 상업적 생산에 충분한 배양 용적을 발효할 수 있다. 일부 구현예에서, 배양물 용적은 약 2리터, 약 10리터, 약 50리터, 약 100리터, 약 150리터, 약 200리터, 약 250리터, 약 300리터, 약 350리터, 약 400리터, 약 450리터, 약 500리터, 약 600리터, 약 800리터, 약 1,000리터, 약 1,200리터, 약 1,500리터, 약 1,800리터, 약 2,000리터, 약 2,200리터, 약 2,500리터, 약 2,750리터, 약 3,000리터, 약 4,000리터, 약 5,000리터, 약 6,000리터, 약 7,000리터, 약 8,000리터, 약 9,000리터, 약 10,000리터, 적어도 약 20,000리터, 적어도 약 50,000리터, 또는 적어도 약 75,000리터이다. 일부 구현예에서, 발효 용적은 약 2리터 내지 약 75,000리터, 약 250리터 내지 약 750리터, 약 300리터 내지 약 800리터, 약 350리터 내지 약 850리터, 약 400리터 내지 약 900리터, 약 450리터 내지 약 950리터, 약 500리터 내지 약 1,000리터, 약 750리터 내지 약 1,250리터, 약 1,000리터 내지 약 2,000리터, 약 2,000리터 내지 약 4,000리터, 약 4,000리터 내지 약 8,000리터, 약 5,000리터 내지 약 10,000리터, 약 50리터 내지 약 75,000리터, 약 50리터 내지 약 50,000리터, 약 50리터 내지 약 25,000리터, 약 50리터 내지 약 20,000리터, 약 50리터 내지 약 15,000리터, 약 50리터 내지 약 10,000리터, 약 100리터 내지 약 10,000리터, 약 100리터 내지 약 5,000리터, 약 100리터 내지 약 4,000리터, 약 100리터 내지 약 3,000리터, 약 100리터 내지 약 2,900리터, 약 100리터 내지 약 2,850리터, 약 100리터 내지 약 2,800리터, 약 100리터 내지 약 2,750리터, 약 2리터, 약 10리터, 약 50리터, 약 100리터, 약 200리터, 약 500리터, 약 1,000리터, 약 1,500리터, 약 10,000리터, 약 20,000리터, 약 50,000리터, 또는 약 75,000리터이다.
일부 구현예에서, 엠. 엘스데니이 세포를 함유하는 배양물은 또한 다른 미생물(즉, 엠. 엘스데니이 세포가 아닌 미생물 세포)을 포함한다. 일부 구현예에서, 배양물은 엠. 엘스데니이 세포 및 완전 혐기성인 다른 미생물을 포함한다. 일부 구현예에서, 배양물은 엠. 엘스데니이 세포 및 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다른 미생물을 포함한다: 락토바실러스, 메가스파에라, 비피도박테리움, 에스케리키아(Escherichia), 엔테로코쿠스, 바실러스, 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 칸디다(Candida), 클로스트리디움(Clostridium), 페디오코쿠스(Pediococcus), 아스퍼길러스(Aspergillus) 및 사카로마이세스(Saccharomyces).
동결-건조된 호기성, 혐기성, 및 효모 세포
한 가지 양태에서, 본 발명은 동결-건조된 메가스파에라 엘스데니이 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 동결-건조된 메가스파에라 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 동결-건조된 메가스파에라 세포에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 동결-건조된 메가스파에라 세포에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 동결-건조된 혐기성 세균 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 동결-건조된 비피도박테리움 세포, 예를 들면, 비. 브레베, 락토바실러스 세포, 예를 들면, 엘. 플란타리움, 비피도박테리움 세포, 예를 들면, 비. 아니말리스 아종, 락티스, 페디오코쿠스 세포, 예를 들면, 피. 악시딜락티시, 락토바실러스 세포, 예를 들면, 엘. 카세이에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 동결-건조된 혐기성 세균 세포에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 동결-건조된 비피도박테리움 세포, 예를 들면, 비. 브레베, 락토바실러스 세포, 예를 들면, 엘. 플란타룸, 비피도박테리움 세포, 예를 들면, 비. 아니말리스 아종, 락티스, 페디오코쿠스 세포, 예를 들면, 피. 악시딜라티시, 락토바실러스 세포, 예를 들면, 엘. 카세이에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 동결-건조된 혐기성 세균에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 동결-건조된 비피도박테리움 세포, 예를 들면, 비. 브레베, 락토바실러스 세포, 예를 들면, 엘. 플란타룸, 비피도박테리움 세포, 예를 들면, 비. 아니말리스 아종, 락티스, 페디오코쿠스 세포, 예를 들면, 피. 악시딜락티시, 락토바실러스 세포, 예를 들면, 엘. 카세이에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 동결-건조된 호기성 세균 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 동결-건조된 바실러스 세포, 예를 들면, 비. 서브틸리스 세포에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 동결-건조된 호기성 세균 세포에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 동결-건조된 바실러스 세포, 예를 들면, 비. 서브틸리스에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 동결-건조된 호기성 세균 세포에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 동결-건조된 바실러스 세포, 예를 들면, 비. 서브틸리스에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 동결-건조된 효모 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 동결-건조된 사카로마이세스 세포, 예를 들면, 에스. 보울라르디이 및 에스 세레비지아에에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 동결-건조된 효모 세포에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 동결-건조된 사카로마이세스, 예를 들면, 에스. 보울라르디이 및 에스. 세레비지아에에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 동결-건조된 효모 세포에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 동결-건조된 사카로마이세스 세포, 예를 들면, 에스. 보울라리디이 및 에스. 세레비지아에에 관한 것이다.
다른 양태에서, 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포를 생산하는 방법은 엠. 엘스데니이 세포 및 성장 배지를 포함하는 배양물을 제조하는 단계; 세포를 수거하는 단계; 세포를 동결시키는 단계; 및 세포를 동결-건조시키는 단계로서, 여기서 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포가 생산되는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 배양물을 제조하는 단계에 이어, 세포를 수거하는 단계(즉, 배양된 세포를 수거)에 이어서, 세포를 동결시키는 단계(즉, 수거된 세포를 동결)에 이어서, 세포를 동결-건조시키는 단계(즉, 동결된 세포를 동결-건조)의 순서로 수행된다.
일부 구현예에서, 방법은 혐기성 조건 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 방법은 혐기성 조건 하에서 배양물을 제조하는 단계, 세포를 수거하는 단계, 세포를 동결시키는 단계, 세포를 동결-건조시키는 단계, 또는 이의 조합을 포함한다.
방법은 본원에 기술된 바와 같은 배양물을 제조하는 임의의 방법을 포함할 수 있다. 방법의 배양은 또한 본원에 기술된 배양물의 임의의 특성을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 배양물 속의 세포는 엠. 엘스데니이 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 배양물 속의 세포는 엠. 엘스데니이 세포로 이루어진다.
일부 구현예에서, 성장 배지는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적더도 2개의 탄소원을 포함한다: 카제인, 락테이트 (즉, 젖산), 덱스트로즈, 프럭토즈, 프럭탄, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈, 아세테이트, 글리세롤, 만니톨, 사카로즈, 크실로즈, 몰라세스, 푸코즈, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 아세트산나트륨, 아라비노즈, 대두 단백질, 가용성 단백질, 라피노즈, 아밀로즈, 전분, 및 이의 조합.
일부 구현예에서, 방법은 세포를 배양물이 이의 대수 성장기를 종결한 후 및 배양물이 이의 정체 성장기를 시작하기 전 12시간 내에 수거하는 단계를 포함한다. 배양물은 실온으로 냉각시켜 수거 시간에 성장을 정지시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 배양물은 액체를 포함하며, 방법은 엠. 엘스데니이 세포(예컨대, 농축된 엠. 엘스데니이 세포)를 액체의 퍼센트로 수거하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 세포를 약 1% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 35%, 약 1% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 25%, 약 1% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 15%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 5%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1%의 액체로 수거하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 세포를 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 액체를 수거하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 배양물은 액체를 포함하며, 이러한 방법은 액체의 퍼센트를 제거함으로써 엠. 엘스데니이 세포(예컨대, 농축된 엠. 엘스데니이 세포)를 수거하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포를 수거하는 단계는 약 50% 내지 약 100%의 액체, 약 55% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 65% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 75% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 85% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 또는 약 95% 내지 약 100%의 액체를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포를 수거하는 단계는 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%의 액체를 제거하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 세포를 농축시킴으로써 엠. 엘스데니이 세포를 수거하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포를 수거하는 단계는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 기술에 의해 세포를 농축시키는 단계를 포함한다: 원심분리, 여과, 투석, 역 삼투압, 및 이의 조합. 일부 구현예에서, 여과는 점토 여과를 포함한다. 일부 구현예에서, 여과는 또한 교차-유동 여과(cross-flow filtration)로서 공지된 접선유동여과를 포함한다.
일부 구현예에서, 수거 시간에 엠. 엘스데니이 세포를 포함하는 배양물의 pH는 약 4.5 내지 약 7.0, 약 4.5 내지 약 6.5, 약 4.5 내지 약 6.0, 약 4.5 내지 약 5.5, 약 4.5 내지 약 5.0, 약 4.6 내지 약 6.9, 약 4.7 내지 약 6.8, 약 4.8 내지 약 6.7, 약 4.9 내지 약 6.6, 약 5.0 내지 약 7.0, 약 5.0 내지 약 6.5, 약 5.0 내지 약 6.0, 약 5.0 내지 약 5.5, 약 5.1 내지 약 6.9, 약 5.2 내지 약 6.8, 약 5.3 내지 약 6.7, 약 5.4 내지 약 6.6, 약 5.5 내지 약 7.0, 약 5.5 내지 약 6.5, 약 5.1 내지 약 6.4, 약 5.2 내지 약 6.3, 약 5.3 내지 약 6.2, 약 5.4 내지 약 6.1, 약 5.5 내지 약 6.0, 약 5.0 내지 약 6.1, 약 5.0 내지 약 6.2, 약 5.0 내지 약 6.3, 약 5.0 내지 약 6.4, 약 5.1 내지 약 6.5, 약 5.2 내지 약 6.5, 약 5.3 내지 약 6.5, 또는 약 5.4 내지 약 6.5이다.
일부 구현예에서, 방법은 엠. 엘스데니이 세포를 포함하는 접종물을 사용하여 발효기내 성장 배지에 접종하여 배양물을 제조하는 단계, 및 배양물을 약 39℃의 온도에서 배양물의 pH가 약 6.0이 될 때까지 항온처리하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 엠. 엘스데니이 세포를 포함하는 접종물은 엠. 엘스데니이 세포 또는 이의 일부의 플라스크 배양물이다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 발효기 속의 성장 배지를 1/50 내지 1/4,000의 접종물 대 배지 비로 접종하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 접종물 대 배지 비는 1/100이다.
일부 구현예에서, 배양물은 적어도 하나의 동결보호제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 동결보호제는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 프럭토즈, 글루코즈, 슈크로즈, 분유, 영아용 조제분유, 스킴 밀크, 트레할로즈, 말토덱스트린, 베타인, 및 이의 조합. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 동결보호제는 배양물의 약 1% 내지 약 50% (w/v), 약 1% 내지 약 40% (w/v), 배양물의 약 1% 내지 약 30% (w/v), 배양물의 약 1% 내지 약 20% (w/v), 배양물의 약 1% 내지 약 10% (w/v), 배양물의 약 1% 내지 약 5% (w/v), 배양물의 약 10% 내지 약 20% (w/v), 배양물의 약 15% 내지 약 25% (w/v), 배양물의 약 20% 내지 약 30% (w/v), 배양물의 약 30% 내지 약 40% (w/v), 배양물의 약 40% 내지 약 50% (w/v), 배양물의 약 60% 내지 약 70% (w/v), 배양물의 약 70% 내지 약 80% (w/v)의 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 동결보호제는 분말화된 동결보호제를 농축된 엠. 엘스데니이 세포에 직접 가함으로써 가해진다. 일부 구현예에서, 동결보호제는 동결보호제의 용액을 농축된 엠. 엘스데니이 세포에 1/1의 비, 1/5의 비, 또는 1/10의 비로 직접 가함으로써 가해진다.
일부 구현예에서, 세포를 동결시키는 단계는 세포를 동결기 속에 두거나 세포를 드라이 아이스, 액체 질소, 또는 이의 조합물과 접촉시킴을 포함한다. 세포를 동결시키는 단계는 세포가 용기내에 있는 동안 세포를 동결시키는 단계를 포함한다. 세포를 접촉시키는 것은 세포를 포함하는 용기를 세포를 동결시키는 단계를 위한 배지와 접촉시킴을 포함한다. 세포를 동결시키는 단계를 위한 배지는 동결기, 아세톤-드라이아이스 욕, 액체 질소, 또는 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 방법은 세포를 약 -20 ℃ 내지 약 -210℃의 온도에서 동결시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 세포를 약 -20 ℃ 내지 약 -80℃의 온도에서 동결시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 세포를 약 -80 ℃ 내지 약 -210℃의 온도에서 동결시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 세포를 약 -20℃ 내지 약 -196℃의 온도에서 동결시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 세포를 약 -80℃ 내지 약 -196℃의 온도에서 동결시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 세포를 약 -20℃의 온도에서 동결시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 세포를 약 -80℃의 온도에서 동결시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 세포를 -196℃의 온도에서 동결시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 세포를 액체 질소와 접촉시킴으로써 세포를 동결시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 세포를 혐기성 조건 하에서 동결시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 동결은 세포를 포함하는 동결된 펠렛을 생산한다. 예를 들면, 동결은 순간 동결기(flash freezer)(예컨대, Model 250-S01 Crygran, IFQ Inc.)를 사용하여 달성할 수 있다.
일부 구현예에서, 동결된 펠렛의 직경은 약 0.001 내지 약 1.0인치, 약 0.01 내지 약 1.0인치, 약 0.1 내지 약 1.0인치, 약 0.2 내지 약 1.0인치, 약 0.3 내지 약 1.0인치, 약 0.4 내지 약 1.0인치, 약 0.5 내지 약 1.0인치, 약 0.6 내지 약 1.0인치, 약 0.7 내지 약 1.0인치, 약 0.8 내지 약 1.0인치, 약 0.9 내지 약 1.0인치, 약 0.001 내지 약 0.9인치, 약 0.01 내지 약 0.9인치, 약 0.1 내지 약 0.9인치, 약 0.2 내지 약 0.9인치, 약 0.3 내지 약 0.9인치, 약 0.4 내지 약 0.9인치, 약 0.5 내지 약 0.9인치, 약 0.6 내지 약 0.9인치, 약 0.7 내지 약 0.9인치, 약 0.8 내지 약 0.9인치, 약 0.001 내지 약 0.8인치, 약 0.01 내지 약 0.8인치, 약 0.1 내지 약 0.8인치, 약 0.2 내지 약 0.8인치, 약 0.3 내지 약 0.8인치, 약 0.4 내지 약 0.8인치, 약 0.5 내지 약 0.8인치, 약 0.6 내지 약 0.8인치, 약 0.7 내지 약 0.8인치, 약 0.001 내지 약 0.7인치, 약 0.01 내지 약 0.7인치, 약 0.1 내지 약 0.7인치, 약 0.2 내지 약 0.7인치, 약 0.3 내지 약 0.7인치, 약 0.4 내지 약 0.7인치, 약 0.5 내지 약 0.7인치, 약 0.6 내지 약 0.7인치, 약 0.001 내지 약 0.6인치, 약 0.01 내지 약 0.6인치, 약 0.1 내지 약 0.6인치, 약 0.2 내지 약 0.6인치, 약 0.3 내지 약 0.6인치, 약 0.4 내지 약 0.6인치, 약 0.5 내지 약 0.6인치, 약 0.001 내지 약 0.5인치, 약 0.01 내지 약 0.5인치, 약 0.05 내지 약 0.5인치, 약 0.1 내지 약 0.5인치, 약 0.15 내지 약 0.5인치, 약 0.2 내지 약 0.5인치, 약 0.3 내지 약 0.5인치, 또는 약 0.4 내지 약 0.5인치이다.
동결된 엠. 엘스데니이 세포는 동결-건조 전에 동결되어(예컨대, 0℃ 미만) 저장되거나 즉시 동결-건조될 수 있다. 일부 구현예에서, 동결된 엠. 엘스데니이 세포는 약 0℃ 이하, 약 -10℃ 이하, 약 -20℃ 이하, 약 -50℃ 이하, 약 -80℃, 또는 약 -196℃ 이하의 온도에서 저장된다. 일부 구현예에서, 동결된 엠. 엘스데니이 세포는 약 -20℃, 약 -30℃, 약 -40℃, 약 -50℃, 약 -60℃, 약 -70℃, 약 -80℃, 약 -90℃, 약 -100℃, 약 150℃, 약 -196℃, 또는 약 -210℃의 온도에서 저장된다.
일부 구현예에서, 동결된 엠. 엘스데니이 세포는 동결건조된다. 일부 구현예에서, 동결된 엠. 엘스데니이 세포는 동결-건조된다. 동결-건조는 예를 들면, 동결된 세포로부터 액체의 제거를 포함한다.
일부 구현예에서, 엠. 엘스데니이 세포의 동결-건조는 동결된 세포를 동결-건조기내에 두는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결-건조는 동결된 세포를 감압에 적용시키고, 세포를 서서히 실온으로 가온시킴을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 세포를 혐기성 조건 하에서 동결-건조시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 동결-건조된 엠. 엘스데니이는 상업적 규모로 생산된다.
일부 구현예에서, 약 1 x 103 내지 1 x 1012 CFU/g의 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포가 본원에 개시된 방법으로 생산된다. 일부 구현예에서, 약 1 x 103 내지 1 x 1012 CFU/g의 엠. 엘스데니이 세포는 동결-건조 후 생존가능하다.
한 가지 양태에서, 본 개시내용에 따른 동결-건조된 메가스파에라 엘스데니이 세포를 생산하는 방법은: (a) 혐기성 조건 하에서 엠. 엘스데니이 세포 및, 카제인, 락테이트 (즉, 젖산), 덱스트로즈, 프럭토즈, 프럭탄, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈, 아세테이트, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 사카로즈, 크실로즈, 몰라세스, 푸코즈, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 아세트산나트륨, 아라비노즈, 대두 단백질, 가용성 단백질, 라피노즈, 아밀로즈, 전분, 트립톤, 효모 추출물 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 탄소원을 포함하는 성장 배지를 포함하는 배양물을 제조하는 단계, (b) 세포를 혐기성 조건 하에서 수거하는 단계, (c) 세포를 동결시키는 단계, 및 (d) 세포를 동결-건조시키는 단계로서, 여기서 약 1 x 103 내지 약 1 x 1012 CFU/g의 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포가 생산되는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용에 따른 동결-건조된 메가스파에라 엘스데니이 세포를 생산하는 방법은: (a) 엠. 엘스데니이 세포 및 성장 배지를 포함하는 배양물을 제조하는 단계, (b) 세포를 혐기성 조건 하에서 배양물이 이의 대수 성장기를 종결한 후 및 배양물이 이의 정체 성장기를 개시하기 전 12 시간 내에 수거하는 단계, (c) 세포를 동결시키는 단계, 및 (d) 세포를 동결-건조시키는 단계로서, 여기서 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포가 생산되는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용에 따른 동결-건조된 메가스파에라 엘스데니이 세포를 생산하는 방법은: (a) 엠. 엘스데니이 세포 및 성장 배지를 포함하는 배양물을 제조하는 단계, (b) 세포를 수거하는 단계, (c) 세포를 약 -80 ℃ 내지 약 -210℃의 온도에서 5시간내의 수거 동안 동결시키는 단계, 및 (d) 세포를 동결-건조시키는 단계로서, 여기서 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포가 생산되는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포의 양 및/또는 동결-건조 후 생존가능한 엠. 엘스데니이 세포의 양은 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 1011 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 1010 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 109 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 108 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 107 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 106 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 105 CFU/g, 약 1 x 104 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 105 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 106 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 107 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 108 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 109 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 1010 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 105 CFU/g, 약 1 x 104 CFU/g 내지 약 1 x 106 CFU/g, 약 1 x 105 CFU/g 내지 약 1 x 107 CFU/g, 약 1 x 106 CFU/g 내지 약 1 x 108 CFU/g, 약 1 x 107 CFU/g 내지 약 1 x 109 CFU/g, 약 1 x 108 CFU/g 내지 약 1 x 1010 CFU/g, 약 1 x 109 CFU/g 내지 약 1 x 1011 CFU/g, 또는 약 1 x 1010 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g이다.
일부 구현예에서, 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포는 약 14일 내지 약 24개월 동안 약 -80℃, 약 -20℃, 약 4℃, 약 25℃, 또는 이의 조합에서 생존가능하다. 일부 구현예에서, 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포는 적어도 약 14일, 적어도 약 1개월, 적어도 약 6개월, 적어도 약 8개월, 적어도 약 10개월, 적어도 약 12개월, 적어도 약 15개월, 적어도 약 18개월, 또는 적어도 약 24개월 동안 약 -80℃, 약 -20℃, 약 4℃, 약 25℃, 또는 이의 조합에서 생존가능하다.
일부 구현예에서, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 1011 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/mL 내지 약 1 x 1010 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 109 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 108 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 107 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 106 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 105 CFU/g, 약 1 x 104 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 105 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 106 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 107 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 108 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 109 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 1010 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 105 CFU/g, 약 1 x 104 CFU/g 내지 약 1 x 106 CFU/g, 약 1 x 105 CFU/g 내지 약 1 x 107 CFU/g, 약 1 x 106 CFU/g 내지 약 1 x 108 CFU/g, 약 1 x 107 CFU/g 내지 약 1 x 109 CFU/g, 약 1 x 108 CFU/g 내지 약 1 x 1010 CFU/g, 약 1 x 109 CFU/g 내지 약 1 x 1011 CFU/g, 또는 약 1 x 1010 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g의 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포가 약 -80℃, 약 -20℃, 약 4℃, 또는 이의 조합의 온도에서 적어도 약 14일, 적어도 약 1개월, 적어도 약 6개월, 적어도 약 8개월, 적어도 약 10개월, 적어도 약 12개월, 적어도 약 15개월, 적어도 약 18개월, 또는 적어도 약 24개월 동안 생존가능하다.
일부 구현예에서, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 1011 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 1010 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 109 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 108 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 107 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 106 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 105 CFU/g, 약 1 x 104 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 105 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 106 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 107 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 108 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 109 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 1010 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g, 약 1 x 103 CFU/g 내지 약 1 x 105 CFU/g, 약 1 x 104 CFU/g 내지 약 1 x 106 CFU/g, 약 1 x 105 CFU/g 내지 약 1 x 107 CFU/g, 약 1 x 106 CFU/g 내지 약 1 x 108 CFU/g, 약 1 x 107 CFU/g 내지 약 1 x 109 CFU/g, 약 1 x 108 CFU/g 내지 약 1 x 1010 CFU/g, 약 1 x 109 CFU/g 내지 약 1 x 1011 CFU/g, 또는 약 1 x 1010 CFU/g 내지 약 1 x 1012 CFU/g의 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포가 저장 후 약 25 ℃의 온도에서 적어도 약 14일, 적어도 약 1개월, 적어도 약 6개월, 적어도 약 8개월, 적어도 약 10개월, 적어도 약 12개월, 적어도 약 15개월, 적어도 약 18개월, 또는 적어도 약 24개월 동안 생존가능하다.
사료 첨가제, 조성물, 및 키트(kit)
한 가지 양태에서, 사료 첨가제는 본원에 개시된 바와 같은 엠. 엘스데니이 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 사료 첨가제는 본원에 개시된 바와 같은 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 사료 첨가제는 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포를 포함한다.
한 가지 양태에서, 사료 첨가제는 본원에 개시된 바와 같은 메가스파에라 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 사료 첨가제는 본원에 개시된 바와 같은 동결-건조된 메가스파에라 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 사료 첨가제는 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 동결-건조된 메가스파에라 세포를 포함한다.
한 가지 양태에서, 사료 첨가제는 본원에 개시된 바와 같은 혐기성 세균 세포를 포함한다. 다른 양태에서, 사료 첨가제는 비피도박테리움 세포, 예를 들면, 비. 브레베, 락토바실러스 세포, 예를 들면, 엘. 플란타리움, 비피도박테리움 세포, 예를 들면, 비. 아니말리스 아종, 락티스, 페디오코쿠스 세포, 예를 들면, 피. 악시딜락티시, 락토바실러스 세포, 예를 들면, 엘. 카세이를 포함한다.
일부 구현예에서, 사료 첨가제는 본원에 개시된 바와 같은 동결-건조된 혐기성 세균 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 사료 첨가제는 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 동결-건조된 혐기성 세균 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 사료 첨가제는 동결-건조된 비피도박테리움 세포, 예를 들면, 비. 브레베, 락토바실러스 세포, 예를 들면, 엘. 플란타룸, 비피도박테리움 세포, 예를 들면, 비. 아니말리스 아종, 락티스, 페디오코쿠스 세포, 예를 들면, 피. 악시딜라티시, 락토바실러스 세포, 예를 들면, 엘. 카세이를 포함한다. 일부 구현예에서, 사료 첨가제는 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 동결-건조된 비피도박테리움 세포, 예를 들면, 비. 브레베, 락토바실러스 세포, 예를 들면, 엘. 플란타룸, 비피도박테리움 세포, 예를 들면, 비. 아니말리스 아종, 락티스, 페디오코쿠스 세포, 예를 들면, 피. 악시딜락티시, 락토바실러스 세포, 예를 들면, 엘. 카세이를 포함한다.
한 가지 양태에서, 사료 첨가제는 본원에 개시된 바와 같은 호기성 세균을 포함한다. 다른 양태에서, 사료 첨가제는 바실러스 세포, 예를 들면, 비. 서브틸리스를 포함한다.
일부 구현예에서, 사료 첨가제는 본원에 개시된 바와 같은 동결-건조된 호기성 세균 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 사료 첨가제는 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 동결-건조된 호기성 세균 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 사료 첨가제는 동결-건조된 바실러스 세포, 예를 들면, 비. 서브틸리스를 포함한다. 일부 구현예에서, 사료 첨가제는 동결-건조된 바실러스 세포, 예를 들면, 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 비. 서브틸리스를 포함한다.
한 가지 양태에서, 사료 첨가제는 본원에 개시된 효모 세포를 포함한다. 다른 양태에서, 사료 첨가제는 사카로마이세스 세포, 예를 들면, 에스. 보울라르디이 및 에스. 세레비지아에를 포함한다.
일부 구현예에서, 사료 첨가제는 본원에 개시된 바와 같은 동결-건조된 효모 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 사료 첨가제는 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 동결-건조된 효모 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 사료 첨가제는 동결-건조된 사카로마이세스 세포, 예를 들면, 에스. 보울라르디이 및 에스. 세레비지아에를 포함한다. 일부 구현예에서, 사료 첨가제는 동결-건조된 사카로마이세스 세포, 예를 들면, 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 에스. 보울라르디이 및 에스. 세레비지아에를 포함한다.
일부 구현예에서, 사료 첨가제는 고체(즉, "고체 사료 첨가제") 또는 액체(즉, "액체 사료 첨가제")이다. 일부 구현예에서, 사료 첨가제는 반-고체 또는 겔(즉, "반-고체 또는 겔 사료 첨가제")이다. 겔 사료 첨가제는 산소 스캐빈저(scavenger)(예컨대, 아스코르브산)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 고체 사료 첨가제는 분말(예컨대, 유동성 분말), 과립(즉, 낟알), 입자(즉, 입자상 물질), 펠렛, 케이크, 수용성 농축액(concentrate), 페이스트, 거환스(bolus), 정제, 가루(dust), 이의 성분, 또는 이의 조합이다.
일부 구현예에서, 액체 사료 첨가제는 용액(예컨대, 수성, 유기, 또는 수성-유기 용액), 현탁액, 유액, 드렌치(drench), 스프레이, 주사가능물질(injectable), 음료(예컨대, 대용유(milk replacer)), 이의 성분, 또는 이의 조합이다.
일부 구현예에서, 겔 사료 첨가제는 오르가노겔(organogel)이다. 일부 구현예에서, 겔 사료 첨가제는 경구 겔(즉, 경구 투여용 겔)이다.
일부 구현예에서, 사료 첨가제는 상단 드레스(top dress)(즉, 식품의 표면에 가하거나 식품(예컨대, 동물 사료)와 혼합하기 위한)로서 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 사료 첨가제는 액체로서의 투여용이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포는 액체 속에 동결-건조된 세포를 재수화시키고/시키거나, 용해하고/하거나, 가용화시키고/시키거나 현탁시킴으로써 액체 사료 첨가제로서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 사료 첨가제는 담체(즉, 하나 이상의 담체)를 포함한다.
적합한 담체의 예는 식물 물질(즉, 전체 식물 또는 식물 부분(예컨대, 종자, 줄기, 잎, 꽃 및/또는 예를 들면, 뿌리), 예를 들면, 건조되거나 가공된 식물 또는 식물 부분), 건조된 곡물(예컨대, 증류기로 건조된 곡물), 알파파, 옥수수 가루, 감귤 가루, 발효 잔사, 분쇄된 굴 껍질, 아타펄거스 점토(attapulgus clay), 밀 쇼오츠(wheat short), 몰라세스 가용물, 옥수수 속대 가루, 식용성의 야채 물질, 토우스트된(toasted) 겉껍질을 벗긴 대두 곡물, 대두 밀 사료(soybean mill feed), 사상균병 항생제(antibiotic mycelis), 질석, 콩 그리츠(soya grits), 유장, 말토덱스트린, 슈크로즈, 덱스트로즈, 석회석(탄산칼슘), 왕겨, 효모 배양물, 건조된 전분, 나트륨 실리카 알루미네이트, 물, 염 용액, 알코올, 실리콘, 왁스, 석유 젤리, 야채 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 리포좀, 당, 젤라틴, 락토즈, 아밀로즈, 스테아르산마그네슘, 활석, 계면활성제, 규산, 점성 파라핀, 향수 오일, 지방산 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 페트로에트랄 지방산 에스테르(petroethral fatty acid ester), 하이드록시메틸-셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈 등, 및 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 사료 첨가제는 부형제(즉, 하나 이상의 부형제), 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 미세결정성 셀룰로즈; 락토즈; 시트르산나트륨; 탄산나트륨; 이염기성 인산칼슘 및 글리신; 붕해제, 예를 들면, 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트, 크로스카멜로즈 나트륨 및 특정의 복합체 실리케이트; 과립화 결합제, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필메틸셀룰로즈(HPMC), 하이드록시프로필셀룰로즈(HPC), 슈크로즈, 젤라틴, 및 아카시아; 증량제, 예를 들면, 말토덱스트린; 수분 스캐빈저(moisture scavenger), 예를 들면, 이산화규소; 산소 스캐빈저(oxygen scavenger), 예를 들면, 아스코르브산; 및/또는 윤활제, 예를 들면, 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트, 및 활석을 포함한다.
일부 구현예에서, 사료 첨가제는 엠. 엘스데니이 세포 및/또는 사료 첨가제를 포함하는 코어, 및 코어 위의 코팅을 포함하는 과립이다. 일부 구현예에서, 코팅은 수화된 장벽 염(hydrated barrier salt)이다. 염 코팅은 증진된 열-내성, 증진된 저장 안전성, 및 다르게는 엠. 엘스데니이 세포 및/또는 사료 첨가제의 부작용(예컨대, 안전성에 있어서)을 가질 수 있는 과립내 다른 성분에 대한 보호를 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 동결-건조된 엠. 엘스데니이는 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 성장 기질, 효소, 당, 탄수화물, 추출물, 및 성장 촉진 미세-성분의 무수 제형과 혼합된다. 당은 락토즈, 말토즈, 덱스트로즈, 말토덱스트린, 글루코즈, 프럭토즈, 만노즈, 타가토즈, 소르보즈, 라피노즈, 아밀로즈, 전분, 및 갈락토즈를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 당은 개별적으로 또는 함께 50 내지 95%의 범위일 수 있다. 추출물은 5 내지 50% 범위의 효모 또는 건조된 효모 발효 용해물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 성장 기질은 5 내지 25%의 범위의 트립티카제; 5 내지 30%의 범위의 젖산나트륨; 및 1 내지 5% 범위의 트윈(Tween) 80을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 탄수화물은 만니톨, 소르비톨, 아도니톨 및 아라비톨을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 탄수화물은 개별적으로 또는 함께 5 내지 50%의 범위일 수 있다. 미세-성분은 0.5 내지 5.0% 범위의 탄산칼슘; 0.5 내지 5.0% 범위의 염화칼슘; 0.5 내지 5.0% 범위의 인산이칼륨; 0.5 내지 5.0% 범위의 인산칼슘; 0.25 내지 1.00% 범위의 망간 프로테이네이트; 및 0.25 내지 1.00% 범위의 망간을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 엠. 엘스데니이 사료 첨가제는 엠. 엘스데니이 세포, 예를 들면, 세포 및/또는 동결-건조된 세포를 포함하는 배양물을 사료 첨가제(예컨대, 담체 및/또는 부형제)의 임의의 추가의 성분과 혼합(예컨대, 혼합기 사용)함으로써 제조한다. 일부 구현예에서, 성분을 혼합하여 균일한 혼합물을 수득한다.
일부 구현예에서, 사료 첨가제는 본원에 개시된 바와 같은 엠. 엘스데니이(예컨대, 동결-건조된 세포) 및 담체를 포함하는 상단-드레스 동물 사료 첨가제이다. 일부 구현예에서, 담체는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 유장, 말토덱스트린, 슈크로즈, 덱스트로즈, 석회석 (즉, 탄산칼슘), 왕겨, 효모 배양물, 건조된 전분, 및 나트륨 실리케이트 알루미네이트, 우유, 물, 및 이의 조합.
일부 구현예에서, 동물 사료 첨가제는 드렌치, 스프레이, 또는 본원에 개시된 바와 같은 엠. 엘스데니이(예컨대, 동결-건조된 세포) 및 수용성 담체를 포함하는 대용유의 보충물이다. 일부 구현예에서, 담체는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 유장, 말토덱스트린, 슈크로즈, 덱스트로즈, 건조된 전분, 나트륨 실리카 알루미네이트, 우유, 물, 및 이의 조합.
한 가지 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 엠. 엘스데니이 세포(예컨대, 본원에 개시된 동결-건조된 세포, 예컨대, 본원에 개시된 바와 같은 방법으로 생산된 동결-건조된 세포) 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 사료 첨가제를 포함하는 식품(예컨대, 동물 사료)에 관한 것이다. 식품 생성물은 동물 소비용(즉, 비-사람 동물 또는 사람)의 임의의 식품이며, 고체 및 액체 조성물 둘 다를 포함한다. 식품은 일반적인 식품; 액체 생성물, 예를 들면, 물, 우유, 기호 음료, 치료학적 음료, 및 영양 음료; 기능성 식품; 보충물; 영양제; 영아용(즉, 비-사람 및 사람 영아 포함) 조제분유, 예를 들면, 조숙아용 조제분유; 임신한 또는 수유중인 동물용 식품; 성체 동물용 식품; 및 노인전문 식품을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 식품은 식품 첨가제를 포함하는 액체(예를 들면, 음료, 예를 들면, 우유, 또는 대용유)을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 엠. 엘스데니이 세포(예컨대, 동결-건조된 세포) 및/또는 사료 첨가제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 조성물은 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 엠. 엘스데니이 세포(예컨대, 동결-건조된 세포) 및/또는 사료 첨가제는 임의의 공지된 기술에 의해 조성물의 요건을 기반으로 하여 화학적으로 또는 물리적으로 추가로 변형되거나 가공될 수 있다.
본 발명의 조성물은 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 부형제는 알칼리제, 안정화제, 항산화제, 부착제, 분리제, 코팅제, 외부 상 성분, 조절된-방출 성분, 용매, 계면활성제, 습윤제, 완충제, 충전제, 연화제, 또는 이의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본원에 논의된 것 외의 부형제는 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed. (2005)에 나열되어 있으나, 이에 한정되지 않는 부형제를 포함할 수 있다. 본원의 특수한 분류에서 부형제(예컨대, "용매")의 혼입은 부형제의 역활을 제한하는 것보다는 설명하기 위한 것으로 의도된다. 특수한 부형제는 다수의 분류 내에 속할 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 약제학적 조성물(예컨대, 비-사람 동물 또는 사람 치료용)이다. 일부 구현예에서, 조성물의 의료용 식품(예컨대, 수의용 식품)이다. 의료용 식품은 의사의 감독 하에서 소비되거나 외부적으로 투여될 조성물로서 및 인식된 과학적 원리를 기반으로 하여, 이에 대한 명백한 영양 요구도가 의학적 평가로 확립된 상태의 특수한 식이 관리를 위해 의도된 식품을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 연방 또는 주 정부의 감독기관에 의해 승인되거나 미국 약전(U.S. Pharmacopeia) 또는 동물, 및 특히 사람에서 사용하기 위한 다른 일반적으로 인식된 국제 약전에 나열됨을 의미한다.
조성물의 경구 투여를 위해, 엠. 엘스데니이 세포(예컨대, 동결-건조된 세포) 또는 사료 첨가제를 당해 분야에 잘 공지된 부형제와 조합시킬 수 있다. 이러한 담체는 예를 들면 본 발명의 엠. 엘스데니이 세포 또는 사료 첨가제가 치료될 대상체가 경구 섭취하기 위해 정제, 환제, 당의제, 캅셀제, 액체, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁제 등으로 제형화되도록 할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 정제, 환제, 카플렛(caplet), 또는 캅셀제이다. 적합한 부형제는 충전제, 예를 들면, 당, 예를 들면, 이에 한정되지 않는, 락토즈, 슈크로즈, 만니톨, 및 소르비톨; 셀룰로즈 제제, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가칸트, 메틸 셀룰로즈, 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸 셀룰로즈, 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 경우에 따라, 붕해제, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 가교-결합된 폴리비닐피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 이의 염, 예를 들면, 알긴산나트륨을 가할 수 있다. 경구적으로 사용될 수 있는 조성물은 젤라틴으로 제조된 캅셀제뿐만 아니라, 젤라틴 및 가소제, 예를 들면, 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연한 밀봉된 캅셀제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 투여형은 채식주의자 투여형(vegetarian dosage form)이며, 여기서 투여형은 동물 공급원으로부터 형성되지 않고 이로부터의 임의의 성분을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 베지테리엔 투여형은 채식주의자 캅셀제이다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 엠. 엘스데니이 세포(예컨대, 동결-건조된 세포) 및/또는 사료 첨가제를 포함하는 캅셀제에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 캅셀제는 젤라틴 캅셀제이다. 일부 구현예에서, 캅셀제는 본원에 개시된 바와 같은 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포 또는 본원에 개시된 바와 같은 사료 첨가제를 포함한다. 일부 구현예에서, 캅셀제는 붕해가능하다. 일부 구현예에서, 캅셀제는 붕해가능한 젤라틴 캅셀제이다.
다른 양태에서, 본 발명은 혐기성 세균 세포를 포함하는 캅셀화된 동결-건조된 조성물에 관한 것이며, 여기서 동결-건조된 분말은 동결-건조된 분말을 가열된 오일로 분산시킴으로써 캅셀화된다. 다른 양태에서, 본 발명은 엠. 엘스데니이 세포를 포함하는 캅셀화된 동결-건조된 조성물에 관한 것이며, 여기서 동결-건조된 분말은 동결건조된 분말을 가열된 오일 속에 분산시킴으로써 캅셀화된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 엠. 엘스데니이 세포, 사료 첨가제, 식품, 및/또는 조성물을 포함하는 키트 또는 패키지(package)이다. 키트 또는 패키지는 사료 첨가제, 식품, 조성물, 또는 이의 조합(예컨대, 하나 이상의 단위)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 동결-건조된 세포, 본원에 개시된 바와 같은 사료 첨가제, 또는 본원에 개시된 바와 같은 캅셀제를 포함한다.
혐기성 세균 세포, 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포를 동물에게 투여하는 방법
한 가지 양태에서, 본 발명은 엠. 엘스데니이 세포를 동물에게 투여하는 방법에 관한 것이다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 메가스파에라 세포를 동물에게 투여하는 방법에 관한 것이다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 혐기성 세균 세포를 동물에게 투여하는 방법에 관한 것이다. 다른 양태에서, 본 발명은 비피도박테리움 세포, 예를 들면, 비. 브레베, 락토바실러스 세포, 예를 들면, 엘. 플란타리움, 비피도박테리움 세포, 예를 들면, 비. 아니말리스 아종, 락티스, 페디오코쿠스 세포, 예를 들면, 피. 악시딜락티시, 락토바실러스 세포, 예를 들면, 엘. 카세이 세포를 동물에게 투여하는 방법에 관한 것이다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 호기성 세균 세포를 동물에게 투여하는 방법에 관한 것이다. 다른 양태에서, 본 발명은 바실러스 세포, 예를 들면, 비. 바실러스 세포를 동물에게 투여하는 방법에 관한 것이다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 효모 세포를 동물에게 투여하는 방법에 관한 것이다. 다른 양태에서, 본 발명은 사카로마이세스 세포, 예를 들면, 에스. 보울라르디이 및 에스. 세레비지아에 세포를 동물에게 투여하는 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 이러한 방법은 동물에게 본원에 기술된 바와 같은 엠. 엘스데니이 세포, 사료 첨가제, 식품, 또는 조성물(예컨대, 캅셀제)을 투여함을 포함한다.
투여는 예를 들면, 경구적으로(즉, 섭취가능한 액체 또는 고체, 경구 드렌치, 사료 첨가제, 식품, 조성물, 또는 캅셀제), 신체 위로 분무함으로써(즉, 미스트 분무(mist spraying)에 의해), 및/또는 주사를 포함하는 임의의 적합한 경로로 수행할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 엠. 엘스데니이 세포를 포함하는 고체, 액체, 또는 겔을 투여함을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 세포를 포함하는 고체 사료 첨가제를 투여함을 포함한다. 일부 구현예에서, 고체 사료 첨가제는 분말(예컨대, 유동성 분말), 과립(즉, 낟알), 입자(즉, 입자상 물질), 펠렛, 케이크, 수용성 농축액, 페이스트, 거환, 정제, 가루, 이의 성분, 또는 이의 조합이다.
일부 구현예에서, 방법은 용액(예컨대, 수성, 유기, 또는 수성-유기 용액), 현탁액, 유액, 드렌치, 스프레이, 주사가능물질, 음료(예컨대, 대용유), 이의 성분, 또는 이의 조합을 투여함을 포함한다. 일부 구현예에서, 액체는 경구적으로 또는 동물에 액체를 분무함으로써 투여된다.
일부 구현예에서, 방법은 엠. 엘스데니이 세포 또는 이러한 세포를 포함하는 사료 첨가제를 다른 동물 사료 첨가제와 조합하여 동물 사료에 가하기 위한 보충물 또는 예비혼합물을 형성시킴을 포함한다. 일부 구현예에서, 다른 사료 첨가제는 엠. 엘스데니이 이외의 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 엠. 엘스데니이 세포(예컨대, 동결-건조된 세포)는 액체로서(예컨대, 예를 들면, 재수화되고 동결-건조된 세포를 포함하는 브로쓰 또는 브로쓰 등가물), 재구성된 세포 페이스트로서, 또는 동결건조된(예컨대, 동결-건조된) 세포로서 사료 첨가물에 가해질 수 있다.동결-건조된 엠. 엘스데니이를 포함하는 미생물을 또한 사료 첨가제에 가하기 전에 캅셀화할 수 있다. 용량형(예컨대, 예정된 용적의 드렌치 또는, 캅셀제)를 또한 형성시킬 수 있고, 경우에 따라, 미생물을 액체 브로쓰 및/또는 동결-건조된 세포를 사료 위에 뿌리거나 사료내로 혼합합으로써 동물 사료에 직접 가할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 고체 사료 첨가제(예컨대, 산제, 과립체, 입자상 물질, 펠렛, 케이크, 동결-건조된 세포, 또는 이의 조합물)을 재수화시켜 투여용 액체를 생산함을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 엠. 엘스데니이 세포를 고체 사료 첨가제 또는 동결-건조된 세포를 재수화시키는 전달 시스템을 통해 동물 사료에, 예를 들면 배치 대 배치 기준으로 적용시킴을 포함한다. 예를 들면, 동결-건조된 분말은 플러싱 시스템(flushing system)내로 폴리비닐 호퍼(hopper)로부터 증강시킬 수 있으며, 이는 분말을 희석시키고 이를 혼합될 사료 위에 분무한다.
일부 구현예에서, 방법은 엠. 엘스데니이 세포를 동물 사료에 저장 빈(storage bin)이 장착된 용적 계량 장치(volumetric metering device)를 사용하여 동물 사료에 적용함을 포함한다. 예를 들면, 동결-건조된 세포(예컨대, 세포를 포함하는 분말)를 저장 빈에 저장하고 동물 사료에 분무하기 직전에 물 또는 수성 욕내에 배출할 수 있다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 동물에게 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 엠. 엘스데니이 세포(예컨대, 동결-건조된 세포), 본원에 개시된 바와 같은 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 본원에 개시된 바와 같은 사료 첨가제, 또는 본원에 개시된 바와 같은 조성물(예컨대, 캅셀제)를 투여함을 포함하여, 동물의 위장관내에서 젖산 생산과 관련된 상태 또는 장애를 치료하거나 예방하기 위한 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 상태 또는 장애는 산증이다. 일부 구현예에서, 상태 또는 장애는 반추 산증이다. 일부 구현예에서, 상태 또는 장애는 호흡기 질환이다. 일부 구현예에서, 상태 또는 장애는 제엽염이다. 일부 구현예에서, 상태 또는 장애는 감염이다. 일부 구현예에서, 감염은 살모넬라 또는 캄필로박터에 의한 것이다. 일부 구현예에서, 살모넬라는 살모넬라 엔테리카 및/또는 살모넬라 본고리이다. 일부 구현예에서, 살모넬라 혈청형은 살모넬라 티피무리움 및/또는 엔티리티디스이다. 일부 구현예에서, 캄필로박터는 캄필로박터 제주니 또는 캄필로박터 콜리이다.
다른 양태에서, 본 발명은 동물에게 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 엠. 엘스데니이 세포(예컨대, 동결-건조된 세포), 본원에 개시된 바와 같은 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 본원에 개시된 바와 같은 사료 첨가제, 또는 본원에 개시된 바와 같은 조성물을 투여함을 포함하여, 동물의 위장관내 기회감염 미생물의 성장을 예방하거나 감소시키는 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 기회감염 미생물은 병원성이다. 일부 구현예에서, 기회감염 미생물은 살모넬라 또는 캄필로박터이다. 일부 구현예에서, 살모넬라는 살모넬라 엔테리카 및/또는 살모넬라 본고리이다. 일부 구현예에서, 살모넬라 혈청형은 살모넬라 티피무리움 및/또는 엔티리티디스이다. 일부 구현예에서, 캄필로박터는 캄필로박터 제주니 또는 캄필로박터 콜리이다.
다른 양태에서, 본 발명은 동물에게 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 엠. 엘스데니이 세포(예컨대, 동결-건조된 세포), 본원에 개시된 바와 같은 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 본원에 개시된 바와 같은 사료 첨가제, 또는 본원에 개시된 바와 같은 조성물을 투여함을 포함하여, 동물의 식이 속의 식물-유래된 인의 생체이용률을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 엠. 엘스데니이 세포는 피타아제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 엠. 엘스데니이 세포의 부재하에서 동물 식이의 투여로부터 생성되는 환경적인 폐기물을 감소시킨다.
다른 양태에서, 본 발명은 동물에게 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 엠. 엘스데니이 세포(예컨대, 동결-건조된 세포), 본원에 개시된 바와 같은 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 본원에 개시된 바와 같은 사료 첨가제, 또는 본원에 개시된 바와 같은 조성물을 투여함을 포함하여, 동물에서 성장 능력을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 동물에서 증진된 성장 능력은 사료 섭취, 평균 일당증체량, 사료 요구율, 사체 획득, 젖 생산 동물에서 젖 생산, 가금류에서 알 생산, 골 광화, 또는 이의 조합에 있어서의 증진이다.
다른 양태에서, 본 발명은 동물에게 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 엠. 엘스데니이 세포(예컨대, 동결-건조된 세포), 본원에 개시된 바와 같은 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 본원에 개시된 바와 같은 사료 첨가제, 또는 본원에 개시된 바와 같은 조성물을 투여함을 포함하여, 동물의 하부 위장관을 산성화시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 하부 위장관은 가금류 동물의 맹장이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 엠. 엘스데니이 세포(예컨대, 동결-건조된 세포), 본원에 개시된 바와 같은 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 본원에 개시된 바와 같은 사료 첨가제, 또는 본원에 개시된 바와 같은 조성물은 동물에게 식품을 공급하기 전에, 이와 동시에, 또는 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 방법은 본원에 개시된 바와 같은 엠. 엘스데니이 세포, 본원에 개시된 바와 같은 방법에 의해 생산된 동결-건조된 세포, 본원에 개시된 바와 같은 고체 사료 첨가제를 투여 전에 액체와 혼합시킴을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 액체는 경구적으로(예컨대, 경구 드렌치) 또는 동물에게 액체를 분무(예컨대, 미스트 분무)함으로써 투여된다.
일부 구현예에서, 방법은 본원에 개시된 바와 같은 엠. 엘스데니이 세포(예컨대, 동결-건조된 세포), 본원에 개시된 바와 같은 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 본원에 개시된 바와 같은 사료 첨가제, 또는 본원에 개시된 바와 같은 조성물의 단일 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 본원에 개시된 바와 같은 엠. 엘스데니이 세포(예컨대, 동결-건조된 세포), 본원에 개시된 바와 같은 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 본원에 개시된 바와 같은 사료 첨가제, 또는 본원에 개시된 바와 같은 조성물의 매일 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 매일 적어도 1회, 매일 적어도 2회, 매일 적어도 3회, 또는 매일 3회 이상이다. 일부 구현예에서, 투여는 임의로(예컨대, 엠. 엘스데니이 세포(예컨대, 동결-건조된 세포), 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 사료 첨가제, 또는 조성물을 포함하는 이용가능한 액체를 음용하거나 이를 포함하는 이용가능한 식품을 섭취함으로써 자가-투여) 이루어진다.
일부 구현예에서, 방법은 본원에 개시된 바와 같은 엠. 엘스데니이 세포 (예컨대, 동결-건조된 세포), 본원에 개시된 바와 같은 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 본원에 개시된 바와 같은 사료 첨가제, 또는 본원에 개시된 바와 같은 조성물의 1일에 1회 이상 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 1일에 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 이상의 투여이다. 일부 구현예에서, 방법은 1일 1회 투여에 이어 투여없이 하루 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여 없이 하루 이상은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 또는 6일, 1주, 2주, 3주, 또는 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월이다.
일부 구현예에서, 동물은 반추동물이다. 일부 구현예에서, 반추동물은 소, 버팔로, 양, 염소, 사슴, 순록, 무스, 기린, 야크 및 엘크일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 반추동물은 소, 버팔로, 양, 염소, 사슴, 및 순록으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 동물은 비-반추동물이다. 일부 구현예에서, 비-반추동물은 말류, 가금류, 돼지류, 개, 및 고양이일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 비-반추동물은 말류, 가금류, 및 돼지류로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 동물은 동물원 동물이다.
일부 구현예에서, 동물은 가금류 동물이다. 일부 구현예에서, 가금류 동물은 식품 동물로서 사용되는 조류(즉, 새), 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 닭, 거위, 오리, 메추라기, 칠면조, 비둘기, 에뮤, 또는 타조이다. 일부 구현예에서, 가금류 동물은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 닭, 거위, 오리, 메추라기, 칠면조, 또는 비둘기. 일부 구현예에서, 가금류 동물은 구이용 영계, 육용종계, 및 산란닭으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 가금류 동물은 닭이다.
일부 구현예에서, 동물은 말류이다. 일부 구현예에서, 말류는 말, 조랑말, 당나귀, 또는 노새이다.
실시예
참고가 이제 다음의 실시예에 대해 이루어지며, 이는 상기 설명과 함께 비-제한적인 방식으로 본 발명의 일부 구현예를 나타낸다.
실시예 1
엠. 엘스데니이의 액체 배양물의 수율에 있어서 온도의 효과
4℃, 20℃, 및 39℃의 저장 온도를 시험하여 0, 7, 14, 21, 및 28일 후 엠. 엘스데니이 NCIMB 41125(Lactipro®)의 액체 배양물 속의 세포의 생존능을 평가하였다. 결과는 생성물을 4℃에서 저장하는 것이 샘플링 일에 상관없이, 20℃ 또는 39℃에서의 저장과 비교하여 배양물의 생존능을 유의적으로(P < 0.001) 증진시켰음을 나타내었다. 28일 후, 4℃에서 저장된 생성물은 20℃ 또는 39℃에서 저장된 생성물에 대해 각각 1.26 x 106 및 6.3 x 105 콜로니 형성 단위/밀리리터(CFU/mL)와 비교하여 3.98 x 106CFU/mL를 가졌다(P < 0.01; 도 1). 따라서, 결과는 감소된 저장 온도가 엠. 엘스데니이 NCIMB 41125의 액체 배양물의 생존능을 개선시킴을 나타낸다.
별개의 연구로부터의 추가의 데이타는 액체 배양물(Lactipro advance®) 속의 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 41125 수율이 실온에서 0, 7, 14, 21, 및 28일의 저장 후 감소함을 나타낸다(도 2).
실시예 2
엠. 엘스데니이의 배양물을 농축하기 위한 접선 유동 여과의 용도
접선 유동 여과(TFF)를 고 처리율에서 다량의 배양물을 농축시키는 방법으로서 시험하였다.
중간시험 규모(pilot scale)의 TFF 시스템(참고: 도 3)을 엠. 엘스데니이에 대한 생산 라인에 통합시키고 500-리터(L) 생산 실시로 시험하여 70%, 80%, 및 90%의 용적 감소 수준에서 중간시험 규모 시스템을 평가하였다. 하나의 RC 100 kDa 막(0.875 mm 채널 높이)이 장착된 TFF 모듈을 사용하였다. 3개의 생산 실시를 총 9개의 실시에 대해 각각의 감소 수준에 대해 수행하였다. 샘플을 각각의 실시에 대해 수집하고 pH, 광학 밀도(OD), 호기성 오염물의 존재 또는 부재, 삼투압, 휘발성 지방산 프로파일, 엠. 엘스데니이 농도, 및 성장 특성에 대해 분석하였다. 샘플을 여과 시작 전에 9개의 엠. 엘스데니이 배양물("비-동결-건조된")로부터, 투과물("Permeate")(이는 시스템에 의해 제거된 용적이다)로부터, 및 보유액("Retentate")(이는 용적 감소 후 남아있는 세포를 포함하는 농축된 엠. 엘스데니이 배양물 용적이다)로부터 수집하였다.
농축 공정의 초기, 중간, 및 말기에 수집한 투과물 샘플은 용적 감소 수준에 걸쳐 일관된 OD 판독치를 가졌으며, 모두 0.045 미만이었다(데이타는 나타내지 않음). 투과물 속에서 회수된 엠. 엘스데니이의 양은 농축 공정의 과정에 걸쳐 증가하였지만(P = 0.0006), 보유액 속에서 수집된 세포의 양과 비교하여 여전히 무시할만한 정도였다(3 x 104 CFU/mL 미만)(< 0.002%). 용적 감소 수준은 투과물에서 회수된 엠. 엘스데니이 농축에 대한 효과를 가지지 않았다(P > 0.9; 표 2).
보유액 속의 엠. 엘스데니이 수율은 각각의 배깅 공정(bagging process)의 초기, 중간, 또는 말기에 수집된 백(bag)에서 상이하지 않았다(P = 0.6088; 데이타는 나타내지 않음). 보유액 수율은 용적 감소 수준에 의해 영향받았다(P < 0.0001; 표 2 및 도 4). 90% 용적 감소 보유액은 70% 및 80% 용적 감소 보유액보다 더 높았다(P < 0.0001). 그러나, 70% 및 80% 보유액은 서로 상이하지 않았다(P > 0.09).
여과 공정은 엠. 엘스데니이 세포가 SDL-20 배지로 다시 접종되는 경우 이의 성장하는 능력에 영향을 미치지 않았다(표 3). 지수기의 기울기는 용적 감소 수준에 의해 영향받지 않았지만(P > 0.3), 샘플의 유형에 의해 영향받았다: "보유액" 대 "비-동결-건조된" (P < 0.001). 지체 시간(lag time)은 용적 감소 수준 및 샘플 유형 둘 다에 의해 영향받았다(P < 0.001). 보유액에 대한 지체 시간은 용적 감소가 증가하면서 감소하였으며, 이는 보다 높은 세포 농도를 나타내었다.
실시예 3
엠. 엘스데니이에 대한 동결 및 동결-건조 매개변수
A. 보유액의 동결 및 동결-건조
TFF를 통해 수득한 보유액을 사용하여 동결 프로토콜, 동결보호제 혼입, 및 다양한 동결-건조 매개변수를 시험하였다.
보유액을 멸균 탈기된(degassed) 혈청 병으로 이동시키고 상이한 동결보호제 제형(w/v): 동결보호제 없음(Ctrl), 스킴 밀크(SM), 트레할로즈(T), 및 베타인과 무균적으로 혼합하였다. 적절한 동결보호제와 혼합된 보유액을 샘플링하여 동결-건조 전 엠. 엘스데니이 농도(즉, 생존능 수(viability count))를 측정하였다. 혼합물을 10 mL의 바이알(4 mL/바이알)로 이동시키고 액체 질소 속에 스냅(sanp) 동결시키거나 -80℃에서 밤새 서서히 동결시켰다. 바이알을 동결-건조기에 이동시켜 느린 또는 신속한 주기를 사용하여 동결건조시켰다. 일단 동결-건조가 완료되면, 세균의 생존을 동결건조된 생성물을 혐기성 희석물이 들어있는 혐기성 챔버(chamber) 속에 재현탁시켜, 이것이 실온에서 40분 동안 재수화하도록 한 후, SDL20 한천 상에 플레이팅함으로써 측정하였다.
동결보호제의 존재 또는 부재하에서 혼합된 상응하는 보유액 속에서 측정된 엠. 엘스데니이의 초기 농도로부터 동결-건조 후 회수된 엠. 엘스데니이의 농도를 감함으로써 세포 손실을 계산하였다. SAS® 소프트웨어를 사용하여 용적 감소 수준(70%, 80%, 또는 90%), 동결-건조 주기(느린 대 신속한), 동결 방법(-80℃ 대 액체 질소), 동결보호제(없음, 베타인, 트레할로즈, 스킴 밀크, 말토덱스트린, 트레할로즈/스킴 밀크(T/SM), 및 말토덱스트린/스킴 밀크(M/SM)) 사이의 상호작용을 분석함으로써 세포-손실 데이타를 계산하였다.
다른 기준과 상관없이 대조군 처리(동결보호제 없음)시 관찰된 세포 손실은 5 Log(CFU/mL) 이상이었다. 유사하게, 다른 기준과는 상관없이 베타인 처리시 관찰된 세포 손실은 3.96 Log CFU/mL 이상이었다. 허용되는 세포 손실 한계는 1.6 log CFU/mL에서 설정하였다. T/SM 또는 M/SM과 혼합된 보유액은 모두 -80℃에서 T/SM 동결되고 느린 또는 신속한 주기를 사용하여 동결-건조된 것을 제외하고 사용된 동결 방법 또는 동결-건조 주기와 상관없이 역치(threshold) 미만이었다(도 5).
B. 저장시 동결-건조 조건의 효과
메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 41125를 여과 장치를 사용하여 10배 농축시키고, 동결-건조 검정을 수행하여 상이한 특징을 시험하였다: 신속한 또는 느린 초기 동결(액체 질소 대 -20℃), 트레할로즈의 존재(0%, 4%, 7.5%, 및 10%) 또는 부재, 및 온화한 또는 신속한 동결-건조 주기(2 x 10-6 Torr에서 38 h 대 135 x 10-6 Torr에서 16.5 h). 시험한 모든 동결-건조된 공정은 재수화후, 심지어 실온에서 4 내지 12개월의 연장된 저장 후 배양물의 성장을 개시하기에 충분한 생존능을 보유할 수 있는 생성물을 생성하였다. 세균 생존능에 있어서의 차이는 그럼에도 불구하고 사용된 동결-건조 특성에 따라 관찰되었다(도 6). 0.04 이상의 최종의 물 활성을 유지하는 느린 동결, 7.5% 트레할로즈 혼입, 및 온화한 동결-건조 단계는 메가스파에라 엘스데니이의 보다 큰 생존과 관련되었다.
C. 동결-건조된 엠. 엘스데니이의 생존능에 있어서 동결보호제의 효과
원심분리된 엠. 엘스데니이 NCIMB 41125 세포 농축물을 동결건조 전에 유아용 조제유 속에 재현탁시켜, 세포를 후속적으로 재수화시킨 경우 세포 생존능에 있어서 1-log 감소만을 야기하였다. 4% 트레할로즈 및 7.5% 스킴 밀크를 엠. 엘스데니이 농축액에 첨가하는 것을 -80℃에서 느린 동결 전 또는 액체 질소 속에서 스냅 동결시켜 초기 동결 공정 동안 직면한 세포 손실을 측정하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 4% 트레할로즈 또는 7.5% 스킴 밀크를 사용한 스냅 동결은 생존가능한 세포의 최대 회수를 수득하였다(생존하는 세포 수에 있어서 0.79 log 감소). 사용된 동결 기술과는 상관없이, 동결보호제가 첨가되지 않은 생성물은 2.34 내지 1.95 log CFU/mL의 메가스파에라 엘스데니이를 손실하였다.
실시예 4
동결-건조된 엠. 엘스데니이의 수율 및 안전성에 있어서 저장 조건의 효과
메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 41125 성장 특성 및 반감기에 있어서 동결-건조 프로토콜 및 저장 조건의 효과를 측정하기 위하여, 90% 용적 감소로부터 수득된 보유액을 8% 트레할로즈/15% 스킴 밀크(T/SM) 또는 8% 말토덱스트린/15% 스킴 밀크(M/SM)와 혼합하고, -80℃에서 또는 액체 질소(LiqN) 속에서 동결시키고, 신속한 주기를 사용하여 동결-건조시켰다. 이후에 보유액 샘플을 성장 곡선 분석 및 스프레드 플레이팅 기술(spread plating technique)을 사용하여 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 및 24주 동안 호기성 및 혐기성 조건에서 4℃ 또는 25℃에서 저장 동안 세균 성장 특성 및 세포 생존에 대해 시험하였다. 요약하면, 저장된 생성물을 샘플링하고, 일련 희석시키며, SDL 한천 플레이트 위로 플레이팅하였다. 또한, 성장 배지(SDL)를 재수화되고 동결-건조된 생성물을 접종(1:100)하고 배양물이 정체기에 이를 때까지 광학 밀도(OD, 600 nm)를 기록하였다. 실험을 3일의 상이한 날에 반복하고 모든 처리를 3회 수행하였다. 희석없이, 흡광도가 스킴 밀크의 존재로 인하여 한계 이상이었으므로 성장 곡선을 수행하기 위해 재수화되고 동결-건조된 샘플을 희석시켰다. 성장 곡선 비교를 용이하기 위하여, 샘플 희석을 대조군으로서 동결-건조되지 않은 샘플에서 수행하였다.
결과: 샘플을 동결-건조시키고 실온에서 또는 4℃에서 호기성 또는 혐기성 조건하에 6개월 동안 저장하였다. 샘플을 단지 2주 저장 후 0.4 내지 3.2 Log 범위인 이들의 혐기성 대응물과 비교하여 처리가 추가의 세포 손실을 신속하게 쇠퇴시킨 것에 상관없이 호기성 조건 하에서 저장하였다. 이러한 결과를 기반으로 수치 명료성을 증진시키기 위해, 혐기적으로 저장된 동결-건조된 생성물에서 관찰된 세포 손실만을 도 8에 나타낸다. 혐기성 조건에서 저장하는 동안, 실온에서 저장된 샘플은 액체 질소 속에 동결된 T/SM 샘플을 제외하고는, 4℃에서 저장된 이들의 대응물보다 더 신속하에 쇠퇴하였다. 액체 질소에서 동결되고 동결-건조 후 실온에서 저장된 T/SM 샘플은 16주의 저장 기간에 걸쳐 4℃에서 저장된 이의 대응물보다 더 많은 세포를 통계적으로 손실하지 않았다(P > 0.1). 그러나, 샘플들 사이의 차이는 20주 저장 후 실온 저장과 4℃ 저장 사이에서 유의적으로 되었으며(P = 0.0002), 20주 저장 후 0.84 log 차이 및 24주 저장 후 0.89 log 차이이었다. 모든 M/SM 샘플은 이들의 T/SM 대응물보다 더 신속하게 쇠퇴하였다. 24주 저장 후(도 9), 액체 질소 속에서 동결시키고 혐기성 조건 하에 4℃에서 저장된 T/SM 샘플내 세포 손실은 임의의 다른 처리보다 유의적으로 더 낮았다(P < 0.02). 액체 질소 속에서 동결되고 혐기성 조건 하에 4℃에서 저장된 T/SM 샘플은 24주 저장 기간으로부터 0.82 log 손실을 야기하는, 동결-건조되기 전 관찰된 엠. 엘스데니이 농도와 비교하여 2.16 log 손실을 가졌다. 각각의 샘플링 날에, 성장 곡선 실험을 수행하여 동결-건조된 생성물의 성장 특성을 동결-건조되지 않은 생성물과 비교하였다. 도 10은 액체 질소 속에서 동결되고, 신속한 주기(250 mTorr에서 18.5 시간)로 동결-건조시키고, 4℃ 또는 실온에서 혐기적으로 저장한 샘플에서 수행한 성장 곡선을 나타낸다. 각각의 성장 곡선에 대해 사용된 동결-건조되지 않은 샘플은 "신선"하였다(2일 이하의 노화). 4℃에서 저장한 동결-건조된 생성물은 실온에서 저장한 동결-건조된 생성물보다 더 짧은 지체 시간을 가졌으며, 이는 이러한 샘플에서 관찰된 엠. 엘스데니이 농도에 있어서의 차이와 일치한다(표 4). 16주의 저장 후 저장 온도에 상관없이 T/SM 샘플은 M/SM 샘플보다 더 짧은 지체 시간을 가졌다.
동결-건조되지 않은 및 25℃에서 12주 동안 저장된 MSM 처리 및 20℃에서 16주 동안 저장된 MSM 처리에 대한 기울기는 비정상적으로 낮았다(표 5). 20 및 24주 저장 후, 동결-건조된 샘플의 지수기 기울기는 동결되지 않은 대조군과는 숫자상으로 상이하지 않았다.
실시예 5
소에서 동결-건조된 엠. 엘스데니이의 효능 및 안정성
A. 동결-건조된 생성물 제조 및 저장 수명
솔직한 재수화된 엠. 엘스데니이 배양물(재수화된 및 상단 드레스 처리)로서 본 시험에 사용된 바이알을 실험 시작 56일 전에 제조하고 사용을 기다리는 동안 4℃에서 냉장고에 저장하였다. 각각의 바이알은 5 mL의 동결-건조된 생성물의 등가물을 함유하였다. 바이알을 6회의 상이한 동결-건조 실시에서 동결-건조시켰다. 각각의 실시를 위해, 3개의 바이알을 동결-건조 후 재수화시키고 3개의 추가의 바이알을 연구일에 재수화시켜 바이알당 엠. 엘스데니이 농도를 측정하였다(표 6). 재수화된 및 상단-드레스 그룹으로부터의 동물에게 1.84 x 1010 CFU의 엠. 엘스데니이에 대해 등가인, 드렌칭(drenching)에서 바이알의 함량을 각각 제공하였다.
실험 출발 후, 실시 #5 및 #6으로부터의 추가의 바이알을 4℃에서 유지시키고, 이러한 실시의 각각의 실시로부터의 3개의 바이알을 매달 재수화하였다(도 11).
바이알내 엠. 엘스데니이 농도는 4℃에서 11개월 저장 동안 4.96 x 1010 CFU/g으로부터 4.17 x 1010 CFU/g으로 변하였으며, 이는 수율에 있어서 0.07 log 손실만을 나타낸다.
매일 상단-드레스 엠. 엘스데니이 배양물(상단-드레스 처리)로서 이러한 시험에서 사용된 생성물을 실험 시작 약 30일 전에 제조하고 폴리호일 백 속에서 동결기 속에 저장하였다. 상단-드레스 생성물을 6회의 상이한 동결-건조 실시에서 동결-건조시키고, 15개의 개개 폴리호일 백(사료제공시 1개의 백/일)내에 포장하고, 질소로 플러싱(flushing)하고,밀봉하여 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 각각의 동결-건조 실시를 위해, 3개의 패키지를 동결-건조 후 재수화하였다. 평균 엠. 엘스데니이 농도는 4 x 1010 CFU/패키지이었다. 3개의 추가의 패키지를 매주 개시할 때 재수화시키고 엠. 엘스데니이 세포를 재수화 용액에 가하여 세포를 40분 동안 정치시키고, 세포를 희석시키며, 세포를 플레이팅함으로써 매일 동물에게 제공된 엠. 엘스데니이 농도를 측정하는데 사용하였다(도 12). 통계적 분석은 시간에 따른 세포 농도에 있어서의 증가를 나타내었다. 모든 생성물을 연구 개시 30일 전에 제조하고, 상단 드레스로서 사용된 생성물은 연구 말기에 약 80일이 지났다. 동물에게 평균 2.19 x 108 CFU의 엠. 엘스데니이를 매일 제공하였다(2.45 x 1010 CFU/패키지).
B. 소 연구
거세한 수소(steer)(n = 462; 초기 체중 900 lbs)를 중량으로 블록화하여 다음으로 이루어진, 4회 처리 중 하나에 무작위로 지정하였다: 메가스파에라 엘스데니이를 제공받지 않은 대조군 그룹(17개 펜(pen); 7개 머리(head)/펜)); 50 mL의 2 x 108 CFU/mL를 함유하는 엠. 엘스데니이 생성물(1010 CFU의 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 41125)를 먼저 제공받은 동결-건조되지 않은 그룹(16개 펜; 7개 머리/펜); 투여 직전 먼저(1010 CFU의 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 41125) 재수화된 동결건조된 생성물을 제공받은 재수화된 그룹(16개 펜; 7개 머리/펜); 및 투여 직전(1010 CFU의 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 41125) 먼저 재수화된 동결건조된 배양물 및 연구 동안에 매일 상단-드레스로서 식이내로 혼입된 동결건조된 생성물을 제공받은 상단-드레스 그룹(108 CFU의 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 41125를 매일; 17개 펜; 7개 머리/펜). 거세한 수소의 동결-건조되지 않은, 재수화된, 및 상단-드레스 그룹을 메가스파에라 엘스데니이의 이들의 선행 드렌치를 먼저 제공한 후 10-일의 단계적으로 증가하는 프로그램에 둔 반면, 대조군 그룹은 21일의 단계적으로 증가하는 프로그램에 두었다. 반추 유액을 제1의 배급량(ration)을 공급한 후 26시간째에 루메노센테시스(rumenocentesis)를 통해 추출하였다. 반추 유액 샘플을 시험관내 소멸 검정에서 pH, 휘발성 지방산 농도, 내독소 수준, 및 젖산의 활용에 대한 능력에 대해 분석하였다. 락테이트 소멸 검정의 경우, 반-정의된 락테이트 배지를 함유하는 10개의 10-mL 튜브에 0.1 mL의 반추 유액을 접종하였다. 광학 밀도를 24 시간 동안 6시간마다 2회 측정하여 주요 기질로서 젖산을 사용한 성장 능력을 평가하였다. 광학 밀도를 젖산 농도의 후속적인 측정을 위해 관찰한 직후 튜브를 동결기내에 두었다. 펜당 한마리의 거세한 수소에 연속적인, 무선주파수 볼루스(radio frequency bolus)를 장착하여 56일 연구에 걸쳐 pH 측정을 추적하였다. 거세한 수소를 0, 28, 및 56일째에 칭량하여 평균 일당증체량, 건조물 섭취, 및 사료 효율을 측정하였다.
동물이 섭취한 살아있는 엠. 엘스데니이를 평가하기 위하여, 동결-건조된 생성물을 알루미늄 팬 속에서 멸균되고 분쇄된 옥수수에 상단-드레스하고 샘플을 실험실 또는 일광하의 외부 주위 대기에 0, 1, 2, 및 4시간 노출 후 수집하였다. 이러한 실험을 2016년 7월 및 8월의 개월 동안에 걸쳐 4회 반복하였다(도 13). 통계적 분석은 저장 조건 상호작용(P = 0.0007), 노출 시간 효과(P < 0.0001), 및 저장 조건 효과(P < 0.0001)에 의한 노출 시간을 나타내었다. 분쇄된 옥수수와 혼합시키고 실험실에서 대기에 노출된 동결-건조된 생성물내 엠. 엘스데니이 농도는 4시간 노출 동안 수치적으로 감소하였으나 이들의 초기 농도와는 유의적으로 상이하지 않았다. 외부 조건에 노출된 샘플 속의 엠. 엘스데니이 농도는 훨씬 더 신속하게 감소하였다. 1시간 노출 후, 초기에 존재하는 엠. 엘스데니이 중 6.4% 만이 회수되었으며, 외부 조건에 노출된 샘플 속의 엠. 엘스데니이 농도는 초기 농도로부터 및 실온에서 2 및 4시간 노출후 유지된 이들의 대응물과는 유의적으로 상이하였다. 이러한 샘플 속의 엠. 엘스데니이 농도는 큰 표준 편차로 나타낸 바와 같이, 실험마다 매우 다양하였다. 이는 외부 조건(열 및 습도)에서의 차이에 기여할 수 있지만, 또한 열 및 습도에 대해 다소 내성일 수 있는 사용된 동결-건조된 생성물에서의 차이에 의해 기여될 수 있다. 동물 연구 동안에, 사료 공급 직전에 분쇄된 옥수수와 혼합한 후 사료로서 즉시 상단-드레스된 동결-건조된 생성물을 침상에 두었다. 분쇄된 옥수수 및 후속적으로 동결-건조된 생성물에 대해 서두르는 동물은 혼합 후 1시간 미만에 소화하는 것으로 여겨졌다. 생성물이 1시간내에 소화되는 것으로 가정할 때, 동물에게 약 1.4 x 107 CFU/머리/일의 살아있는 세포(상단-드레스 생성물 2.2 x 108 CFU/머리/일내 6.4%의 평균 농도)를 제공하였다.
가속화된 단계적으로 증대되는 엠. 엘스데니이 처리된 거세한 수소는 유사한 28일 체중(P = 0.53; 표 7), 평균 일당증체량(P = 0.71), 및 사료 효율(P = 0.69)을 야기하였다. 상단-드레스 처리는 대조군보다 더 적은 건조물을 섭취하였다(P = 0.05). 제1의 56일의 사료제공에 걸친 가축사육장 성능은 처리 중에서 유사한 결과를 생산하였다(P > 0.10). 보존된 21일 가속화된 단계적으로 증대되는 프로그램을 제공받는 대조군을 사용하여, 가속화된 단계적으로 증대되는 프로그램을 나타내는 처리 중 이러한 유사성은 소 건강 또는 가축사육장 성능에 부정적으로 영향을 미치지 않고 임의의 3개 형태의 엠. 엘스데니이 처리를 사용하여 시행할 수 있다.
반추 유액 pH(제1의 식이를 사료공급 후 26시간째에 추출됨)는 처리 중에서 유사하였다(P > 0.10; 표 8). 다른 처리보다 유의적으로 더 높은 상단-드레스 처리를 사용한 총 VFA 농도에서의 차이가 존재하였다(P < 0.01). 상단 드레스 처리는 재수화된 처리보다 더 높은 아세테이트 농도를 가졌다(P = 0.02). 아세테이트 농도에서 유의적인 차이가 있었지만, 아세테이트:프로피오네이트 비는 처리 중에서 유사하였다(P = 0.96). 다른 VFA는 처리 중에서 유사하였다(P > 0.18).
반추 유액(제1의 식이를 사료공급한 후 26시간째에 추출함) 속의 내독소 농도는 처리 중에서 유사하였다(P = 0.3462; 도 14). 내독소 수준을 반추내에서 세균 분해의 지표로서 측정하였다. 산증을 앓고 있는 동물은 150,000 EU/mL 보다 더 높은 내독소 수준을 갖는 것으로 보고되었다. 본 연구에서 측정된 내독소 수준은 모두 처리와 상관없이 이러한 역치 미만이었다.
32개의 펜(pen) 각각에서 한마리의 거세한 수소에게 56일 연구에 걸쳐 시간마다 반추 pH 측정을 보고한 내재하는 반추 pH 프로브(8마리의 거세한 수소/처리)를 장착하였다(도 15). 각각의 처리에 대한 평균 반추 pH 측정을 도 15에서 1시간 간격으로 보고한다. 일 상호작용에 의한 처리(P < 0.01)를 반추 pH에 대해 검출하였다. 또한, 반추 pH에서 처리(P < 0.01) 및 사료공급 일(P < 0.01)의 효과가 존재하였다. 가속화된 단계적으로 증대하는 엠. 엘스데니이 처리는 평균 반추 pH가 임상 산증의 상태로 감소하도록 하지 않았다. 사료 공급일이 증가하면서, 동결건조된 처리(재수화된 및 상단드레스)는 대조군 및 동결건조되지 않은 처리보다 더 높은 반추 pH를 유지한다.
광학 밀도 측정을 24시간 기간에 걸쳐 6시간 간격으로 관찰하여 반-정의된 락테이트 배지로 접종된 혼합된 반추 미생물의 성장 곡선을 측정하고, 이러한 데이타를 도 16에 나타낸다. 처리와 검출된 시간 사이에 상호작용이 존재하였다(P < 0.02). 처리(P < 0.01) 및 시간(P < 0.01)의 개개 효과가 또한 발견되었다. 재수화된 동결-건조된 것이 동결-건조된 것보다 매일(P < 0.02) 및 대조군(P = 0.007)보다 더 높은 경우, 처리 중에서 차이는 12시간까지 검출되었다. 24시간째에, 엠. 엘스데니이 처리(P > 0.10) 사이에 차이가 없었지만, 대조군 처리는 모든 엠. 엘스데니이 처리보다 유의적으로 적은 미생물 성장을 가졌다(P < 0.01).
도 17은 혼합된 반추 미생물을 접종하고 0, 6, 12, 18, 또는 24시간 동안 항온처리한 반-정의된 락테이트 배지의 L-락테이트 소멸을 나타낸다. 처리와 시간 사이의 상호작용을 처리의 효과(P = 0.01) 및 항온처리 시간(P < 0.0001)의 효과와 함께 검출하였다(P = 0.007). 동결-건조되지 않은 처리는 0시간에 다른 처리보다 L-락테이트를 거의 함유하지 않았다(P = 0.04). L-락테이트의 농도는 6, 12, 및 18-시간 시점에 걸쳐 처리 중 유사하였다(P > 0.10). 상기 언급한 광학 밀도의 결과와 유사하게, 대조군 거세한 수소로부터의 반추 미생물은 24시간 항온처리에 전체적으로 엠. 엘스데니이 처리보다 락테이트를 거의 이용하지 않은 반면(P < 0.003), 엠. 엘스데니이 처리 중에서 차이가 검출되지 않았다(P > 0.10). 이러한 데이타는 엠. 엘스데니이로 처리한 거세한 수소로부터의 반추 미생물은 대조군 거세한 수소로부터의 것보다 반-정의된 락테이트 배지에서 보다 효율적으로 성장하였으며, 이는 이러한 처리에서 젖산 활용에 대해 보다 큰 능력을 시사한다. 또한, 메가스파에라 처리는 L-젖산의 활용에 대한 능력과 관련하여 유사하였다.
VFA 농도를 광학 밀도 및 락테이트 소멸 검정에 사용된 샘플에서 측정하고 표 9에 나타낸다. 총 VFA(P = 0.002), 아세테이트(P = 0.0002), 이소부티레이트(P = 0.04), 부티레이트(P < 0.0001), 이소발러레이트(P = 0.0007), 및 발러레이트(P < 0.0001)의 농도뿐만 아니라, 아세테이트 : 프로피오네이트 비(P = 0.02)에 대해 검출된 시간 상호작용에 의한 처리가 존재하였다. 시간의 효과는 총 VFA 및 모든 개개 VFA(P < 0.0001)에 대해 밝혀졌다. 치료 중 차이는 이소부티레이트(P = 0.02), 부티레이트(P = 0.0004), 및 발러레이트(P = 0.001)에 대해 발견되었다. 이소부티레이트의 농도는 대조군 및 재수화된 것과 비교하는 경우 동결-건조되지 않은 및 상단 드레스 처리 그룹(각각 P < 0.005 및 P < 0.004)에 대해 18시간째에 더 낮았다. 24시간 시점에서 상단-드레스는 동결-건조되지 않은 및 재수화된 처리보다 이소부티레이트가 거의 없었지만(P = 0.002) 대조군과 유사하였다(P > 0.10). 재수화된 샘플의 부티레이트 농도는 18시간 항온처리 후 상단-드레스의 것보다 더 높았다(P = 0.02). 대조군 처리는 엘. 에스데니이 처리보다 24시간내에 부티레이트를 더 적게 생산하였다(P < 0.0001). 부티레이트에 있어서의 차이는 또한 재수화된 처리보다 더 높은 농도를 함유하는 동결-건조되지 않은 샘플을 사용한 시점에서 메가스파에라 처리 중에서 검출되었다(P = 0.01). 18 시간은 다른 처리와 비교하는 경우 재수화된 것에 대해 더 낮은 말러레이트 농도를 나타내었다(P = 0.01). 유사한 관찰이 24시간의 항온처리시 발러레이트 및 부티레이트 농도에 대해 이루어졌다. 대조군은 모든 엠. 엘스데니이 처리보다 발러레이트를 더 적게 함유하였지만(P < 0.0001), 농도는 재수화된 것보다 동결-건조되지 않은 샘플에서 더 높았다(P = 0.03). 다른 VFA에 대해 주요 처리 효과는 관찰되지 않았다(P > 0.05). 무시할만한 농도의 이소카프로에이트, 카프로에이트, 및 헵타노에이트를 측정하였다. 처리 x 시간 상호작용(P = 0.02)은 아세테이트:프로피오네이트 비 뿐만 아니라 시간의 효과에 대해서도 발견되었지만(P > 0.0001), 처리 사이에서 유사하였다(P = 0.57).
실시예 6
메가스파에라 엘스데니이의 피타아제 활성
엠. 엘스데니이 세포의 시험관내 피타아제 활성을 평가하였다.
메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 41125 세포를 본원에 기술한 바와 같은 혐기성 조건 하에서 무기 포스페이트(KH2PO4) 또는 피테이트를 인 공급원으로서 함유하는 반-정의된 락테이트 배지 속에서 배양하였다. 배양 개시(0 시간)로부터 8시간까지 2시간 간격째에, 1 밀리리터(mL) 샘플을 배양물로부터 제거하고 원심분리하여 세포 펠렛을 형성시켰다. 이후에 세포 펠렛 속의 피타아제 활성은 몰리브데이트 블루 방법(Molybdate blue method)을 사용하여 측정하였다. 참고: Yanke et al., Microbiol. 144: 1565-1573 (1998). 요약하면, 37℃에서 pH 5.0에서 30분 항온처리내 효소 절단에 의해 방출된 무기 포스페이트를 700 나노미터(nm)에서 분광광도계로 정량화하고 표준 곡선과 비교하였다. 피타아제 활성을 시험 조건 하에서 분당 세포 펠렛으로부터 방출된 무기 인의 양으로서 측정하였다.
도 18은 피타아제의 존재 또는 부재하에서 메가스파에라 엘스데니이 세포의 성장은 유의적인 피타아제 활성을 생성하였음을 나타내며, 이는: (1) 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 41125 세포가 피타아제를 생산하고, (2) 피타아제 생산은 배지 속에서 인의 존재에 의해 억제되지 않으며, (3) 메가스파에라 엘스데니이에 의한 피타아제 생산은 배지 속의 피테이트의 존재하에서 더 큰 것으로 나타남을 입증한다.
실시예 7
살모넬라 농도 및 유병률(prevalence)에 있어서 메가스파에라 엘스데니이의 효과
1일된 구이용 닭(n=384)을 4개의 상이한 처리 그룹으로 무작위로 할당하였다: 1) 메가스파에라를 제공받지 않는 대조군 그룹, 2) 액체 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 41125를 함유하는 병 먹이통에 자유로이 접근하는 임의의 그룹, 3) 이들의 사료에 동결-건조된 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 41125를 매일 제공받는 동결-건조된 그룹, 및 4) 0일째에 액체 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 41125를 제공받는 경구 위관영양 그룹.
각각의 4개 처리를 각각 6마리의 새를 포함하는 16개의 케이지로 나타낸다. 동물 체중, 사료 소비, 및 사료 요구율을 15일의 시험 기간에 걸쳐 기록하였다. 15일의 사료공급 기간 후, 케이지당 2마리의 동물을 무작위로 선택하고, 도축하고, 맹장을 회수하여 살모넬라 유병률을 측정하였다. 요약하면, 맹장을 회수하여, 지플록 백(Ziploc bag)에 넣고, 빙상에 저장하였다. 맹장을 70% 에탄올로 세척하고 손으로 맛사지하여 성분을 추출하였다. 1 밀리리터의 회수된 성분을 인산염 완충액 염수 용액(PBS) 속에 일련 희석시키고 브릴리언트 그린 한천(brilliant green agar: BGA)에 둔다. BGA 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 항온처리하였다. 추정상 살모넬라 콜로니(핑크색 콜로니)를 계수하고 옥소이드 살모넬라 라텍스 시험(Oxoid Salmonella latex test) FT0203(Oxoid-Thermo Scientific, 영국 햄스셔 소재)을 사용하여 살모넬라로서 확인하였다. 추가로, 1 밀리리터의 맹장 성분 샘플을 9 mL의 라파포트-바실리아디스(Rappaport-Vassiliadis: RV)에 선택적인 농축을 위해 가하였다. 검출가능한 살모넬라 성장이 BGA 플레이트에서 관찰되지 않은 경우, RV 농축물을 BGA 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 24시간 동안 항온처리하고, 살모넬라의 존재에 대해 평가하였다. 직접적인 플레이팅으로 성장하지 않지만, RV 농축으로 양성적으로 성장하는 샘플에 9의 임의의 수를 부여하고(이론적 검출 한계 미만의 1) 직접적인 플레이팅 또는 RV 농축시 성장하지 않는 샘플에 0의 수를 부여하였다.
결과는 동결-건조된 물질을 제공받은 새가 대조군 그룹과 비교하여 -1 Log의 차이까지 밀리리터당 콜로니 형성 단위(CFU/mL)의 수에 있어서 더 낮은 맹장 살모넬라 농도를 가졌음을 나타내었다. 참고: 도 19. 동결-건조된 그룹의 샘플내 살모넬라의 유병률은 또한 대조군 그룹과 비교하는 경우 13%까지 감소하였다. 참고: 도 20.
실시예 8
구이용 닭의 성장 능력 및 맹장 특성에 있어서 메가스파에라 엘스데니이의 효과
A. 실험 설계 및 처리
1일된 수컷을 사용하여 무작위처리된 완전 블록 설계에서 3회 처리의 24회 반복을 처리 개시에 1일된 Cobb 500 구이용 닭을 사용하여 수행하였다(Cobb-Vantress in Siloam Springs, Arkansas). 처리는 경구 위관영양법 또는 조류의 체표면에 적용된 에어로졸화된 미스트로서 투여된 엠. 엘스데니이 균주 NCIMB 41125, 및 대조군(엠. 엘스데니이 없음)이었다. 조류를 72 펜내에 가두었으며, 각각의 펜은 실험 개시에 35마리의 조류를 함유하였다(총 2,520마리의 조류).
엠. 엘스데니이의 투여 전, 신선한 배양물의 5L의 호일 백을 격렬하게 진탕시켜 성분을 균질화하였다. 타이곤 관(Tygon tubing)을 사용하여 손으로 실시된 투여 장치를 백에 연결시켰다. 투여 장치의 저장기(reservoir)를 반복적으로 채우고 수회 분배하여 공기를 뺏다. 성분은 산소 지시인자를 함유하는 배양물이 이의 정상적인 색상을 보유한 경우, 주위 공기가 없는 것으로 여겨졌다.
닭을 35개의 그룹으로 배분하고, 각각의 그룹의 체중을 기록하였다. 조류의 그룹을 각각의 블록내에 무작위로 지정된 실험 처리로, 블록에 의해 가공하였다.
24개 펜(35마리의 조류/펜; 총 840마리의 조류)에 1.97 x 109 CFU/mL의 엠. 엘스데니이 균주 NCIMB 41125를 함유하는 0.2mL의 신선한 배양물을 경구 위관영양법으로 Scorex Classic 173.05005 자동-충전 주사기(auto-filling syringe)(Ecublens, 스위스)를 사용하여 투여하였다. 기술자들은 엄지손가락과 검지손가락을 사용하여 부리를 개방한 채로 새를 구속시키면서 주사기의 성분을 조류의 구강에 직접 배출시켰다.
24개 펜(35마리의 조류/펜; 총 840마리의 조류)에 1.97 x 109 CFU/mL의 엠. 엘스데니이 균주 NCIMB 41125를 함유하는 신선한 배양물의 에어로졸화된 미스트를 분무 팁이 장착된 공기압 드렌칭 장치(pneumatic drenching device)에 의해 적용시켜 투여하였다. 조류를 플라스틱 터브(plastic tub)(50 cm x 35 cm x 40 cm)에 두고 배양물을 펜당 60mL의 용적에서 분무된 미스트로서 이들의 체표면에 적용시켰다(~1.7 mL/조류).
24개의 펜(35마리의 조류/펜; 총 840마리의 조류)을 엠. 엘스데니이와 접촉시키지 않고 대조군으로서 제공하였다. 처리된 조류와의 교차 오염을 방지하기 위하여, 대조군 조류를 처리한 조류와 접촉하지 않고 칭량되어 펜으로 이동될 지정된 캐리어 내에 있는 지정된 개인만이 취급하였다. 하나의 경우에 조류를 잘못 세고 펜 51에 기술적 오류로 인하여 35마리의 조류보다는 33마리의 조류를 제공하였다.
B. 사료 공급 및 물 공급
신선한 물을 물 공급 라인으로부터 현탁된 시퍼(sipper)(6개의 시퍼/펜)를 통해 자유로이 공급하였다. 시퍼 높이를 시험 전체에서 조절하여 조류의 성장을 도모하였다. 하기 표 10은 실험에서 사용된 식이를 나타낸다. 모든 식이는 펜의 중심에 현탁된 중력 공급기(gravity feeder)로 공급하였다. 사료를 필요할 경우 가하여 연구 동안 전체에서 임의로 접근하도록 보장하였다. 5kg의 개시 식이를 펜에서 조류를 두기 전에 중력 공급기에 두었다.
개시 식이를 펜으로부터 연구 16일째에 제거하였다. 잔류 사료를 칭량하고, 각각의 모이통으로부터 제거하고, 펜 번호에 상응하는 번호매긴 통내에 두었다. 모이통을 성장 식이로 다시 채웠다. 이 공정을 성장 식이를 최종 식이로 교체하는 시간인, 연구 30일째에 반복하였다. 36일째에 실험을 종결하고, 잔류 종결 식이를 칭량하고 각각의 펜에 대해 기록하였다.
각각의 상(개시, 성장, 및 종결)에 대해 펜당 총 사료 소비를 다음과 같이 계산하였다: 가해진 사료 - 회수된 사료.
일당 조류당 섭취를 다음과 같이 계산하였다: 소비된 총 사료 ÷ [펜당 1일 머리 수 x 사료공급 총 일수]
C. 조류 체중
펜 체중을 각각의 사료공급 기간 말기에 기록하였다(개시, 성장, 종결). 개시 시기(16일째)의 말기에, 각각의 펜내 모든 조류를 터브(tub)(50 cm x 35 cm x 40 cm)내로 두고 칭량하였다. 터브의 중량을 총 중량으로부터 감하여 펜내 조류의 중량을 측정하였다. 성장기(30일)의 말기에, 각각의 펜내 모든 조류를 동일한 중량의 2개 터브(각각 103 cm x 55 cm x 41 cm)내에 두고, 칭량하고, 중량을 함께 가하였다. 각각의 터브의 중량(조류를 이들 내에 두기 전에 취함)을 총 중량으로부터 감하여 펜내 조류의 중량을 측정하였다. 종결기(36일째)의 말기에, 각각의 펜내 모든 조류를 동일한 중량의 2개 터브(각각 103 cm x 55 cm x 41 cm)내에 두고 칭량하였다. 이번에는, 스케일(scale)은 터브를 제자리에 놓고 무게를 측정하였다. 각각의 터브 속의 조류의 중량을 이후에 가하고 총 펜 중량을 측정하였다. 배설물 축적을 설명하기 위해 펜 사이에서 스케일을 다시 조정하였다. 각각의 칭량 기간에, 조류가 터브 속에 위치하면 머리 수 검증을 수행하였다.
D. 샘플링 과정
각각의 주(7, 14, 21, 28 및 35일)에, 1 내지 3마리의 새를 각각의 펜으로부터 무작위로 선택하고 경부 탈구로 희생시켰다. 맹장 성분(0.5 g)을 수집하고 탈이온수(2 mL)와 20 mL의 HDPE 신틸레이션 바이알(Fisher Sci.; 03-337-23B) 속에서 와동 혼합기를 사용하여 혼합하였다. 이동가능한 pH 미터(Thermo Scientific Orion 3-star 이동가능한 pH 미터, 매사츄세츠주 왈탐 소재)를 사용하여 pH를 측정하였다. 맹장 혼합물의 4개의 부분을 1 부분의 25% w/v 메타인산 용액에 가하고 와동 혼합기를 사용하여 균질화하였다. 이후에 샘플을 2개의 미세원심분리 튜브내에 1-mL 분취량으로 이동시키고 -18℃에서 동결시켜 휘발성 지방산(VFA)의 분석을 기다렸다.
7 및 21일째에, 맹장 성분을 2개의 분취량으로 분할하였다. 1 분취량을 VFA 분석에 대해 사용하여 상기 설명한 바와 같이 제조하였다. 다른 것(0.5 g)을 직접 별개의 20-mL HDPE 신틸레이션 바이알(Fisher Sci.; 03-337-23B)내에 두고 정량적인, 실시간 PCR을 사용하여 세균 수를 정량화하기 위해 동결시켰다(-80℃).
E. 맹장 pH 및 휘발성 지방산의 분석
앞서 희석되고 산성화된 맹장 샘플을 해동시키고, 와동 혼합기를 사용하여 균질화시키고 24 xg에서 18분 동안 원심분리하였다. 수성 상층액을 가스 크로마토그래피 바이알로 이동시켰다. 휘발성 지방산을 DB-WAX 모세관 컬럼(30 m x 0.53 mm x 0.5 mm 필름 두께; Sigma Aldrich, 미주리주 세인트 루이스 소재) 및 불꽃 이온화 검출기가 장착된 Agilent 7890 가스 크로마토그래피(Agilent Technologies, 캘리포니아주 산타 클라라 소재)를 사용하여 측정하였다. 헬륨을 담체 가스로서 22 cm/s의 유동 속도에서, 1-μL 분할 주입 및 50:1의 분류(split flow)와 함께 사용하였다. 초기 오븐 온도는 80℃이었고 온도는 10℃/분으로 220℃까지 증가하였다. 투입구 및 검출기 온도는 80℃이었고 온도는 10℃/min에서 220℃로 증가시켰다. 투입 및 검출기 온도는 250℃이었다. 휘발성 지방산은 아세테이트, 프로피오네이트, 이소부티레이트, 부티레이트, 이소발러레이트, 발러레이트, 이소카프로에이트, 카프로에이트 및 헵타노에이트를 함유하는 알려진 표준물(Supelco 휘발성 지방산 표준 혼합물(Volatile Fatty Acid Standard Mix); Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트 루이스 소재)과 비교함으로써 정량화하였다.
F. 사체 측정
조류를 5주령째에 도축하여 사체 측정을 측정하였다. 사료는 도축하기 대략 4시간 전에 주지 않았다. 5마리의 평균 크기의 조류를 각각의 펜으로부터 선택하고 가공 구역으로 수송하기 위한 캐치 박스(catch boxe)내에 두었다. 5마리의 조류를 기절시켜 방혈함으로써 펜으로 칭량하여 도축 직전 살아있는 중량을 측정하였다. 조류를 2분 동안 방혈시킨 후 회전 스캘더(rotary scalder)에 63℃에서 대략 30초 동안 두었다. 조류를 털 제거를 위해 회전 드럼 기계 플럭커(rotary drum mechanical plucker)에 30초 동안 이동시켰다. 발, 머리 및 정강이를 제거하고 사체를 겨드랑이 주변을 절개하여 내장을 제거하였다. 이후에 사체를 펜으로 칭량하여 더운 사체 수율을 측정하였다.
G. 통계적 분석
데이타를 SAS® 소프트웨어버젼 9.4의 혼합 과정을 사용하여 분석하였다. 모델은 고정된 처리 효과, 무작위 차단 효과, 및 실험 단위로서의 펜을 포함하였다. 유의성은 P < 0.05에서 나타내었다. 최소제곱법 평균(least-squares means) 중에서의 차이는 SAS® 소프트웨어의 PDiff 선택사항을 사용하여 측정하였다.
H. 결과
구이용 영계는 처리에 걸쳐 유사한 사료 섭취, 사료 효율, 및 평균 일당증체량을 입증하였다. 조류 중량 및 폐사율은 또한 처리에 영향받지 않았다. 그러나, 드레스된 수율(dressed yield)은 분무화된 미스트로서 엠. 엘스데니이를 제공받은 조류 또는 대조군 조류와 비교하여 경구 위관영양으로서 엠. 엘스데니이를 제공받은 조류의 경우 더 적었다.
맹장 pH는 대조군 조류의 것과 비교하여, 미스트 또는 경구 적용에 의해 엠. 엘스데니이를 제공받은 조류에서는 더 적었다(P < 0.01; 표 11).
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대조군, 분무화된 미스트, 및 경구 위관영양 처리에 대한 평균 맹장 pH는 각각 6.76, 6.63, 및 6.60이었다. 일 수 상호작용에 의한 처리는 맹장 아세테이트(P < 0.01), 프로피오네이트(P = 0.03), 부티레이트(P < 0.01), 아세테이트: 프로피오네이트 비(P = 0.01; A : P 비), 카프로에이트(P = 0.002) 및 총 VFA(P < 0.01) 농도에 대해 검출하였다(표 4). 아세테이트는 7일 내지 14일까지 증가하여, 14일째에 최대였다. 경구 위관영양으로서 엠. 엘스데니이를 제공받은 조류의 맹장 성분은 14일째에 대조군 조류의 것보다 더 많은 아세테이트, 부티레이트, 및 카프로에이트 농도를 함유하였다(P < 0.01). 21일까지, 아세테이트 농도는 모든 처리에 걸쳐 감소하였지만; 맹장내 아세테이트의 농도는 분무화된 미스트 또는 경구 위관영양으로 처리한 조류와 비교하여 대조군 조류에서 더 컷다(P < 0.01). 프로피오네이트 및 부티레이트 농도는 또한 21일째에 엠. 엘스데니이로 처리한 조류의 것보다 대조군 조류의 맹장 성분에서 더 컷다(P < 0.01). 프로피오네이트 농도는 모든 처리에서 21일째에 최대였고 35일까지 상승하여 남았지만 이들은 28일 내지 35일의 처리에 걸쳐 상이하지 않았다(P > 0.05). A : P 비는 7일째의 대조군과 비교하여 엠. 엘스데니이로 처리한 조류의 맹장 성분 속에서 더 컷으며(P < 0.01), 대조군, 분무화된 미스트 및 경구 위관영양의 경우 A:P 비는 각각 31.96, 41.33 및 42.03이었다. 14일째에 엠. 엘스데니이(40.44 mM)의 분무화된 미스트로 처리한 보류의 A:P 비는 대조군 조류의 것(29.80 mM) 또는 엠. 엘스데니이의 경구 위관영양을 받는 것(33.69; P < 0.03)보다 더 컷다. 맹장 A: P 비는 21일 내지 35일에 처리에 걸쳐 상이하지 않았다(P > 0.05). 맹장 성분내 이소부티레이트, 발러레이트, 이소발러레이트, 이소카프로레이트 및 헵타노에이트 농도는 처리에 의해 영향받지 않았다(P > 0.10). 총 맹장 VFA 농도는 14일째에 대조군 조류와 비교하여 경구적으로 위관영양된 조류에서 더 컷다(P < 0.001). 그러나, 총 VFA 농도는 21일째에 대조군의 것(87.57 mM)과 비교하여 분무화된 미스트 또는 경구 위관영양으로서 엠. 엘스데니이를 제공받은 조류의 맹장 성분내에서 더 적었다(각각 64.90 mM 및 64.82 mM). 총 맹장 VFA 농도는 7, 28, 및 35일 동안의 처리에 걸쳐 유사하였다(P > 0.30).
실시예 9
구이용 닭의 성장 능력에 있어서 메가스파에라 엘스데니이의 효과
A. 실험 설계 및 처리-연구 1
배터리 및 티어(tier)에 의해 차단된, 6회 처리의 18회 반복을 처리 개시에 1일된 Cobb 500 구이용 영계(Cobb-Vantress in Siloam Springs, 아칸사스 소재)를 사용하여 수행하였다. 처리는 대조군(프로바이오틱 없음), 경구 위관영양으로서 투여된 락티프로(Lactipro) Advance® (메가스파에라 엘스데니이 균주 NCIMB 41125의 동결-건조되지 않은 액체 배양물, MS Biotec, 캔사스주 와메고(Wame해) 소재), 경구 위관영양으로서 투여된 메가스파에라 엘스데니이 균주 KS 249 배양물, 경구 위관영양으로서 투여된 메가스파에라 엘스데니이 균주 ATCC® 25940, 에어로졸로서 조류의 체 표면에 적용된 Lactipro Advance®(메가스파에라 엘스데니이 균주 NCIMB 41125의 동결-건조되지 않는 액체 배양물, MS Biotec, 캔사스주 와메고 소재), 및 동결-건조된 메가스파에라 엘스데니이 균주 NCIMB 41125(MS Biotec, Wamego, Kansas)이었다. 조류를 108 펜에 가두고, 각각의 펜은 실험 초기에 8마리의 조류를 함유하였다(1,152마리의 총 조류).
조류를 8개 그룹으로 계수하고, 각각의 그룹의 중량을 기록하였다. 조류의 그룹을 블록으로서 가공하고, 실험적 처리를 각각의 블록내에서 펜에 무작위로 할당하였다.
18개의 펜(8마리의 조류/펜; 총 144마리의 조류)을 1.97 x 109 CFU/mL의 메가스파에라 엘스데니이 균주 NCIMB 41125의 동결건조되지 않은 액체 배양물을 함유하는 0.2 mL의 Lactipro Advance®로 경구(위관영양)적으로 투여하였다. 이러한 균주에 대해 CFU/mL를 평가하기 위한 시도는 성공적이지 않았다. 18개의 펜(8마리의 조류/펜; 총 144마리의 조류)의 메가스파에라 엘스데니이의 공지되지 않은 농도의 메가스파에라 엘스데이를 함유하는 0.2 mL의 신규한 균주로 경구적으로(위관영양) 투여하였다. 18개의 펜(8마리의 조류/펜; 총 144마리의 조류)에 1.06 x 109 CFU/mL의 메가스파에라 엘스데니이 균주 ATCC® 25940을 함유하는 신성한 배양물 0.2mL를 경구적으로(위관영양) 투여하였다. 모든 경구 투여를 사용하여 투여한 조류는 기술자의 손바닥내에 감금시키고, 부리를 엄지손가락과 검지로 열어 유지시키고, 배양물을 Eppendorf® 참고 리피터 피펫(Reference repeater pipette)(독일 함부르크 소재)을 사용하여 구강내로 직접 방출하였다.
18개의 펜(8마리의 조류/펜; 총 144마리의 조류)에 1.97 x109 CFU/mL의 메가스파에라 엘스데니이 균주 NCIMB 41125(~1.88 mL/조류)를 함유하는 펜당 15 mL의 Lactipro Advance®로 미스트처리하였다. 조류를 플라스틱 터브(50 cm의 길이 x 35 cm의 너비, x 40 cm의 깊이) 속에 두고, 배양물을 미립화 팁이 장착된 유압 드렌칭 장치(pneumatic drenching device)를 사용하여 미립화된 미스트로서 조류의 체표면에 적용하였다. 미스트처리된 조류를 설계한 개인이 취급하고 칭량, 적용 및 펜으로 이동을 위한 지정된 캐리어(carrier) 속에 두어 교차-오염을 최소화하였다.
18개의 펜(8마리의 조류/펜; 총 144마리의 조류)을 조류당 1/4 티스픈(teaspoon)의 비율로 1.18 x 107 CFU/g의 메가스파에라 엘스데니이 균주 NCIMB 41125를 함유하는 상단드레싱(식이 및 동결-건조된 메가스파에라 엘스데니이의 혼합물)을 제공하였다. 처리는 연구 10일째에 시작하여 1300 시간에 매일 홈통(trough feeder)에 직접 가하였다.
나머지 18개의 펜(8마리의 조류/펜; 총 144마리의 조류)을 대조군으로서 제공하였으며 프로바이오틱 생성물과 접촉시키지 않았다. 대조군 조류를 지정된 사람이 취급하여 칭량 및 펜으로의 이동을 위해 지정된 캐리어 내에 두어 처리된 조류에 의한 교차-오염을 최소화하였다.
B. 실험 설계 및 처리 - 연구 2
배터리 및 티어에 의해 차단된, 2회 처리의 18회 반복을 1일령의 Cobb 500 구이용 병아리(Cobb-Vantress in Siloam Springs, 아칸사스)를 사용하여 수행하였다. 처리는 대조군(프로바이오틱 없음) 또는 동결-건조된 메가스파에라 엘스데니이 균주 NCIMB 41125(MS Biotec, 캔사스주 와메고 소재)이었다. 조류를 108개 펜에 가두고, 각각의 펜은 실험 초기에 8마리의 조류를 함유하였다(총 1,152마리의 조류).
조류를 8개 그룹으로 계수하고, 각각의 그룹의 중량을 기록하였다. 조류를 블록으로 가공하고, 실험 처리는 각각의 블록내 펜에 무작위로 지정하였다. 18개의 펜(8마리의 조류/펜; 총 144마리의 조류)를 조류당 1/4 티스픈의 비율에서 1.18 x 107 CFU/g의 메가스파에라 엘스데니이 균주 NCIMB 41125를 함유하는 상단 드레싱(식이 및 동결-건조된 메가스파에라 엘스데니이의 혼합물)을 제공하였다. 처리는 연구 10일째에 시작하여 1300 시간에 매일 홈통에 직접 가하였다.
나머지 18개의 펜(8마리의 조류/펜; 총 144마리의 조류)을 대조군으로서 제공하였으며, 프로바이오틱 생성물과 접촉시키지 않았다. 대조군 조류를 지정된 사람이 취급하여 칭량 및 펜으로의 이동을 위해 설계된 캐리어 내에 두어 처리된 조류에 의한 교차-오염을 최소화하였다.
C. 사료 공급 및 물 공급 - 연구 1 및 2
신선한 물은 임의로 이용가능하였다. 조류를 펜 속에 두기 전에, 9.5 kg의 일반적인 개시 식이(표 12)를 각각의 펜의 옆의 홈통에 두었다.
사료를 필요한 경우 보충하여 연구 전체에서 임으로 접근하도록 보증하였다. 실험의 종결시(18일째), 소비되지 않은 사료를 각각의 먹이통으로부터 제거하고, 칭량하여, 기록하였다. 펜에 의해 소비된 총 사료를 먹이통에 가해진 양과 이로부터 회수된 양 사이의 차이로서 계산하였다. 조류당 1일 사료 섭취는 다음과 같이 계산하였다: 소비된 총 사료 ÷ [펜당 1일 머리 수 x 사료제공 총 일 수]
D. 조류 중량 - 연구 1 및 2
연구의 결론시, 펜에서 모든 조류를 터브(50 cm 길이 x 35 cm 너비, x 40 cm 깊이)에 두고 칭량하였다. 조류를 이 곳에 넣기 전에 터브의 중량을 재고 총 중량으로부터 감하여 펜내 조류의 중량을 확인하였다. 머리 수 확인을 이때 또한 수행하였다.
E. 통계적 분석 - 연구 1 및 2
데이타를 SAS® 소프트웨어 9.4의 혼합 과정을 사용하여 분석하였다. 모델은 고정된 처리 효과, 블록의 무작위 효과, 및 실험 단위로서의 펜을 포함하였다. 유의성은 P < 0.05에서 나타내었다. 최소제곱법 평균 중에서의 차이를 SAS® 소프트웨어의 PDiff 선택사항을 사용하여 측정하였다.
F. 결과 - 연구 1 및 2
연구 1의 경우, 모든 처리 그룹에 걸쳐 구이용 영계는 유사한 1일 사료 섭취, 평균 일당증체량, 중량획득:사료, 및 폐사율을 나타내었다.
그러나, 표 13에 나타낸 바와 같이, 연구 2는 평균 일당증체량(P = 0.02) 및 중량획득:사료(P = 0.04)가 대조군 조류와 비교하여 동결-건조된 메가스파에라 엘스데니이를 제공받은 조류에서 둘 다 더 컸음을 나타내었다. 사료:중량비를 나타내는 도 21을 또한 참고한다. 사료 섭취 및 폐사율은 처리 그룹 중에서 상이하지 않았다.
실시예 10
말류 맹장 발효에서 메가스파에라 엘스데니이의 효과
A. 실험 설계 및 처리
미리 맹장 캐뉼라(cecal cannulae)로 고정시킨 8마리의 단거리 경주말(Quarter horse), 4마리의 수컷 및 4마리의 거세말(평균 체중 = 540 kg; SEM = 75 kg)(Beard et al., JAS 89(8): 2425-2429 (2011))을 3회 처리 기간에 걸쳐 반복된 3 x 3(처리 x 말)의 불완전한 라틴 방진(Latin Square)에서 사용하였다. 각각의 처리 기간은 28-일 세척 기간으로 분리하였다. 처리는 (1) 음성 대조군(엠. 엘스데니이 없음; 대조군), (2) 1.97 x 109 CFU/mL의 엠. 엘스데니이 균주 NCIMB 41125 (Lactipro Advance®, MS Biotec, 캔사스주 와메고 소재)를 함유하는 50 mL의 신선한 배양물을 경구 드렌치(Drench)를 통해 투여하고, (3) 7.02 x 108 CFU/mL의 엠. 엘스데니이 균주 NCIMB 41125(MS Biotec, 캔사스주 와메고 소재)를 함유하는 0.40 g의 동결-건조된 배양물을 2 몰라세스-기반 말 처리기(동결-건조된)를 통해 투여하였다. 말을 처리에 무작위로 지정하였다(표 14).
말을 하나의 헛간내 개개 마굿간(3.05 x 3.66 m)에 가두고 소나무 대팻밥으로 침상을 만들었다. 말을 각각의 처리 기간 동안 상이한 마굿간에 무작위로 지정하여 헛간내 위치를 기반으로 통풍 또는 온도에 있어서 임의의 가능한 변화에 대해 고려하였다. 말을 처리 기간 동안 매일 걷도록 하였다.
경구 드렌치를 매 처리 기간 1일째에 사료공급 직전 1.97 x 109 CFU/mL의 엠. 엘스데니이 균주 NCIMB 41125를 함유하는 50 mL의 신선한 배양물을 수동으로 실시하는 투여 장치(60 mL 가변성 자동 드렌처(Variable Automatic Drencher) MKIII, NJ Phillips, 오스트레일리아 NSW)를 사용하여 투여하였다. 프로바이오틱 배양물의 투여 전에, 5L 백의 신선한 배양물을 격렬하게 진탕시켜 내용물을 균질화하였다. 수동으로 실시된 투여 장치를 백에 타이곤 관(Tygon tubing)을 사용하여 부착시키고 저장기를 충전시켰다. 대략 100 내지 200 mL의 배양물을 폐기 용기내로 버려서 관 및 장치 둘 다에서 산소를 고갈시킬 수 있도록 하였다.
동결-건조된 프로바이오틱 처리 그룹에서 말에게 각각의 사료공급 날 아침 전에 동결-건조된 생성물을 함유하는 2회의 옥수수 및 몰라세스 기반 처리를 제공하였다. 엠. 엘스데니이 균주 NCIMB 4112는 연구에 앞서 동결-건조시켜 평균 7.02 x 108 CFU/mL의 엠. 엘스데니이를 지닌 약 0.40 g의 동결-건조된 세균을 각각 함유하는 진공 밀봉된 포켓에 패키지하였다. 하나의 샘플을 각 날에 플레이팅하여 각각의 처리 기간을 통해 일관된 세균 생존능을 보증하였다. 말이 처리를 거부하면, 동결-건조된 생성물을 거환으로서 손으로 투여하였다.
나머지 말은 이들이 대조군으로서 제공되는 기간 동안 프로바이오틱에 노출시키지 않았다.
B. 사료 및 물 공급
처리 기간 동안, 말에게 매일 2회 건초 및 2회의 사료공급 사이에 균일하게 분할한 농축물을 공급하였다. 각각의 말은 1일당 참새귀리 건초(brome hay)로 공급된 것으로서 이의 체중의 1%를 공급하였다(표 15).
각각의 말을 1 내지 5일 동안 1일당 이의 체중의 0.2%의 비율에서 질감이 있는 농축물(상기 표 15에 분석, 하기 표 16에 조성물)을 이의 체중의 1%까지 단계별로 증가시킨 후 5일 내지 7일 동안 낟알 중 1% BW AF에서 유지시켰다. 모든 거부물을 칭량하고 기록하였다. 마굿간에 자동 물공급기를 장착하여 신선한 물을 임의로 공급하였다. 급수기를 세정하고 1일당 수회 적절한 기능을 위해 점검하였다.
세척 기간 동안 말을 사내 사육장에 가두고 임의로 참새귀리 건조 식이로 유지시켰다(표 **). 말을 각각의 세척 기간 말기에 칭량하여 처리 기간 동안 제공된 양의 정밀한 계산을 보증하였다.
C. 샘플링 과정
맹장 샘플을 각각 7일의 기간 동안 4시간마다 맹장 캐뉼라를 통해 수집하였다. 말에게 1000시간 및 2200시간째에 매일 제공하고 샘플을 후속적인 사료공급 전에 사료공급 후 4, 8 및 12시간째에 수집하였다. 각각의 처리 기간의 0일째에, 샘플을 투여 또는 사료공급 전에 수집하여 후장(hindgut) 속의 pH, VFA 및 엠. 엘스데니이 집단의 기본 값을 확립하였다.
샘플을 캐뉼라 캡을 제거하고 맹장 성분이 캐뉼라로 유동될때 이를 포획하여 수집하였다. 맹장 유액을 4개 층의 치즈직포(cheesecloth)를 통해 걸러낸 후, 100-mL의 표본 컵에 두었다. 충분한 샘플이 중력 유동을 통해 수집되지 않은 경우, 포켓용 펌프를 사용하여 맹장 성분을 추출하였다. 0, 1, 3 및 7일에 1000시간째에, 추가의 맹장 샘플을 PCR 분석을 위해 수집하였다. 제1의 처리 기간 동안, 여과되지 않은 샘플을 20-mL의 HDPE 신틸레이션 바이알(Fischer Sci.; 03-337-23B) 속에 수집하였다. 이러한 여과되지 않은 샘플을 DNA 추출을 위해 샘플을 분리하는데 있어서 챌린지에 제기하여, 나머지 2회 처리 기간 동안 걸러진 맹장 유액을 50-mL의 팔콘 원추형 원심분리 튜브(Falcon conical centrifuge tube)(Corning Inc. 352070; Corning, 뉴욕주 소재)에 수집하고 -80℃에서 즉시 동결시켜 PCR 분석을 기다렸다. 기술자는 각각의 말들 사이에서 장갑을 교체하였다.
D. 맹장 pH 및 휘발성 지방산의 분석
걸러진 맹장 유액의 pH를 휴대용 pH 측정기(Thermo Scientific Orion 3 Star 휴대용 pH 측정기, 매사츄세츠주 왈탐 소재; Accumet probe)를 사용하여 수집한 직후에 측정하였다. pH를 기록한 후, 샘플을 1 mL의 분취량으로 2개의 미세원심분리 튜브에 이동시키고 0.25 mL의 단백질제거용 25% 메타-인산과 혼합하였다. 샘플을 -18℃에서 적어도 24시간 동안 VFA 분석 전에 동결시켰다.
산성화된 및 동결된 맹장 샘플을 해동시키고 와동 혼합기를 사용하여 균질화하고 24 x g에서 18분 동안 원심분리하였다. 이후에 수성 상층액을 가스 크로마토그래피 바이알로 이동시켰다. 휘발성 지방산을 DB-WAX 모세관 컬럼(10 mm x 0.10 mm x 0.1 mm 필름 두께; Agilent 및 J&W 컬럼, 캘리포니아주 산타 클라라 소재) 및 화염 이온화 검출기가 장착된 Agilent 7890 가스 크로마토그래프(Agilent Technologies, 캘리포니아주 산타 클라라 소재)를 사용하여 측정하였다. 수소를 캐리어 가스로서 46 cm/초의 유동 속도에서, 1-μL 분할 주입 및 분할 유동 50:1로 사용하였다. 초기 오븐 온도는 70℃이고 온도는 15℃/분으로 130℃까지 증가시킨 다음, 60℃/분으로 220℃까지 증가시키고 2분 동안 유지시켰다. 투입구 및 검출기 온도는 각각 260℃ 및 300℃이었다. 휘발성 지방산을 아세테이트, 프로피오네이트, 이소부티레이트, 부티레이트, 이소발러레이트, 발러레이트, 이소카프로레이트, 카프로에이트 및 헵타노에이트를 함유하는 공지된 표준물(Supelco 휘발성 지방산 표준 혼합물(Volatile Fatty Acid Standard Mix); Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트 루이스 소재)과 비교함으로써 정량화하였다.
E. 통계적 분석
데이타를 SAS® 소프트웨어 버젼 9.4의 글림믹스 과정(Glimmix procedure)을 사용하여 분석하였다. 모델을 처리의 고정된 효과 및 말, 기간 및 처리의 무작위 효과를 포함시켰다. 말은 실험 단위로 제공하였다. 1일 효과내 시간에 의한 처리는 임의의 매개변수에 대해 유의적이지 않았으므로 모델로부터 배제시켰다. 유의성은 P < 0.05에서 나타내고, 경향성은 0.05 < P < 0.10인 것으로 고려되었다. 최소-제곱법 평균 중의 차이는 SAS® 소프트웨어의 PDiff 선택사항을 사용하여 측정하였다.
F. 결과
맹장 pH는 식이내 낟알의 혼입이 증가하면서 대조군과 비교하여 엠. 엘스데니이로 처리한 말에서 더 큰 경향이 있었다. 도 22를 참고한다. 경구 드렌치로서 엠. 엘스데니이를 투여받은 말의 맹장 pH는 낟알의 완전한 할당물을 사료공급한 첫째날인, 5일째에 대조군보다 상승하였다(각각 7.00 및 7.19; P = 0.09). 7일째에, 동결-건조된 처리로서 엠. 엘스데니이를 제공받은 말은 대조군(6.99; P = 0.09)보다 더 높은 맹장 pH(7.19)를 갖는 경향이 있었다.
표 17은 처리 그룹의 VFA 프로파일을 나타낸다.
엠. 엘스데니이 보충은 맹장내 아세테이트 또는 프로피오네이트 농도에 있어서 효과를 갖지 않았다(P > 0.10; 표 **). 그러나, 일 상호작용에 의한 처리는 아세테이트:프로피오네이트(A:P) 비에서 검출되었다(P < 0.05). 맹장 A:P 비는 엠. 엘스데니이(2.41)를 제공받지 않은 말 또는 경구 드렌치로서 엠. 엘스데니이를 제공받은 말(2.60; P < 0.05)보다 동결-건조된 엠. 엘스데니이 (2.83)를 제공받은 말에서 7일째에 더 컷다. 맹장 발러레이트는 대조군 동물(0.04 mM) 또는 엠. 엘스데니이의 경구 드렌치를 제공받은 말(0.07 mM; P < 0.02)보다 동결-건조된 엠. 엘스데니이(0.15 mM)를 제공받은 말에서 7일째에 더 컷다. 맹장 발러레이트는 대조군 동물(P < 0.01)보다 5일째에 드렌치된 말에서 더 적었지만; 이는 동결-건조된 엠. 엘스데니이(P > 0.10)로 처리된 말의 것과 유사하였다. 헵타노에이트 및 이소카프로레이트 농도는 무시할만한 정도였으며, 처리 또는 상호작용 효과는 검출되지 않았으므로, 이러한 VFA는 표** 로부터 배제시켰다.
맹장 pH 및 발효 생성물은 최대 양의 낟알이 소비된 날인, 5일 내지 7일째에 엠. 엘스데니이를 사용한 보충에 의해 가장 많이 영향받았다.
실시예 11
구이용 닭에서 액체 배양물 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 41125 (Lactipro®) 적용의 평가
중간시험(pilot) 구이용 영계 성능 연구를 버지니아 다양화된 연구 회사(Virginia Diversified Research Corporation)에서 수행하여 구이용 병아리의 성장 능력에서 미스트되거나 위관영양된 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 41125의 효과를 평가하였다.
0일째에 Coccivac-B로 예방접종된 1일된 구이용 병아리(n=720) 스프레이를 6개의 상이한 처리에 무작위로 할당시켰다: (1) 메가스파에라(nCON)를 제공받지 않은 음성 대조군 그룹, (2) 이들의 부화장 상자(hatchery crate)내에 있을 때(d0 미스트) 0일째에 미스트(1-2 mL/조류)에 의해 0일째에 엠. 엘스데니이 NCIMB 41125를 제공받은 미스트 그룹, (3) 2시간 사료 절식 및 1시간 물 절식 후(d7 GAV) 경구 위관 영양에 의해 7일째에 2 mL의 엠. 엘스데니이 NCIMB 41125를 제공받은 7일째 위관영양 그룹, (4) 2시간 사료 절식 및 1시간 물 절식 후(d14 GAV) 경구 위관 영양에 의해 14일째에 5 mL의 엠. 엘스데니이 NCIMB 41125를 제공받은 14일 위관영양 그룹, (5) 2시간 사료 절식 및 1시간 물 단식 후(d21 GAV) 경구 위관 영양에 의해 21일째에 10 mL의 엠. 엘스데니이 NCIMB 41125를 제공받은 21일 위관 영양 그룹, 및 6) 메가스파에라를 제공받지 않았지만 BMD (50 g/t)로 처리된 개시 및 성장 사료 및 스타팍(Stafac)(20 g/t)으로 처리된 최종 사료를 제공받은 양성 대조군 그룹.
각각의 처리는 각각 30마리의 조류를 함유하는 4개 케이지로 나타내었다. 조류에게 제공한 식이는 다음과 같았다: 0 내지 18일째의 개시 사료, 18 내지 35일째의 성장 사료, 및 35 내지 39일째에 최종 사료. 동물 중량, 사료 소비, 및 사료 전환을 39일 시험 기간에 걸쳐 기록하였다.
결과는 표 18에 나타낸다. 전체적인 폐사율은 처리에 걸쳐 상이하지 않았다(표 18). d0 미스트 그룹에 대한 사료 전환률은 25일째에 모든 다른 처리보다 유의적으로 더 낮았고 pCON보다 5.3% 개선되었으며 nCON보다 6.5% 개선되었다. 사료공급 39일째에, 메가스파에라 엘스데니이 처리된 그룹의 사료 전환률은 pCON과 유의적으로 상이하지 않았지만 d7 GAV를 예외하고는 수치적으로 더 낮은 경향이 있었다. d21 GAV 그룹에 대한 사료 전환률은 사료 전환률에 있어서 7.7% 개선으로 nCON보다 유의적으로 더 낮았다.
실시예 12
2개의 탄소 공급원이 보충된 반-정의된 성장 배지에서 엠. 엘스데니이의 성장하는 상이한 균주
A. 실험 설계
다음의 세균 균주를 본 실시예에서 사용하였다: (1) 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 41125, (2) 메가스파에라 엘스데니이 ATCC 25940, (3) 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 702261, (4) 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 702262, 및 (5) 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 702410.
모든 균주를 반-정의된 락테이트 성장 배지에서 혈청 병 속에서 성장시켰다. 수득되는 배양물을 이후 사용하여 2개의 탄소원: 60%의 락테이트 및 40%의 글루코즈, 70%의 락테이트 및 30%의 글루코즈, 또는 40%의 락테이트 및 60%의 글루코즈로 이루어진 Na-락테이트 및 글루코즈가 보충된 반 정의된 성장 배지를 함유하는 96-웰 플레이트에 접종하였다.
96-웰 플레이트를 이후에 39℃에서 혐기성 조건하에 항온처리하고 광학 밀도(600 nm)를 15분 간격으로 자동적으로 기록하였다.
B. 다양한 2개-탄소 배지에서 엠. 엘스데니이 균주의 성장 특성의 분석
상이한 반-정의된 배지 및 상이한 엠. 엘스데니이 균주가 들어있는 수득되는 성장 곡선을 x-축에 항온처리 시간 및 y-축에 광학 밀도 판독으로 플롯팅하여, 성장 특성을 비교하였다(도 23-25).
본 실험에서 시험한 엠. 엘스데니이의 모든 균주는 60%의 락테이트 및 40%의 글루코즈, 70%의 락테이트 및 30%의 글루코즈, 또는 40%의 락테이트 및 60%의 글루코즈로 이루어진 반-정의된 배지에서 성장시키는 경우 유사한 성장 특성을 나타내었다.
실시예 13
2개의 탄소원으로 보충된 후 세포를 동결-건조시킴으로써 반-정의된 성장 배지 상에서 엠. 엘스데니이의 상이한 균주의 성장
A. 실험 설계
다음의 세균 균주를 본 실시예에서 사용하였다: (1) 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 41125, (2) 메가스파에라 엘스데니이 ATCC 25940, (3) 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 702261, (4) 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 702262, 및 (5) 메가스파에라 엘스데니이 NCIMB 702410.
모든 균주를 반-정의된 락테이트 성장 배지 상에서 혈청 병 속에서 성장시켰다. 이후에 수득되는 배양물을 사용하여 2개의 탄소원: 60%의 락테이트 및 40%의 글루코즈 또는 70%의 락테이트 및 30%의 글루코즈로 이루어진 Na-락테이트 및 글루코즈가 보충된 반-정의된 성장 배지를 함유하는 5-L 들이 발효기 용기 속에 접종하였다.
배양물의 샘플을 8, 10, 12, 14, 및 16시간의 성장 후 수집하여, 실온으로 냉각시키고 세포를 99%의 액체를 제거함으로써 호기적으로 및 혐기적으로 수거하였다. 보유물을 동결보호제(슈크로즈)의 용액과 1/5 비에서 호기성 및 혐기성 조건 하에 혼합하여, 5% w/v의 최종 슈크로즈 농도를 수득하였다. 혼합물을 샘플링하여 예비-동결-건조되는 엠. 엘스데니이 농도(즉, 생존능 계산)를 측정하였다.
수득되는 혼합물의 분취량을 10 mL의 바이알(4 mL/바이알)로 이동시키고 액체 질소 속에서 스냅 동결시켰다. 바이알을 동결-건조기로 이동시켜 신속한 주기 후 동결건조되도록 하였다. 일단 동결-건조가 완료되면, 동결건조된 생성물을 혐기성 희석액이 들어있는 혐기성 챔버 속에 재현탁시켜, 이것이 실온에서 40분 동안 재수화되도록 한 후 반-정의된 락테이트 한천 위에 플레이팅함으로써 세균의 생존을 측정하였다(즉, 생존능 계산).
세포 손실은 엠. 엘스데니이의 초기(동결-건조 전) 농도로부터 동결-건조 후 회수된 엠. 엘스데니이의 농도를 감함으로써 계산하였다.
B. 성장 동안 다양한 시간에 다양한 반-정의된 배지에서 성장시키고, 수거하여 동결-건조한 상이한 엠. 엘스데니이 균주의 동결-건조 후 세포 손실의 비교
본 실험에서 시험한 엠. 엘스데니이의 모든 균주는 동결-건조 후 살아있는 세포를 생성하였다. 허용되는 세포 손실 한계는 1.6 log CFU/mL에서 설정하였다. 균주 또는 수거 시간에 상관없이, 70%의 락테이트 및 30%의 글루코즈를 함유하는 반 정의된 배지에서 성장한 세포의 동결 건조 동안 직면한 세포 손실(표 19)은 모두 허용되는 한계 이하이며 0.3 내지 1.3 log의 범위이었다.
60%의 락테이트 및 40%의 글루코즈를 함유하는 반 정의된 배지에서 성장시킨 세포의 동결 건조 동안 직면한 세포 손실(표 20)은 수거 시간에 더 영향받았지만, 모든 균주는 여전히 적어도 3회의 수거 횟수 동안 허용되는 한계 미만인 세포 손실을 야기하였다. 동결 건조 전 수거 시간의 최적화는 동결-건조 후 회수의 추가의 증진을 야기할 수 있다.
본원에 기술된 전체적인 방법은 사용된 메가스파에라 엘스데니이 균주와는 상관없이 살아있는 세포를 함유하는 동결 건조된 생성물을 생성하였다.
실시예 14
동결-건조된 엠. 엘스데니이의 캡슐화 및 이의 안정성의 측정
TFF를 통해 수득된 엠. 엘스데니이 NCIMB 41125 보유물을 동결보호제 용액(슈크로즈)과 1/5 비에서 무균적으로 혼합하여 5% 슈크로즈(w/v)의 최종 농도를 수득하였다. 혼합물을 액체 질소 속에서 스냅 동결시키고 신속한 주기를 사용하여 동결건조시킬 동결-건조기에 이동시켰다. 일단 동결-건조가 완료되면, 동결건조된 생성물을 혐기성 희석액이 들어있는 혐기성 챔버 속에서 재현탁시키고, 이를 실온에서 40분 동안 재수화시킨 다음 반 정의된 락테이트 한천 위에 플레이팅함으로써 세균의 생존을 측정하였다.
수득되는 동결 건조된 엠. 엘스데니이 분말을 이어서 캐리어(증량제)와 혼합하고 분말을 가열된 야자유 증류물 또는 스테아르산 속에 분산시켜 캅셀화하였다. 이후 혼합물을 신속하게 냉각시키고 수득되는 생성물을 샘플링하여 세균의 생존을 측정하였다. 샘플을 혐기성 희석액이 들어있는 혐기성 챔버 속에 재현탁시키고, 15초 동안 배합하고, 40분 동안 실온에서 재수화되도록 한 후 반 정의된 락테이트 한천 위에 플레이팅하였다. 본 실험을 상이한 가열 온도 및 상이한 유형의 오일을 사용하여 3회 반복하였다(방법 1, 2, 및 3). 방법 1은 110℃의 가열 온도 및 캡슐화 물질로서 팜유 증류물을 사용한다. 방법 2는 52℃의 가열 온도 및 캅셀화 물질로서 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 및 리놀렌산의 모노- 및 디-글리세라이드의 혼합물을 사용한다. 방법 3은 65℃의 가열 온도 및 캅셀화 물질로서 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 및 레놀렌산의 모노- 및 디-글리세라이드의 혼합물을 사용한다.
손실 퍼센트는 동결-건조후 회수된 농축물로부터 캅셀화 후 회수된 엠. 엘스데니이의 농도를 감하고 이를 동결-건조 후 회수된 농도로 나누어서 계산하였다.
추가의 샘플을 캅셀화된 생성물로부터 방법 2 및 방법 3을 사용하여 수집하고, 호기성 조건 하에서 4개월의 기간 동안 실온에서 저장함으로써 생성물의 안전성을 평가하였다. 샘플을 혐기성 희석액이 들어있는 혐기성 챔버 속에 재현탁시키고, 15초 동안 혼합하고, 실온에서 40분 동안 재수화시킨 후 반-정의된 락테이트 한천 위에 플레이팅하였다. 도 26 및 도 27은 방법 2 또는 3을 사용하여 캅셀화된 동결-건조된 엠. 엘스데니이의 안전성이 단지 대략 1 log CFU/g를 상실하였음을 나타낸다.
동결-건조된 엠. 엘스데니이를 캅셀화하기 위해 사용된 방법 2 및 3은 67.9% 초과의 세포 회수율을 생성하였다(표 21).
또한, 방법 2 또는 방법 3 후에 캅셀화된 동결 건조된 샘플은 4개월 이하 동안 정상의 산소 및 습도 조건 하에서 실온에서 저장 동안 세포 생존능에 있어서 1 log 감소를 야기하였다.
방법 2 및 방법 3 후 동결 건조된 엠. 엘스데니이의 캅셀화는 산소 및 습도로부터 세균에 대한 추가의 보호를 제공하였다. 이러한 공정은 임의의 특이적인 패키징없이 실온에서 캅셀화된 동결-건조된 엠. 엘스데니이를 저장하도록 하며 사료 속에 생성물의 첨가를 허용할 수 있다.
실시예 15
중간시험 규모로 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이의 저장 수명
A. 실험 설계
70%의 락테이트 및 30%의 글루코즈로 이루어진 반 정의된 배지의 600-리터의 배치(batch)를 본 실험에 사용하여 엠. 엘스데니이 NCIMB 41125를 성장시켰다. 39℃에서 14시간 항온처리 후, 수득되는 배양물을 실온으로 냉각시키고 세포를 실시예 2에 기술된 바와 같이 접선 유동 여과 시스템을 사용하여 수거하였다. 99 퍼센트의 액체 용적을 배양물로부터 제거한 후 보유물을 슈크로즈 동결보호제 용액 속에 1:5 비로 재현탁시켜 5% w/v의 최종 슈크로즈 농도를 수득하였다.
이후에, 혼합물을 액체 질소 속에 동결시키고, 동결된 펠렛을 동결 건조기에 이동시키고 신속한 주기에 따라 동결건조시켰다. 일단 동결 건조가 완료되면, 동결건조된 분말을 수집하고 혐기성 조건 하에서 마일러 파우스 단독("M.e.") 또는 증량제로서 말토덱스트린과 함께("M.e. + 말토덱스트린") 패키지하였다(표 22).
동결-건조된 생성물속의 엠. 엘스데니이 농도(처리당 3개 샘플)를 동결건조된 생성물을 혐기성 희석액이 들어있는 혐기성 챔버 속에 재현탁시키고, 이를 실온에서 40분 동안 재수화시킨 다음, 반 정의된 락테이트 한천 위에 플레이팅함으로써 측정하였다(즉, 생존능 계산). 엠. 엘스데니이 농도는 형질전환된 CFU/Pouch 및 log로서 나타내었다.
B. 저장 수명 연구
상이한 처리를 함유하는 마일라 파우치(Mylar pouch)를 실온(75℉; 25℃) 또는 40℉(4℃)에서 저장하였다. 추가의 샘플을 0.5, 1, 2, 3, 4, 및 6개월의 저장 후 수득하고 앞서 기술한 바와 동일한 방식으로 가공하여(시점당 처리당 3개 샘플) 생성물 저장 수명을 측정하였다. 엠. 엘스데니이 농도를 형질전환된 CFU/파우치 및 log로 나타내었다.
저장 수명은 도 28에 나타낸다. 시간에 따른 엠. 엘스데니이 농도는 저장 온도에 영향받았다. 6개월 저장 후, 40℉(4.4℃)에서 저장한 샘플은 말토덱스트린의 존재 및 부재와 상관없이 안정하였지만, 75℉(23.9℃)에서 저장한 샘플은 "M.e." 처리의 경우 약 1.6 log 및 "M.e. + 말토덱스트린" 처리의 경우 약 0.8 log를 손실하였다.
실시예 16
미생물 세포 성장, 배지, 온도, 및 pH
혐기성 세균을 3개의 범주로 나눌 수 있다, (1) 완전 혐기성균; (2) 내성 혐기성균; 및 (3) 조건 혐기성균. 완전 혐기성균은 정상적인 대기 농도의 산소 속에서 생존하지 않는 세균이다. 일부 완전 혐기성균은 8% 이하의 산소에서 생존할 수 있지만, 다른 것은 산소 농도가 0.5% 미만이지 않는 한 생존할 수 없다. 내기성 혐기성균은 산소의 존재하에서 생존할 수 있지만, 성장을 위해 산소를 이용하지 않는다. 조건 혐기성균은 호기성 호흡을 위해 산소를 사용할 수 있지만, 또한 산소가 존재하지 않는 경우 혐기성 호흡을 사용할 수 있다.
유사하게, 호기성 세균은 2개의 범주로 나누어질 수 있다: (1) 완전 호기성균; 및 (2) 미호기성균. 완전 호기성균은 세포 호흡을 수행하기 위해 산소를 필요로 하며 산소의 정상 대기 농도에서 생존할 수 있다. 미호기성균은 세포 성장에 산소를 필요로 하지만 산소의 정상적인 대기 농도에 의해 해를 입는다.
효모는 다수의 진균 왕국으로서 분류된 단일-세포의, 진핵 미생물이다. 효모는 완전 호기성균 또는 조건 혐기성 균일 수 있다.
메가스파에라, 예를 들면, 엠. 엘스데니이 및 비피도박테리움, 예를 들면, 비. 브레베는 완전 혐기성균의 대표적인 종이다. 락토바실러스, 예를 들면, 엘. 플란타룸 및 비피도박테리움, 예를 들면, 비. 아니말리스 아종 락티스는 내기성 혐기성균의 대표적인 종이다. 페디오코쿠스, 예를 들면, 피. 악시딜락티시 및 락토바실러스, 예를 들면, 엘. 카세이는 조건 혐기성균의 대표적인 종이다. 바실러스, 예를 들면, 비. 서브틸리스는 완전 호기성균의 대표적인 종이다. 사카로마이세스, 예를 들면. 에스. 보울라르디이 및 에스. 세레비지아에는 효모의 대표적인 종이다.
호기성 세균, 혐기성 세균, 및 효모는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 탄소원을 포함하는 배지 에서 성장한다: 카제인, 락테이트, 덱스트로즈, 프럭토즈, 프럭탄, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈, 아세테이트, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 사카로즈, 크실로즈, 몰라세스, 푸코즈, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 아세트산나트륨, 아라비노즈, 대두 단백질, 가용성 단백질, 라피노즈, 아밀로즈, 전분, 트립톤, 효모 추출물 및 이의 조합. 또한, 호기성 세균, 혐기성 세균, 및 효모는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 탄소원을 포함하는 배지에서 성장한다: 카제인, 락테이트, 덱스트로즈, 프럭토즈, 프럭탄, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈, 아세테이트, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 사카로즈, 크실로즈, 몰라세스, 푸코즈, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 아세트산나트륨, 아라비노즈, 대두 단백질, 가용성 단백질, 라피노즈, 아밀로즈, 전분, 트립톤, 효모 추출물 및 이의 조합. 혐기성 세균은 혐기성 조건 하에서 또는 혐기성 세균 세포 성장을 촉진시키는 필요한 산소 농도로 성장하며, 호기성 세균 및 효모는 상기로부터의 적어도 2개의 탄소원을 포함하는 배지를 사용한 적절한 산소 조건 하에서 및 엘. 플란타룸의 경우 15℃ 내지 45℃의 온도 및 비. 브레베, 비. 아니말리스 아종. 락티스, 피, 악시딜락티시, 엘. 카세이, 에스. 보울라르디이, 및 비. 서브틸리스의 경우 20℃ 내지 45℃의 온도에서 성장한다. 이러한 균주에 대한 최적 온도는 에스. 세레비지아에를 제외하고는 37℃이며, 단 에스. 세레비지아에는 30℃를 선호한다. 배지의 pH는 4.0 내지 9, 보다 구체적으로 pH 4.0 내지 4.5, 4.5 내지 5.5, 5.5 내지 6.5, 6.5 내지 7.5, 7.5 내지 8.5, 또는 8.5 내지 9.0이다. 미생물은 대수 성장기가 종결할 때까지, 즉, 적어도 1 시간 내지 6 시간, 6 시간 내지 12 시간, 12 시간 내지 24 시간, 24 시간 내지 36 시간, 36 시간 내지 48 시간, 48 시간 내지 72 시간, 72 시간 내지 96 시간, 또는 96 시간 내지 120 시간 성장한다.
일단 배지가 적어도 1 x 103 CFU/g를 함유하면, 미생물을 적절한 조건 하에서 수거하고 미생물을 동물 사료 제형에서 사용하기 위해 동결-건조시키고/시키거나 캅셀화한다.
실시예 17
호기성 세균, 혐기성 세균, 및 효모의 배양물을 농축시키기 위한 접선 유동 여과의 용도
실시예 2에 기술된 방법을 본 실시예에서 실시예 16에 개시된 호기성 세균, 혐기성 세균, 및 효모와 함께 사용하고 적절한 배지를 사용하여 최적의 미생물 세포 성장을 허용하였다. 메가스파에라 엘스데니이와 유사하게, 호기성 미생물(바실러스 서브틸리스), 혐기성 세균(비피도박테리움 브레베, 락토바실러스 플란타룸, 비피도박테리움 동물 아종. 락티스, 페디오코쿠스 악시딜락티시, 및 락토바실러스 카세이), 및 효모(사카로마이세스 보울라르디이 및 세레비지아에)은 농축 공정의 과정에 걸쳐 침투물 및 보유물 속에서 회수된 살아있는 미생물의 양과 관련하여 유사한 결과를 수득한다. 또한, 여과 공정은 미생물 생존 가능성에 있어서 또는 여과 후 미생물이 성장하는 능력에 있어서 효과를 가지지 않는다. 따라서, 미생물을 액체 브로쓰 속에서 성장시키고, 여과하고, 동결, 동결-건조, 및/또는 캅셀화를 위해 제조한다.
실시예 18
호기성 세균, 혐기성 세균, 및 효모에 대한 동결 및 동결-건조 매개변수
상이한 유형의 호기성 세균, 혐기성 세균, 및 효모에서 다양한 동결 및 동결-건조 매개변수의 효과를 측정하기 위하여, 실시예 17에 따른 실시예를 수행한다. 실시예 3과 유사하게, 허용되는 세포 손실 한계는 1.6 log CFU/mL에서 설정한다.
비피도박테리움 브레베, 락토바실러스 플란타룸, 비피도박테리움 아니말리스 아종. 락티스, 페디오코쿠스 악시딜락티시, 락토바실러스 카세이, 바실러스 서브틸리스, 사카로마이세스 보울라르디이, 및 사카로마이세스 세레비지아에를 동결보호제를 제외하고, 스킴 밀크, 트레할로즈, 슈크로즈, 또는 이의 조합을 함유하는 동결보호제 용액 속에 동결건조 전에 재현탁시킨다. 이후에 각각의 혼합물을 바이알(vial)에 이동시키고 -80℃에서 서서히 동결시키거나 액체 질소 속에서 스냅 동결시키고, 이후 동결-건조기 속에 두어 신속한 또는 느린 주기를 사용하여 동결건조시킨다.
동결보호제와 혼합되지 않은 보유물 모두는 동결보호제 용액과 혼합된 보유물보다 더 큰 세포 손실 및 동결-건조 주기 또는 동결 방법과는 상관없이 한계(threshold)보다 더 큰 세포 손실을 가졌다.
또한, 시험되는 모든 동결-건조 공정은 심지어 실온에서 또는 적어도 4℃에서 4 내지 12개월의 연장된 저장 후에, 재수화 후 배양물의 성장을 개시하기에 충분한 생존능을 보유할 수 있는 생성물을 생성하였다.
실시예 19
동결-건조된 호기성 세균, 혐기성 세균, 및 효모의 수율 및 안정성에서 저장 조건의 효과
실시예 4에 나타낸 세포 생존 및 미생물 성장 특성에 대한 시험 방법을 실시예 16에 개시된 호기성 세균, 혐기성 세균 및 효모로, 및 최적의 미생물 세포 성장을 허용하는 적절한 배지를 사용하는 본 실시예에서 사용하였다.
비피도박테리움 브레베, 락토바실러스 플란타룸, 비피도박테리움 아니말리스 아종. 락티스, 페디오코쿠스 악시딜락티시, 락토바실러스 카세이, 바실러스 서브틸리스, 사카로마이세스 보울라르디이, 및 사카로마이세스 세레비지아에의 성장 특성 및 저장 수명에 있어서 동결-건조 프로토콜 및 저장 조건의 효과를 측정하기 위하여, 실시예 18에서와 같이 생산된 동결-건조된 배양물을 이후에 미생물 성장 특성 및 세포 생존에 대해 4℃ 또는 25℃에서 호기성 또는 혐기성 조건 하에서 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 및 2주 동안 성장 곡선 분석 및 확산 플레이팅 기술을 사용하여 시험하였다.
호기성 조건에서 저장된 동결-건조된 혐기성 세균은, 처리와 상관없이 이들의 혐기성-저장된 대응물과 비교하여 추가의 세포 손실과 함께 보다 신속하게 쇠퇴한다.
25℃에서 저장된 샘플은 4℃에서 저장된 이들의 대응물보다 보다 신속하게 쇠퇴하였다.
액체 질소에서 동결되고 동결-건조 후 25℃에서 저장된 샘플은 16주의 저장 기간에 걸쳐 4℃에서 저장된 이들의 대응물보다 더 많은 세포를 손실하지 않았지만, 샘플 사이의 차이는 20 및/또는 24주의 저장 후 25℃ 내지 4℃ 저장 사이에서 유의적이다.
각각의 샘플링 일에, 성장 곡선 실험을 수행하여 동결-건조된 생성물 대 비-동결-건조된 생성물의 성장 특성을 비교하였다. 각각의 성장 곡선에 대해 사용된 동결-건조되지 않은 샘플은 "신선"하다(2일 이하). 4℃에서 저장된 동결-건조된 생성물은 25℃에서 저장된 동결-건조된 생성물보다 더 짧은 지체 시간을 가진다. 16주 저장 후, 동결보호제를 함유하는, 액체 질소에서 동결된, 동결-건조된, 혐기성 조건 하에 저장된 혐기성 세균으로부터의 모든 샘플은 회복되어 다시 생존할 수 있다. 유사하게, 동결보호제를 함유하는, 액체 질소 속에 동결되고 동결-건조된 호기성 세균 및 효모로부터의 모든 샘플은 회복하여 또한 다시 생존할 수 있다.
실시예 20
캅셀화된 동결-건조된 호기성, 혐기성 세균, 및 효모의 수율 및 안전성에 있어서 저장 조건의 효과
다양한 호기성 세균, 혐기성 세균, 및 효모의 동결 및 동결-건조된 보유물을 실시예 16 내지 19에 기술된 바와 같이 수행한다. 동결-건조 후, 혐기성 세균을 담체(증량제)와 혼합하고 동결-건조된 분말을 실시예 14에 기술된 바와 같이 가열된 오일 속에 분배함으로써 캅셀화하였다. 이후에 혼합물을 신속하게 냉각시키고 수득되는 생성물을 샘플링하여 미생물의 생존을 측정하였다. 혐기성 미생물 샘플을 혐기성 희석액이 들어있는 혐기성 챔버 속에 재현탁시키고, 15초 동안 혼합하고, 실온에서 40분 동안 재수화되도록 한 후 반-정의된 락테이트 한천에 플레이팅한다. 혐기성 미생물 샘플을 정상의 대기 농도의 산소 속에서 희석액과 함께 재현탁시키고, 15초 동안 혼합하고 실온에서 40분 동안 재수화되도록 한 후 반-정의된 락테이트 한천에 플레이팅하였다. 본 실험을 상이한 가열 온도 및 상이한 유형의 오일을 사용하여 3회 반복하였다(방법 1, 2, 및 3). 방법 1은 110℃의 가열 온도 및 캅셀화 물질로서 야자유 증류물을 사용한다. 방법 2는 52℃의 가열 온도 및 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 및 리놀렌산의 모노- 및 디-글리세라이드의 혼합물을 캅셀화 물질로서 사용한다. 방법 3은 65℃의 가열 온도 및 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 및 리놀렌산의 모노- 및 디-글리세라이드의 혼합물을 캅셀화 물질로서 사용한다.
캅셀화로부터의 세포 손실 퍼센트는 방법 2 또는 3을 사용하여 40% 미만이다. 다양한 호기성 세균의 캅셀화 후, 정상의 대기 산소 조건하의 실온에서 저장된 호기성 세균, 및 효모, 캅셀화된 미생물은 저장 과정 전체에서 세포 생존능에 있어 단지 약간 감소되었다(예컨대, 세포 생존능에 있어서 0.5 내지 2-log 감소).
Claims (119)
- (a) 혐기성 조건 하에서 엠. 엘스데니이(M. elsdenii) 세포 및, 카제인, 락테이트, 덱스트로즈, 프럭토즈, 프럭탄, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈, 아세테이트, 글리세롤, 만니톨, 사카로즈, 크실로즈, 몰라세스(molasses), 푸코즈, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 아세트산나트륨, 아라비노즈, 대두 단백질, 가용성 단백질, 라피노즈, 아밀로즈, 전분, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 탄소원(carbon source)을 포함하는 성장 배지를 포함하는 배양물을 제조하는 단계,
(b) 세포를 혐기성 조건 하에서 수거(harvesting)하는 단계,
(c) 세포를 동결시키는 단계, 및
(d) 세포를 동결-건조시키는 단계로서, 여기서 약 1 x 103 내지 약 1 x 1012 CFU/g의 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포가 생산되는 단계를 포함하는,
동결-건조된 메가스파에라 엘스데니이(Megasphaera elsdenii) 세포의 생산 방법. - 제1항에 있어서, 적어도 2개의 탄소원이 약 50 내지 90%의 제1의 탄소원 및 약 10 내지 50%의 제2의 탄소원으로 이루어지며, 여기서 제2의 탄소원은 제1의 탄소원과는 상이하고, 여기서 100%의 적어도 2개의 탄소원이 제1의 탄소원 및 제2의 탄소원으로 이루어진 방법.
- (a) 엠. 엘스데니이 세포 및 성장 배지를 포함하는 배양물을 제조하는 단계,
(b) 배양물이 이의 대수 성장기를 종료한 후 및 배양물이 이의 정체 성장기를 시작하기 전에 12시간 내에 혐기성 조건 하에서 세포를 수거하는 단계,
(c) 세포를 동결시키는 단계, 및
(d) 세포를 동결-건조시키는 단계로서, 여기서 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포가 생산되는 단계를 포함하는,
동결-건조된 메가스파에라 엘스데니이 세포의 생산 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 수거가 원심분리, 여과, 투석, 역 삼투압, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 기술을 포함하는 방법.
- 제4항에 있어서, 여과가 접선 유동 여과(tangential flow filtration)를 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물이 액체를 포함하고, 여기서 수거 단계가 약 60% 내지 약 100%의 액체를 제거함을 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 동결이 약 -80℃ 내지 약 -210℃의 온도에서 수행되는 방법.
- (a) 엠. 엘스데니이 세포 및 성장 배지를 포함하는 배양물을 제조하는 단계,
(b) 세포를 수거하는 단계,
(c) 세포를 약 -80℃ 내지 약 -210℃의 온도에서 수거 5분 내에 동결시키는 단계, 및
(d) 세포를 동결건조시키는 단계로서, 여기서 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포가 생산되는 단계를 포함하는,
동결 건조된 메가스파에라 엘스데니이 세포의 생산 방법. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 동결 단계가 엠. 엘스데니이 세포를 포함하는 용기를 액체 질소와 접촉시킴을 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 동결 단계가 세포를 액체 질소와 접촉시킴을 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 동결 단계가 약 -196℃의 온도에서 수행되며 세포를 포함하는 동결된 펠렛(pellet)을 생산하고, 여기서 동결된 펠렛의 직경은 약 0.001 내지 약 0.5 인치인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 수거 전 엠. 엘스데니이 배양물의 pH가 약 4.5 내지 약 7.0인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 x 103 내지 약 1 x 1012 CFU/g의 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포가 약 25℃의 온도에서 저장 후 적어도 2주 동안 생존가능한 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 x 103 내지 약 1 x 1012 CFU/g의 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포가 약 4℃에서 저장 후 적어도 1개월 동안 생존가능한 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물이 적어도 하나의 동결보호제를 추가로 포함하는 방법.
- 제15항에 있어서, 적어도 하나의 동결보호제가 프럭토즈, 글루코즈, 슈크로즈, 분유(milk powder), 영아용 조제분유(infant formula), 스킴 밀크(skim milk), 트레할로즈, 말토덱스트린, 베타인, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제15항 또는 제16항에 있어서, 적어도 하나의 동결보호제가 배양물의 약 1% 내지 약 20%(w/v)의 양으로 존재하는 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 동결-건조된 엠. 엘스데니이가 시판 규모로 생산되는 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물의 용적이 적어도 약 50 리터인 방법.
- 제3항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 x 103 내지 1 x 1012 CFU/g의 엠. 엘스데니이 세포가 동결-건조 후 생존가능한 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물 속의 세포가 엠. 엘스데니이 세포로 이루어진 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포를 포함하는 고체 사료 첨가제.
- 제22항에 있어서, 고체 사료 첨가제가 다른 미생물을 추가로 포함하는 고체 사료 첨가제.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 고체 사료 첨가제가 분말, 과립, 입자상 물질, 펠렛, 케이크, 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 고체 사료 첨가제.
- 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 사료 첨가제가 프로바이오틱(probiotic)인 고체 사료 첨가제.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포 또는 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 고체 사료 첨가제를 포함하는 조성물.
- 제26항에 있어서, 조성물이 캅셀제인 조성물.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 고체 사료 첨가제, 또는 제26항 또는 제27항에 따른 조성물을 포함하는 키트(kit).
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 고체 사료 첨가제, 또는 제26항 또는 제27항에 따른 조성물을 동물에게 투여함을 포함하여, 동물에게 엠. 엘스데니이 세포를 투여하는 방법.
- 유효량의 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 임의의 고체 사료 첨가제, 또는 제26항 또는 제27항에 따른 조성물을 동물에게 투여함을 포함하여, 동물의 위장관내 젖산 생산과 관련된 상태 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법.
- 제30항에 있어서, 상태 또는 장애가 산증(acidosis)인 방법.
- 제30항 또는 제31항에 있어서, 상태 또는 장애가 제일위과산증(ruminal acidosis)인 방법.
- 제30항에 있어서, 상태 또는 장애가 호흡기 질환인 방법.
- 제30항에 있어서, 상태 또는 장애가 제엽염(laminitis)인 방법.
- 제30항에 있어서, 상태 또는 장애가 감염인 방법.
- 제35항에 있어서, 감염이 살모넬라(Salmonella) 또는 캄필로박터(Campylobacter)에 의한 것인 방법.
- 유효량의 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 고체 사료 첨가제, 또는 제26항 또는 제27항에 따른 조성물을 동물에게 투여함을 포함하여, 동물의 위장관내 기회감염 미생물의 성장을 예방하거나 감소시키는 방법.
- 제37항에 있어서, 기회감염 미생물이 병원성인 방법.
- 제37항 또는 제38항에 있어서, 기회감염 미생물이 살모넬라 또는 캄필로박터인 방법.
- 유효량의 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 고체 사료 첨가제, 또는 제26항 또는 제27항에 따른 조성물을 동물에게 투여함을 포함하여, 동물의 식이 속의 식물-유래된 인의 생체이용률(bioavailability)을 증진시키는 방법.
- 유효량의 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 고체 사료 첨가제, 또는 제26항 또는 제27항에 따른 조성물을 동물에게 투여함을 포함하여, 동물에서 성장 능력을 증진시키는 방법으로서, 여기서 동물에서 증진된 성장 능력은 사료 섭취, 평균 일당증체량(daily gain), 사료 요구율(feed conversion ratio), 사체 획득(carcass gain), 젖 생산 동물에서 젖 생산, 가금류에서 알 생산, 골 광화(bone mineralization), 또는 이의 조합에 있어서의 증진인 방법.
- 제29항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포, 고체 사료 첨가제, 또는 조성물이 사료를 사용하여 동물에게 먹이주기 전, 이와 동시에, 또는 후에 투여되는 방법.
- 제29항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 투여 전에 동결-건조된 엠. 엘스데니이 세포 또는 고체 사료 첨가제를 액체와 혼합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제43항에 있어서, 액체가 경구적으로 또는 동물에게 액체를 분무함으로써 투여되는 방법.
- 제29항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 엠. 엘스데니이 세포, 사료 첨가제, 또는 조성물의 단일 투여를 포함하는 방법.
- 제29항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 엠. 엘스데니이 세포, 사료 첨가제, 또는 조성물의 매일 투여를 포함하는 방법.
- 제29항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 하루에 엠. 엘스데니이 세포, 사료 첨가제, 조성물의 1회 이상의 투여를 포함하는 방법.
- 제29항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 동물은 반추동물인 방법.
- 제48항에 있어서, 반추동물이 소, 양, 염소, 사슴, 버팔로, 및 순록으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제29항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 동물이 비-반추동물인 방법.
- 제50항에 있어서, 비-반추동물이 말류(equine), 가금류, 및 돼지류로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제29항 내지 제33항, 제35항 내지 제47항, 제50항, 또는 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 동물이 가금류 동물인 방법.
- 제52항에 있어서, 가금류 동물이 닭, 거위, 오리, 메추라기, 칠면조, 또는 비둘기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제52항 또는 제53항에 있어서, 가금류 동물이 영계, 육용종계, 및 산란닭으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 가금류 동물이 닭인 방법.
- 제29항 내지 제47항, 제50항, 또는 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 동물이 말류(equine)인 방법.
- 제56항에 있어서, 말류가 말(horse), 조랑말, 당나귀, 또는 노새인 방법.
- 가금류 동물에게 유효량의 엠. 엘스데니이 세포를 투여함을 포함하여, 가금류 동물의 위장관내 젖산 생산과 관련된 상태 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법.
- 제58항에 있어서, 상태 또는 장애가 산증인 방법.
- 제58항에 있어서, 상태 또는 장애가 호흡기 질환인 방법.
- 제58항에 있어서, 상태 또는 장애가 감염인 방법.
- 제61항에 있어서, 감염이 살모넬라 또는 캄필로박터에 의한 것인 방법.
- 가금류 동물에게 유효량의 엠. 엘스데니이 세포를 투여함을 포함하여, 가금류 동물의 위장내 기회감염 미생물의 성장을 예방하거나 감소시키는 방법.
- 제63항에 있어서, 기회감염 미생물이 병원성인 방법.
- 제63항 또는 제64항에 있어서, 기회감염 미생물이 살모넬라 또는 캄필로박터인 방법.
- 가금류 동물에게 유효량의 엠. 엘스데니이 세포를 투여함을 포함하여, 가금류 동물의 식이(diet) 속에서 식물-유래된 인의 생체이용률을 증진시키는 방법.
- 가금류 동물에게 유효량의 엠. 엘스데니이 세포를 투여함을 포함하여, 가금류 동물에서 성장 능력을 증진시키는 방법으로서, 여기서 동물에서 증진된 성장 능력은 사료 섭취, 평균 일당증체량, 사료 요구율, 사체 획득, 알 생산, 골 광화, 또는 이의 조합에 있어서의 증진인 방법.
- 제56항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 가금류 동물이, 닭, 거위, 오리, 메추라기, 칠면조, 또는 비둘기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제58항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 가금류 동물이 영계, 육용종계, 및 산란닭으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제58항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 가금류 동물이 닭인 방법.
- 말류에게 유효량의 엠. 엘스데니이 세포를 투여함을 포함하여, 말류의 위장관내에서의 젖산 생산과 관련된 상태 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법.
- 제71항에 있어서, 상태 또는 장애가 산증인 방법.
- 제71항에 있어서, 상태 또는 장애가 호흡기 질환인 방법.
- 제71항에 있어서, 상태 또는 장애가 제엽염인 방법.
- 제71항에 있어서, 상태 또는 장애가 감염인 방법.
- 제75항에 있어서, 감염이 살모넬라 또는 캄필로박터에 의한 것인 방법.
- 말류에게 유효량의 엠. 엘스데니이 세포를 투여함을 포함하여, 말류의 위장관속에서 기회감염 미생물의 성장을 예방하거나 감소시키는 방법.
- 제77항에 있어서, 기회감염 미생물이 병원성인 방법.
- 제77항 또는 제78항에 있어서, 기회감염 미생물이 살모넬라 또는 캄필로박터인 방법.
- 말류에게 유효량의 엠. 엘스데니이 세포를 투여함을 포함하여, 말류의 식이 속의 식물-유래된 인의 생체이용률을 증진시키는 방법.
- 말류에게 유효량의 엠. 엘스데니이 세포를 투여함을 포함하여, 말류에서 성장 능력을 증진시키는 방법으로서, 여기서 동물에서 증진된 성장 능력은 사료 섭취, 평균 일당증체량, 사료 요구율, 사체 획득, 젖 생산, 알 생산, 골 광화, 또는 이의 조합에 있어서의 증진인 방법.
- 제71항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 말류가 말, 조랑말, 당나귀, 또는 노새인 방법.
- 제58항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 사료 첨가제가 엠. 엘스디니이 세포를 포함하는 방법.
- 제83항에 있어서, 사료 첨가제가 분말, 과립, 입자상 물질, 펠렛, 케이크, 액체, 겔, 또는 이의 조합인 방법.
- 제58항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 엠. 엘스데니이 세포 또는 이러한 세포를 포함하는 사료 첨가제를 포함하는 방법.
- 제85항에 있어서, 조성물이 캅셀제인 방법.
- 제58항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 엠. 엘스데니이 세포가 동결-건조된 세포인 방법.
- 제58항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 엠. 엘스데니이 세포가 액체로 투여되는 방법.
- 제88항에 있어서, 방법이 사료 첨가제 또는 동결-건조된 세포를 재수화시켜 액체를 생산함을 추가로 포함하는 방법.
- 제88항 또는 제89항에 있어서, 액체가 경구 섭식에 의해 또는 동물을 액체로 분무시킴에 의해 투여되는 방법.
- 제58항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 엠. 엘스데니이 세포가 동물에게 사료를 사용하여 먹이를 주기 전, 이와 동시에, 또는 후에 투여되는 방법.
- 제58항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 엠. 엘스데니이 세포의 단일 투여를 포함하는 방법.
- 제58항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 엠. 엘스데니이 세포의 매일 투여를 포함하는 방법.
- 제58항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 하루에 엠. 엘스데니이 세포의 1회 이상의 투여를 포함하는 방법.
- (a) 혐기성 조건 하에서 메가스파에라 세포 및, 카제인, 락테이트, 덱스트로즈, 프럭토즈, 프럭탄, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈, 아세테이트, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 사카로즈, 크실로즈, 몰라세스, 푸코즈, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 아세트산나트륨, 아라비노즈, 대두 단백질, 가용성 단백질, 라피노즈, 아밀로즈, 전분, 트립톤, 효모 추출물, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 탄소원을 포함하는 성장 배지를 포함하는 배양물을 제조하는 단계,
(b) 세포를 혐기성 조건 하에서 수거하는 단계,
(c) 세포를 동결시키는 단계,
(d) 세포를 동결-건조시키는 단계, 및
(e) 세포를 캅셀화하는 단계로서, 여기서 약 1 x 103 내지 약 1 x 1012 CFU/g의 캅셀화된 동결-건조된 메가스파에라 세포가 생산되는 단계를 포함하는,
동결-건조된 메가스파에라 세포의 생산 방법. - 동물에게 제95항의 방법에 의해 생산된 캅셀화된 동결-건조된 메가스파에라 세포를 투여하는 단계를 포함하여, 동물에게 메가스파에라 세포를 투여하는 방법.
- 동물에게 유효량의 제95항의 방법에 의해 생산된 캅셀화된 동결-건조된 메가스파에라 세포를 투여하는 단계를 포함하여, 동물에서 성장 능력을 증진시키는 방법으로서, 여기서 동물에서 증진된 성장 능력이 사료 섭취, 평균 일당증체량, 사료 요구율, 사체 획득, 젖-생산 동물에서 젖 생산, 가금류에서 알 생산, 골 광화, 또는 이의 조합에 있어서의 증진인 방법.
- 동물에게 유효량의 제95항에 따른 방법에 의해 생산된 캅셀화된 동결-건조된 메가스파에라 세포를 투여함을 포함하여, 동물의 위장관내 기회감염 미생물의 성장을 예방하거나 감소시키기 위한 방법.
- 제95항에 따른 방법에 의해 생산된 캅셀화된 동결-건조된 메가스파에라 세포를 포함하는 조성물.
- (a) 혐기성 조건 또는 부분 혐기성 조건 하에서 혐기성 세균 세포 및, 카제인, 락테이트, 덱스트로즈, 프럭토즈, 프럭탄, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈, 아세테이트, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 사카로즈, 크실로즈, 몰라세스, 푸코즈, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 아세트산나트륨, 아라비노즈, 대두 단백질, 가용성 단백질, 라피노즈, 아밀로즈, 전분, 트립톤, 효모 추출물, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 탄소원을 포함하는 성장 배지를 포함하는 배양물을 제조하는 단계,
(b) 세포를 혐기성 조건 또는 부분 혐기성 조건하에서 수거하는 단계,
(c) 세포를 동결시키는 단계, 및
(d) 세포를 동결-건조시키는 단계로서, 여기서 약 1 x 103 내지 약 1 x 1012 CFU/g의 동결-건조된 혐기성 세균 세포가 생산되는 단계를 포함하는,
동결-건조된 혐기성 세균 세포의 생산 방법. - 동물에게 제100항에 따른 방법에 의해 생산된 동결-건조된 혐기성 세균 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 동물에게 혐기성 세균 세포를 투여하는 방법.
- 동물에게 유효량의 제100항에 따른 방법에 의해 생산된 동결-건조된 혐기성 세균 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 동물에서 성장 능력을 증진시키는 방법으로서, 여기서 동물에서 증진된 성장 능력이 사료 섭취, 평균 일당증체량, 사료 요구율, 사체 획득, 젖-생산 동물에서 젖 생산, 가금류에서 알 생산, 골 광화, 또는 이의 조합에 있어서의 증진인 방법.
- 동물에게 유효량의 제100항에 따른 방법에 의해 생산된 동결-건조된 혐기성 세균 세포를 투여하는 단계를 포함하여, 동물의 위장 관 속의 기회감염 미생물을 예방하거나 감소시키는 방법.
- 제100항에 따른 방법에 의해 생산된 동결-건조된 혐기성 세균 세포를 포함하는 조성물.
- (a) 혐기성 조건 또는 부분 혐기성 조건 하에서 혐기성 세균 세포 및, 카제인, 락테이트, 덱스트로즈, 프럭토즈, 프럭탄, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈, 아세테이트, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 사카로즈, 크실로즈, 몰라세스, 푸코즈, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 아세트산나트륨, 아라비노즈, 대두 단백질, 가용성 단백질, 라피노즈, 아밀로즈, 전분, 트립톤, 효모 추출물, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 탄소원을 포함하는 성장 배지를 포함하는 배양물을 제조하는 단계,
(b) 세포를 혐기성 조건 또는 부분 혐기성 조건하에서 수거하는 단계,
(c) 세포를 동결시키는 단계,
(d) 세포를 동결-건조시키는 단계, 및
(e) 세포를 캅셀화하는 단계로서, 여기서 약 1 x 103 내지 약 1 x 1012 CFU/g의 캅셀화된 동결-건조된 혐기성 세균 세포가 생산되는 단계를 포함하는,
캅셀화된, 동결-건조된 혐기성 세균 세포의 생산 방법. - 동물에게 제105항에 따른 방법에 의해 생산된 캅셀화된 동결-건조된 혐기성 세균 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 동물에게 혐기성 세균 세포를 투여하는 방법.
- 동물에게 유효량의 제105항에 따른 방법에 의해 생산된 캅셀화된 동결-건조된 혐기성 세균 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 동물에서 성장 능력을 증진시키는 방법으로서, 여기서 동물에서 증진된 성장 능력이 사료 섭취, 평균 일당증체량, 사료 요구율, 사체 획득, 젖 생산 동물에서 젖 생산, 가금류에서 알 생산, 골 광화, 또는 이의 조합에 있어서의 증진인 방법.
- 동물에게 유효량의 제105항에 따른 방법에 의해 생산된 캅셀화된 동결-건조된 혐기성 세균 세포를 투여함을 포함하는, 동물의 위장관내에서 기회감염 미생물의 성장을 예방하거나 감소시키기 위한 방법.
- 제105항에 따른 방법에 의해 생산된 캅셀화된 동결-건조된 혐기성 세균 세포를 포함하는 조성물.
- (a) 호기성 조건 하에서 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포 및, 카제인, 락테이트, 덱스트로즈, 프럭토즈, 프럭탄, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈, 아세테이트, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 사카로즈, 크실로즈, 몰라세스, 푸코즈, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 아세트산나트륨, 아라비노즈, 대두 단백질, 가용성 단백질, 라피노즈, 아밀로즈, 전분, 트립톤, 효모 추출물, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 탄소원을 포함하는 성장 배지를 포함하는 배양물을 제조하는 단계,
(b) 세포를 수거하는 단계,
(c) 세포를 동결시키는 단계, 및
(d) 세포를 동결-건조시키는 단계로서, 여기서 약 1 x 103 내지 약 1 x 1012 CFU/g의 동결-건조된 호기성 세균 및/또는 효모 세포가 생산되는 단계를 포함하는,
동결-건조된 호기성 세균 및/또는 효모 세포의 생산 방법. - 동물에게 제110항에 따른 방법에 의해 생산된 동결-건조된 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포를 투여하는 단계를 포함하여, 동물에게 호기성 세균 및/또는 효모 세포를 투여하는 방법.
- 동물에게 유효량의 제110항에 따른 방법에 의해 생산된 동결-건조된 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포를 투여함을 포함하는, 동물에서 성장 능력을 증진시키는 방법으로서, 여기서 동물에서 증진된 성장 능력이 사료 섭취, 평균 일당증체량, 사료 요구율, 사체 획득, 젖 생산 동물에서 젖 생산, 가금류에서 알 생산, 골 광화, 또는 이의 조합에 있어서의 증진인 방법.
- 동물에게 유효량의 제110항에 따른 방법에 의해 생산된 동결-건조된 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포를 투여하는 단계를 포함하여, 동물의 위장관내에서 기회감염 미생물의 성장을 예방하거나 감소시키기 위한 방법.
- 제110항에 따른 방법에 의해 생산된 동결-건조된 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포를 포함하는 조성물.
- (a) 호기성 조건 하에서 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포 및, 카제인, 락테이트, 덱스트로즈, 프럭토즈, 프럭탄, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈, 아세테이트, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 사카로즈, 크실로즈, 몰라세스, 푸코즈, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 아세트산나트륨, 아라비노즈, 대두 단백질, 가용성 단백질, 라피노즈, 아밀로즈, 전분, 트립톤, 효모 추출물, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 탄소원을 포함하는 성장 배지를 포함하는 배양물을 제조하는 단계,
(b) 세포를 호기성 조건 하에서 수거하는 단계,
(c) 세포를 동결시키는 단계,
(d) 세포를 동결-건조시키는 단계, 및
(e) 세포를 캅셀화하는 단계로서, 여기서 약 1 x 103 내지 약 1 x 1012 CFU/g의 캅셀화된 동결-건조된 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포가 생산되는 단계를 포함하는,
캅셀화된 동결-건조된 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포의 생산 방법. - 동물에게 제115항에 따른 캅셀화된 동결-건조된 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 동물에게 호기성 세균 및/또는 효모 세포를 투여하는 방법.
- 동물에게 유효량의 제115항에 따른 방법에 의해 생산된 캅셀화된 동결-건조된 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포를 투여함을 포함하여, 동물에서 성장 능력을 증진시키는 방법으로서, 여기서 동물에서 증진된 성장 능력이 사료 섭취, 평균 일당증체량, 사료 요구율, 사체 획득, 젖 생산 동물에서 젖 생산, 가금류에서 알 생산, 골 광화, 또는 이의 조합에 있어서의 증진인 방법.
- 동물에게 유효량의 제115항에 따른 방법에 의해 생산된 캅셀화된 동결-건조된 혐기성 세균 세포 및/또는 효모 세포를 투여함을 포함하여, 동물의 위장관내에서 기회감염 미생물의 성장을 예방하거나 감소시키기 위한 방법.
- 제115항에 따른 방법에 의해 생산된 캅셀화된 동결-건조된 호기성 세균 세포 및/또는 효모 세포 포함하는 조성물.
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