TW202408639A - 電噴霧乾燥厭氧細菌之方法及其組合物 - Google Patents

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明威 劉
詹姆士 史考特 德魯亞德
阿曼達 彼得森
席琳 卡洛琳 阿普爾斯
吉娜 瑞 海倫
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美商雅西奧塔美國公司
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Abstract

本發明係關於電噴霧乾燥厭氧細菌細胞及/或埃氏巨球型菌( Megasphaera elsdenii)之方法及系統、其組合物及飼料添加劑。該等方法、其組合物及飼料添加劑將在細菌延長儲存後導致經改善之存活率及產率。此等改善係有利於一定範圍之應用，包括用於動物健康及飼養中。

Description

電噴霧乾燥厭氧細菌之方法及其組合物
本發明係關於透過施加少量熱量將厭氧細菌電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法及系統。
埃氏巨球型菌( Megasphaera elsdenii，即 M. elsdenii)係一種厭氧非運動性及革蘭氏陰性雙球菌，其利用乳酸鹽作為較佳碳源且可有助於預防酸中毒，酸中毒係一種常見的消化系統疾患，其每年影響數百萬頭牛及乳牛。
當牛及其他反芻動物攝取大量澱粉質食物(例如，穀粒)或單糖時，胃中之伺機性微生物會迅速將此等化合物發酵成乳酸。乳酸係一種強效有機酸且會導致乳酸中毒，該乳酸中毒會破壞反芻動物之正常消化活動並對消化道內壁造成廣泛損害。受影響之動物表現欠佳。且乳酸中毒之最急性形式會對動物之消化及呼吸道系統系統造成不可逆轉之損害，以及增加死亡率。
埃氏巨球型菌可藉由將乳酸轉化為作為無害有機化合物之揮發性脂肪酸(VFA；例如丁酸鹽、丙酸鹽及乙酸鹽)來有助於控制乳酸中毒。然而，反芻動物胃腸道中之埃氏巨球型菌群體通常含量過低以致難以預防酸中毒之風險。因此，研發來自埃氏巨球型菌之菌株(Lactipro®)之活細胞之液體培養物以增加埃氏巨球型菌於反芻動物胃腸道中之拓殖速率。參見例如美國專利第7,550,139號。然而，含有埃氏巨球型菌之產品的使用受到實際約束限制，包括難以將埃氏巨球型菌產品維持在該生物體所需之厭氧條件下及難以於14天內將該等埃氏巨球型菌產品自生產設施運輸至最終使用地點，14天後該產品中埃氏巨球型菌之存活率顯著降低。含有凍乾埃氏巨球型菌(Lactipro NXT ®)之產品具有比Lactipro®更長之架儲期，但期望進一步改良用於擴大規模生產並使其更具成本效益之方法。參見WO 2018/144653 A1，其係以全文引用之方式併入本文中。
諸如噴霧乾燥之方法通常使用經加熱乾燥流體(例如，經加熱空氣)來產生乾燥粉末，此導致厭氧細菌(例如，埃氏巨球型菌)之穩定性及/或存活率降低。
因此，需用於進行噴霧乾燥製程之新穎方法及裝置，其增加厭氧細菌(例如，埃氏巨球型菌)之穩定性及存活率且其減少或消除習知噴霧乾燥製程之不利特性。亦需要克服現存限制的其他厭氧細菌(包括雙叉桿菌( Bifidobacterium) (諸如短型雙叉桿菌( B. breve))、乳桿菌( Lactobacillus) (諸如胚芽乳桿菌( L. plantarum))、雙叉桿菌 (諸如動物雙叉桿菌乳亞種( B. animalissubsp. lactis))、片球菌( Pediococcus) (諸如乳酸片球菌( P. acidilactici))、乳桿菌 (諸如乾酪乳桿菌( L. casei))、絲狀桿菌( Fibrobacter) (諸如產琥珀酸絲狀桿菌( F. succinogenes))及丁酸弧菌( Butyrivibrio) (諸如溶纖維丁酸弧菌( B. fibrisolvens)))之穩定粉末調配物，及其產生方法。亦需要克服現存限制的其他厭氧細菌(包括雙叉桿菌(諸如短型雙叉桿菌)、乳桿菌(諸如胚芽乳桿菌)、雙叉桿菌(諸如動物雙叉桿菌乳亞種)、片球菌(諸如乳酸片球菌)、乳桿菌(諸如乾酪乳桿菌)、絲狀桿菌(諸如產琥珀酸絲狀桿菌)及丁酸弧菌(諸如溶纖維丁酸弧菌)、瘤胃球菌( Ruminococcus) (諸如黃色瘤胃球菌( R. flavefaciens)))之穩定粉末調配物及其產生方法。
在一些態樣中，本文提供一種用於將埃氏巨球型菌細胞噴霧乾燥成乾燥粉末之系統，該系統包含水、載劑及埃氏巨球型菌細胞之來源；包含攪拌裝置之貯槽，且該貯槽係經佈置以自該來源接收該水、該載劑及該等埃氏巨球型菌細胞以形成黏度於約1 cP至約500 cP範圍內之漿料；經構形以使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料之電極；噴霧器；包含入口端、出口端及位於該入口端與該出口端之間的內部體積之乾燥室，該內部體積係經構形以容納該漿料及乾燥流體。在一些態樣中，該乾燥室係經構形以乾燥該漿料。在一些態樣中，該噴霧器係經構形以：(i)自該貯槽接收該漿料；及(ii)將該漿料排放至該乾燥室內用於與該乾燥流體接觸以形成含有該等埃氏巨球型菌細胞之乾燥粉末。在一些態樣中，該乾燥流體包含溫度介於約50℃至約100℃之間的氮或氬，且其中整個系統係在小於2%氧下。
在一些態樣中，本文提供一種將埃氏巨球型菌細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括：製備包含埃氏巨球型菌細胞、生長培養基及滲透物保護劑分子之培養物；收獲該等埃氏巨球型菌細胞，形成包含水、載劑及該等埃氏巨球型菌細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度；使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料；使該漿料霧化以產生該漿料之液滴之噴霧；將該漿料之液滴之該噴霧引入乾燥室內；及將介於50℃至100℃之間的溫度之乾燥流體進料至該乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之埃氏巨球型菌細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末。在一些態樣中，該乾燥粉末包含小於15%含水量。在一些態樣中，整個方法係在小於2%氧下進行。
在一些態樣中，本文提供一種將埃氏巨球型菌細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括：製備包含埃氏巨球型菌細胞、生長培養基及滲透物保護劑分子之培養物，其中在培養期間，於一定時間週期內改變pH、溫度及/或滲透壓；收獲該等埃氏巨球型菌細胞；形成包含水、載劑及該等埃氏巨球型菌細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度；使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料；使該漿料霧化以產生該漿料之液滴之噴霧；將該漿料之液滴之該噴霧引入乾燥室內；及將溫度介於約50℃至約100℃之間的乾燥流體進料至該乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之埃氏巨球型菌細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末。在一些態樣中，該乾燥粉末包含小於15%含水量。在一些態樣中，整個方法係在小於2%氧下進行。
在一些態樣中，載劑具有約2重量%至約30重量%之最終濃度。
在一些態樣中，本文提供一種將埃氏巨球型菌細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括：製備包含埃氏巨球型菌細胞及生長培養基之培養物；添加滲透物保護劑分子；收獲該等埃氏巨球型菌細胞；形成包含水、載劑及該等埃氏巨球型菌細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度；使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料；使該漿料霧化以產生該漿料之液滴之噴霧；將該漿料之液滴之該噴霧引入乾燥室內；及將溫度介於約50℃至約100℃之間的乾燥流體進料至該乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之埃氏巨球型菌細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末，其中該乾燥粉末包含小於15%含水量，且其中整個方法係在小於2%氧下進行。
在一些態樣中，本文提供一種將埃氏巨球型菌細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括：製備包含埃氏巨球型菌細胞及生長培養基之培養物，其中在培養期間，於一定時間週期內改變pH、溫度及/或滲透壓；添加滲透物保護劑分子；收獲該等埃氏巨球型菌細胞；形成包含水、載劑及該等埃氏巨球型菌細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度；使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料；使該漿料霧化以產生該漿料之液滴之噴霧；將該漿料之液滴之該噴霧引入乾燥室內；及將溫度介於約50℃至約100℃之間的乾燥流體進料至該乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之埃氏巨球型菌細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末，其中該乾燥粉末包含小於10%含水量，且其中整個方法係在小於2%氧下進行。
在一些態樣中，本文提供一種將埃氏巨球型菌細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括：製備包含埃氏巨球型菌細胞及生長培養基之培養物；收獲該等埃氏巨球型菌細胞；添加滲透物保護劑分子；形成包含水、載劑及該等埃氏巨球型菌細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度；使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料；使該漿料霧化以產生該漿料之液滴之噴霧；將該漿料之液滴之該噴霧引入乾燥室內；及將溫度介於約50℃至約100℃之間的乾燥流體進料至乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之埃氏巨球型菌細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末，其中該乾燥粉末包含小於15%含水量，且其中整個方法係在小於2%氧下進行。
在一些態樣中，本文提供一種將埃氏巨球型菌細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括：製備包含埃氏巨球型菌細胞及生長培養基之培養物，其中在培養期間，於一定時間週期內改變pH、溫度及/或滲透壓；收獲該等埃氏巨球型菌細胞；添加滲透物保護劑分子；形成包含水、載劑及該等埃氏巨球型菌細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度；使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料；使該漿料霧化以產生該漿料之液滴之噴霧；將該漿料之液滴之該噴霧引入乾燥室內；及將溫度介於約50℃至約100℃之間的乾燥流體進料至該乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之埃氏巨球型菌細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末，其中該乾燥粉末包含小於10%含水量，且其中整個方法係在小於2%氧下進行。
在一些態樣中，本文提供一種形成包含囊封於載劑內之埃氏巨球型菌細胞之乾燥粉末之方法，該方法包括：於混合貯槽中形成包含水、載劑及埃氏巨球型菌細胞之漿料，同時用攪拌裝置攪拌該混合貯槽；使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料；於噴霧器中使該漿料霧化並將霧化漿料排放至乾燥室內用於與乾燥流體接觸以形成含有囊封於該載劑內之埃氏巨球型菌細胞之乾燥粉末。在一些態樣中，該乾燥流體包含溫度介於約50℃至約100℃之間的氮或氬。在一些態樣中，該乾燥粉末包含小於10%含水量。在一些態樣中，整個方法係在厭氧條件下進行。在一些態樣中，整個方法係在小於2%氧下進行。
在一些態樣中，該乾燥流體係選自由氮及氬組成之群。
在一些態樣中，該等埃氏巨球型菌細胞係在收獲前濃縮約20X至約100X。
在一些態樣中，該方法進一步包括藉由將乾燥流體進料至乾燥室內前，施加約0.1 kV至約45 kV之電壓而將該乾燥流體加熱至介於約50℃至約100℃之間。
在一些態樣中，該方法進一步包括藉由將乾燥流體進料至乾燥室內前，施加約10 kV至約30 kV之電壓而將該乾燥流體加熱至介於約50℃至約100℃之間。
在一些態樣中，該方法進一步包括藉由將乾燥流體進料至乾燥室內前，施加約11 kV至約25 kV之電壓而將該乾燥流體加熱至介於約50℃至約100℃之間。
在一些態樣中，該乾燥流體溫度介於約60℃至約90℃之間。
在一些態樣中，該方法進一步包括藉由將乾燥流體進料至乾燥室內前施加約10 kV至約30 kV之電壓而將該乾燥流體加熱至介於約60℃至約90℃之間。
在一些態樣中，該電壓係以恆定或脈衝方式施加。
在一些態樣中，該載劑係選自由以下組成之群：糖、糖醇、糖衍生物、多醣、囊封聚合物或氮源，及其混合物。在一些態樣中，該糖係蔗糖。
在一些態樣中，該囊封聚合物係海藻酸鹽。
在一些態樣中，該載劑係以約1%至約40% (w/v)之量存在。
在一些態樣中，該乾燥粉末包含約1 x 10 3至約1 x 10 13CFU/公克之埃氏巨球型菌細胞。
在一些態樣中，該乾燥粉末包含約1 x 10 3CFU/公克之埃氏巨球型菌細胞。
在一些態樣中，該培養物之體積係至少2至50公升。在一些態樣中，該培養物之體積係至少2公升。
在一些態樣中，該培養物之體積係至少50公升。
在一些態樣中，本文提供一種飼料添加劑，其包含藉由本文描述之方法中之任一者產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞。
在一些態樣中，該飼料添加劑進一步包含另一微生物。
在一些態樣中，該飼料添加劑係選自由以下組成之群：粉末、顆粒、微粒、集結粒、餅狀物，或其組合。
在一些態樣中，該飼料添加劑係益生菌。
在一些態樣中，本文提供一種組合物，其包含藉由本文描述之方法中之任一者產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞。在一些態樣中，該組合物包含本文描述之飼料添加劑中之任一者。
在一些態樣中，該組合物係膠囊。
在一些態樣中，本文提供一種套組，其包含藉由本文描述之方法中之任一者產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、本文描述之飼料添加劑中之任一者或本文描述之組合物中之任一者。
在一些態樣中，本文提供一種用於治療或預防與動物胃腸道中之乳酸產生相關聯之病症或疾患之方法，其包括對該動物投與有效量之藉由本文描述之方法中之任一者產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、本文描述之飼料添加劑中之任一者或本文描述之組合物中之任一者。
在一些態樣中，該病症或疾患係酸中毒。
在一些態樣中，其中該病症或疾患係瘤胃酸中毒。在一些態樣中，該病症或疾患係後腸酸中毒。
在一些態樣中，該病症或疾患係呼吸道疾病。
在一些態樣中，該病症或疾患係蹄葉炎。
在一些態樣中，該病症或疾患係感染。
在一些態樣中，該感染係由沙氏桿菌( Salmonella)或彎曲桿菌( Campylobacter)引起。
在一些態樣中，本文提供一種用於預防或減少伺機性微生物於動物胃腸道中生長之方法，其包括對該動物投與有效量之藉由本文描述之方法中之任一者產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、本文描述之飼料添加劑中之任一者或本文描述之組合物中之任一者。
在一些態樣中，該伺機性微生物係致病的。
在一些態樣中，該伺機性微生物係沙氏桿菌或彎曲桿菌。在一些態樣中，該伺機性微生物係大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)。
在一些態樣中，本文提供一種改善動物飲食中之植物來源磷之生體可用率之方法，其包括對該動物投與有效量之藉由本文描述之方法中之任一者產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、本文描述之飼料添加劑中之任一者或本文描述之組合物中之任一者。
在一些態樣中，本文提供一種改善動物中之生長表現之方法，其包括對該動物投與有效量之藉由本文描述之方法中之任一者產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、本文描述之飼料添加劑中之任一者或本文描述之組合物中之任一者。在一些態樣中，動物中之經改善之生長表現係以下之改善：飼料攝取量、平均日增重、飼料轉化率、屠體增重、產乳動物之產乳量、家禽之產蛋量、骨礦化，或其組合。
在一些態樣中，該等經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、該飼料添加劑或該組合物係在用食物飼餵動物之前、同時或之後投與。
在一些態樣中，該方法進一步包括在投與前將經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞或飼料添加劑與液體混合。
在一些態樣中，該液體係口服或藉由對動物噴霧該液體投與。
在一些態樣中，該方法包括單次投與經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、飼料添加劑或組合物。
在一些態樣中，該方法包括每日投與經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、飼料添加劑或組合物。
在一些態樣中，該方法包括於一天內多於一次投與經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、飼料添加劑或組合物。
在一些態樣中，該動物係反芻動物。
在一些態樣中，該反芻動物係選自由以下組成之群：牛、綿羊、山羊、鹿、水牛及馴鹿。
在一些態樣中，該動物係非反芻動物。
在一些態樣中，該非反芻動物係選自由以下組成之群：馬類、家禽及豬。
在一些態樣中，該家禽係選自由以下組成之群：雞、鵝、鴨、鵪鶉、火雞或鴿子。
在一些態樣中，該家禽係選自由以下組成之群：肉雞、肉種雞及蛋雞。
在一些態樣中，該家禽係雞。
在一些態樣中，該馬類係馬、小馬、驢或騾。
在一些態樣中，該載劑係選自由以下組成之群：糖、糖醇、糖衍生物、多醣、囊封聚合物或氮源，及其混合物。在一些態樣中，該囊封聚合物係海藻酸鹽。在一些態樣中，該糖係蔗糖。
在一些態樣中，該乾燥粉末包含約1 x 10 3至約1 x 10 13CFU/公克之埃氏巨球型菌細胞。
在一些態樣中，該乾燥粉末包含約1 x 10 3CFU/公克之埃氏巨球型菌細胞。
在一些態樣中，本文提供一種乾燥粉末，其包含複數個藉由本文描述之方法中之任一者形成之乾燥顆粒。
在一些態樣中，本文提供藉由本文描述之方法中之任一者製備之囊封於載劑內之埃氏巨球型菌細胞。
在一些態樣中，本文提供一種用於將厭氧細胞噴霧乾燥成乾燥粉末之系統，該系統包含：水、載劑及厭氧細胞之來源；包含攪拌裝置之貯槽，且該貯槽係經安置以自該來源接收該水、該載劑及該等厭氧細胞以形成黏度於約1 cP至約500 cP範圍內之漿料；經構形以使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料之電極；噴霧器；包含入口端、出口端及位於該入口端與該出口端之間的內部體積之乾燥室，且該內部體積係經構形以容納該漿料及乾燥流體。在一些態樣中，該乾燥室係經構形以乾燥該漿料。在一些態樣中，該噴霧器係經構形以：(i)自該貯槽接收該漿料；及(ii)將該漿料排放至該乾燥室內用於與該乾燥流體接觸以形成含有該等厭氧細胞之乾燥粉末。在一些態樣中，該乾燥流體包含溫度介於約50℃至約100℃之間的氮或氬。在一些態樣中，整個系統係在小於2%氧下。
在一些態樣中，本文提供一種將厭氧細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括：製備包含厭氧細胞、生長培養基及滲透物保護劑分子之培養物；收獲該等厭氧細胞；形成包含水、載劑及該等厭氧細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度；使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料；使該漿料霧化以產生該漿料之液滴之噴霧；將該漿料之液滴之該噴霧引入乾燥室內；及將溫度介於約50℃至約100℃之間的乾燥流體進料至該乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之厭氧細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末。在一些態樣中，該乾燥粉末包含小於10%含水量。在一些態樣中，整個方法係在小於2%氧下進行。
在一些態樣中，本文提供一種將厭氧細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括：製備包含厭氧細胞、生長培養基及滲透物保護劑分子之培養物；收獲該等厭氧細胞；形成包含水、載劑及該等厭氧細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度；使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料；使該漿料霧化以產生該漿料之液滴之噴霧；將該漿料之液滴之該噴霧引入乾燥室內；及將溫度介於約50℃至約100℃之間的乾燥流體進料至該乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之厭氧細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末。在一些態樣中，在培養期間，於一定時間週期內改變pH、溫度及/或滲透壓。在一些態樣中，該乾燥粉末包含小於15%含水量。在一些態樣中，整個方法係在厭氧條件下進行。在一些態樣中，整個方法係在小於2%氧下進行。
在一些態樣中，載劑具有約2重量%至約30重量%之最終濃度。
在一些態樣中，本文提供一種將厭氧細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括：製備包含厭氧細胞及生長培養基之培養物；添加滲透物保護劑分子；收獲該等厭氧細胞；形成包含水、載劑及該等厭氧細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度；使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料；使該漿料霧化以產生該漿料之液滴之噴霧；將該漿料之液滴之該噴霧引入乾燥室內；及將溫度介於約50℃至約100℃之間的乾燥流體進料至該乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之厭氧細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末，其中該乾燥粉末包含小於15%含水量，且其中整個方法係在小於2%氧下進行。
在一些態樣中，本文提供一種將厭氧細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括：製備包含厭氧細胞及生長培養基之培養物，其中在培養期間，於一定時間週期內改變pH、溫度及/或滲透壓；添加滲透物保護劑分子；收獲該等厭氧細胞；形成包含水、載劑及該等厭氧細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度；使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料；使該漿料霧化以產生該漿料之液滴之噴霧；將該漿料之液滴之該噴霧引入乾燥室內；及將溫度介於約50℃至約100℃之間的乾燥流體進料至該乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之厭氧細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末，其中該乾燥粉末包含小於10%含水量，且其中整個方法係在小於2%氧下進行。
在一些態樣中，滲透物保護劑分子係在細胞生長期間、在收獲細胞之前或之後添加。
在一些態樣中，本文提供一種將厭氧細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括：製備包含厭氧細胞及生長培養基之培養物；收獲該等厭氧細胞；添加滲透物保護劑分子；形成包含水、載劑及該等厭氧細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度；使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料；使該漿料霧化以產生該漿料之液滴之噴霧；將該漿料之液滴之該噴霧引入乾燥室內；及將溫度介於約50℃至約100℃之間的乾燥流體進料至該乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之厭氧細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末，其中該乾燥粉末包含小於15%含水量，且其中整個方法係在小於2%氧下進行。
在一些態樣中，該滲透物保護劑分子係在細胞生長期間、收獲細胞之前或之後添加。
在一些態樣中，本文提供一種將厭氧細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括：製備包含厭氧細胞及生長培養基之培養物，其中在培養期間，於一定時間週期內改變pH、溫度及/或滲透壓；收獲該等厭氧細胞；添加滲透物保護劑分子；形成包含水、載劑及該等厭氧細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度；使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料；使該漿料霧化以產生該漿料之液滴之噴霧；將該漿料之液滴之該噴霧引入乾燥室內；及將溫度介於約50℃至約100℃之間的乾燥流體進料至該乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之厭氧細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末，其中該乾燥粉末包含小於10%含水量，且其中整個方法係在小於2%氧下進行。
在一些態樣中，該滲透物保護劑分子係在細胞生長期間、收獲細胞之前或之後添加。
在一些態樣中，本文提供一種形成包含囊封於載劑內之厭氧細胞之乾燥粉末之方法，該方法包括：於混合貯槽中形成包含水、載劑及厭氧細胞之漿料，同時用攪拌裝置攪拌該混合貯槽；使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料；於噴霧器中使該漿料霧化並將霧化漿料排放至乾燥室內用於與乾燥流體接觸以形成含有囊封於該載劑內之厭氧細胞之乾燥粉末。在一些態樣中，該乾燥流體包含溫度介於約50℃至約100℃之間的氮或氬。在一些態樣中，該乾燥粉末包含小於15%含水量。在一些態樣中，整個方法係在厭氧條件下進行。在一些態樣中，整個方法係在小於2%氧下。
在一些態樣中，該滲透物保護劑分子係在細胞生長期間、收獲細胞之後或之後添加。
在一些態樣中，該乾燥流體係選自由氮及氬組成之群。
在一些態樣中，該等厭氧細胞係在收獲前濃縮約25X至約100X。
在一些態樣中，該方法進一步包括藉由將乾燥流體進料至乾燥室內前，施加約0.1 kV至約45 kV之電壓而將該乾燥流體加熱至介於約50℃至約100℃之間。
在一些態樣中，該方法進一步包括藉由將乾燥流體進料至乾燥室內前，施加約10 kV至約30 kV之電壓而將該乾燥流體加熱至介於約50℃至約100℃之間。
在一些態樣中，該方法進一步包括藉將乾燥流體進料至乾燥室內前，施加約11 kV至約25 kV之電壓而將該乾燥流體加熱至介於約50℃至約100℃之間。
在一些態樣中，該乾燥流體溫度介於約60℃至約90℃之間。
在一些態樣中，該方法進一步包括藉由將乾燥流體進料至乾燥室內前，施加約10 kV至約30 kV之電壓而將該乾燥流體加熱至介於約60℃至約90℃之間。
在一些態樣中，該電壓係以恆定或脈衝方式施加。
在一些態樣中，該載劑係選自由以下組成之群：蔗糖、糖、糖醇、糖衍生物、多醣、囊封聚合物或氮源，及其混合物。
在一些態樣中，該囊封聚合物係海藻酸鹽。
在一些態樣中，該乾燥粉末包含約1 x 10 3至約1 x 10 13CFU/公克之厭氧細胞。
在一些態樣中，該乾燥粉末包含約1 x 10 3CFU/公克之厭氧細胞。
在一些態樣中，本文提供一種乾燥粉末，其包含複數個藉由本文描述之方法中之任一者形成之乾燥顆粒。
在一些態樣中，本文提供藉由本文描述之方法中之任一者製備之囊封於載劑內之厭氧細胞。
在一些態樣中，本文提供一種改善動物中之生長表現之方法，其包括對該動物投與有效量之藉由本文描述之方法中之任一者產生之經電噴霧乾燥之厭氧細胞。在一些態樣中，該動物中之經改善之生長表現係以下之改善：飼料攝取量、平均日增重、飼料轉化率、屠體增重、產乳動物之產乳量、家禽之產蛋量、骨礦化，或其組合。
在一些態樣中，本文提供一種用於預防或減少伺機性微生物於動物胃腸道中生長之方法，其包括對該動物投與有效量之藉由本文描述之方法中之任一者產生之經電噴霧乾燥之厭氧細胞。
在一些態樣中，本文提供一種組合物，其包含藉由本文描述之方法中之任一者產生之經電噴霧乾燥之厭氧細菌細胞。
在一些態樣中，該等埃氏巨球型菌細胞係在收獲前在約30℃至約40℃下、在約30℃下、在約31℃下、在約32℃下、在約33℃下、在約34℃下、在約35℃下、在約36℃下、在約37℃下、在約38℃下、在約39℃下或在約40℃下生長。
在一些態樣中，該等厭氧細胞係在收獲前在約30℃至約40℃下、在約30℃下、在約31℃下、在約32℃下、在約33℃下、在約34℃下、在約35℃下、在約36℃下、在約37℃下、在約38℃下、在約39℃下或在約40℃下生長。
在一些態樣中，該漿料係以介於約1 L/小時與約10,000 L/小時之間的速率處理。在一些態樣中，該漿料係以約3,000 L/小時之速率處理。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2022年7月29日申請之美國臨時申請案第63/369,915號之優先權權益，其係以全文引用之方式併入本文中。
本發明係關於用於藉由施加少量熱量將埃氏巨球型菌電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法。本發明亦係關於包含經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞之飼料添加劑及組合物。
本文中提及之所有公開案、專利及其他參考文獻均係出於所有目的以全文引用之方式併入本文中，該引用之程度就如同以引用之方式將各個別公開案或專利申請案明確且個別地併入本文中一樣。另外，本申請案中任何參考文獻之引用或鑑別不應解釋為承認此參考文獻可作為本發明之現有技術。 術語
除非另有定義，否則本文使用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般技術者通常瞭解之含義相同之含義。在衝突之情況下，將以本申請案(包括定義)為準。除非內文另有要求，否則單數術語應包括複數及複數術語應包括單數。
在使用章節標題之範圍內，不應將其等解釋為必要限制。
如本文及隨附申請專利範圍中使用，除非內文另有明確規定，否則單數形式「一」、「一個」及「該」包括複數個參考物。例如，術語「化合物」或「至少一種化合物」可包括複數種化合物，包括其混合物。例如，術語「一」、「一個」、「該」、「一或多種」及「至少一種」於本文中可互換使用。
如本文使用，術語「約」當用於修飾與本發明相關之量時，係指可例如透過例行性測試及處理；透過此測試及處理中之疏忽錯誤；透過本發明中採用之成分之製造、來源或純度之差異；及諸如此類而發生之數值量的變化。無論是否由術語「約」修飾，技術方案均包括列舉量之等效物。在一些態樣中，術語「約」意謂加上或減去報告數值之10%。
在整個本申請案中，本發明之各種態樣可以範圍形式呈現。應瞭解以範圍形式之描述係僅出於便利及簡潔且不應解釋為對本發明範圍之刻板限制。因此，應認為範圍之描述具有明確揭示之所有可能之子範圍及於該範圍內之個別數值。例如，應認為範圍(諸如1至6)之描述具有明確揭示之子範圍(諸如1至2、1至3、1至4、1至5、2至3、2至4、2至5、2至6、3至4、3至5、3至6等)及於該範圍內之個別數字(例如，1、2、3、4、5及6)。此無關於該範圍之寬度同樣適用。
術語「包含(comprises、comprising)」、「包括(includes、including)、「具有」及其等詞形變化可互換且意謂「包括(但不限於)」。應瞭解每當本文用語言「包含」描述態樣時，亦提供以「由……組成」及/或「基本上由……組成」之術語描述之另外類似態樣。
術語「由……組成」意謂「包括且限於」。
術語「基本上由……組成」意謂組合物之指定材料，或方法之指定步驟，及彼等不實質性影響材料或方法之基本特性之另外材料或步驟。
本文使用術語「及/或」時應視為明確揭示兩種指定特徵或組分中之各者，包括或不包括另一者。因此，如諸如本文之「A及/或B」之片語中使用之術語「及/或」旨在包括「A及B」、「A或B」、「A」 (單獨)及「B」 (單獨)。同樣，如諸如「A、B及/或C」之片語中使用之術語「及/或」旨在包含下列態樣中之各者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A (單獨)；B (單獨)；及C (單獨)。
如本文使用，術語「培養(culture/to culture/culturing)」意謂在容許細胞生長或分裂之活體外條件下培養細胞或使細胞維持在活性狀態下。本文亦可使用術語「培養物(a culture)」以係指在活體外條件下培養之細胞(例如，液體生長培養基培養之細胞)。
如本文使用之術語「益生菌」係指一或多種活微生物(細菌及/或酵母菌)且可包括或可不包括其他成分，其當以足夠量投與時可賦予動物或個體健康益處。
如本文中使用之術語「直接飼餵微生物產品」係指含有一或多種活微生物(細菌及/或酵母菌)且可包括或可不包括其他成分的產品，其可以飼料混合物、大丸藥及/或口服糊劑對動物或個體投與，且當以足夠量投與時可賦予該動物或個體健康益處。
如本文使用之術語「飼料添加劑」係指單獨或一起用於營養中(例如，以改善食物(例如，動物飼料)之品質、改善動物之表現及健康及/或增強食物或食物內材料之消化率)之一或多種成分、產品或物質(例如，細胞)。飼料添加劑可為例如益生菌。
如本文使用之術語「生長培養基」及「培養基」係指含有支持細胞生長之組分之固體(例如，瓊脂)、半固體(例如，瓊脂)或液體(例如，兩者)組合物。
如本文使用之術語「收獲(harvest/harvesting)」係指自培養物收集細胞，例如，於來自該培養物之生長培養基中收獲細胞、藉由自該等細胞移除一定量之生長培養基收集細胞(例如，藉由於液體培養物中濃縮該等細胞或自該生長培養基分離該等細胞)，或停止培養該等細胞。該等術語包括收集或移除一定體積之包含來自液體培養物之細胞之液體，包括其中該等細胞已經濃縮之體積。
如本文使用之術語「經分離」不一定反映分離物已經純化之程度但指示自天然形式或天然環境分離或分開。分離物可包括(但不限於)經分離之微生物、經分離之生物質或經分離之培養物。
如本文使用，「賦形劑」係指用於產生如本文揭示之飼料添加劑、食物、組合物或醫藥組合物之所需特性之組分或組分之混合物。本發明之賦形劑可描述為「醫藥上可接受之」賦形劑，當添加至醫藥組合物時，意謂該賦形劑係化合物、材料、組合物、鹽及/或劑型，其於合理之醫學判斷之範圍內適用於與動物(即，人類及非人類動物)之組織接觸而於與合理之收益/風險比相稱之所需接觸持續時間內無過度之毒性、刺激、過敏反應或其他成問題之併發症。
如本文使用，術語「產率」係指活性(或存活的)細胞之量，包括特定體積中(例如，每毫升菌落形成單位(「CFU/mL」))或特定重量中(例如，每公克CFU (「CFU/g」))之量。
如本文使用，術語「存活的」係指一或多種活性生物體或(例如，一或多種活著的微生物細胞)。「存活率」係指尤其在某些條件下活著的能力。
如本文使用，「純化(purify)」、「經純化(purified)」及「純化(purification)」意謂自非所需之組分、材料汙穢、混合物或瑕疵變得大體上純或純淨的。
除非另有說明，否則術語「動物」或「個體」係指屬於動物界之任何生物體且包括(但不限於)水生動物及陸生動物，諸如魚類；商業魚類；觀賞魚；魚苗；雙殼類；軟體動物；甲殼類動物；貝類；蝦；蝦苗；滷蟲；輪蟲；豐年蝦；濾食動物；兩棲類；爬蟲類；哺乳動物；非人類動物；家畜；農場動物；動物園動物；競技類動物；種畜；競速類動物；展示動物；繁育動物(heirloom animals)；珍稀或瀕危動物；伴生動物；寵物(諸如狗、貓、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠或馬)；靈長類動物，諸如猴(例如，捲尾猴(cebus)、恆河猴、非洲綠猴、赤猴、食蟹獼猴及鬚猴)、類人猿、紅毛猩猩、狒狒、長臂猿及黑猩猩；犬科動物，諸如狗及狼；貓科動物，諸如貓、獅子及老虎；馬科動物，諸如馬、小馬、驢、騾及斑馬；食用動物，諸如乳牛、水牛、牛、豬、家禽及綿羊；有蹄類動物，諸如鹿及長頸鹿；鳥類(即，鳥)；家禽類，諸如雞、鵝、鴨、鵪鶉、火雞、鴿子、鴯鶓、鴕鳥及用作食物或農場動物之任何其他鳥，包括肉雞、肉種雞及蛋雞；嚙齒類動物，諸如小鼠、大鼠、倉鼠及天竺鼠；等等。在一些態樣中，該個體係哺乳動物。在一些態樣中，該哺乳動物係人類個體。在一些態樣中，該哺乳動物排除人類個體。動物飼料包括(但不限於)水產養殖飼料、家畜飼料(包括寵物飼料)、動物學動物飼料、工作動物飼料、牲畜飼料，及其組合。在一些態樣中，食物包括動物食物及人類食物。
應知曉為清晰起見而描述於各別態樣之內文中之本發明之某些特徵亦可組合提供於單個態樣中。相反，為簡潔起見而描述於單個態樣之內文中之本發明之各種特徵亦可各別或以任何合適之子組合或在合適之情況下提供於本發明之任何其他描述之態樣中。除非態樣在無彼等元素之情況下係不起作用的，否則認為各種態樣之內文中描述之某些特徵不為彼等態樣之基本特徵。
儘管與彼等本文描述者相似或等效之方法及材料可用於本發明之實務或測試中，但下文描述合適之方法及材料。該等材料、方法及實例僅為說明性的且無意為限制性。本發明之其他特徵及優勢將自實施方式及隨附申請專利範圍顯而易見。 埃氏巨球型菌
本文描述之揭示內容中可使用來自任何菌株或菌株之任何組合之埃氏巨球型菌細胞。
一或多種埃氏巨球型菌菌株可選自原種培養物保藏中心(例如，美國典型培養物保藏中心(「ATCC®」)、國家食品工業與海洋細菌保藏中心(「NCIMB」)、國家典型培養物保藏中心(「NCTC」)、美國研究服務(「ARC」)培養物保藏中心(即，「NRRL」)、國家動物衛生研究所(NIAH)培養物保藏中心，或可為已自天然來源(例如，自反芻動物胃腸道)分離之菌株。
可選自培養物保藏中心之埃氏巨球型菌菌株之實例包括(但不限於)表1中按寄存編號列舉之菌株。亦指示該等寄存編號之替代名稱。 表1：埃氏巨球型菌菌株之實例及各菌株之來源。
寄存編號 替代名稱 菌株來源
ATCC® 25940 NCIMB 8927；BE2-2083 綿羊之瘤胃
ATCC® 17752 B159；NCIMB 702409；NCDO2409 N/A
ATCC® 17753 T81；NCIMB 702410；NCDO2410 N/A
NCIMB 702261 A17-2；A12-2；NCDO2261 成人糞便
NCIMB 702262 S17-3；NCDO2262 幼豬糞便
NCIMB 702264 LC1 N/A
NCIMB 702331 LC1；NCDO2263；NCDO2264；NCDO2331 N/A
NCIMB 41125    乳牛之瘤胃
NCIMB 41787    乳牛之瘤胃
NCIMB 41788    乳牛之瘤胃
NRRL 18624    牛之瘤胃
NIAH 1102    N/A
CBS146325 (NRRL)      
CBS146326 (NRRL)      
CBS146327 (NRRL)      
CBS146328 (NRRL)      
CBS146329 (NRRL)      
CBS146330 (NRRL)      
在一些態樣中，埃氏巨球型菌細胞係來自具有選自由以下組成之群之寄存編號之菌株：ATCC® 25940、ATCC® 17752、ATCC® 17753、NCIMB 702261、NCIMB 702262、NCIMB 702264、NCIMB 702331、NCIMB 702409、NCIMB 702410、NCIMB 41125、NCIMB 41787、NCIMB 41788、NRRL 18624、NIAH 1102、CBS146325、CBS146326、CBS146327、CBS146328、CBS146329、CBS146330，及其組合，包括表1中之替代名稱中之任一者或任何市售來源之埃氏巨球型菌。
在一些態樣中，埃氏巨球型菌細胞係來自從反芻動物(例如，乳牛)分離之菌株。例如，參見美國專利第7,550,139號。
在一些態樣中，埃氏巨球型菌細胞係來自從非反芻動物(例如，人類)分離之菌株。
在一些態樣中，埃氏巨球型菌細胞係來自針對以下選擇之菌株：乳酸鹽利用率(例如，在糖之存在下利用乳酸鹽之菌株)、對離子載體抗生素之耐藥性、相對高之生長率、主要產生乙酸鹽之能力、在低於5.0及低至4.5之pH值下增殖之能力、揮發性脂肪酸(VFA)之產生、植酸酶活性，及其組合。參見例如美國專利第7,550,139號。
在一些態樣中，針對乳酸鹽利用率選擇之菌株在可溶性碳水化合物(例如，葡萄糖及/或麥芽糖)之存在下利用乳酸鹽作為較佳碳源。乳酸鹽利用率可例如基於在含有乳酸鹽且缺乏可溶性碳水化合物之培養基中相較於在經可溶性碳水化合物補充之相同培養基中之生長來測定。
在一些態樣中，埃氏巨球型菌細胞係來自相較於其他菌株具有高生長率之菌株。不同菌株之生長率可例如藉由於液體培養基中培養細胞並監測光學密度之經時增加來測定。
在一些態樣中，埃氏巨球型菌細胞係來自具有植酸酶活性之菌株。
在一些態樣中，埃氏巨球型菌細胞係來自埃氏巨球型菌菌株NCIMB 41125。埃氏巨球型菌之此菌株具有高比生長率(0.94代/小時)，能夠於4.5至6.5或更大之pH範圍內生長，使用D-及L-乳酸鹽作為其較佳受質，但亦具有利用葡萄糖及其他碳水化合物之能力，且耐受離子載體。
在一些態樣中，埃氏巨球型菌細胞係來自埃氏巨球型菌菌株NCIMB 41787。在一些態樣中，該等埃氏巨球型菌細胞係來自埃氏巨球型菌菌株NCIMB 41788。
在一些態樣中，埃氏巨球型菌細胞係來自埃氏巨球型菌菌株ATCC® 25940。
在一些態樣中，埃氏巨球型菌細胞係來源於選自原種培養物保藏中心或自天然來源分離之菌株。「來源」於菌株之細胞可為天然或人工衍生物，諸如，舉例而言亞分離物、突變體、變體或重組菌株。
在一些態樣中，埃氏巨球型菌係經凍乾。參見WO 2018/144653 A1，其係以全文引用之方式併入本文中。 製備包含厭氧細菌細胞或埃氏巨球型菌細胞之培養物
包括埃氏巨球型菌之厭氧細菌應在厭氧條件下培養以獲得最大產率及存活率。在一些態樣中，厭氧細菌(例如，埃氏巨球型菌)應在小於2%氧下培養。
在一些態樣中，培養物包含埃氏巨球型菌細胞及生長培養基。
在一些態樣中，培養物包含埃氏巨球型菌細胞之一或多種菌株。在一些態樣中，該培養物包含埃氏巨球型菌細胞之單一菌株。在一些態樣中，該培養物由埃氏巨球型菌細胞(即，由埃氏巨球型菌細胞組成之培養物中之細胞，例如，埃氏巨球型菌細胞之一或多種菌株)之一或多種菌種組成。在一些態樣中，該培養物由埃氏巨球型菌細胞之單一菌株組成。
在一些態樣中，培養物包含厭氧細菌細胞之一或多種菌株及生長培養基。在一些態樣中，該培養物包含雙叉桿菌細胞(諸如短型雙叉桿菌)、乳桿菌細胞(諸如胚芽乳桿菌)、雙叉桿菌細胞(諸如動物雙叉桿菌乳亞種)、片球菌細胞(諸如乳酸片球菌)、乳桿菌細胞(諸如乾酪乳桿菌)、絲狀桿菌(諸如產琥珀酸絲狀桿菌)及丁酸弧菌(諸如溶纖維丁酸弧菌)、瘤胃球菌(諸如黃色瘤胃球菌)及生長培養基。
可使用用於接種、生長及收獲厭氧細胞(例如，埃氏巨球型菌細胞)之各種發酵參數，包括連續發酵(即，連續培養)或分批發酵(即，分批培養)。參見例如美國專利第7,550,139號。
用於厭氧細胞(例如，埃氏巨球型菌細胞)之生長培養基可為固體、半固體或液體。培養基可含有提供必要元素及特定因子使得可生長之營養物質。各種微生物培養基及變化為此項技術中熟知。可於任何時間(包括培養開始時、在培養期間或間歇/連續)將培養基添加至培養物。
生長培養基之實例包括(但不限於)：(1)半限定培養基(semi-defined media)，其含有蛋白腖，3 g/L；酵母菌，3 g/L；維生素溶液，2 mL/L；礦物溶液，25 mL/L；靛紅(0.5%)，1 g/L；12.5% L-半胱胺酸，2 g/L；12.5%硫化鈉，2 g/L；及用乳酸鈉(半限定乳酸鹽，SDL)、葡萄糖(半限定葡萄糖，SDG)或麥芽糖(半限定麥芽糖，SDM)補充；(2)經修飾強化之梭菌瓊脂/肉湯培養基(預還原)，其含有蛋白腖，10 g/L；牛肉提取物，10 g/L；酵母菌提取物，3 g/L；右旋糖5 g/L；NaCl，5 g/L；可溶性澱粉，1 g/L；L-半胱胺酸HCl，0.5 g/L；乙酸鈉，3 g/L；及刃天青(0.025%)，4 mL/L；(3)具有脫纖維素綿羊血之胰酪酶大豆瓊脂/肉湯；(4)不含半限定瘤胃流體之培養基，其含有乳酸鈉(70%)，10 g/L；蛋白腖，2 g/L；KH 2PO 41 g/L；(NH 4) 2SO 43 g/L；MgSO 47H 2O 0.2 g/L；CaCl 2.2H 2O 0.06 g/L；維生素(鹽酸吡哆醇，4 mg/L；吡哆胺，4 mg/L；核黃素，4 mg/L；鹽酸硫銨，4 mg/L；菸鹼醯胺，4 mg/L；Ca-D-泛酸鹽，4 mg/L；4-胺基苯甲酸，0.2 mg/L、生物素，0.2 mg/L、葉酸，0.1 mg/L及氰基鈷胺素，0.02 mg/L)；Na 2S.9H 2O，0.25 g/L；半胱胺酸，0.25 g/L；消泡劑，0.07 mL /L及莫能菌素，10 mg/L；及其係藉由以下製備：將乳酸鈉及礦物溶液添加至儲集瓶並高壓蒸氣滅菌60分鐘；將蛋白腖溶解於300 mL蒸餾H 2O中並單獨高壓蒸氣滅菌；預先過濾滅菌維生素溶液及兩種還原劑；高壓蒸氣滅菌後，用厭氧氣體將該儲集瓶充氣整夜；在冷卻後單獨添加其他成分；及用5N HCl將pH調整至所需值；及(5)經培養之瘤胃流體乳酸鹽(「IRFL」)培養基，其含有400 mL來自苜蓿飼餵之綿羊之經培養之澄清瘤胃流體、371 mL蒸餾水、2 g蛋白腖、15 g瓊脂、100 mL 10% (w/v) D,L-乳酸鈉溶液、100 mL 0.04% (w/v)溴甲酚紫溶液及25 mL含有40 g/L KH 2PO 4之礦物溶液；120 g/L (NH 4) 2SO 4；8 g/L MgSO 4.7H 2O及2.4 g/L CaCl 2.2H 2O，其中乳酸(90% w/v)係用於將pH調整至5.5，然後在121℃下高壓蒸氣滅菌25分鐘，然後於50℃水浴中冷卻同時用厭氧氣體混合物充氣，接著添加兩毫升Na 2S.9H 2O (12.5% w/v)及半胱胺酸.HCl.H 2O (12.5% w/v)中之各者。
在一些態樣中，培養物包含含有至少兩種碳源之生長培養基。在一些態樣中，該至少兩種碳源係選自由以下組成之群：酪蛋白、澱粉(例如，糊化澱粉及/或可溶性澱粉)、乳酸鹽(即，乳酸)、右旋糖、果糖、果聚糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、乙酸鹽、甘油、甘露醇、山梨醇、蔗糖、木糖、糖蜜、岩藻糖、葡糖胺、右旋糖酐、脂肪、油、甘油、乙酸鈉、阿拉伯糖、大豆蛋白、可溶性蛋白質、棉子糖、直鏈澱粉、澱粉、胰腖、酵母菌提取物及其組合。
在一些態樣中，至少兩種碳源由約1至99%之第一碳源(例如，本文描述之任何碳源)及約1至99%之第二碳源(例如，不同於該第一碳源之本文描述之任何碳源)組成，其中該至少兩種碳源之100%由該第一第一碳源及該第二碳源組成。在一些態樣中，該至少兩種碳源由約50至60%之該第一碳源及約40至50%之該第二碳源、約50至70%之該第一碳源及約30至50%之該第二碳源、約50至80%之該第一碳源及約20至50%之該第二碳源或約50至90%之該第一碳源及約10至50%之該第二碳源組成。在其他態樣中，該至少兩種碳源由約65至75%之該第一碳源及約25至35%之該第二碳源組成。在一些態樣中，該第一碳源係乳酸鹽。
在一些態樣中，培養物可進一步包含滲透物保護劑分子。在一些態樣中，該滲透物保護劑分子係在收獲細胞前添加。在一些態樣中，該滲透物保護劑分子係在收獲該等細胞後添加。滲透物保護劑分子可保護厭氧細胞(例如，埃氏巨球型菌細胞)免受由電噴霧乾燥引起之壓力。此導致在電噴霧乾燥後更長之架儲期及更高之CFU/g。滲透物保護劑分子之類別之實例為(但不限於)胺基酸、糖、多元醇、甲胺及甲基鋶化合物。在一些態樣中，此等類別係以介於約0.001莫耳(M)至0.5 M之間添加至培養物。在一些態樣中，該滲透物保護劑分子係甲胺。在一些態樣中，該甲胺係甜菜鹼。在一些態樣中，該滲透物保護劑分子係甜菜鹼。在一些態樣中，該甜菜鹼係以介於約0.001莫耳(M)至0.5 M之間添加至該培養物。在一些態樣中，該滲透物保護劑分子係脲。在一些態樣中，該脲係以介於約0.001莫耳(M)至0.5 M之間添加至該培養物。在一些態樣中，該滲透物保護劑分子係三甲胺N-氧化物(TMAO)。在一些態樣中，該三甲胺N-氧化物(TMAO)係以介於約0.001莫耳(M)至0.5 M之間添加至該培養物。在一些態樣中，該滲透物保護劑分子係二甲基巰基丙酸。在一些態樣中，該二甲基巰基丙酸係以介於約0.001莫耳(M)至0.5 M之間添加至該培養物。在一些態樣中，該滲透物保護劑分子係肌胺酸。在一些態樣中，該肌胺酸係以介於約0.001莫耳(M)至0.5 M之間添加至該培養物。在一些態樣中，該滲透物保護劑分子係甘油磷醯膽鹼。在一些態樣中，該甘油磷醯膽鹼係以介於約0.001莫耳(M)至0.5 M之間添加至該培養物。在一些態樣中，該滲透物保護劑分子係肌醇。在一些態樣中，該肌醇係以介於約0.001莫耳(M)至0.5 M之間添加至該培養物。在一些態樣中，該滲透物保護劑分子係牛磺酸。在一些態樣中，該牛磺酸係以介於約0.001莫耳(M)至0.5 M之間添加至該培養物。在一些態樣中，該滲透物保護劑分子係甘胺酸。在一些態樣中，該甘胺酸係以介於約0.001莫耳(M)至0.5 M之間添加至該培養物。
在一些態樣中，厭氧細胞(例如，埃氏巨球型菌細胞)係在約39℃至約40℃下、在約35℃下、在約36℃下、在約37℃下、在約38℃下、在約39℃下或在約40℃下生長。
在一些態樣中，包含厭氧細胞(例如，埃氏巨球型菌細胞)之培養物之溫度可於一定時間週期內增加以誘導於細胞中產生抗逆性分子(例如，熱休克蛋白及/或冷休克蛋白)，及然後使該溫度恢復至原始設定點。此導致在電噴霧乾燥後具有更長架儲期及更高CFU/g之電噴霧乾燥顆粒。在一些態樣中，該溫度係自培養過程設定點增加1至30℃。在一些態樣中，該溫度係自培養過程設定點增加2至29℃。在一些態樣中，該溫度係自培養過程設定點增加3至28℃。在一些態樣中，該溫度係自培養過程設定點增加4至27℃。在一些態樣中，該溫度係自培養過程設定點增加5至26℃。在一些態樣中，該溫度係自培養過程設定點增加6至25℃。在一些態樣中，該溫度係自培養過程設定點增加7至24℃。在一些態樣中，該溫度係自培養過程設定點增加8至23℃。在一些態樣中，該溫度係自培養過程設定點增加9至22℃。在一些態樣中，該溫度係自培養過程設定點增加10至21℃。在一些態樣中，該溫度係自培養過程設定點增加11至20℃。在一些態樣中，該溫度係自培養過程設定點增加12至19℃。在一些態樣中，該溫度係自培養過程設定點增加13至18℃。在一些態樣中，該溫度係自培養過程設定點增加14至17℃。在一些態樣中，該溫度係自培養過程設定點增加15至16℃。在一些態樣中，該溫度係自培養過程設定點增加1℃、2℃、3℃、4℃或5℃或1至5℃。
在一些態樣中，增加培養物之溫度之時間週期係約1分鐘至12小時。在一些態樣中，增加該培養物之溫度之時間週期係約30分鐘至11小時。在一些態樣中，增加該培養物之溫度之時間週期係約1至10小時。在一些態樣中，增加該培養物之溫度之時間週期係約2至9小時。在一些態樣中，增加該培養物之溫度之時間週期係約3至8小時。在一些態樣中，增加該培養物之溫度之時間週期係約4至7小時。在一些態樣中，增加該培養物之溫度之時間週期係約5至6小時。
在一些態樣中，將厭氧細胞(例如，埃氏巨球型菌細胞)冷卻至約18℃至約25℃用於儲存。
在一些態樣中，包含厭氧細胞(例如，埃氏巨球型菌細胞)之培養物之pH (例如，在培養期間及/或在收獲時)係介於約4.0至約8.0之間、介於約4.0至約7.5之間、介於約4.0至約7.0之間、介於約4.0至約6.5之間、介於約4.0至約6.0之間、介於約4.0至約5.5之間、介於約4.0至約5.0之間、介於約4.0至約4.5之間、約4.5至約8.0之間、介於約4.5至約7.5之間、介於約4.5至約7.0之間、介於約4.5至約6.5之間、介於約4.5至約6.0之間、介於約4.5至約5.5之間、介於約4.5至約5.0之間、介於約4.6至約6.9之間、介於約4.7至約6.8之間、介於約4.8至約6.7之間、介於約4.9至約6.6之間、介於約5.0至約7.0之間、介於約5.0至約6.5之間、介於約5.0至約6.0之間、介於約5.0至約5.5之間、介於約5.1至約6.9之間、介於約5.2至約6.8之間、介於約5.3至約6.7之間、介於約5.4至約6.6之間、介於約5.5至約7.0之間、介於約5.5至約6.5之間、介於約5.1至約6.4之間、介於約5.2至約6.3之間、介於約5.3至約6.2之間、介於約5.4至約6.1之間、介於約5.5至約6.0之間、介於約5.0至約6.1之間、介於約5.0至約6.2之間、介於約5.0至約6.3之間、介於約5.0至約6.4之間、介於約5.1至約6.5之間、介於約5.2至約6.5之間、介於約5.3至約6.5之間或介於約5.4至約6.5之間。
在一些態樣中，包含厭氧細胞(例如，埃氏巨球型菌細胞)之培養物之pH可於一定時間週期內減小以誘導於細胞中產生抗逆性分子(例如，熱休克蛋白及/或冷休克蛋白)，及然後使該pH恢復至原始設定點。此導致在電噴霧乾燥後具有更長架儲期及更高CFU/g之電噴霧乾燥顆粒。在一些態樣中，該pH係自培養過程設定點減小0.1至6.0個pH單位。在一些態樣中，該pH係自培養過程設定點減小0.5至5.5個pH單位。在一些態樣中，該pH係自培養過程設定點減小1.0至5.0個pH單位。在一些態樣中，該pH係自培養過程設定點減小1.5至4.5個pH單位。在一些態樣中，該pH係自培養過程設定點減小2.0至4.0個pH單位。
在一些態樣中，包含厭氧細胞(例如，埃氏巨球型菌細胞)之培養物之pH可於一定時間週期內增加以誘導於細胞中產生抗逆性分子(例如，熱休克蛋白及/或冷休克蛋白)，及然後使該pH恢復至原始設定點。此導致在電噴霧乾燥後具有更長架儲期及更高CFU/g之電噴霧乾燥顆粒。在一些態樣中，該pH係自培養過程設定點增加0.1至6.0個pH單位。在一些態樣中，該pH係自培養過程設定點增加0.5至5.5個pH單位。在一些態樣中，該pH係自培養過程設定點增加1.0至5.0個pH單位。在一些態樣中，該pH係自培養過程設定點增加1.5至4.5個pH單位。在一些態樣中，該pH係自培養過程設定點增加2.0至4.0個pH單位。
在一些態樣中，減小或增加培養物之pH之時間週期係約1分鐘至12小時。在一些態樣中，減小或增加該培養物之pH之時間週期係約30分鐘至11小時。在一些態樣中，減小或增加該培養物之pH之時間週期係約1至10小時。在一些態樣中，減小或增加該培養物之pH之時間週期係約2至9小時。在一些態樣中，減小或增加該培養物之pH之時間週期係3至8小時。在一些態樣中，減小或增加該培養物之pH之時間週期係4至7小時。在一些態樣中，減小或增加該培養物之pH之時間週期係5至6小時。
在一些態樣中，包含厭氧細胞(例如，埃氏巨球型菌細胞)之培養物之滲透壓可於一定時間週期內增加以誘導於細胞中產生抗逆性分子(例如，熱休克蛋白及/或冷休克蛋白)，及然後使該滲透壓恢復至原始設定點。此導致在電噴霧乾燥後具有更長架儲期及更高CFU/g之電噴霧乾燥顆粒。在一些態樣中，該培養物之滲透壓可藉由將鹽以介於約0.2 M與2 M之間添加至該培養物而增加。在一些態樣中，該培養物之滲透壓可藉由將鹽以介於約0.3 M與1.9 M之間添加至該培養物而增加。在一些態樣中，該培養物之滲透壓可藉由將鹽以介於約0.4 M與1.8 M之間添加至該培養物而增加。在一些態樣中，該培養物之滲透壓可藉由將鹽以約0.5 M與1.7 M之間添加至該培養物而增加。在一些態樣中，該培養物之滲透壓可藉由將鹽以介於約0.6 M與1.6 M之間添加至該培養物而增加。在一些態樣中，該培養物之滲透壓可藉由將鹽以介於約0.7 M與1.5 M之間添加至該培養物而增加。在一些態樣中，該培養物之滲透壓可藉由將鹽以介於約0.8 M與1.4 M之間添加至該培養物而增加。在一些態樣中，該培養物之滲透壓可藉由將鹽以介於約0.9 M與1.3 M之間添加至該培養物而增加。在一些態樣中，該培養物之滲透壓可藉由將鹽以介於約1.0 M與1.2 M之間添加至該培養物而增加。
在一些態樣中，增加培養物之滲透壓之時間週期係約1分鐘至12小時。在一些態樣中，增加該培養物之滲透壓之時間週期係約30分鐘至1小時。在一些態樣中，增加該培養物之滲透壓之時間週期係約1至10小時。在一些態樣中，增加該培養物之滲透壓之時間週期係2至9小時。在一些態樣中，增加該培養物之滲透壓之時間週期係3至8小時。在一些態樣中，增加該培養物之滲透壓之時間週期係4至7小時。在一些態樣中，增加該培養物之滲透壓之時間週期係5至6小時。
在一些態樣中，包含厭氧細胞(例如，埃氏巨球型菌細胞)之培養物之滲透壓可於一定時間週期內減小以誘導於細胞中產生抗逆性分子(例如，熱休克蛋白及/或冷休克蛋白)，及然後使該滲透壓恢復至原始設定點。
為培養厭氧細胞(例如，埃氏巨球型菌細胞)，可使用維持厭氧條件之不同尺寸及設計之發酵罐。在一些態樣中，培養厭氧細胞應在小於2%氧下進行。發酵罐可例如發酵足夠用於商業生產該等厭氧細胞(例如，埃氏巨球型菌細胞)之培養物體積。
在一些態樣中，培養物體積係約2公升、約5公升、約10公升、約50公升、約100公升、約150公升、約200公升、約250公升、約300公升、約350公升、約400公升、約450公升、約500公升、約600公升、約800公升、約1,000公升、約1,200公升、約1,500公升、約1,800公升、約2,000公升、約2, 200公升、約2,500公升、約2,750公升、約3,000公升、約4,000公升、約5,000公升、約6,000公升、約7,000公升、約8,000公升、約9,000公升、約10,000公升、約20,000公升、約50,000公升或約75,000公升。
在一些態樣中，培養物體積係約2公升至約75,000公升、約2公升至約70,000公升、約2公升至約65,000公升、約2公升至約60,000公升、約2公升至約55,000公升、約2公升至約50,000公升、約2公升至約45,000公升、約2公升至約40,000公升、約2公升至約35,000公升、約2公升至約30,000公升、約2公升至約25,000公升、約2公升至約20,000公升、約2公升至約15,000公升、約2公升至約10,000公升、約2公升至約5,000公升、約2公升至約2,500公升、約2公升至約500公升、約2公升至約250公升、約2公升至約100公升、約2公升至約50公升、約2公升至約25公升或約2公升至約10公升。
在一些態樣中，培養物體積係約5公升至約75,000公升、約5公升至約70,000公升、約5公升至約65,000公升、約5公升至約60,000公升、約5公升至約55,000公升、約5公升至約50,000公升、約5公升至約45,000公升、約5公升至約40,000公升、約5公升至約35,000公升、約5公升至約30,000公升、約5公升至約25,000公升、約5公升至約20,000公升、約5公升至約15,000公升、約5公升至約10,000公升、約5公升至約5,000公升、約5公升至約2,500公升、約5公升至約500公升、約5公升至約250公升、約5公升至約100公升、約5公升至約50公升、約5公升至約25公升或約5公升至約10公升。
在一些態樣中，培養物體積係約10公升至約75,000公升、約10公升至約70,000公升、約10公升至約65,000公升、約10公升至約60,000公升、約10公升至約55,000公升、約10公升至約50,000公升、約10公升至約45,000公升、約10公升至約40,000公升、約10公升至約35,000公升、約10公升至約30,000公升、約10公升至約25,000公升、約10公升至約20,000公升、約10公升至約15,000公升、約10公升至約10,000公升、約10公升至約5,000公升、約10公升至約2,500公升、約10公升至約500公升、約10公升至約250公升、約10公升至約100公升、約10公升至約50公升或約10公升至約25公升。
在一些態樣中，培養物體積係約250公升至約750公升、約300公升至約800公升、約350公升至約850公升、約400公升至約900公升、約450公升至約950公升、約500公升至約1,000公升、約750公升至約1,250公升、約1,000公升至約2,000公升、約2,000公升至約4,000公升、約4,000公升至約8,000公升、約5,000公升至約10,000公升、約50公升至約75,000公升、約50公升至約50,000公升、約50公升至約25,000公升、約50公升至約20,000公升、約50公升至約15,000公升、約50公升至約10,000公升、約100公升至約10,000公升、約100公升至約5,000公升、約100公升至約4,000公升、約100公升至約3,000公升、約100公升至約2,900公升、約100公升至約2,850公升、約100公升至約2,800公升、約100公升至約2,750公升。
在一些態樣中，培養物包含液體，及該方法包括藉由移除一定百分比之該液體來收獲厭氧細胞(例如，埃氏巨球型菌細胞)。在一些態樣中，收獲該等細胞包括移除約5%至約100%、約10%至約100%、約15%至約100%、約20%至約100%、約25%至約100%、約30%至約100%、約35%至約100%、約40%至約100%、約45%至約100%、約50%至約100%之該液體、約55%至約100%、約60%至約100%、約65%至約100%、約70%至約100%、約75%至約100%、約80%至約100%、約85%至約100%、約90%至約100%或約95%至約100%之該液體。在一些態樣中，收獲該等細胞包括移除至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%之該液體。在一些態樣中，該等細胞係濃縮約1至100X。在一些態樣中，該等細胞係濃縮約5至100X。在一些態樣中，該等細胞係濃縮約10至100X。在一些態樣中，該等細胞係濃縮約15至100X。在一些態樣中，該等細胞係濃縮約20至100X。在一些態樣中，該等細胞係濃縮約25至100X。在一些態樣中，該等細胞係濃縮約30至100X。在一些態樣中，該等細胞係濃縮約35至100X。在一些態樣中，該等細胞係濃縮約40至100X。
在一些態樣中，培養物包含液體，及該方法包括藉由在收獲前移除一定百分比之該液體濃縮厭氧細胞(例如，埃氏巨球型菌細胞)。在一些態樣中，濃縮該等細胞包括移除約5%至約100%、約10%至約100%、約15%至約100%、約20%至約100%、約25%至約100%、約30%至約100%、約35%至約100%、約40%至約100%、約45%至約100%、約50%至約100%之該液體、約55%至約100%、約60%至約100%、約65%至約100%、約70%至約100%、約75%至約100%、約80%至約100%、約85%至約100%、約90%至約100%,或約95%至約100%之該液體。在一些態樣中，濃縮該等細胞包括移除至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%之該液體。在一些態樣中，該等細胞係濃縮約1至100X。在一些態樣中，該等細胞係濃縮約5至100X。在一些態樣中，該等細胞係濃縮約10至100X。在一些態樣中，該等細胞係濃縮約15至100X。在一些態樣中，該等細胞係濃縮約20至100X。在一些態樣中，該等細胞係濃縮約25至100X。在一些態樣中，該等細胞係濃縮約30至100X。在一些態樣中，該等細胞係濃縮約35至100X。在一些態樣中，該等細胞係濃縮約40至100X。
在一些態樣中，該方法包括藉由濃縮細胞收獲厭氧細胞(例如，埃氏巨球型菌細胞)。在一些態樣中，收獲該等細胞包括藉由至少一種選自由以下組成之群之技術濃縮該等細胞：離心、過濾、透析、反滲透，及其組合。在一些態樣中，該過濾包括黏土過濾。在一些態樣中，該過濾包括用黏土絮凝。在一些態樣中，該過濾包括用黏土及殼聚糖之組合絮凝。在一些態樣中，該過濾包括切向流過濾，亦稱為錯流過濾。
在一些態樣中，收獲時包含厭氧細胞(例如，埃氏巨球型菌細胞)之培養物之pH係介於約4.5至約7.0之間、介於約4.5至約6.5之間、介於約4.5至約6.0之間、介於約4.5至約5.5之間、介於約4.5至約5.0之間、介於約4.6至約6.9之間、介於約4.7至約6.8之間、介於約4.8至約6.7之間、介於約4.9至約6.6之間、介於約5.0至約7.0之間、介於約5.0至約6.5之間、介於約5.0至約6.0之間、介於約5.0至約5.5之間、介於約5.1至約6.9之間、介於約5.2至約6.8之間、介於約5.3至約6.7之間、介於約5.4至約6.6之間、介於約5.5至約7.0之間、介於約5.5至約6.5之間、介於約5.1至約6.4之間、介於約5.2至約6.3之間、介於約5.3至約6.2之間、介於約5.4至約6.1之間、介於約5.5至約6.0之間、介於約5.0至約6.1之間、介於約5.0至約6.2之間、介於約5.0至約6.3之間、介於約5.0至約6.4之間、介於約5.1至約6.5之間、介於約5.2至約6.5之間、介於約5.3至約6.5之間或介於約5.4至約6.5之間。
在一些態樣中，收獲時包含厭氧細胞(例如，埃氏巨球型菌細胞)之培養物之原始pH約6.0。在一些態樣中，該pH增加至約7.5歷時約5分鐘至約60分鐘。在一些態樣中，該pH減小至約3.5歷時約5分鐘至約60分鐘。在一些態樣中，約5分鐘至60分鐘後，將該pH調整回至約6.0之原始pH。在一些態樣中，調整回至該原始pH係用滲透保護劑進行。在一些態樣中，該滲透保護劑係選自由以下組成之群：甜菜鹼、海藻糖、脯胺酸、四氫嘧啶，或其組合。在一些態樣中，該滲透保護劑係糖、糖醇、糖衍生物、多醣、囊封聚合物或氮源，及其混合物。在一些態樣中，該糖係蔗糖。在一些態樣中，調整回至該原始pH係在無滲透保護劑之情況下進行。
在一些態樣中，pH增加至約7.5歷時約5分鐘、約10分鐘、約15分鐘、約20分鐘、約25分鐘、約30分鐘、約35分鐘、約40分鐘、約45分鐘、約50分鐘、約55分鐘或約60分鐘。在一些態樣中，該pH增加至約7.5歷時約5分鐘至約60分鐘、約10分鐘至約60分鐘、約15分鐘至約60分鐘、約20分鐘至約60分鐘、約25分鐘至約60分鐘、約30分鐘至約60分鐘、約35分鐘至約60分鐘、約45分鐘至約60分鐘、約5分鐘至約45分鐘、約5分鐘至約30分鐘、約5分鐘至約25分鐘、約5分鐘至約20分鐘、約5分鐘至約15分鐘或約5分鐘至約10分鐘。
在一些態樣中，pH減小至約3.5歷時約5分鐘、約10分鐘、約15分鐘、約20分鐘、約25分鐘、約30分鐘、約35分鐘、約40分鐘、約45分鐘、約50分鐘、約55分鐘或約60分鐘。在一些態樣中，該pH減小至約3.5歷時約5分鐘至約60分鐘、約10分鐘至約60分鐘、約15分鐘至約60分鐘、約20分鐘至約60分鐘、約25分鐘至約60分鐘、約30分鐘至約60分鐘、約35分鐘至約60分鐘、約45分鐘至約60分鐘、約5分鐘至約45分鐘、約5分鐘至約30分鐘、約5分鐘至約25分鐘、約5分鐘至約20分鐘、約5分鐘至約15分鐘或約5分鐘至約10分鐘。
在一些態樣中，該方法包括用包含厭氧細胞(例如，埃氏巨球型菌細胞)之接種體接種於發酵罐中生長培養基以製備培養物，並在約39℃之溫度下培養該培養物直至該培養物約pH6.0。在一些態樣中，該接種體包含厭氧細胞(例如，埃氏巨球型菌)。在一些態樣中，該方法包括接種於發酵罐中生長培養基，接種體與培養基之比率為1/50至1/4,000。在一些態樣中，該接種體與培養基之比率為1/100。 電噴霧乾燥厭氧細菌細胞及/或埃氏巨球型菌細胞
噴霧乾燥係一種藉由用熱氣(通常空氣或氮)快速乾燥自液體或漿料產生乾燥粉末之方法。
噴霧乾燥製程以含有經溶解或懸浮之組分之液體溶劑(通常水)諸如乳液(例如，含有厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌之乳液)開始。懸浮液包括待囊封之物質(負載物)及兩親性載劑(通常經修飾之澱粉)，其等係於該液體溶劑中均質化為懸浮液。該負載物為厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌，且該經均質化之懸浮液通常稱為漿料。
噴霧乾燥器使用一種類型噴霧器，諸如噴霧噴嘴，以使漿料分散成具有一些相對可控之液滴尺寸之可控噴霧。取決於製程要求，液滴尺寸之直徑約10至500微米之範圍內。最常見之應用需於50至200微米範圍內之液滴尺寸。
在霧化的同時，將漿料進料至乾燥室(通常為其中亦引入經加熱空氣之塔)內。該空氣當其進入該乾燥室時之溫度通常係於180至200℃之範圍內。該經加熱空氣為來自液滴之液體(水)之揮發性組分之蒸發供應能量。當該水蒸發時，載劑在負載物周圍形成硬化外殼，產生乾燥粉末。
厭氧細胞(例如，埃氏巨球型菌)係乳化於載劑流體系統中或溶解於其中以形成漿料。在一些態樣中，該等厭氧細胞係選自由以下組成之群：雙叉桿菌細胞(諸如短型雙叉桿菌)、乳桿菌細胞(諸如胚芽乳桿菌)、雙叉桿菌細胞(諸如動物雙叉桿菌乳亞種)、片球菌細胞(諸如乳酸片球菌)、乳桿菌細胞(諸如乾酪乳桿菌)、絲狀桿菌(諸如產琥珀酸絲狀桿菌)、瘤胃球菌(諸如黃色瘤胃球菌)及丁酸弧菌(諸如溶纖維丁酸弧菌)。
於溶液貯槽中形成漿料並使用泵或其他運輸工具將其遞送至噴霧器。該漿料進入該噴霧器並以液滴之噴霧形式離開該噴霧器，並將該等液滴引入乾燥室內。乾燥流體之進料藉由製程加熱器加熱並藉由鼓風器供應至該乾燥室內。在一些態樣中，該乾燥流體係空氣、氬或氮。當霧化液滴在曝露於進入之經加熱空氣後乾燥以形成固體顆粒時，自該等液滴蒸發之水進入該經加熱空氣。
乾燥粉末連同載有水蒸氣之空氣一起離開乾燥器室，並運送至旋風分離器，其自循環氣流移除乾燥顆粒並使該等顆粒沈積至收集容器內。載有水蒸氣之空氣離開該收獲容器並進入袋式除塵器，其中移除極細顆粒，然後經由鼓風器將載有水蒸氣之空氣送至冷凝器內。該冷凝器自製程空氣移除該水蒸氣，且收集之水可重複使用或廢棄。
傳統噴霧乾燥製程之一個突出特點為離開加熱器並進入乾燥室之入口氣體之高溫(大約200℃)，及離開該乾燥室之出口氣體之溫度，其通常係大於100℃。儘管將液滴注入腔室中之高溫環境內，但該等液滴實際上無法達到入口氣體溫度。然而，該等液滴確實經加熱至該等液滴中相當大一部分之所需成分(即，負載物之部分，厭氧細菌細胞及/或埃氏巨球型菌)係經非所需修飾之程度。負載物之非所需修飾(負載物損失)導致該等厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌之存活率降低。因此，該負載物之蒸發及熱降解降低最終粉末產品之性能特性，且因此導致商業用途中性能之顯著降低及收益之顯著損失。
本發明提供一種使用低溫(例如，「無熱量」)之電噴霧乾燥之方法，產生具有極佳存活率及穩定性之粉末細菌產品(例如，厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌)之噴霧乾燥製程。本發明之噴霧乾燥方法不採用經加熱氣體以自霧化流體液滴移除水，正如先前採用噴霧乾燥操作之情況。相反，本發明之噴霧乾燥方法使用未加熱空氣，例如，除濕空氣，以進行高通量霧化製程，利用獨特之乾燥器設計及黏度於1至2000 cP範圍內之高固體含量(低含水量)漿料/乳液來產生在低溫(諸如以50至100℃數量級之溫度)下乾燥之粉末。相反，本發明之噴霧乾燥方法使用未加熱空氣、氮或氬，例如，除濕空氣、氮或氬，以進行高通量霧化製程，利用獨特之乾燥器設計及黏度於1至2000 cP範圍內之高固體含量(低含水量)漿料/乳液來產生在低溫(諸如以50至100℃數量級之溫度)下乾燥之粉末。另外，將靜電電荷施加至該漿料或該等霧化液滴，藉此濕液滴上之各別電荷產生引起相鄰液滴相互排斥之力。
在一些態樣中，本發明係關於一種電噴霧乾燥厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞之方法。
在一些態樣中，本發明係關於經電噴霧乾燥之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞。
在一些態樣中，本發明係關於藉由本文揭示之方法或系統產生之經電噴霧乾燥之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞。
在一些態樣中，本發明提供一種用於根據本發明之一或多項態樣在不採用經加熱空氣或使用低經加熱空氣之情況下將液體產品噴霧乾燥成乾燥粉末之系統。在一些態樣中，本發明提供一種用於根據本發明之一或多項態樣在不採用經加熱空氣、氮或氬或使用低經加熱空氣、氮或氬之情況下將液體產品噴霧乾燥成乾燥粉末之系統。該系統包括與習知噴霧乾燥系統中相同或相似元件中之一些。
在一些態樣中，該系統包括藉助於泵(或等效運輸機構)進料包含厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌之漿料之乾燥室。該漿料進入噴霧器並以液滴之噴霧形式離開該噴霧器，將液滴引入該乾燥室內。未加熱流體或低經加熱流體(諸如空氣、氮或氬或另一合適之氣體)之進料係藉由鼓風器供應至該乾燥室內。供應之空氣、氮或氬可在引入該乾燥室內之前經受除濕(經由除濕器)。霧化液滴在曝露於進入之空氣、氮或氬後乾燥以形成固體顆粒。水自該等液滴蒸發並進入該乾燥室內之空氣、氮或氬中。乾燥粉末連同載有水蒸氣之空氣、氮或氬一起離開該乾燥室，並運送至旋風分離器，其自循環空氣、氮或氬流移除乾燥顆粒並使該等顆粒沈積至收集容器內。載有水蒸氣之空氣、氮或氬離開該收集容器並進入袋式除塵器，其中移除極細顆粒，然後經由鼓風器將載有水蒸氣之空氣、氮或氬送至冷凝器內。該冷凝器自製程空氣、氮或氬移除水蒸氣，且收集之水/氣體可重複使用或廢棄。
未加熱或低經加熱空氣、氮或氬可用於噴霧乾燥系統及製程中之另一原因在於漿料不為習知的。在一些態樣中，該漿料包括液體溶劑、載劑及活性生物體。在一些態樣中，該液體溶劑係水，然而，視需要或期望可採用其他合適之溶劑。在一些態樣中，該載劑係碳水化合物。在一些態樣中，該活性生物體可為厭氧細菌及/或埃氏巨球型菌。
控制漿料之形成使得獲得至少一個變量(諸如黏度、液體溶劑(例如，水)之量或其他與該漿料之含水量相關之合適度量)之調節。在一些態樣中，該漿料之形成可包括控制該漿料之黏度使得霧化步驟處之黏度係介於約1與2000厘泊(cP)之間。在一些態樣中，霧化步驟處之黏度係介於約10與1950厘泊(cP)之間。在一些態樣中，霧化步驟處之黏度係介於約50與1900厘泊(cP)之間。在一些態樣中，霧化步驟處之黏度係介於約100與1800厘泊(cP)之間。在一些態樣中，霧化步驟處之黏度係介於約150與1750厘泊(cP)之間。在一些態樣中，霧化步驟處之黏度係介於約200與1700厘泊(cP)之間。在一些態樣中，霧化步驟處之黏度係介於約250與1650厘泊(cP)之間。在一些態樣中，霧化步驟處之黏度係介於約300與1600厘泊(cP)之間。在一些態樣中，霧化步驟處之黏度係介於約350與1550厘泊(cP)之間。在一些態樣中，霧化步驟處之黏度係介於約400與1500厘泊(cP)之間。在一些態樣中，霧化步驟處之黏度係介於約450與1450厘泊(cP)之間。在一些態樣中，霧化步驟處之黏度係介於約500與1400厘泊(cP)之間。在一些態樣中，霧化步驟處之黏度係介於約550與1350厘泊(cP)之間。在一些態樣中，霧化步驟處之黏度係介於約600與1300厘泊(cP)之間。在一些態樣中，霧化步驟處之黏度係介於約650與1250厘泊(cP)之間。在一些態樣中，霧化步驟處之黏度係介於約700與1200厘泊(cP)之間。在一些態樣中，霧化步驟處之黏度係介於約750與1150厘泊(cP)之間。在一些態樣中，霧化步驟處之黏度係介於約800與1100厘泊(cP)之間。在一些態樣中，霧化步驟處之黏度係介於約850與1050厘泊(cP)之間。在一些態樣中，霧化步驟處之黏度係介於約900與1000厘泊(cP)之間。在一些態樣中，霧化步驟處之黏度係介於約925與975厘泊(cP)之間。在一些態樣中，霧化步驟處之黏度係介於1與500 cP之間。在一些態樣中，霧化步驟處之黏度係5至50厘泊(cP)。
在一些態樣中，漿料之形成可包括控制該漿料內之水或液體溶劑之比率使得霧化步驟處該漿料內之水或液體溶劑之比率係以下中之至少一者：介於約70與99重量百分比之間；介於約71與98重量百分比之間；介於約72與97重量百分比之間；介於約73與96重量百分比之間；介於約74與95重量百分比之間；介於約75與95重量百分比之間；介於約76與94重量百分比之間；介於約77與93重量百分比之間；介於約78與92重量百分比之間；介於約79與91重量百分比之間；介於約80與89重量百分比之間；介於約81與88重量百分比之間；介於約82與87重量百分比之間；介於約83與86重量百分比之間；及介於約84與85重量百分比之間。
可用於噴霧乾燥系統及製程中之未加熱空氣、氮或氬之另一原因係因為在霧化之前、期間或之後進行靜電充電過程。特定言之，將靜電電荷施加至漿料或霧化液滴。在此方面，該系統及/或製程包括與一或多個電極耦合之高壓電源(約0.1至45 kV DC)。在一些態樣中，該高壓電源係約0.5至40 kV DC。在一些態樣中，該高壓電源係約1至35 kV DC。在一些態樣中，該高壓電源係約5至30 kV DC。在一些態樣中，該高壓電源係約10至25 kV DC。在一些態樣中，該高壓電源係約15至20 kV DC。在一些態樣中，該高壓電源係約15 kV DC。
在一些態樣中，該系統及/或製程包括使用控制模組來提供電壓梯度之可程式化概況。在一些態樣中，該電壓梯度以約0.1 kV開始並增加至45 kV。在一些態樣中，該電壓梯度以約0.5 kV開始並增加至40 kV。在一些態樣中，該電壓梯度以約1 kV開始並增加至35 kV。在一些態樣中，該電壓梯度以約5 kV開始並增加至30 kV。在一些態樣中，該電壓梯度以約10 kV開始並增加至25 kV。電壓梯度的使用將例如扭曲產生具有高存活率及/或穩定性之顆粒結構之磁場。
在一些態樣中，該系統及/或製程包括使用控制模組來提供振盪電壓之可程式化概況。在一些態樣中，該電壓將在0.1 kV與45 kV之間振盪，及設定點為25 kV。在一些態樣中，該電壓將在1 kV與40 kV之間振盪，及設定點為25 kV。在一些態樣中，該電壓將在5 kV與35 kV之間振盪，及設定點為25 kV。在一些態樣中，該電壓將在10 kV與30 kV之間振盪，及設定點為25 kV。振盪電壓的使用將例如扭曲產生具有高存活率及/或穩定性之顆粒結構之磁場。
高壓電源之極性可以正或負構型。使漿料(或霧化液滴)與電極接觸以賦予其電荷。在一較佳態樣中，使該漿料與該(等)電極接觸以產生帶電漿料。同時或之後，霧化該帶電漿料以產生複數個帶靜電之濕顆粒(液滴)。
濕液滴上之各別電荷產生趨於引起相鄰液滴相互排斥之力。另外，給定液滴上之力與此給定液滴之表面張力相反。當該給定液滴上之電荷超過臨限值水準(瑞利限值(Rayleigh limit))時，該液滴變得不穩定且較小之衛星液滴係自該給定(母)液滴噴射。該等衛星液滴中之一或多者亦可進一步變得不穩定且產生另外衛星液滴，因為隨著蒸發發生，該等衛星液滴中之表面電荷密度不減小。
使帶靜電之濕顆粒/液滴於乾燥室內懸浮足夠之時間以允許由靜電電荷於至少一些濕顆粒/液滴上誘導之前述排斥力引起至少一些此等顆粒分裂成濕的子顆粒/液滴。該等液滴之懸浮液在無任何經加熱乾燥流體存在之情況下持續足夠之時間以驅除大多數濕顆粒/液滴內足夠量之液體溶劑從而留下複數個乾燥顆粒(粉末)，各乾燥顆粒含有囊封於載劑內之活性生物體。應注意，自給定體積之霧化漿料(即，自給定液滴)產生子顆粒/液滴導致此體積之更快乾燥，此係由於該等子顆粒/液滴之總表面積極大增加且在各分裂事件後各子顆粒/液滴之顆粒體積之伴隨減小。
子顆粒/液滴之產生可稱為庫侖分裂。此等庫侖分裂事件之時間尺度係在幾微秒至幾毫秒之數量級。自給定顆粒/液滴分裂約十個子顆粒/液滴使該給定顆粒/液滴之直徑減小約30%。於直徑中達成此減小所需之時間量(以幾微秒至幾毫秒數量級)比在經加熱空氣、氮或氬之存在下之擴散蒸發快一個數量級，其根據下式以特徵時間發生：t=do 2/k，其中do係顆粒之直徑及k係蒸發擴散係數。針對於20至200 mm直徑範圍內之顆粒，藉由蒸發達成任何顯著直徑減小之時間係以十分之一至幾秒之數量級，其比藉由庫侖分裂達成之直徑減小長得多(一至兩個數量級)。
相較於經加熱空氣系統及製程，漿料中相對低含水量及液滴上之靜電電荷之個別或組合特性允許乾燥室內之溫度條件低得多。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣)之溫度係介於15與100℃之間。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣)之溫度係介於20與95℃之間。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣)之溫度係介於25與90℃之間。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣)之溫度係介於30與85℃之間。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣)之溫度係介於35與80℃之間。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣)之溫度係介於40與75℃之間。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣)之溫度係介於45與70℃之間。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣)之溫度係介於50與70℃之間。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣)之溫度係介於55與65℃之間。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣)之溫度係62.5℃。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣)之溫度係67.5℃。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣)之溫度係70℃。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣)之溫度係80℃。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣)之溫度係90℃。
在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣、氮或氬)之溫度係介於15與100℃之間。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣、氮或氬)之溫度係介於20與95℃之間。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣、氮或氬)之溫度係介於25與90℃之間。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣、氮或氬)之溫度係介於30與85℃之間。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣、氮或氬)之溫度係介於35與80℃之間。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣、氮或氬)之溫度係介於40與75℃之間。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣、氮或氬)之溫度係介於45與70℃之間。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣、氮或氬)之溫度係介於50與70℃之間。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣、氮或氬)之溫度係介於55與65℃之間。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣、氮或氬)之溫度係62.5℃。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣、氮或氬)之溫度係67.5℃。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣、氮或氬)之溫度係70℃。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣、氮或氬)之溫度係80℃。在一些態樣中，引入該乾燥室內之未加熱乾燥流體(例如，空氣、氮或氬)之溫度係90℃。
在一些態樣中，該乾燥流體係氣體。在一些態樣中，該乾燥流體係氬。在一些態樣中，該乾燥流體係氮。在一些態樣中，該乾燥流體係空氣。
通常，入口空氣、氮或氬溫度將導致低於該入口空氣、氮或氬溫度之來自乾燥室之出口空氣溫度。
在一些態樣中，該方法進一步包括藉由將空氣進料至該乾燥室內之前，施加0.1至45 kV之電壓而將該空氣加熱至介於50℃與100℃之間。在一些態樣中，該方法進一步包括藉由將空氣進料至該乾燥室內之前，施加0.1至45 kV之電壓而將該空氣加熱至介於約40℃與約120℃之間。在一些態樣中，該方法進一步包括將空氣進料至該乾燥室內之前，藉由施加電壓而加熱該空氣。在一些態樣中，將該空氣加熱至介於約40℃至約120℃之間、介於約40℃至約110℃之間、介於約40℃至約100℃之間、介於約40℃至約90℃之間、介於約40℃至約80℃之間、介於約40℃至約70℃之間、介於約40℃至約60℃之間、介於約40℃至約50℃之間、介於約50℃至約120℃之間、介於約60℃至約120℃之間、介於約70℃至約120℃之間、介於約80℃至約120℃之間、介於約90℃至約120℃之間、介於約100℃至約120℃之間或介於約110℃至約120℃之間。在一些態樣中，該方法進一步包括藉由將空氣、氮或氬進料至乾燥室內之前，施加0.1至45 kV之電壓而將空氣加熱至介於50℃至100℃之間。在一些態樣中，該方法進一步包括藉由將空氣、氮或氬進料至乾燥室內之前，施加0.1至45 kV之電壓而將空氣、氮或氬加熱至介於約40℃至約120℃之間。在一些態樣中，該方法進一步包括藉由將空氣、氮或氬進料至乾燥室內之前，施加電壓而加熱空氣、氮或氬。在一些態樣中，將該空氣、氮或氬加熱至介於約40℃至約120℃之間、介於約40℃至約110℃之間、介於約40℃至約100℃之間、介於約40℃至約90℃之間、介於約40℃至約80℃之間、介於約40℃至約70℃、介於約40℃至約60℃之間、介於約40℃至約50℃之間、介於約50℃至約120℃之間、介於約60℃至約120℃之間、介於約60℃至約90℃之間、介於約70℃至約120℃之間、介於約80℃至約120℃之間、介於約90℃至約120℃之間、介於約100℃至約120℃之間或介於約110℃至約120℃之間。在一些態樣中，該電壓係約0.1 kV、約1 kV、約5 kV、約10 kV、約15 kV、約20 kV、約25 kV、約30 kV、約35 kV、約40 kV或約45 kV。在一些態樣中，該電壓係介於約0.1至約45 kV之間。在一些態樣中，該電壓係介於約0.1至約45 kV，約0.1至約40 kV、約0.1至約35 kV、約0.1至約30 kV、約0.1至約25 kV、約0.1至約20 kV、約0.1至約15 kV、約0.1至約10 kV、約0.1至約5 kV、約0.1至約1 kV、約1至約45 kV、約5至約45 kV、約10至約45 kV、約15至約45 kV、約20至約45 kV、約25至約45 kV、約30至約45 kV、約35至約45 kV或約40至約45 kV之間。
在一些態樣中，該方法進一步包括藉由將空氣進料至該乾燥室內之前，施加15 kV之電壓而將該空氣加熱至介於50℃至100℃之間。在一些態樣中，該方法進一步包括藉由將空氣、氮或氬進料至乾燥室內之前，施加15 kV之電壓而將該空氣、氮或氬加熱至介於50℃至100℃之間。
在一些態樣中，空氣係在介於70℃至90℃之間的溫度下。在一些態樣中，空氣、氮或氬係在介於70℃至90℃之間的溫度下。
在一些態樣中，該方法進一步包括藉由將空氣進料至該乾燥室內之前，施加15 kV之電壓而將該空氣加熱至介於70℃至90℃之間。在一些態樣中，該方法進一步包括藉由將空氣、氮或氬進料至乾燥室內之前，施加15 kV之電壓而將該空氣、氮或氬加熱至介於70℃至90℃之間。
在一些態樣中，該電壓係以恆定或脈衝方式施加。
在一些態樣中，可需確保引入乾燥室內之乾燥流體(例如，空氣、氮或氬)具有相對低含水量。因此，該系統可包括製程除濕器以在引入該乾燥室內之前自該乾燥流體移除一定量之水。在一些態樣中，在除濕後，輸入該乾燥室內之未加熱空氣、氮或氬可處於約介於1與20%之間的相對濕度。在一些態樣中，在除濕後，輸入該乾燥室內之未加熱空氣、氮或氬可處於約介於2與19%之間的相對濕度。在一些態樣中，在除濕後，輸入該乾燥室內之未加熱空氣、氮或氬可處於約介於3與18%之間的相對濕度。在一些態樣中，在除濕後，輸入該乾燥室內之未加熱空氣、氮或氬可處於約介於4與17%之間的相對濕度。在一些態樣中，在除濕後，輸入該乾燥室內之未加熱空氣、氮或氬可處於約介於5與16%之間的相對濕度。在一些態樣中，在除濕後，輸入該乾燥室內之未加熱空氣、氮或氬可處於約介於6與15%之間的相對濕度。在一些態樣中，在除濕後，輸入該乾燥室內之未加熱空氣、氮或氬可處於約介於7與14%之間的相對濕度。在一些態樣中，在除濕後，輸入該乾燥室內之未加熱空氣、氮或氬可處於約介於8與13%之間的相對濕度。在一些態樣中，在除濕後，輸入該乾燥室內之未加熱空氣、氮或氬可處於約介於9與12%之間的相對濕度。在一些態樣中，在除濕後，輸入該乾燥室內之未加熱空氣、氮或氬可處於約介於10與11%之間的相對濕度。
在一些態樣中，未加熱空氣、氮或氬之露點可於-20℃至5℃、-15℃至5℃、-12℃至3℃、-12℃至0℃、-12℃至-5℃之範圍內，或任何其他適用於噴霧乾燥操作之露點範圍。
噴霧器可藉助於已知方法、設備及/或技術中之任一者實施。在一些態樣中，該噴霧器可使用以下中之至少一者實施：噴嘴技術、離心技術、氣動技術及超音波技術。針對大多數霧化技術，漿料不以最終液滴形式離開霧化機構，而是以液體薄膜或系帶(ligament)之碎片形式。液滴之形成由於液體之表面張力而在該液體已離開該霧化機構後立即發生。來自給定類型之霧化之液滴尺寸取決於使該漿料破碎成碎片之能量輸入，例如，以增加該漿料之總有效表面積。
在一些態樣中，針對給定霧化技術，平均液滴尺寸及分佈可相當恆定，且係於1至500微米之範圍內。在一些態樣中，該平均液滴尺寸係於10至450微米之範圍內。在一些態樣中，該平均液滴尺寸係於50至400微米之範圍內。在一些態樣中，該平均液滴尺寸係於100至350微米之範圍內。在一些態樣中，該平均液滴尺寸係於150至300微米之範圍內。在一些態樣中，該平均液滴尺寸係於200至250微米之範圍內。
在一些態樣中，具有單個噴嘴(即，單一流體)之噴霧器藉由分配及混合細胞、載劑及囊封材料囊封該等細胞。在一些態樣中，具有兩個噴嘴(即，雙重流體)之噴霧器將自一個噴嘴分配該等細胞及於第二噴嘴中分配該載劑及/或囊封材料，並將兩種流體混合在一起以囊封該等細胞(藉由產生核心及外層塗層)。在一些態樣中，具有單個噴嘴(即，單一流體)之噴霧器將噴霧乾燥與該載劑混合之細胞，且囊封步驟將在噴霧乾燥或沃斯特(Wurster)塗佈機或其他塗佈設備後進行。
根據本文之各種態樣之靜電電荷過程及所得庫侖分裂過程一般產生比習知噴霧乾燥製程更大之顆粒。然而，該等更大之顆粒來自甚至更大之母體顆粒，其等無法由習知噴霧器足量產生。根據本文之態樣產生之子代顆粒更小，且該製程趨於使極黏漿料具有雙峰尺寸分佈。
可認為離心(或旋轉)霧化係霧化之最常見形式。離心霧化採用旋轉圓盤或轉輪，其將漿料之液體流分解成液滴。在一些態樣中，離心霧化裝置可採用直徑約5至50 cm之圓盤或轉輪。在一些態樣中，該離心霧化裝置可採用直徑約10至45 cm之圓盤或轉輪。在一些態樣中，該離心霧化裝置可採用直徑約10至45 cm之圓盤或轉輪。在一些態樣中，該離心霧化裝置可採用直徑約15至40 cm之圓盤或轉輪。在一些態樣中，該離心霧化裝置可採用直徑約20至30 cm之圓盤或轉輪。在一些態樣中，該圓盤或轉輪可於約5,000至40,000 rpm之範圍內旋轉。在一些態樣中，該圓盤或轉輪可於約10,000至35,000 rpm之範圍內旋轉。在一些態樣中，該圓盤或轉輪可於約15,000至30,000 rpm之範圍內旋轉。在一些態樣中，該圓盤或轉輪可於約20,000至30,000 rpm之範圍內旋轉。由離心霧化裝置產生之液滴之尺寸係約與該圓盤或轉輪之圓周速度成反比。
噴嘴霧化採用泵，其加壓並迫使漿料通過噴嘴之孔口以使液體破碎成細小液滴。在一些態樣中，孔口尺寸通常係於0.5至30 mm之範圍內。在一些態樣中，該孔口尺寸通常係於1至29 mm之範圍內。在一些態樣中，該孔口尺寸通常係於5至25 mm之範圍內。在一些態樣中，該孔口尺寸通常係於10至20 mm之範圍內。在一些態樣中，該孔口尺寸通常係於13至17 mm之範圍內。該等液滴之尺寸取決於該孔口之尺寸及壓降。跨該孔口之壓降越大則產生之液滴越小。因此，為針對給定進料速率減小顆粒/液滴尺寸，可採用更小之孔口及更高之泵壓。
雙流體氣動霧化採用該漿料與另一流體(通常壓縮空氣)之相互作用，使用一流體噴嘴用於該壓縮空氣及一流體噴嘴用於該漿料。在一些態樣中，該空氣及漿料之壓力可於約200至350 kPa之範圍內。在一些態樣中，該空氣及漿料之壓力可於約210至340 kPa之範圍內。在一些態樣中，該空氣及漿料之壓力可於約220至330 kPa之範圍內。在一些態樣中，該空氣及漿料之壓力可於約230至320 kPa之範圍內。在一些態樣中，該空氣及漿料之壓力可於約240至310 kPa之範圍內。在一些態樣中，該空氣及漿料之壓力可於約250至300 kPa之範圍內。在一些態樣中，該空氣及漿料之壓力可於約260至290 kPa之範圍內。在一些態樣中，該空氣及漿料之壓力可於約270至280 kPa之範圍內。粒度係藉由改變壓縮空氣流與漿料流之比率來控制。在一些態樣中，雙流體氣動霧化採用該漿料與另一流體(通常壓縮空氣、氮或氬)之相互作用，使用一流體噴嘴用於該壓縮空氣、氮或氬及一流體噴嘴用於該漿料。在一些態樣中，該空氣、氮或氬及漿料之壓力可於約200至350 kPa之範圍內。在一些態樣中，該空氣、氮或氬及漿料之壓力可於約210至340 kPa之範圍內。在一些態樣中，該空氣、氮或氬及漿料之壓力可於約220至330 kPa之範圍內。在一些態樣中，該空氣、氮或氬及漿料之壓力可於約230至320 kPa之範圍內。在一些態樣中，該空氣、氮或氬及漿料之壓力可於約240至310 kPa之範圍內。在一些態樣中，該空氣、氮或氬及漿料之壓力可於約250至300 kPa之範圍內。在一些態樣中，該空氣、氮或氬及漿料之壓力可於約260至290 kPa之範圍內。在一些態樣中，該空氣、氮或氬及漿料之壓力可於約270至280 kPa之範圍內。粒度係藉由改變壓縮空氣、氮或氬流與漿料流之比率來控制。
音波霧化採用超音波能量以超音波頻率振動表面。使漿料與振動表面接觸以產生顆粒/液滴。
在一些態樣中，本發明可使用離心噴霧器、噴嘴型噴霧器、雙流體噴霧器或音波噴霧器。
在一些態樣中，該雙流體噴霧器包含具有近端及遠端之主體。在一些態樣中，該雙流體噴霧器具有延伸穿過該主體之通道且包括入口(通常在該主體之近端附近)，及出口(一般在該主體之遠端附近)。該通道運行以將兩種流體中之第一者(即，漿料)，自該入口運輸至該出口。
在一些態樣中，該雙流體噴霧器亦包括至少一個電極，其運行以接觸漿料並對其施加靜電電荷，使得該雙流體噴霧器運行以產生複數個帶靜電濕顆粒/液滴。在一些態樣中，該至少一個電極可安置於該雙流體噴霧器之主體內使得該漿料與該電極接觸並變得帶靜電，同時自該通道之入口流動至該出口。在一些態樣中，該電極可安置於該通道內，較佳以同軸佈置，使得該電極之表面積之極大一部分可用於與該漿料接觸。在一些態樣中，該電極可藉助於該主體之螺紋孔及該電極之互補螺紋軸插入該通道內，當螺紋孔與互補螺紋軸接合時，將該電極放置於該通道內。在一些態樣中，連接端子可電及機械耦合至該電極以提供用於與高壓電源連接並於該電極之表面處接收電壓電勢之構件。
在一些態樣中，該雙流體噴霧器可包括與通道之出口流體連通之噴嘴。在一些態樣中，該通道之出口包括尺寸及形狀設定為與該噴嘴之入口端處之互補孔接合並接收於其中之管。該管及孔之接合允許漿料(已帶靜電)自該通道流體連通至中間安置於該噴嘴內之內部體積中。在一些態樣中，即使在流體壓力下，仍可採用密封環來確保該管與該孔之間的流體緊密密封。在一些態樣中，該噴嘴較佳包括自該內部體積延伸至噴嘴孔口之直徑減小之過渡段(錐形表面)。在一些態樣中，該噴嘴孔口較佳具有一般圓柱形形狀，包括尺寸足以在其等一經屈服於表面張力時即產生具有所需尺寸及形狀之濕顆粒/液滴的內孔。
在一些態樣中，該雙流體噴霧器可進一步包括噴嘴帽，其一般圍繞該噴嘴且允許噴嘴孔口延伸通過其遠端處之孔。在一些態樣中，該噴嘴帽包括於其近端處之接合特徵，其接合主體之遠端。在一些態樣中，該噴嘴帽包括螺紋柄，其旋入該主體之互補螺紋孔內。在一些態樣中，可採用密封環來確保在該噴嘴帽之內表面與該噴嘴之外表面之間的流體緊密密封，藉此於其之間形成內部體積。
在一些態樣中，該雙流體噴霧器包括延伸通過主體之另一通道，其包括入口(通常在主體之近端附近)及出口(通常在該主體之遠端附近)。在一些態樣中，該通道運行以將兩種流體中之第二者(即，未加熱空氣、氮或氬)自該入口運輸至該出口。在一些態樣中，該出口係與內部體積(在噴嘴帽之內表面與噴嘴之外表面之間)流體連通。因此，該通道運行以將該未加熱空氣、氮或氬自該雙流體噴霧器之近端運輸至該遠端。在一些態樣中，通過該雙流體噴霧器之未加熱空氣、氮或氬之流量在約130 psi之輸入壓力下可為約5,100 m 3/h。在一些態樣中，通過該雙流體噴霧器之未加熱空氣、氮或氬之流量在約100 psi之輸入壓力下可為約4,000 m 3/h。在一些態樣中，通過該雙流體噴霧器之未加熱空氣、氮或氬之流量在約115 psi之輸入壓力下可為約4,500 m 3/h。在一些態樣中，通過該雙流體噴霧器之未加熱空氣、氮或氬之流量在約160 psi之輸入壓力下可為約6,200 m 3/h。在一些態樣中，通過該雙流體噴霧器之未加熱空氣、氮或氬之流量在約145 psi之輸入壓力下可為約5,500 m 3/h。
在一些態樣中，噴嘴包括於其外部之錐形表面，其係於外表面下游及內部體積下游。在一些態樣中，噴嘴帽包括與該錐形表面鄰接之互補內表面。許多溝槽(凹槽)係安置於上錐形表面中並自該內部體積延伸至噴嘴孔口。當該噴嘴帽之互補內表面係與該錐形表面鄰接時，該等溝槽提供未加熱空氣、氮或氬自該內部體積流體連通至該噴嘴孔口。該等溝槽終止於該錐形表面之外周邊緣與該噴嘴孔口之外表面之間的環形空間，其中該噴嘴孔口離開該噴嘴。該環形空間係與該孔流體連通，藉此經適當尺寸設定之孔(大於該噴嘴孔口之直徑)允許該未加熱空氣、氮或氬在壓力下離開該噴嘴及噴嘴帽。在一些態樣中，該等溝槽延伸使得其等切向終止於該環形空間並藉此導致該未加熱空氣、氮或氬在其離開該孔後於該空間內及於該噴嘴孔口附近產生旋流流體運動。
在一些態樣中，未加熱空氣、氮或氬在其離開噴嘴及噴嘴帽時之旋流流體運動在複數個濕顆粒/液滴離開該噴嘴時對其等賦予旋流攪動。此旋流攪動可使該等濕顆粒/液滴懸浮及攪動以達成前述分裂及蒸發。在一些態樣中，上文霧化方法可在約20至100 psi之輸入壓力下達成1至20 kg/h數量級之相對高漿料通量。在一些態樣中，上文霧化方法在在約15至125 psi之輸入壓力下可達成0.1至25 kg/h數量級之相對高漿料通量。
在一些態樣中，乾燥室可用於根據本發明之系統中。在一些態樣中，該乾燥室可包括入口端、出口端及內部體積，在該內部體積中乾燥濕顆粒/液滴。在一些態樣中，該乾燥室係由非導電材料形成。在一些態樣中，材料之選擇將為非金屬以避免導電材料。然而，現有技術噴霧乾燥製程之傳統智慧需要經加熱空氣(以200℃之數量級)，因此其需要金屬乾燥室(通常不銹鋼)，否則該腔室將扭曲或否則失效。
在一些態樣中，使用未加熱空氣、氮或氬容許乾燥室由非金屬材料形成，因為該乾燥室內部之溫度可小於50℃。在一些態樣中，該乾燥室可由諸如聚合物基複合材料之材料形成。單絲纏繞玻璃纖維複合材料貯槽(其等係用於儲存水、各種食料、糧食儲存、鹽水及許多基於非食物之應用)具有極佳之負載性質且可用於製造極大之貯槽。在一些態樣中，單絲纏繞玻璃纖維複合材料材料可用於製造本文揭示之乾燥室。例如，當相較於由不銹鋼製成之尺寸相似之容器時，工程化塑膠通常具有較低之基本材料成本及製造成本。此等材料亦可使該乾燥室之設計具有更大之靈活性，容許形成複雜之形狀，由不銹鋼製造該等複雜形狀係困難得多且製造成本更高。
在一些態樣中，貯槽包含攪拌裝置(例如，推進器或攪拌棒)。
在一些態樣中，貯槽係經佈置以接收液體溶劑(例如，水)、載劑及厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞。
使用非金屬非導電之介電材料來形成乾燥室(諸如工程化塑膠複合材料材料)允許於該乾燥室本身內使用一或多個電場，以將顆粒/液滴推進至所需軌跡內及/或將此等顆粒/液滴自該乾燥室之入口端推向其出口端。不同於金屬導電容器，其幾乎不可能於該容器內部形成電場，因為所有電荷均聚集於該容器之表面上。
在一些態樣中，乾燥室可包括位於其入口端處或附近之第一電極，及位於該乾燥室之出口端處及附近之第二電極。在該第一與第二電極之間施加電壓電勢源於該乾燥室內誘導足以在顆粒/液滴於腔室內乾燥時將該等顆粒/液滴推進至所需軌跡中之電場。在一些態樣中，所需軌跡即使在此等壁向該出口端逐漸錐化之情況下仍導致該電場之線一般平行於該乾燥室之壁延伸。為達成此軌跡，相較於該第一電極，該第二電極將具有相對小直徑。若該第一及第二電極一般具有相同之直徑，則該電場之線將一般平行於該乾燥室之壁延伸，及然後穿過於該出口端處之錐形壁。其他顆粒軌跡可基於該等電極之數量、位置、尺寸及形狀達成。在一些態樣中，該第一及第二電極可安置於該乾燥室外部，然而憑藉其由非導電材料形成而於該乾燥室之內部體積內誘導電場。
在一些態樣中，乾燥顆粒形態受益於無熱製程，因為顆粒在其等進入乾燥室時部經歷溫度之突然升高且該等顆粒之表面上不顯示裂紋、表面上無火山結構或該等顆粒內無中空區域。
一般而言，無熱製程證實起始活性生物體(例如，厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌)之保藏水準較高。在一些態樣中，相較於經加熱噴霧乾燥製程，該無熱製程導致更穩定且存活的厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌。在一些態樣中，於無熱樣品中，非存活的厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌之出現將極大減少，導致包含厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌之粉末的更長預計架儲期。
在一些態樣中，所得乾燥粉末包括複數個乾燥顆粒，其等個別地含有一定量由乾燥漿料產生之囊封於載劑內之最終活性生物體(例如，厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌)，該漿料含有初始活性生物體、液體溶劑及載劑。在一些態樣中，該初始活性生物體包括一或多種組成組分，其等中之至少一者係獲得細菌、益生菌等中之至少一者之一或多種主要分子類型。在一些態樣中，該細菌係如本文揭示之埃氏巨球型菌。在一些態樣中，該細菌係埃氏巨球型菌NCIMB 41125。
在一些態樣中，該載劑係經修飾之澱粉或碳水化合物。在一些態樣中，該載劑係選自由以下組成之群：蔗糖、麥芽糊精、麥芽糖、疏水性澱粉、糖、糖醇、糖衍生物或氮源(例如(但不限於)銨鹽及衍生物、酵母菌提取物、脫脂乳或玉米浸液)，及其混合物。在一些態樣中，該載劑係選自由以下組成之群：蔗糖、麥芽糊精、麥芽糖、多醣、囊封聚合物、疏水性澱粉、糖、糖醇、糖衍生物或氮源(例如(但不限於)銨鹽及衍生物、酵母菌提取物、脫脂乳或玉米浸液)，及其混合物。在一些態樣中，該囊封聚合物係海藻酸鹽。在一些態樣中，該載劑具有整個漿料及/或乾燥粉末之1至50重量%之濃度。在一些態樣中，該載劑具有整個漿料及/或乾燥粉末之1至45重量%之濃度。在一些態樣中，該載劑具有整個漿料及/或乾燥粉末之1至40重量%之濃度。在一些態樣中，該載劑具有整個漿料及/或乾燥粉末之1至35重量%之濃度。在一些態樣中，該載劑具有整個漿料及/或乾燥粉末之1至30重量%之濃度。在一些態樣中，該載劑具有整個漿料及/或乾燥粉末之1至25重量%之濃度。在一些態樣中，該載劑具有整個漿料及/或乾燥粉末之2至20重量%之濃度。在一些態樣中，該載劑具有整個漿料及/或乾燥粉末之1至20重量%之濃度。在一些態樣中，該載劑具有整個漿料及/或乾燥粉末之2至19重量%之濃度。在一些態樣中，該載劑具有整個漿料及/或乾燥粉末之3至18重量%之濃度。在一些態樣中，該載劑具有整個漿料及/或乾燥粉末之4至17重量%之濃度。在一些態樣中，該載劑具有整個漿料及/或乾燥粉末之5至16重量%之濃度。在一些態樣中，該載劑具有整個漿料及/或乾燥粉末之6至15重量%之濃度。在一些態樣中，該載劑具有整個漿料及/或乾燥粉末之7至14重量%之濃度。在一些態樣中，該載劑具有整個漿料及/或乾燥粉末之8至13重量%之濃度。在一些態樣中，該載劑具有整個漿料及/或乾燥粉末之9至12重量%之濃度。在一些態樣中，該載劑具有整個漿料及/或乾燥粉末之10至11重量%之濃度。
在一些態樣中，該載劑具有整個漿料及/或乾燥粉末之約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%或約50重量%之濃度。
在一些態樣中，含水量係小於乾燥粉末之1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%或約50重量%。在一些態樣中，該含水量係乾燥粉末之約1至30重量%。在一些態樣中，該含水量係乾燥粉末之約3至25重量%。在一些態樣中，該含水量係乾燥粉末之約5至20重量%。在一些態樣中，該含水量係乾燥粉末之約10至20重量%。
在一些態樣中，最終活性生物體包括與如藉由乾燥漿料修飾之初始活性生物體之組成組分對應之組成組分中之一或多者。該最終活性生物體中之一或多種主要分子類型中之至少一者之重量百分比係基本上與該初始活性生物體中之對應主要分子類型之重量百分比相同(例如，於其之約5%、4%、3%或1%內)。
於本發明之低溫(例如無熱)噴霧乾燥製程中使用高固體含量乳液(及基於該乳液之總重量計，固體濃度為至少40重量%，且基於相同總重量計，較佳為至少50重量%)為藉由該製程產生之最終粉末提供許多所需之屬性，諸如：(1)高顆粒密度，及密度大於水之密度(即，＞1 g/cc)，使得顆粒容易沉入水溶液中並變得迅速溶解或懸浮，(2)由較高固體含量賦予更大之抗氧化性，(3)使用高固體含量漿料/乳液與低溫組合達成顯著之能量效率，因為相較於傳統噴霧乾燥製程，蒸發多達其約一半之水，及(4)對高價值活性生物體(諸如埃氏巨球型菌)之極佳保留，作為由低溫乾燥及高固體含量漿料/乳液帶來之另一實質性經濟優勢。
然而，習知高溫乾燥製程導致厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌之存活率顯著損失，導致具有較少存活的厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌之粉末。一般而言，由高溫習知噴霧乾燥製程產生之粉末具有小平均直徑，例如，以60至100微米之數量級，不完全緻密，且難以溶解於水溶液中。相比之下，藉由本發明之低溫噴霧乾燥製程產生之粉末具有大平均直徑，諸如以125至250微米之數量級，係完全緻密的，且容易進入溶液中。
電噴霧乾燥可為連續製程。在一些態樣中，漿料係以介於約0.1 L/小時與約10,000 L/小時之間的速率處理。在一些態樣中，該漿料係以介於約0.25 L/小時與約10,000 L/小時之間的速率處理。在一些態樣中，該漿料係以介於約1 L/小時與約10,000 L/小時之間的速率處理。在一些態樣中，該漿料係以介於約10 L/小時與約5,000 L/小時之間的速率處理。在一些態樣中，該漿料係以介於約50 L/小時與約1,000 L/小時之間的速率處理。在一些態樣中，該漿料係以介於約100 L/小時與約900 L/小時之間的速率處理。在一些態樣中，該漿料係以介於約200 L/小時與約800 L/小時之間的速率處理。在一些態樣中，該漿料係以介於約300 L/小時與約700 L/小時之間的速率處理。在一些態樣中，該漿料係以介於約400 L/小時與約600 L/小時之間的速率處理。在一些態樣中，該漿料係以介於約500 L/小時與約600 L/小時之間的速率處理。
因此，可產生本發明之經噴霧乾燥之粉末，其中最終活性生物體包括對應於藉由噴霧乾燥製程修飾之初始活性生物體之組成組分之組成組分中之一或多者，其中該經噴霧乾燥之粉末或纖維組合物具有以下特性中之至少一者：(i)最終生物體中之一或多種主要分子類型(例如，厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌)中之至少一者之重量百分比，其係於該初始活性生物體中之對應主要分子類型之重量百分比之約15%內，且例如，其可於該初始活性生物體中之對應主要分子類型之重量百分比之約12%、10%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%內。
在一些態樣中，約1 x 10 3至1 x 10 13CFU/g經電噴霧乾燥之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞係藉由本文揭示之方法產生。在一些態樣中，約1 x 10 3至1 x 10 13CFU/g之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞在電噴霧乾燥後係存活的。
在一些態樣中，藉由本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞之量及/或在電噴霧乾燥後存活的厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞之量係約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 12CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 11CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 10CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 9CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 8CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 7CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 6CFU/g、約1 x 10 4CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 5CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 6CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 7CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 8CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 9CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 10CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 5CFU/g、約1 x 10 4CFU/g至約1 x 10 6CFU/g、約1 x 10 5CFU/g至約1 x 10 7CFU/g、約1 x 10 6CFU/g至約1 x 10 8CFU/g、約1 x 10 7CFU/g至約1 x 10 9CFU/g、約1 x 10 8CFU/g至約1 x 10 10CFU/g、約1 x 10 9CFU/g至約1 x 10 11CFU/g、或約1 x 10 10CFU/g至約1 x 10 13CFU/g。
在一些態樣中，該等經電噴霧乾燥之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞係在約-80℃、約-20℃、約4℃、約25℃，或其組合下存活約14天至約24個月。在一些態樣中，該等經電噴霧乾燥之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞係在約-80℃、約-20℃、約4℃、約25℃，或其組合下存活至少14天、至少1個月、至少6個月、至少8個月、至少10個月、至少12個月、至少15個月、至少18個月或至少24個月。
在一些態樣中，該等經電噴霧乾燥之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞係在約-20℃、約4℃、約30℃，或其組合下存活至少75天。在一些態樣中，該等經電噴霧乾燥之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞係在約-20℃下存活至少6個月。在一些態樣中，該等經電噴霧乾燥之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞係在約37℃下存活至少28天。
在一些態樣中，該等經電噴霧乾燥之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞係在約-80℃、約-20℃、約4℃、約25℃，或其組合下存活14天、1個月、6個月、8個月、10個月、12個月、15個月、18個月或24個月。
在一些態樣中，該等經電噴霧乾燥之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞係在約-20℃、約4℃、約30℃，或其組合下存活75天。在一些態樣中，該等經電噴霧乾燥之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞係在約-20℃下存活6個月。在一些態樣中，該等經電噴霧乾燥之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞係在約37℃下存活28天。
在一些態樣中，約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 12CFU/g、約1 x 10 3CFU/mL至約1 x 10 11CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 10CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 9CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 8CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 7CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 6CFU/g、約1 x 10 4CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 5CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 6CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 7CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 8CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 9CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 10CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 5CFU/g、約1 x 10 4CFU/g至約1 x 10 6CFU/g、約1 x 10 5CFU/g至約1 x 10 7CFU/g、約1 x 10 6CFU/g至約1 x 10 8CFU/g、約1 x 10 7CFU/g至約1 x 10 9CFU/g、約1 x 10 8CFU/g至約1 x 10 10CFU/g、約1 x 10 9CFU/g至約1 x 10 11CFU/g、或約1 x 10 10CFU/g至約1 x 10 13CFU/g經電噴霧乾燥之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞在約-80℃、約-20℃、約4℃，或其組合之溫度下儲存至少14天、至少1個月、至少6個月、至少8個月、至少10個月、至少12個月、至少15個月、至少18個月或至少24個月後係存活的。
在一些態樣中，約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 12CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 11CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 10CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 9CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 8CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 7CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 6CFU/g、約1 x 10 4CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 5CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 6CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 7CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 8CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 9CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 10CFU/g至約1 x 10 13CFU/g、約1 x 10 3CFU/g至約1 x 10 5CFU/g、約1 x 10 4CFU/g至約1 x 10 6CFU/g、約1 x 10 5CFU/g至約1 x 10 7CFU/g、約1 x 10 6CFU/g至約1 x 10 8CFU/g、約1 x 10 7CFU/g至約1 x 10 9CFU/g、約1 x 10 8CFU/g至約1 x 10 10CFU/g、約1 x 10 9CFU/g至約1 x 10 11CFU/g、或約1 x 10 10CFU/g至約1 x 10 13CFU/g經電噴霧乾燥之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞在約25℃之溫度下儲存至少14天、至少1個月、至少6個月、至少8個月、至少10個月、至少12個月、至少15個月、至少18個月或至少24個月後係存活的。 飼料添加劑、組合物及套組
在一些態樣中，飼料添加劑包含如本文揭示之經電噴霧乾燥之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞。在一些態樣中，該飼料添加劑包含藉由本文揭示之方法產生之凍乾厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞。
在一些態樣中，該飼料添加劑為固體(即，「固體飼料添加劑」)或液體(即，「液體飼料添加劑」)。在一些態樣中，該飼料添加劑為半固體或凝膠(即，「半固體或凝膠飼料添加劑」)。凝膠飼料添加劑可含有氧清除劑(例如，抗壞血酸)。
在一些態樣中，固體飼料添加劑為粉末(例如，可流動粉末)、顆粒體(即，顆粒)、粒子(即，微粒)、集結粒、餅狀物、水溶性濃縮物、糊劑、大丸藥、錠劑、粉塵、其組分，或其組合。
在一些態樣中，液體飼料添加劑為溶液(例如，水溶液、有機溶液或有機水溶液)、懸浮液、乳液、灌劑(drench)、噴霧、可注射劑、飲品(例如，乳替代品)、其組分，或其組合。
在一些態樣中，凝膠飼料添加劑為有機凝膠。在一些態樣中，該凝膠飼料添加劑為口服凝膠(即，用於口服投與之凝膠)。
在一些態樣中，該飼料添加劑係用作表面加料(top dress)(即，用於添加至食物之表面或與食物(例如，動物飼料)混合)。在一些態樣中，該飼料添加劑係用於作為液體投與。
在一些態樣中，如本文揭示之經電噴霧乾燥之厭氧細胞(例如，雙叉桿菌細胞(諸如短型雙叉桿菌)、乳桿菌細胞(諸如胚芽乳桿菌)、雙叉桿菌細胞(諸如動物雙叉桿菌乳亞種)、片球菌細胞(諸如乳酸片球菌)、乳桿菌細胞(諸如乾酪乳桿菌)、絲狀桿菌(諸如產琥珀酸絲狀桿菌)、瘤胃球菌(諸如黃色瘤胃球菌)及丁酸弧菌(諸如溶纖維丁酸弧菌))及/或埃氏巨球型菌細胞可藉由將該等細胞再水合、溶解、增溶及/或懸浮於液體中而用作液體飼料添加劑。
在一些態樣中，該飼料添加劑包含飼料添加劑載劑(即，一或多種飼料添加劑載劑)。
合適之飼料添加劑載劑之實例包括(但不限於)植物材料(即，整個植物或植物部分(例如，舉例而言，種子、莖、葉、花及/或根)，包括經乾燥或處理之植物或植物部分)、經乾燥之穀物(例如，經蒸餾器乾燥之穀物)、苜蓿、玉米粉、柑橘粉、發酵殘餘物、經研磨之牡蠣殼、凹凸棒石(attapulgus)黏土、碎麥粉、糖蜜可溶物、玉米芯粉、可食用蔬菜物質、烤去皮大豆粉、大豆粉飼料、抗生素黴菌、蛭石、大豆粗粉、乳清、麥芽糊精、蔗糖、右旋糖、石灰石(碳酸鈣)、稻殼、酵母菌培養物、乾燥澱粉、矽鋁酸鈉、水、鹽溶液、醇、聚矽氧、蠟、石油膠、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂質體、糖、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石、表面活性劑、矽酸、黏性石蠟、香料油、脂肪酸單甘油酯及二甘油酯、石油醚脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮，及類似物，及其組合。
在一些態樣中，該飼料添加劑包含賦形劑(即，一或多種賦形劑)，包括(但不限於)微晶纖維素；乳糖；檸檬酸鈉；碳酸鈣；磷酸二氫鈣及甘胺酸；崩解劑，諸如澱粉、澱粉乙醇酸鈉、交聯羧甲基纖維素鈉及某些複合矽酸鹽；造粒黏合劑，諸如聚乙烯吡咯啶酮、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)、蔗糖、明膠及阿拉伯膠；填充劑，諸如麥芽糊精；水分清除劑，諸如二氧化矽；氧清除劑，諸如抗壞血酸；及/或潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸、山崳酸甘油酯及滑石。
在一些態樣中，該飼料添加劑係包含以下之顆粒體：包含厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞及/或飼料添加劑之核心，及於該核心上之塗層。在一些態樣中，該塗層係水合障壁鹽。該鹽塗層可提供經改善之耐熱性、經改善之儲存穩定性及保護免受可原本對該等埃氏巨球型菌細胞及/或飼料添加劑有不利影響(例如，對穩定性)之該等顆粒體中之其他組分的損害。
在一些態樣中，該等經電噴霧乾燥之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞係與添加劑之乾燥調配物混合，該等添加劑包括(但不限於)生長受質、酵素、糖、碳水化合物、提取物及生長促進微成分。該等糖可包括(但不限於)乳糖、麥芽糖、右旋糖、麥芽糊精、蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、塔格糖、山梨糖、棉子糖、直鏈澱粉、澱粉及半乳糖。該等糖可個別地或組合於50至95%範圍內。該等提取物可包括(但不限於)於5至50%範圍內之酵母菌或經乾燥之酵母菌發酵可溶物。在一些態樣中，該等提取物包括濃縮發酵玉米提取物或玉米浸液。該等生長受質可包括(但不限於)胰酪酶，於5至25%範圍內；乳酸鈉，於5至30%範圍內；及Tween 80，於1至5%範圍內。該等碳水化合物可包括(但不限於)甘露醇、山梨醇、福壽草醇及阿拉伯糖醇。該等碳水化合物可個別地或組合於5至50%範圍內。該等微成分可包括(但不限於)碳酸鈣，於0.5至5.0%範圍內；氯化鈣，於0.5至5.0%範圍內；磷酸氫二鉀，於0.5至5.0%範圍內；磷酸鈣，於0.5至5.0%範圍內；錳蛋白鹽，於0.25至1.00%範圍內；及錳，於0.25至1.00%範圍內。
在一些態樣中，厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌飼料添加劑係藉由混合(例如，用混合器)厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞製備，包括包含該等細胞及/或經電噴霧乾燥之細胞，及該等飼料添加劑之任何另外組分(例如，載劑及/或賦形劑)之培養物。在一些態樣中，將該等組分混合以獲得均勻混合物。
在一些態樣中，該飼料添加劑係包含如本文揭示之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞(例如，經電噴霧乾燥之細胞)及載劑之表面加料動物飼料添加劑。在一些態樣中，該載劑係選自由以下組成之群：乳清、麥芽糊精、蔗糖、右旋糖、石灰石(即，碳酸鈣)、稻殼、酵母菌培養物、乾燥澱粉及矽鋁酸鈉、乳、水，及其組合。
在一些態樣中，該動物飼料添加劑係包含如本文揭示之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞(例如，經電噴霧乾燥之細胞)及水溶性載劑之乳替代品之灌劑、噴霧或補充劑。在一些態樣中，該載劑係選自由以下組成之群：乳清、麥芽糊精、蔗糖、右旋糖、乾燥澱粉、矽鋁酸鈉、乳、水，及其組合。
在一些態樣中，本發明係關於包含厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞(例如，如本文揭示之經電噴霧乾燥之細胞，例如，藉由如本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之細胞)及/或如本文揭示之飼料添加劑之食物(例如，動物飼料)。食物產品係用於動物消耗(即，非人類動物或人類)之任何食物，且包括固體及液體組合物兩者。食物包括(但不限於)常見食物；液體產品，包括水、乳、飲料、治療性飲品及營養素飲料；功能性食品；補充劑；營養品；嬰兒(即，包括非人類及人類嬰兒)配方食品，包括用於早產嬰兒之配方食品；用於懷孕或哺乳動物之食物；用於成年動物之食物；及老年食品。在一些態樣中，該食物包括包含該飼料添加劑之液體(例如，飲品，例如，水、乳或乳替代品)。
在一些態樣中，本發明係關於一種包含如本文揭示之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞(例如，經電噴霧乾燥之細胞)及/或飼料添加劑之組合物。在一些態樣中，該組合物包含藉由本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞。
本發明之組合物可包括一或多種賦形劑。在一些態樣中，該賦形劑可為(但不限於)鹼劑、穩定劑、抗氧化劑、黏合劑、分離劑、塗層劑、外相組分、控釋組分、溶劑、表面活性劑、保濕劑、緩衝劑、填充劑、軟化劑，或其組合。除彼等本文討論者外，賦形劑亦可包括列舉於(但不限於) Remington: The Science and Practice of Pharmacy，第21版(2005)中之賦形劑。本文特定分類中包括之賦形劑(例如，「溶劑」)旨在闡述(而非限制)該賦形劑之作用。特定賦形劑可落於多種分類中。
在一些態樣中，該組合物為醫藥組合物(例如，用於治療非人類動物或人類)。在一些態樣中，該組合物係醫療食物(例如，獸用食品)。醫療食物包括在醫生(例如，獸醫)之監督下食用或外部投與之組合物中且旨在用於基於公認之科學原理藉由醫學評估建立獨特之營養要求之病症之特定飲食管理之食物。在一些態樣中，該醫藥組合物包含醫藥上可接受之賦形劑。在一些態樣中，術語「醫藥上可接受」意謂經聯邦或州政府監管機構批准或美國藥典或其他公認之國際藥典中列舉用於動物中，且更特定言之用於人類中。
針對組合物之口服投與，厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞(例如，經電噴霧乾燥之細胞)或飼料添加劑可與此項技術中熟知的賦形劑組合。此等載劑可例如容許將本發明之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞或飼料添加劑調配成錠劑、藥丸、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿料、懸浮液及類似物，用於由待治療之個體口服攝取。在一些態樣中，該組合物係錠劑、藥丸、膠囊型錠劑或膠囊。合適之賦形劑包括(但不限於)填充劑，諸如糖類，包括(但不限於)乳糖、蔗糖、甘露醇及山梨醇；纖維素製劑，諸如(但不限於)玉米澱粉、小麥澱粉、大米澱粉、馬鈴薯澱粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉及聚乙烯吡咯啶酮(PVP)。視需要，可添加崩解劑，諸如(但不限於)交聯聚乙烯吡咯啶酮、瓊脂或海藻酸或其鹽，諸如海藻酸鈉。可口服使用之組合物包括(但不限於)由明膠製成之膠囊，及由明膠及塑化劑(諸如甘油或山梨醇)製成之軟質密封膠囊。在一些態樣中，該劑型係素食劑型，其中該劑型不由來自動物來源之任何組分形成且不含有來自動物來源之任何組分。在一些態樣中，該素食劑型為素食膠囊。
在一些態樣中，本發明係關於包含如本文揭示之厭氧細胞及/或埃氏巨球型菌細胞、飼料添加劑、食物及/或組合物之套組或包裝。套組或包裝可包括飼料添加劑、食物組合物，或其組合之單元(例如，一或多個單元)。在一些態樣中，該套組包含藉由本文揭示之方法產生之凍乾細胞、如本文揭示之飼料添加劑或如本文揭示之膠囊。 對動物投與經電噴霧乾燥之厭氧細菌細胞及/或埃氏巨球型菌之方法
在一些態樣中，本發明係關於一種對動物投與經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞之方法。
在一些態樣中，本發明係關於一種對動物投與經電噴霧乾燥之厭氧細菌細胞之方法。在一些態樣中，本發明係關於一種對動物投與經電噴霧乾燥之雙叉桿菌細胞(諸如短型雙叉桿菌)、乳桿菌細胞(諸如胚芽乳桿菌)、雙叉桿菌細胞(諸如動物雙叉桿菌乳亞種)、片球菌細胞(諸如乳酸片球菌)、乳桿菌細胞(諸如乾酪乳桿菌細胞)、絲狀桿菌(諸如產琥珀酸絲狀桿菌細胞)、瘤胃球菌(諸如黃色瘤胃球菌)及丁酸弧菌(諸如溶纖維丁酸弧菌細胞)之方法。
在一些態樣中，該方法包括對動物投與如本文描述之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、飼料添加劑、食物或組合物(例如，膠囊)。
投與可藉由任何可相容之途徑，包括(例如)口服(即，可攝取之液體或固體、口服灌劑、飼料添加劑、食物、組合物或膠囊)，藉由噴塗至身體上(即，藉由噴霧)及/或注射。
在一些態樣中，該方法包括投與包含經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞之固體、液體或凝膠。
在一些態樣中，該方法包括投與包含經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞之固體飼料添加劑。在一些態樣中，該固體飼料添加劑係粉末(例如，可流動粉末)、顆粒體(即，顆粒)、顆粒(即，微粒)、集結粒、餅狀物、水溶性濃縮物、糊劑、大丸藥、錠劑、粉塵、其組分，或其組合。
在一些態樣中，該方法包括投與包含經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞之液體飼料添加劑。在一些態樣中，該方法包括投與呈液體的經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞。在一些態樣中，該液體係溶液(例如，水溶液、有機溶液或有機水溶液)、懸浮液、乳液、灌劑、噴霧、可注射劑、飲品(例如，乳替代品)、其組分，或其組合。在一些態樣中，該液體係口服或藉由對動物噴霧該液體投與。
在一些態樣中，該方法包括將經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞或包含該等細胞之飼料添加劑與另一動物飼料添加劑組合以形成補充劑或預混料用於添加至動物飼料。在一些態樣中，該另一飼料添加劑包含除埃氏巨球型菌外之細胞。
在一些態樣中，經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞可以液體(例如，以肉湯或肉湯等效物，例如，包括再水合之經電噴霧乾燥之細胞)，或以復原細胞糊劑的形式添加至飼料添加劑。亦可形成劑型(例如預定體積之灌劑或膠囊)，且視需要，該等經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞可直接添加至動物飼料，如藉由將液體肉湯及/或經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞噴灑至該飼料上或混合至該飼料內。
在一些態樣中，該方法包括再水合飼料添加劑(例如，粉末、顆粒、微粒、集結粒、餅狀物、經電噴霧乾燥之細胞，或其組合)以產生用於投與之液體。
在一些態樣中，該方法包括透過再水合飼料添加劑之遞送系統將經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞施加至動物飼料，包括以分批為基礎。例如，經電噴霧乾燥之粉末可自聚乙烯料斗進入沖洗系統，該沖洗系統稀釋該粉末並將其噴塗至待混合之飼料上。
在一些態樣中，該方法包括使用具有儲倉之容積計量裝置將經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞施加至動物飼料。例如，該等經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞(例如，包含該等細胞之粉末)可儲存於該儲倉中並僅在噴塗至動物飼料上之前排放至水或水浴內。
在一些態樣中，本發明係關於一種用於治療或預防與動物胃腸道中之乳酸產生相關聯之病症或疾患之方法，其包括對該動物投與有效量之如本文揭示之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌、藉由如本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、如本文揭示之飼料添加劑或如本文揭示之組合物(例如，膠囊)。
在一些態樣中，本發明係關於一種用於治療或預防與動物胃腸道中之乳酸產生相關聯之病症或疾患之方法，其包括對該動物投與有效量之如本文揭示之經電噴霧乾燥之厭氧細胞、藉由如本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之厭氧細胞、如本文揭示之飼料添加劑或如本文揭示之組合物(例如，膠囊)。
在一些態樣中，該病症或疾患係酸中毒。在一些態樣中，該病症或疾患係瘤胃酸中毒。在一些態樣中，該病症或疾患係呼吸道疾病。在一些態樣中，該病症或疾患係蹄葉炎。在一些態樣中，該病症或疾患係感染。在一些態樣中，該感染係感染沙氏桿菌或彎曲桿菌。在一些態樣中，該沙氏桿菌係腸道沙氏桿菌( Salmonella enterica)及/或邦戈爾沙氏桿菌( Salmonella bongori)。在一些態樣中，該沙氏桿菌血清型係鼠傷寒沙氏桿菌( Salmonella Typhimurium)及/或腸炎沙氏桿菌( Salmonella Enteritidis)。在一些態樣中，該彎曲桿菌係空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni)或大腸彎曲桿菌( Campylobacter coli)。在一些態樣中，該病症或疾患係後腸酸中毒。
在一些態樣中，該病症或疾患係其中丁酸鹽、戊酸鹽及/或丙酸鹽之比例增加之病症或疾患。
在一些態樣中，本發明係關於一種用於預防或減少伺機性微生物於動物胃腸道中生長之方法，其包括對該動物投與有效量之如本文揭示之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、藉由如本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、如本文揭示之飼料添加劑或如本文揭示之組合物。
在一些態樣中，本發明係關於一種用於預防或減少伺機性微生物於動物胃腸道中生長之方法，其包括對該動物投與有效量之如本文揭示之經電噴霧乾燥之厭氧細胞、藉由如本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之厭氧細胞、如本文揭示之飼料添加劑或如本文揭示之組合物。
在一些態樣中，伺機性微生物為致病的。在一些態樣中，該伺機性微生物為沙氏桿菌或彎曲桿菌。在一些態樣中，該沙氏桿菌為腸道沙氏桿菌及/或邦戈爾沙氏桿菌。在一些態樣中，該沙氏桿菌血清型為鼠傷寒沙氏桿菌及/或腸炎沙氏桿菌。在一些態樣中，彎曲桿菌為空腸彎曲桿菌或大腸彎曲桿菌。在一些態樣中，該伺機性微生物為大腸埃希氏桿菌。
在一些態樣中，本發明係關於一種改善動物飲食中植物來源磷之生體可用率之方法，其包括對該動物投與有效量之如本文揭示之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、藉由如本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、如本文揭示之飼料添加劑或如本文揭示之組合物。在一些態樣中，該等經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞包含植酸酶活性。在一些態樣中，該方法減少在缺乏埃氏巨球型菌細胞之情況下由投與動物飲食產生之環境含磷廢物。
在一些態樣中，本發明係關於一種改善動物飲食中植物來源磷之生體可用率之方法，其包括對該動物投與有效量之如本文揭示之經電噴霧乾燥之厭氧細胞、藉由如本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之厭氧細胞、如本文揭示之飼料添加劑或如本文揭示之組合物。在一些態樣中，該等經電噴霧乾燥之厭氧細胞包含植酸酶活性。在一些態樣中，該方法減少在缺乏厭氧細胞之情況下由投與動物飲食產生之環境含磷廢物。
在一些態樣中，本發明係關於一種改善動物中之生長表現之方法，其包括對該動物投與有效量之如本文揭示之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、藉由如本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、如本文揭示之飼料添加劑或如本文揭示之組合物。
在一些態樣中，本發明係關於一種改善動物中之生長表現之方法，其包括對該動物投與有效量之如本文揭示之經電噴霧乾燥之厭氧細胞、藉由如本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之厭氧細胞、如本文揭示之飼料添加劑或如本文揭示之組合物。
在一些態樣中，本發明係關於一種增加動物後腸之pH之方法，其包括對該動物投與有效量之如本文揭示之經電噴霧乾燥之厭氧細胞、藉由如本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之厭氧細胞、如本文揭示之飼料添加劑或如本文揭示之組合物。
在一些態樣中，動物中之經改善生長表現係以下之改善：飼料攝取量、平均日增重、飼料轉化率、屠體增重、產乳動物之產乳量、家禽之產蛋量、骨礦化，或其組合。
在一些態樣中，本發明係關於一種使動物之下消化道酸化之方法，其包括對該動物投與有效量之如本文揭示之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、藉由如本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、如本文揭示之飼料添加劑或如本文揭示之組合物。在一些態樣中，該下消化道係家禽之盲囊(ceca)。
在一些態樣中，本發明係關於一種使動物之下消化道酸化之方法，其包括對該動物投與有效量之如本文揭示之經電噴霧乾燥之厭氧細胞、藉由如本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之厭氧細胞、如本文揭示之飼料添加劑或如本文揭示之組合物。在一些態樣中，該下消化道係家禽之盲囊。
在一些態樣中，如本文揭示之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞、藉由如本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞、如本文揭示之飼料添加劑或如本文揭示之組合物係在用飼料飼餵動物之前、同時或之後投與。
在一些態樣中，該方法進一步包括在投與前將如本文揭示之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞、藉由如本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞或如本文揭示之飼料添加劑固體與液體混合。
在一些態樣中，液體係口服(例如，口服灌劑)或藉由對動物噴塗(例如，噴霧)該液體投與。
在一些態樣中，該方法包括單次投與如本文揭示之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞、藉由如本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞、如本文揭示之飼料添加劑或如本文揭示之組合物。
在一些態樣中，該方法包括投與如本文揭示之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞、藉由如本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞、如本文揭示之飼料添加劑或如本文揭示之組合物。在一些態樣中，該投與包括用如本文揭示之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞、藉由如本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞、如本文揭示之飼料添加劑或如本文揭示之組合物對動物(例如，鳥)進行除塵。在一些態樣中，如本文揭示之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞、藉由如本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞、如本文揭示之飼料添加劑或如本文揭示之組合物係由該鳥經由自我梳理(preening)攝取。
在一些態樣中，該方法包括每日投與如本文揭示之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞、藉由如本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞、如本文揭示之飼料添加劑或如本文揭示之組合物。在一些態樣中，該投與係每天至少一次、每天至少兩次、每天至少三次或每天多於三次。在一些態樣中，該投與係隨意的(例如，藉由飲用可獲得之液體或食用可獲得之食物自我投與，該液體或食物包含經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞、藉由如本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞、飼料添加劑或組合物)。
在一些態樣中，該方法包括於一天內多於一次投與如本文揭示之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞、藉由如本文揭示之方法產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌或厭氧細胞、如本文揭示之飼料添加劑或如本文揭示之組合物。在一些態樣中，該投與係於一天內二、三、四、五、六次或更多次投與。在一些態樣中，該方法包括於一天內多於一次投與，接著一或多天不投與。在一些態樣中，該一或多天不投與係一、二、三、四、五或六天、一週、兩週、三週或四週、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月或六個月不投與。
在一些態樣中，該動物係反芻動物。在一些態樣中，該反芻動物可為(但不限於)牛、水牛、綿羊、山羊、鹿、馴鹿、駝鹿、長頸鹿、犛牛及麋鹿。在一些態樣中，該反芻動物係選自由以下組成之群：牛、水牛、綿羊、山羊、鹿及馴鹿。
在一些態樣中，該動物為非反芻動物。在一些態樣中，該非反芻動物可為(但不限於)馬類、家禽、豬、狗及貓。在一些態樣中，該非反芻動物係選自由以下組成之群：馬類、家禽及豬。
在一些態樣中，該動物係動物園動物。
在一些態樣中，該動物係家禽。在一些態樣中，該家禽係鳥類(即，鳥)，其係用作食物動物，包括(但不限於)雞、鵝、鴨、鵪鶉、火雞、鴿子、鴯鶓或鴕鳥。在一些態樣中，該家禽係選自由以下組成之群：雞、鵝、鴨、鵪鶉、火雞或鴿子。在一些態樣中，該家禽係選自由以下組成之群：肉雞、肉種雞及蛋雞。在一些態樣中，該家禽係雞。
在一些態樣中，該動物係馬類。在一些態樣中，該馬類係馬、小馬、驢或騾。 實例
現參考下列實例，該等實例連同上文描述一起以非限制性方式闡述本發明之一些態樣。 實例1 經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌之實驗室規模生產
在實驗室中使用實驗室規模發酵罐製備埃氏巨球型菌NCIMB 41125培養物。製備兩個由兩種碳源組成之半限定培養基之10公升生物反應器以使埃氏巨球型菌NCIMB 41125生長。
使用埃氏巨球型菌NCIMB 41125之整夜培養物以1:100比率接種生物反應器並在39℃下在厭氧條件下使用氮墊培養該等生物反應器15小時。
將所得培養物冷卻至室溫(大約25℃)並以900 mL等分試樣(1X細胞培養物或發酵物)包裝於聚箔袋中及儲存在4℃下直至進一步處理。儲存之細胞培養物係用於原料編號1至6、8、10及11。
將由上文培養物製備之細胞放置於在厭氧條件下之離心瓶(每瓶900 mL，總計11瓶)內，並以5,200 rpm在20℃下離心10分鐘。在離心後，移除上清液以獲得細胞之100X濃縮物(每瓶9 mL，總計11瓶)。使經濃縮之細胞集結粒重懸浮於上清液中以獲得10X細胞濃縮物。
另一袋培養物(大約900 mL)係在相同條件下離心。使此經濃縮之細胞集結粒重懸浮於厭氧反滲透(RO)水中以獲得1X細胞濃度(9 mL細胞濃縮物+ 891 mL RO水)用於原料編號7。
將細胞濃縮物(10X)組合，充分攪動，並在無菌且厭氧條件下包裝於聚箔袋(每袋900 mL)中。該細胞濃縮物(1X)係遵循相同之方法進行包裝。兩個袋均儲存在4℃下直至進一步電噴霧乾燥處理。
在電噴霧乾燥細胞之前，在無菌且厭氧條件下將穩定劑溶液添加至細胞濃縮物以使細胞存活率最大化。穩定劑溶液係溶解於水中之載劑，其亦充當該等細胞之保護劑，且該等術語在整個過程中可互換使用。
使載劑於厭氧室中放置過夜以使含氧量最小化，然後包裝成配備三埠之無菌厭氧硼矽酸鹽玻璃瓶。
在配備三埠之硼矽酸鹽玻璃瓶中製備無菌厭氧反滲透水(「厭氧RO水」)。
藉由於硼矽酸鹽玻璃瓶中在厭氧條件下將RO水添加至碳水化合物粉末製備最終穩定劑溶液。不同之穩定劑溶液及組分係列舉於表2中。 表2：穩定劑溶液之組分
穩定劑類型 添加之碳水化合物 碳水化合物量，g RO水量，mL (qs至)
1X蔗糖 蔗糖 62.50 100
2X蔗糖 蔗糖 125.00 175
1X (蔗糖+澱粉) 蔗糖 62.50 250
澱粉 100.00
1X (麥芽糊精+麥芽糖) 麥芽糊精 46.90 75
麥芽糖 15.63
2X (麥芽糊精+麥芽糖) 麥芽糊精 93.75 100
麥芽糖 31.20
為製備用於電噴霧乾燥之不同原料(即，細胞懸浮液)，細胞濃縮物(1X或10X)及穩定劑溶液係以表3中指示之比率混合。所有添加均在氮墊下進行以維持無氧環境。 表3：用於電噴霧乾燥之原料之組分
原料編號 細胞濃縮物 細胞濃縮物，份數 穩定劑溶液，份數 總重量，g
1 1X 8.91 1.09 1134
2 1X 8.87 1.13 1087
3 1X 8.92 1.08 1097
4 1X 8.27 1.73 1298
5 1X* 8.84 1.16 1034
6 1X 7.54 2.46 1347
7 10X 8.80 1.20 1020
8 1X 9.86 0.14 1028
9 1X 9.09 0.91 1127
*用無菌厭氧反滲透水而非上清液使細胞濃縮物重懸浮至1X。
於液體培養物(細胞培養物、細胞濃縮物、細胞懸浮液/原料)中及於電噴霧乾燥後獲得之乾燥樣品中評估埃氏巨球型菌NCIMB 41125細胞之濃度。
液體樣品係於以下獲得：(1)於10 L生物反應器中培養15小時(細胞培養物)，(2)在使用離心收獲細胞後(10X細胞濃縮物)，及(3)在將穩定劑溶液添加至該細胞濃縮物後(最終原料)。所有處理均在無菌且厭氧條件下一式三份取樣，於無菌厭氧稀釋劑中稀釋，並一式兩份接種至半限定乳酸鹽瓊脂(SDL瓊脂)上。然後在39℃下將瓊脂盤培養48小時，然後計數集落形成單元(CFU)並計算各樣品的每毫升濃度。
將電噴霧乾燥後獲得之乾燥樣品稱重，並使0.32 g該乾燥樣品重懸浮於40 mL無菌厭氧稀釋劑中。使樣品在室溫下再水合2小時，然後進一步稀釋並接種至半限定乳酸鹽瓊脂上。如上文描述處理盤以測定乾燥樣品中之最終細胞濃度。
電噴霧乾燥後之細胞回收率係藉由將乾燥樣品中埃氏巨球型菌細胞之總量除以電噴霧乾燥前之樣品中埃氏巨球型菌細胞之初始總量計算。參見下式。
使用靜電噴霧乾燥器製備埃氏巨球型菌NCIMB 41125之乾燥粉末。藉由使用流動速率為150 Nm 3/h流動速率，固定入口溫度在50至100℃之範圍內之經加熱氮氣達成乾燥。
透過遞送至夾套燒杯之冷卻水流使原料(細胞懸浮液)維持在4℃，在該夾套燒杯中維持該原料並藉由頂置式攪拌器連續攪拌。透過容器之頂部空間不斷沖洗氮墊以維持無氧環境。
透過蠕動泵將原料(細胞懸浮液)遞送至於靜電噴霧乾燥器室頂部之兩個流體噴嘴，於其中將該原料霧化並使其帶電。該霧化係透過在350 kPa及35℃下之經加熱加壓氮氣達成。
透過由脈衝寬度調製器控制之電壓發生器將電荷遞送至在噴嘴前與懸浮液接觸之電極。在腔室中同時乾燥霧化原料並於垂直室之末端收集乾燥粉末。
於電噴霧-乾燥製程結束時，收集乾燥粉末，儲存於金屬化袋或防潮容器中，用氮沖洗並在4℃下長期儲存。該製程之結果係顯示於表4中。 表4：電噴霧乾燥之組分及電噴霧乾燥後之結果
編號 細胞濃度 穩定劑 細胞懸浮液基質 入口溫度(℃) 細胞培養物CFU/mL 粉末CFU/g 粉末CFU/g 粉末CFU/g 粉末Aw CFU回收率%
平均值 平均值 下限 上限   
1 1X 1X蔗糖 上清液 80 9E+08 2E+08 8E+07 3E+08 0.13 2.6%
2 1X 1X蔗糖 上清液 70 9E+08 9E+08 7E+08 1E+09 0.147 10.6%
3 1X 1X蔗糖 上清液 90 9E+08 2E+08 2E+08 3E+08 0.209 2.6%
4 1X 2X蔗糖 上清液 80 9E+08 2E+08 1E+08 4E+08 0.246 4.8%
5 1X 1X蔗糖於RO水中 厭氧RO水 80 4E+08 3E+08 2E+08 5E+08 0.151 6.1%
6 1X 1X蔗糖+ 1X HICAP澱粉 上清液 70 9E+08 6E+07 1E+07 2E+08 0.131 1.2%
7 10X 1X蔗糖 上清液 80 3E+09 6E+08 NA NA 0.22 2.0%
8 1X 1X麥芽糊精+麥芽糖(3:1) 上清液 70 9E+08 1E+08 4E+07 2E+08 0.217 1.2%
9 1X 2X麥芽糊精+麥芽糖(3:1) 上清液 70 9E+08 4E+07 6E+06 1E+08 0.22 0.8%
在使用相同載劑/穩定劑溶液(1X蔗糖)之電噴霧乾燥製程之所測試入口溫度中，70℃產生10.6%之最高CFU回收率。增加之80℃及90℃之入口溫度各將產率減小至2.6%。另外，較高溫度(即，80℃及90℃)下之電噴霧乾燥不顯著降低所得粉末中之含水量。
在所測試載劑/穩定劑溶液(蔗糖、麥芽糊精+麥芽糖、疏水性澱粉)中，蔗糖產生最高CFU，且2X蔗糖亦進一步改善80℃之CFU回收率%。以70℃之入口溫度用蔗糖及疏水性澱粉進行電噴霧乾燥降低CFU回收率%。
細胞濃度(1X或10X)似乎不影響CFU回收率%。然而，10X細胞樣品在濃縮10倍的同時在電噴霧乾燥之前的儲存過程中經歷CFU之降低，此導致低於預期之CFU濃度。 實例2 經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌NCIMB 41125之商業規模生產
使用由兩種碳源組成之半限定培養基之10公升生物反應器來製備接種體。用埃氏巨球型菌NCIMB 41125之整夜培養物以1:100比率接種該生物反應器並在39℃下培養該生物反應器14小時。將所得培養物冷卻至室溫並包裝於兩個5L聚箔袋中。
在無菌且厭氧條件下使用一種生產貯槽來製備2,100 L由兩種碳源組成之半限定培養基，以使埃氏巨球型菌NCIMB 41125生長。用上文製備之埃氏巨球型菌NCIMB 41125之5 L培養物中之一者接種該生產貯槽。在接種後，在39℃下將該生產貯槽培養14小時，接著冷卻至室溫。使用無菌厭氧技術獲得細胞培養物之4 L等分試樣以評估葡萄糖含量、OD、pH、污染物含量(需氧生長、酵母菌及黴菌)、埃氏巨球型菌濃度及比重。
使用切向流過濾(TFF)收獲生產貯槽之內容物(細胞培養物)。簡而言之，使細胞培養物循環通過TFF系統並廢棄上清液直至貯槽中僅殘餘21 L滯留物。同時，使用63 L RO水(在厭氧且無菌條件下製備)沖洗滯留物並重懸浮以達成25X之最終滯留物濃度。在無菌且厭氧條件將最終滯留物(84 L)包裝於5 L聚箔袋中，儲存在4℃下直至電噴霧乾燥。
為製備穩定劑溶液(載劑)，將蔗糖粉末於厭氧室中放置整夜以使含氧量最小化，然後包裝於配備三埠之無菌且厭氧硼矽酸鹽瓶中。於配備三埠之硼矽酸鹽瓶中製備無菌且厭氧RO水。藉由在如表5中指示之厭氧條件下經由該三埠將RO水添加至蔗糖粉末製備穩定劑溶液(蔗糖溶液)。 表5：穩定劑溶液之組分
穩定劑類型 添加之碳水化合物 碳水化合物量，g RO水量，mL (qs至)
1X蔗糖 蔗糖 125 200
藉由將在TFF後獲得之25X細胞濃縮物(滯留物)與穩定劑溶液混合製備經電噴霧乾燥之不同原料(細胞懸浮液)。所有步驟均在氮墊下進行以始終維持無氧環境。針對各樣品，原料中之最終蔗糖濃度及細胞濃度均係相同的(即，相較於初始培養物，分別為62.5 mg/mL及約22.5X)。
於液體培養物(細胞培養物、細胞濃縮物/滯留物、細胞懸浮液/原料)中及於電噴霧乾燥後獲得之乾燥樣品中評估埃氏巨球型菌NCIMB 41125細胞之濃度。
液體樣品係於以下收獲：(1)於生產貯槽中培養17小時後(細胞培養物)，(2)在使用TFF系統收獲該等細胞後(25X細胞濃縮物/滯留物)，及(3)在將穩定劑溶液(蔗糖溶液)添加至該細胞濃縮物後(最終原料，22.5X)。所有處理均在無菌且厭氧條件下一式三份取樣，稀釋於無菌厭氧稀釋劑中，並一式兩份接種至半限定乳酸鹽瓊脂(SDL瓊脂)上。然後在39℃下將瓊脂盤培養48小時，然後計數集落形成單元(CFU)並計算樣品之每毫升濃度。
將電噴霧乾燥後獲得之乾燥樣品稱重，並使0.3 g該乾燥樣品重懸浮於60 mL無菌厭氧稀釋劑或經10 g/L酵母菌及5 g/L大豆蛋白腖補充之無菌厭氧稀釋劑中。使樣品在室溫下再水合2小時，然後進一步稀釋於厭氧稀釋劑(補充或未補充)中並整夜接種至SDL瓊脂或具有1 mL補充之厭氧稀釋劑之富集SDL瓊脂內。如上文處理盤以測定乾燥樣品中之最終細胞濃度。
電噴霧乾燥後之細胞回收率係藉由將乾燥樣品中埃氏巨球型菌之總量除以最終原料樣品中埃氏巨球型菌之初始總量(電噴霧乾燥前)計算。
使用靜電噴霧乾燥器製備埃氏巨球型菌NCIMB 41125之乾燥粉末。透過流動速率為150 Nm 3/h流動速率，固定入口溫度在50與100℃之範圍內之經加熱氮氣達成乾燥。
透過遞送至夾套燒杯之冷卻水流使原料(細胞懸浮液)保持在4℃，在該夾套燒杯中維持該原料並藉由頂置式攪拌器連續攪拌。通過容器之頂部空間不斷沖洗氮墊以維持無氧環境。
透過蠕動泵將原料(細胞懸浮液)遞送至於靜電噴霧乾燥器室頂部之兩個流體噴嘴，於其中將該原料霧化並使其帶電，該霧化係透過在350 kPa及35℃下之經加熱加壓氮氣達成。
透過由脈衝寬度調製器控制之電壓發生器將電荷遞送至在噴嘴前與懸浮液接觸之電極。在腔室中同時乾燥霧化原料並於垂直室之末端收集乾燥粉末。
於電噴霧-乾燥製程結束時，收集乾燥粉末，儲存於金屬化袋或防潮容器中，用氮沖洗並在4℃下長期儲存。該製程之結果係顯示於表6中。 表6：電噴霧乾燥之組分及電噴霧乾燥後之結果
編號 最終原料細胞濃度 穩定劑 入口溫度(℃) 24X濃縮物發酵物 CFU/mL 粉末CFU/g 粉末CFU/g 粉末CFU/g 粉末Aw CFU回收率%
平均值 平均值 下限 上限   
1 21.6X 1X蔗糖 70 6.5E+10 8.1E10 6.0E10 1.1E11 0.202 13%
2 21.6X 1X蔗糖 65 6.5E+10 4.5E10 2.1E10 6.6E10 0.201 9%
3* 21.6X 1X蔗糖 62.5 6.5E+10 2.3E10 5.5E9 3.7E10 0.05 4%
結果證實在70℃下用1X蔗糖溶液電噴霧21.6X之濃縮原料產生與實例1中可比較之CFU回收率%。該等結果指示在不影響CFU回收率%之情況下可電噴霧更濃縮埃氏巨球型菌原料。然而，使溫度分別降低至65℃及62.5℃不改善回收率。 實例3 相較於電噴霧乾燥，習知噴霧乾燥將導致存活的埃氏巨球型菌細胞之回收率降低
如實例2中描述 ，培養及處理埃氏巨球型菌用於習知噴霧乾燥。
習知噴霧乾燥器將用於使用蔗糖、麥芽糖、麥芽糊精、糖醇或澱粉混合物作為穩定劑以下列噴霧條件(表7)產生乾燥埃氏巨球型菌粉末。 表7：電噴霧乾燥製程之特性
細胞濃度 基質/穩定劑濃度(最終濃度) 噴霧入口溫度(℃) 噴霧出口溫度(℃) 乾燥氣體
1X 2至20%蔗糖 110至150  70至110 空氣或氮(厭氧)
2至20%麥芽糖+麥芽糊精
2至20%糖醇
預期習知噴霧乾燥製程將產生足夠乾燥之粉末(Aw ≤ 0.3)，及入口溫度大於120℃，同時用氮厭氧噴霧乾燥。預期CFU回收率% ＜ 1%。進行相同製程，但使用空氣作為乾燥氣體預期產生＜ 0.1% CFU回收率%。相比之下，預期電噴霧乾燥產生高10至100倍之CFU回收率%。 實例4 相較於凍乾，電噴霧乾燥導致存活的埃氏巨球型菌及乾燥粉末產量增加
如WO 2018/144653 A1 (該案係以引用之方式併入本文中)之實例13中描述，在無菌且厭氧條件下在500公升貯槽中，使埃氏巨球型菌NCIMB 41125細胞於由兩種碳源組成之半限定培養基中生長。
在細胞生長階段結束時，使用切向流過濾系統(TFF)濃縮細胞培養物以移除90%之液體(滲透物)並收集10X滯留物。
然後將滯留物與8%海藻糖/15%脫脂乳(T/SM)或8%麥芽糊精/15%脫脂乳(M/SM)混合。對與適當之冷凍保護劑混合之滯留物取樣以測定凍乾前的埃氏巨球型菌濃度(即，存活率計數)。使混合物分散至小瓶(4 mL/小瓶)內並在-80℃下或於液氮中冷凍，且使用快速循環凍乾。
凍乾製程完成後，藉由用厭氧稀釋劑使凍乾產物重懸浮於厭氧室中，容許其在室溫下再水合40分鐘，及然後接種至SDL20瓊脂上測定細菌之存活率。
使用擴散接種技術在需氧或厭氧條件下在4℃或25℃下儲存0、2、4、8、12、16、20及24週期間測試滯留物樣品之細胞存活率。簡而言之，對儲存產品取樣，連續稀釋，並接種至SDL瓊脂盤上。在不同之3天重複實驗，所有處理均一式三份進行。
細胞回收率係藉由將凍乾後回收之埃氏巨球型菌細胞之濃度除以與或不與冷凍保護劑混合之對應滯留物中量測之埃氏巨球型菌細胞之初始濃度計算。
結果證實不含冷凍保護劑(對照)之凍乾後埃氏巨球型菌細胞之回收率係接近於零(表8)。於液氮中快速冷凍之樣品具有比其等在-80℃下冷凍之對應物更高之回收率，與所使用之冷凍保護劑無關。於液氮中以M/SM及T/SM冷凍觀察到最佳回收率，分別為5.82%及3.96%。彼等回收率仍低於自實例1及2中以70℃之入口溫度運行之電噴霧乾燥觀察到的回收率。 表8：使用各種冷凍保護劑及冷凍溫度之凍乾後之埃氏巨球型菌的回收率
冷凍保護劑 冷凍 回收率 %
對照 -80℃ 0.00%
液氮 0.00%
M/SM -80℃ 1.18%
液氮 5.82%
T/SM -80℃ 0.30%
液氮 3.96%
另外，電噴霧乾燥容許比凍乾產生更多含有埃氏巨球型菌細胞之乾燥粉末。
假定入口原料流具有10%固體，乾燥能力/蒸發速率為4至32 kg/h之電噴霧乾燥可產生於16至384 kg範圍內之乾燥粉末(圖1)。相反，冷凍乾燥器以分批模式運行，及乾燥能力/蒸發速率為4至32 kg/h之冷凍乾燥器每週5天產生4至8 kg乾燥粉末。此呈現乾燥粉末生產率之4至40X差異，證實使用電噴霧乾燥之另一益處。 實例5 使用電壓梯度或振盪電壓模式之電噴霧乾燥將導致存活的埃氏巨球型菌細胞之回收率增加及架儲期增加
如實例2中描述，培養及處理埃氏巨球型菌細胞用於電噴霧乾燥，只是用於使顆粒帶電之電壓將如下：(1)電壓梯度自1 (電噴霧乾燥開始)漸增至15 kV (電噴霧乾燥結束)或(2)在電噴霧乾燥期間於0 min內振盪電壓介於1與15 kV之間。分別參見表9及10。預期該電壓梯度及/或振盪電壓將增加存活的細胞之回收率及埃氏巨球型菌細胞乾燥粉末之架儲期。 表9：用於電噴霧乾燥之梯度電壓
kV (時間零) kV (ESD結束)
1 15
2 14
3 13
4 12
5 11
6 10
表10：用於電噴霧乾燥之振盪電壓
下界(kV) 上界(kV) 頻率(Hz)
1 15 1至500
2 14
3 13
4 12
5 11
6 10
7 9
實例6 在電噴霧乾燥前藉由改變培養物之溫度、pH或滲透壓對細胞加壓力將導致存活的埃氏巨球型菌細胞之回收率增加及架儲期增加
如實例2中描述，培養及處理埃氏巨球型菌細胞用於電噴霧乾燥，只是在培養過程中，於對數生長中期或之後，歷時數分鐘至數小時將溫度增加至50至60℃，然後冷卻至環境溫度。預期培養期間溫度之暫時增加將導致於該等細胞內產生壓力蛋白，其將增加存活細胞之回收率及埃氏巨球型菌細胞乾燥粉末之架儲期。
如實例2中描述，培養及處理埃氏巨球型菌細胞用於電噴霧乾燥，只是在培養過程中，於對數生長中期或之後，歷時數分鐘至數小時將pH增加至＞7.5或減小至＜4，然後恢復至原始pH設定點。預期培養期間pH之暫時增加或減小將導致於該等細胞內產生壓力蛋白，其將增加存活細胞之回收率及埃氏巨球型菌細胞乾燥粉末之架儲期。
如實例2中描述，培養及處理埃氏巨球型菌細胞用於電噴霧乾燥，只是在培養過程中，於對數生長中期或之後，歷時數分鐘至數小時藉由添加鹽誘導滲透壓力增加滲透壓，然後移除另外鹽使該滲透壓恢復至原始設定點。預期培養期間滲透壓之暫時增加將導致於該等細胞內產生壓力蛋白，其將增加存活細胞之回收率及埃氏巨球型菌細胞乾燥粉末之架儲期。 實例7 可藉由電噴霧乾燥保藏多種埃氏巨球型菌菌株
為確定各種電噴霧乾燥方案對不同埃氏巨球型菌菌株之影響，將進行下列實驗。
下列埃氏巨球型菌菌株將用於此實驗中：(1)埃氏巨球型菌NCIMB 41125、(2)埃氏巨球型菌ATCC 25940、(3)埃氏巨球型菌NCIMB 702261、(4)埃氏巨球型菌NCIMB 702262及(5)埃氏巨球型菌NCIMB 702410。
除非下文另有指示，否則此實驗中將使用之方法係與實例1及2中描述之方法相同。相較於NCIMB 41125 (實例1及2)，預期電噴霧乾燥埃氏巨球型菌菌株將關於噴霧乾燥後之乾燥產物中回收之存活微生物的量產生相似之結果。另外，電噴霧乾燥製程將對微生物存活率或對乾燥後之微生物之生長能力無影響。
預期與埃氏巨球型菌NCIMB 41125相似，在相同載劑(蔗糖)之所測試入口溫度(即70℃、80℃及90℃)中，70℃產生所有其他埃氏巨球型菌菌株最高之細胞回收率。80℃及90℃之經增加入口溫度將降低細胞產率且將不顯著降低所得粉末中之含水量。亦預期將溫度進一步降低至65℃及62.5℃將不改善細胞回收率。
預期與埃氏巨球型菌NCIMB 41125相似，在所測試載劑(即，蔗糖、麥芽糊精+麥芽糖及疏水性澱粉)中，蔗糖將產生最高之細胞回收率，及蔗糖濃度之增加(在電噴霧乾燥前，50至150 g/L)亦將進一步改善回收率百分比。
預期與埃氏巨球型菌NCIMB 41125相似，原料細胞濃度(1X或10X)將不影響電噴霧乾燥後之細胞回收率。同樣，預期22.5X及1X之原料細胞濃度將產生可比較之細胞回收率，指示在不影響細胞回收效率之情況下產生更濃縮產物之能力。 實例8 可藉由電噴霧乾燥保藏厭氧細菌細胞
為確定各種電噴霧乾燥方案對不同類型之厭氧細菌之影響，將進行下列實例。
可將厭氧細菌分為三種類別：(1) 專性厭氧菌；(2)耐氣性厭氧菌；及(3)兼性厭氧菌。專性厭氧菌係在正常大氣氧濃度下無法存活之細菌。一些專性厭氧菌可於高達8%氧中存活，而其他則無法存活，除非氧濃度係小於0.5%。耐氣性厭氧菌可在氧之存在下存活，但無法利用氧來生長。兼性厭氧菌可使用氧進行有氧呼吸，但若不存在氧，則亦可使用厭氧呼吸。
巨球型菌(諸如埃氏巨球型菌)、絲狀桿菌(諸如產琥珀酸絲狀桿菌)、丁酸弧菌(諸如溶纖維丁酸弧菌)及雙叉桿菌(諸如短型雙叉桿菌)係專性厭氧菌之代表性物種。乳桿菌(諸如胚芽乳桿菌)及雙叉桿菌(諸如動物雙叉桿菌乳亞種)係耐氣性厭氧菌之代表性物種。片球菌(諸如乳酸片球菌)及乳桿菌(諸如乾酪乳桿菌)係兼性厭氧菌之代表性物種。
此實驗中將使用之方法係與實例1及2中描述之方法相同，只是使用適當之培養基及生長條件以容許最佳微生物細胞生長。預期電噴霧乾燥厭氧細菌(即，產琥珀酸絲狀桿菌( Fibrobacter succinogenes)、溶纖維丁酸弧菌( Butyrivibrio fibrisolvens)、短型雙叉桿菌( Bifidobacterium breve)、胚芽乳桿菌( Lactobacillus plantarum)、動物雙叉桿菌乳亞種( Bifidobacterium animalis subsp. lactis)、乳酸片球菌( Pediococcus acidilactici)、黃色瘤胃球菌( Ruminococcus flavefaciens)及乾酪乳桿菌( Lactobacillus casei))將關於電噴霧乾燥後之乾燥產物中回收之存活細胞之量產生與用埃氏巨球型菌所見相似之結果。另外，電噴霧乾燥製程將對微生物存活率或對微生物乾燥後之生長能力無影響。
預期與所有埃氏巨球型菌菌株相似，在相同載劑(蔗糖)之所測試入口溫度(即70℃、80℃及90℃)中，70℃將產生所有其他厭氧細菌最高之細胞回收率。80℃及90℃之經增加入口溫度將降低細胞產率且將不顯著降低所得粉末中之含水量。亦預期將溫度進一步降低至65℃及62.5℃將不改善細胞回收率。
預期與所有埃氏巨球型菌菌株相似，在所測試載劑(即，蔗糖、麥芽糊精+麥芽糖及疏水性澱粉)中，蔗糖將產生最高之細胞回收率，且蔗糖濃度之增加亦將進一步改善回收率百分比。
預期與所有埃氏巨球型菌菌株相似，原料細胞濃度(1X或10X)將不影響電噴霧乾燥後之細胞回收率。同樣，預期22.5X及1X之原料細胞濃度將產生可比較之細胞回收率，指示在不影響細胞回收效率之情況下產生更濃縮產物之能力。 實例9 在電噴霧乾燥期間之電壓梯度影響埃氏巨球型菌細胞回收率
在噴霧乾燥期間施加電壓係靜電噴霧乾燥在高溫下達成有效噴霧乾燥之基礎。通常，藉由使電壓保持在恆定水準下進行ESD。此實例證實以脈衝電壓進行ESD之可行性，同時達成有效乾燥及CFU回收率。
程序：如WO 2018/144653 A1之實例13中描述，在無菌且厭氧條件下在500公升貯槽中，使埃氏巨球型菌NCIMB 41125細胞於由兩種碳源組成之半限定培養基中生長。
在細胞生長階段結束時，使用切向流過濾系統(TFF)濃縮細胞培養物以移除99%之液體(滲透物)並收集100X滯留物。將穩定劑(蔗糖)及YEP溶液(經10 g/L酵母菌及5 g/L大豆蛋白腖補充之無菌厭氧稀釋劑)添加至該100X滯留物內以達成20X之最終細胞濃度及如表11中列舉之最終添加劑濃度。 表11：穩定劑溶液之最終濃度
原料 最終細胞濃縮物，倍 最終蔗糖濃度，g/L 氮源，g/L
1 20X 125 10 g/L酵母菌提取物+ 5 g/L蛋白腖
原料係於ESD單元(PolarDry 001)中用下列參數進行四輪電噴霧乾燥。 表12：電噴霧乾燥製程之特性
   第1輪 第2輪* 第3輪* 第4輪*
入口溫度(℃) 80 80 80 80
流動速率(g/min) 4 4 4 4
霧化溫度(℃) 35 35 35 35
霧化氣體壓力(kPa) 325 325 325 325
電壓(kV) 恆定15 kV 高：25 kV歷時3 s 低：3 kV歷時1 s 高：20 kV歷時3 s 低：1 kV歷時6 s 高：20 kV歷時3 s 低：5 kV歷時5 s
持續時間(min) 120至240 120至240 120至240 120至240
*在整個ESD運行中，電壓自高至低設定脈動。
在運行結束時收集經電噴霧乾燥之粉末，並測定水活性、含水量、存活率(CFU/g)及完整細胞/g。
CFU分析：將ESD後獲得之乾燥樣品稱重，並使0.3 g重懸浮於60 mL無菌厭氧稀釋劑或經10 g/L酵母菌及5 g/L大豆蛋白腖補充之無菌厭氧稀釋劑中。使樣品在室溫下再水合2小時，然後進一步稀釋於厭氧稀釋劑(補充或未補充)並整夜放置於SDL瓊脂或具有1 mL補充之厭氧稀釋劑之富集SDL瓊脂內。如上文處理盤以測定乾燥樣品中之最終細胞濃度。
ESD後之細胞回收率係藉由將乾燥樣品中埃氏巨球型菌之總量除以最終原料樣品(ESD前)中埃氏巨球型菌之初始總量計算。
完整細胞分析：使用BactoBox® (SBT儀器) (一種便攜式流式細胞儀)量測完整細胞(具有完整脂質膜之細胞)。
將來自CFU分析之再水合樣品連續稀釋於PBS緩衝液(1:9比率)中以滿足Bactobox之總顆粒/mL的目標濃度(10,000至5,000,000總顆粒/mL)。然後用該單元分析樣品並根據稀釋倍數及樣品重量調整結果。
ESD後之完整細胞回收率係藉由將乾燥樣品中完整埃氏巨球型菌細胞之總量除以最終原料樣品(ESD前)中完整埃氏巨球型菌細胞之初始總量計算。
表13提供來自ESD方案之結果。 表13：來自ESD方案之結果
參數 第1輪 第2輪 第3輪 第4輪
水活性 0.126 0.083 0.051 0.076
含水量，% 4.31 2.48 2.79 3.80
存活率，CFU/g 3.5x10 10 2.5x10 10 2.0x10 10 6.7x10 9
CFU回收率，% 20 14 11 4
Bactobox，完整細胞/g 1.2 x10 11 1.3 x10 11 1.5 x10 11 1.3 x10 11
完整細胞回收率，% 39 43 48 43
此實例成功證實電壓脈動對以較低含水量及水活性達成ESD之影響。含水量較低之微生物粉末一般係與較長之架儲期相關，因為越乾燥之材料越趨於穩定。儘管完整細胞回收率隨電壓脈動改善，但CFU回收率一般較低。 實例10 使用複合氮源作為穩定劑之電噴霧乾燥
此實例證實利用豐富之複合營養物質作為穩定劑來改善CFU回收率及存活率之影響。
程序：在無菌且厭氧條件下於500公升貯槽中在39℃下使埃氏巨球型菌NCIMB 41125細胞於由兩種碳源組成之半限定培養基中生長。
在細胞生長階段結束時，使用切向流過濾系統(TFF)濃縮細胞培養物以移除99%之液體(滲透物)並收集100X滯留物。將穩定劑及反滲透(RO)水(有或無複合氮源)添加至該100X滯留物內以達成20X之最終細胞濃度及如表14中列舉之最終添加劑濃度。 表14：原料中之最終添加劑濃度
原料 最終細胞濃縮物(倍) 最終蔗糖濃度(g/L) 氮源(g/L)
1 20 125 無
2 20 125 10 g/L酵母菌提取物+ 5 g/L蛋白腖
於ESD單元(PolarDry 001)中用下列參數電噴霧乾燥原料。 表15：ESD參數
參數 設定
入口溫度(℃) 80
流動速率(g/min) 4
霧化溫度(℃) 35
霧化氣體壓力(kPa) 325
電壓(kV) 15
持續時間(min) 120至240
在每次運行結束時收集經電噴霧乾燥之粉末及如實例9中描述測定水活性、含水量、存活率(CFU/g)及完整細胞/g。
表16提供來自由ESD方案量測之參數的結果。 表16：來自ESD方案之結果
   原料1 (無複合氮源) 原料2 (具有複合氮源)
水活性 0.10 0.08
含水量，% 3.1 3.0
存活率(CFU/g) 3.7 x10 10 4.2x10 10
CFU回收率% 12% 6%
Bactobox (完整細胞/g) 9.5 x10 10 1.2 x10 11
完整細胞回收率% 31% 40%
此等結果證實在ESD期間使用複合氮源作為穩定劑達成較高CFU及完整細胞回收率之可行性及優勢。 實例11 加速及短期架儲期研究
此實例證實來自ESD及凍乾(FD)製程兩者之乾燥埃氏巨球型菌41125之相對穩定性。
程序：將來自實例1之ESD粉末包裝並儲存於金屬化袋中，及頂部空間用氮氣沖洗。將該等袋熱封並儲存在-20℃、4℃或37℃下。將使用蔗糖(50 g/L)作為溶解於RO水中之穩定劑之濃縮細胞(20X；來自實例1中之相同發酵批次)凍乾。將所得凍乾粉末包裝成ESD粉末並儲存在37℃或4℃下。
遵循實例11中描述之CFU分析程序，週期性分析細胞之存活率以估計不同溫度下之穩定性概況。37℃之儲存溫度係用於模擬儲存之長期效應並在不誘導新變化之情況下加速產品之變質(加速架儲期)。
結果：圖2證實ESD及凍乾均產生在加速高溫曝露下具有可比較穩定性概況之材料。凍乾粉末由於較低之固體賦形劑負載(125 g/L蔗糖相比於50 g/L蔗糖)而具有較高之初始CFU/g。ESD及FD粉末兩者之存活率之降低係以相似速率。儘管兩種乾燥技術之間的穩定性相對接近，但由於連續生產模式相對於分批模式(冷凍乾燥器)，ESD提供更高之生產潛力。
圖3證實ESD及FD粉末均顯示4℃下存活率之可比較降低。另外，儲存在-20℃下之ESD粉末與其儲存在4℃下之對應物並無不同。當相較於其儲存在-20℃或4℃下之對應物時，該ESD粉末在30℃下之儲存顯示存活率之降低，尤其在30天後。 實例12 先導規模生產之凍乾埃氏巨球型菌之架儲期延長
此實例證實凍乾埃氏巨球型菌41125於延長之儲存期內之相對穩定性。
程序：如WO 2018/144653 A1 (該案係以全文引用之方式併入本文中)之實例15中描述，在無菌且厭氧條件下，使埃氏巨球型菌NCIMB 41125細胞於由兩種碳源組成之半限定培養基中生長，並凍乾。
凍乾一經完成，即收集凍乾粉末並與作為填充劑(0.16 g凍乾粉末+ 2.34 g麥芽糊精)之麥芽糊精混合。然後將所得基質包裝於明膠膠囊中並放置於密拉(Mylar)袋內同時維持厭氧條件。
隨機選擇來自生產運行之開始、中期及結束時之二十七個膠囊(總計81個膠囊)。針對總計405個膠囊，將實驗重複5次(5個生產批次)。該膠囊中之埃氏巨球型菌濃度係藉由以下測定：使凍乾產物重懸浮於具有40 mL厭氧稀釋劑之厭氧室中，容許其在室溫下再水合40分鐘，及然後接種至半限定乳酸鹽瓊脂上(即，存活率計數)。埃氏巨球型菌濃度係以CFU/mL表示並進行對數轉換。
將含有埃氏巨球型菌膠囊之金屬化袋儲存在4℃下。樣品在儲存0、0.5、1、3、6、9、12、18及24個月後獲得並以與先前描述相同之方式處理(每個時間點每次處理3個樣品；總計405個樣品)以確定埃氏巨球型菌架儲期。
圖4證實埃氏巨球型菌濃度係經時穩定的，及第零天取樣與24個月取樣之間的差異為0.02 log。 實例13 在ESD期間使用不同入口溫度產生之埃氏巨球型菌之架儲期延長
此實例證實與處理期間所使用之入口溫度無關，ESD粉末中之埃氏巨球型菌NCIMB 41125於延長之儲存期內之相對穩定性。
程序：以商業規模製備埃氏巨球型菌NCIMB 41125原料(細胞懸浮液)，如實例2中強調，藉由將在TFF後獲得之25X細胞濃縮物(滯留物)與2X蔗糖溶液(穩定劑)混合以獲得125 mg/mL之最終蔗糖濃度及相較於初始培養物約22.5X之細胞濃度。然後如實例2中描述使用靜電噴霧乾燥器噴霧乾燥所得細胞懸浮液。乾燥係透過流動速率為150 Nm 3/h流動速率及入口溫度為70℃、75℃或80℃之經加熱氮達成。
週期性分析細胞之存活率以估計在不同入口溫度下處理之ESD粉末之穩定性概況。用於CFU分析之程序係如實例9中描述進行，只是以30或40 mL經10 g/L酵母菌及5 g/L大豆蛋白腖補充之無菌厭氧稀釋劑代替60 mL使來自每次處理之0.3 g等分試樣再水合。針對ESD粉末之量調整最終細胞濃度並對數轉換。在第0、1、2、3及6個月測試ESD粉末樣品。在整個架儲期測試過程中，所有樣品均儲存在-20℃下。
結果：圖5證實與ESD處理期間所使用之入口溫度無關，當在-20℃下儲存長達6個月時，所有處理均產生穩定產品，從而證實加速架儲期結果。
埃氏巨球型菌濃度係經時穩定的，及針對80℃、75℃及70℃入口溫度，第零天取樣與6個月取樣之間的差異分別為0.08、0.27及0.45。此等結果與實例3中針對FD埃氏巨球型菌產品觀察到之結果並無不同。 實例14 使用囊封聚合物之ESD
此實例證實以一個步驟進行噴霧乾燥及囊封絕對厭氧菌同時達成相對高CFU及完整細胞回收率之可行性。
程序：在無菌且厭氧條件下於500公升貯槽中在39℃下使埃氏巨球型菌NCIMB 41125細胞於由兩種碳源組成之半限定培養基中生長。
在細胞生長階段結束時，使用切向流過濾系統(TFF)濃縮細胞培養物以移除99%之液體(滲透物)並收集100X滯留物。將穩定劑及囊封聚合物(海藻酸鹽或阿拉伯膠)及RO水添加至該100X滯留物內以達成20X之最終細胞濃度及如表17中列舉之最終添加劑濃度。 表17：原料中之最終添加劑濃度
原料 最終細胞濃縮物，倍 最終蔗糖濃度，g/L 最終囊封聚合物濃度，%
1 20X 125 1.0%低黏度海藻酸鹽
2 20X 125 2.0%阿拉伯膠
於ESD單元(PolarDry 001)中用表18中之參數電噴霧乾燥原料。 表18：ESD參數
參數 設定
入口溫度，℃ 80
流動速率，g/min 4
霧化溫度,℃ 35
霧化氣體壓力，kPa 325
電壓，kV 15
持續時間，min 120至240
在運行結束時收集經電噴霧乾燥之粉末，並測定水活性、含水量、存活率(CFU/g)及完整細胞/g。
在實例9中描述之CFU分析及完整細胞分析程序後，週期性分析細胞之存活率以估計不同溫度下之穩定性概況。
表19提供來自由ESD方案量測之參數之結果。 表19：來自ESD方案之結果
參數 原料1 (具有低黏度海藻酸鹽) 原料2 (具有阿拉伯膠)
水活性 0.089 0.093
含水量，% 3.73 3.18
存活率，CFU/g 1.1x10 10 2.2 x10 10
CFU回收率，% 6 12
Bactobox，完整細胞/g 9.5 x10 10 9.5 x10 10
完整細胞回收率，% 54 54
此等結果證實在ESD期間以一個步驟用囊封聚合物將微生物囊封於可溶性賦形劑內，並維持高CFU及完整細胞回收率之可行性。 實例15 使用糖及糖醇之混合物之ESD
糖醇(諸如山梨醇、木糖醇、甘露醇)係已知作為滲透物保護劑分子。然而，目前仍不清楚，其作為用於乾燥營養細胞之保護劑分子之有效性。此結果證實其可行性。
程序：在無菌且厭氧條件下於500公升貯槽中在39℃下使埃氏巨球型菌NCIMB 41125細胞於由兩種碳源組成之半限定培養基中生長。
在細胞生長階段結束時，使用切向流過濾系統(TFF)濃縮細胞培養物以移除99%之液體(滲透物)並收集100X滯留物。將穩定劑(蔗糖+山梨醇)及YEP溶液(經10 g/L酵母菌及5 g/L大豆蛋白腖補充之無菌厭氧稀釋劑)添加至該100X滯留物內以達成20X之最終細胞濃度及如表20中列舉之最終添加劑濃度。 表20：原料中之最終添加劑濃度
原料 最終細胞濃縮物，倍 最終蔗糖濃度，g/L 最終山梨醇濃度，g/L 氮源，g/L
1 20X 93.75 31.25 10 g/L酵母菌提取物+ 5 g/L蛋白腖
於ESD單元(PolarDry 001)中用下列參數電噴霧乾燥原料。 表21：ESD參數
參數 設定
入口溫度，℃ 80
流動速率，g/min 4
霧化溫度，℃ 35
霧化氣體壓力，kPa 325
電壓，kV 15
持續時間，min 120至240
在運行結束時收集經電噴霧乾燥之粉末，並測定水活性、含水量、存活率(CFU/g)及完整細胞/g。CFU分析及完整細胞分析係如實例9中描述進行。
表22提供來自由ESD方案量測之參數之結果。 表22：來自ESD方案之結果
參數 結果
水活性 0.035
含水量，% 1.67
存活率，CFU/g 3.4x10 10
CFU回收率% 19
Bactobox，完整細胞/g 1.5 x10 11
完整細胞回收率，% 86
此實例成功證實調配物可產生高CFU回收率及完整細胞回收率。 實例16 使用革蘭氏陽性絕對厭氧菌(黃色瘤胃球菌)之ESD
此實例證實ESD製程對來自由細胞壁特性分類之不同類別之另一絕對厭氧菌的適用性。黃色瘤胃球菌亦係絕對厭氧菌(諸如埃氏巨球型菌)，然而，其為革蘭氏陽性。噴霧乾燥製程之效用係與其細胞壁結構及完整性密切相關。因此，於革蘭氏陽性及革蘭氏陰性微生物中證實有效之ESD製程係其應用範圍之關鍵指標。
程序：在無菌且厭氧條件下在具有三埠附件之1 L派熱克斯(pyrex)瓶中，使黃色瘤胃球菌ATCC 49949細胞於由兩種碳源組成之半限定培養基中生長。在37℃下於厭氧室中將經接種之培養基培養12小時。
在細胞生長階段結束時，將穩定劑(蔗糖)添加至發酵物內以達成表23中列舉之最終添加劑濃度。 表23：原料中之最終添加劑濃度
原料 最終細胞濃縮物，倍 最終蔗糖濃度，g/L 氮源，g/L
1 1 (無濃度) 125 10 g/L酵母菌提取物+ 5 g/L蛋白腖
於ESD單元(PolarDry 001)中用下列參數電噴霧乾燥原料。 表24：ESD參數
參數 設定
入口溫度，℃ 80
流動速率，g/min 4
霧化溫度，℃ 35
霧化氣體壓力，kPa 325
電壓，kV 15 (恆定)
持續時間，min 120至240
在運行結束時收集經電噴霧乾燥之粉末，並測定水活性、含水量、存活率(CFU/g)及完整細胞/g。CFU分析及完整細胞分析係根據實例9中描述之程序進行。
表25提供來自由ESD方案量測之參數之結果。 表25：來自ESD方案之結果
參數 結果
水活性 0.1
含水量，% 3.5
存活率，CFU/g 9.0x10 8
CFU回收率，% 143
Bactobox，完整細胞/g 1.2 x10 9
完整細胞回收率，% 141
此等結果指示來自於黃色瘤胃球菌ATCC 49949細胞上進行之ESD製程之幾乎完全100%之CFU回收率及完整細胞回收率。相較於埃氏巨球型菌NCIMB 41125，黃色瘤胃球菌呈現更高之回收率。鑑於來自兩種絕對厭氧菌(埃氏巨球型菌，革蘭氏陰性微生物；黃色瘤胃球菌，革蘭氏陽性微生物)之整體結果，顯示所述ESD製程有效穩定並回收具有不同特性之高含量之活厭氧細胞。
圖1顯示自電噴霧乾燥細菌之潛在每週乾燥粉末產量。
圖2顯示儲存在37℃下之埃氏巨球型菌ESD及凍乾(FD)粉末之加速架儲期。
圖3顯示儲存在-20℃、4℃及30℃下之埃氏巨球型菌ESD粉末之架儲期，及儲存在4℃下之FD粉末之架儲期。
圖4顯示儲存在4℃下之埃氏巨球型菌凍乾粉末之架儲期。
圖5顯示在80℃、75℃或70℃之入口溫度下處理並儲存在-20℃下之ESD粉末之長期架儲期。

Claims (92)

  1. 一種用於將埃氏巨球型菌( Megasphaera elsdenii)細胞噴霧乾燥成乾燥粉末之系統，該系統包含： 水、載劑及埃氏巨球型菌細胞之來源； 包含攪拌裝置之貯槽，且該貯槽經安置以自該來源接收該水、該載劑及該等埃氏巨球型菌細胞以形成黏度約1 cP至約500 cP範圍內之漿料； 電極，其係經構形以使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料中； 噴霧器； 包含入口端、出口端及位於該入口端與該出口端之間的內部體積之乾燥室，該內部體積係經構形以容納該漿料及乾燥流體， 其中該乾燥室係經構形以乾燥該漿料； 其中該噴霧器係經構形以： (i)自該貯槽接收該漿料；及 (ii)將該漿料排放至該乾燥室內用於與該乾燥流體接觸以形成含有該等埃氏巨球型菌細胞之乾燥粉末；及 其中該乾燥流體包含溫度介於約50℃至約100℃之間的氮或氬，且其中該整個系統低於2%氧。
  2. 一種將埃氏巨球型菌細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括： 製備包含埃氏巨球型菌細胞、生長培養基及滲透物保護劑分子之培養物； 收獲該等埃氏巨球型菌細胞； 形成包含水、載劑及該等埃氏巨球型菌細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度； 使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料； 使該漿料霧化以產生該漿料液滴之噴霧； 將該漿料液滴之該噴霧引入乾燥室內；及 將溫度介於約50℃至約100℃之間的乾燥流體進料至該乾燥室內並乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之該等埃氏巨球型菌細胞之乾燥顆粒的乾燥粉末，其中該乾燥粉末包含低於15%含水量，且其中該整個方法係在低於2%氧下進行。
  3. 一種將埃氏巨球型菌細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括： 製備包含埃氏巨球型菌細胞、生長培養基及滲透物保護劑分子之培養物，其中在培養期間，於一定時間週期內改變pH、溫度及/或滲透壓； 收獲該等埃氏巨球型菌細胞； 形成包含水、載劑及該等埃氏巨球型菌細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度； 使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料； 使該漿料霧化以產生該漿料液滴之噴霧； 將該漿料液滴之該噴霧引入乾燥室內；及 將溫度介於約50℃至約100℃之間的乾燥流體進料至該乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之該等埃氏巨球型菌細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末，其中該乾燥粉末包含低於15%含水量，且其中該整個方法係在低於2%氧下進行。
  4. 一種將埃氏巨球型菌細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括： 製備包含埃氏巨球型菌細胞及生長培養基之培養物； 添加滲透物保護劑分子； 收獲該等埃氏巨球型菌細胞； 形成包含水、載劑及該等埃氏巨球型菌細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度； 使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料； 使該漿料霧化以產生該漿料液滴之噴霧； 將該漿料液滴之該噴霧引入乾燥室內；及 將溫度介於約50℃至約100℃之間的乾燥流體進料至該乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之該等埃氏巨球型菌細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末，其中該乾燥粉末包含低於15%含水量，且其中該整個方法係在低於2%氧下進行。
  5. 一種將埃氏巨球型菌細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括： 製備包含埃氏巨球型菌細胞及生長培養基之培養物，其中在培養期間，於一定時間週期內改變pH、溫度及/或滲透壓； 添加滲透物保護劑分子； 收獲該等埃氏巨球型菌細胞； 形成包含水、載劑及該等埃氏巨球型菌細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度； 使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料； 使該漿料霧化以產生該漿料液滴之噴霧； 將該漿料液滴之該噴霧引入乾燥室內；及 將溫度介於約50℃至約100℃之間的乾燥流體進料至該乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之該等埃氏巨球型菌細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末，其中該乾燥粉末包含低於15%含水量，且其中該整個方法係在低於2%氧下進行。
  6. 一種將埃氏巨球型菌細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括： 製備包含埃氏巨球型菌細胞及生長培養基之培養物； 收獲該等埃氏巨球型菌細胞； 添加滲透物保護劑分子； 形成包含水、載劑及該等埃氏巨球型菌細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度； 使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料； 使該漿料霧化以產生該漿料液滴之噴霧； 將該漿料液滴之該噴霧引入乾燥室內；及 將溫度介於約50℃至約100℃之間的乾燥流體進料至該乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之該等埃氏巨球型菌細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末，其中該乾燥粉末包含低於15%含水量，且其中該整個方法係在低於2%氧下進行。
  7. 一種將埃氏巨球型菌細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括： 製備包含埃氏巨球型菌細胞及生長培養基之培養物，其中在培養期間，於一定時間週期內改變pH、溫度及/或滲透壓； 收獲該等埃氏巨球型菌細胞； 添加滲透物保護劑分子； 形成包含水、載劑及該等埃氏巨球型菌細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度； 使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至漿料； 使該漿料霧化以產生該漿料液滴之噴霧； 將該漿料液滴之該噴霧引入乾燥室內；及 將溫度介於約50℃至約100℃之間的乾燥流體進料至該乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之該等埃氏巨球型菌細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末，其中該乾燥粉末包含低於10%含水量，且其中該整個方法係在低於2%氧下進行。
  8. 一種形成包含囊封於載劑內之埃氏巨球型菌細胞之乾燥粉末之方法，該方法包括： 於混合貯槽中形成包含水、載劑及埃氏巨球型菌細胞之漿料，同時用攪拌裝置攪拌該混合貯槽； 使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料； 於噴霧器中使該漿料霧化並將霧化漿料排放至乾燥室內用於與乾燥流體接觸以形成含有囊封於該載劑內之該等埃氏巨球型菌細胞之乾燥粉末，且其中該乾燥流體包含溫度介於約50℃至約100℃之間的氮或氬，且其中該乾燥粉末包含低於15%含水量，且其中該整個方法係在低於2%氧下進行。
  9. 如請求項2至7中任一項之方法，其中該等埃氏巨球型菌細胞係在收獲前濃縮約20X至約100X。
  10. 如請求項2至8中任一項之方法，其進一步包括藉由將該乾燥流體進料至該乾燥室內前，施加約0.1 kV至約45 kV之電壓而將該乾燥流體加熱至介於約50℃至約100℃之間。
  11. 如請求項2至10中任一項之方法，其進一步包括藉由將該乾燥流體進料至該乾燥室內前，施加約10 kV至約30 kV之電壓而將該乾燥流體加熱至介於約50℃至約100℃之間。
  12. 如請求項2至8中任一項之方法，其中該乾燥流體溫度介於約60℃與約90℃之間。
  13. 如請求項12之方法，其進一步包括藉由將該乾燥流體進料至該乾燥室內前，施加約10 kV至約30 kV之電壓而將該乾燥流體加熱至介於約60℃至約90℃之間。
  14. 如請求項10、11及13中任一項之方法，其中該電壓係以恆定或脈衝方式施加。
  15. 如請求項2至14中任一項之方法，其中該載劑係選自由以下組成之群：蔗糖、糖、糖醇、糖衍生物、多醣、囊封聚合物或氮源，及其混合物。
  16. 如請求項15之方法，其中該載劑係以約1%至約40% (w/v)之量存在。
  17. 如請求項2至16中任一項之方法，其中該乾燥粉末包含約1 x 10 3至約1 x 10 13CFU/公克之埃氏巨球型菌細胞。
  18. 如請求項17之方法，其中該乾燥粉末包含約1 x 10 3CFU/公克之埃氏巨球型菌細胞。
  19. 如請求項1至18中任一項之方法，其中該培養物體積至少50公升。
  20. 一種飼料添加劑，其包含藉由如請求項1至19中任一項之方法產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞。
  21. 如請求項20之飼料添加劑，其中該飼料添加劑進一步包含另一微生物。
  22. 如請求項20或21之飼料添加劑，其中該飼料添加劑係選自由以下組成之群：粉末、顆粒、微粒、集結粒、餅狀物，或其組合。
  23. 如請求項20至22中任一項之飼料添加劑，其中該飼料添加劑係益生菌。
  24. 一種組合物，其包含藉由如請求項1至19中任一項之方法產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞或如請求項20至23中任一項之飼料添加劑。
  25. 如請求項24之組合物，其中該組合物係膠囊。
  26. 一種套組，其包含藉由如請求項1至19中任一項之方法產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、如請求項20至23中任一項之飼料添加劑或如請求項24或25之組合物。
  27. 一種用於治療或預防與動物胃腸道中之乳酸產生相關聯之病症或疾患之方法，其包括對該動物投與有效量之藉由如請求項1至19中任一項之方法產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、如請求項20至23中任一項之飼料添加劑或如請求項24或25之組合物。
  28. 如請求項27之方法，其中該病症或疾患係酸中毒。
  29. 如請求項27或28之方法，其中該病症或疾患係瘤胃酸中毒。
  30. 如請求項27之方法，其中該病症或疾患係呼吸道疾病。
  31. 如請求項27之方法，其中該病症或疾患係蹄葉炎。
  32. 如請求項27之方法，其中該病症或疾患係感染。
  33. 如請求項32之方法，其中該感染係由沙氏桿菌( Salmonella)或彎曲桿菌( Campylobacter)引起。
  34. 一種用於預防或減少伺機性微生物於動物胃腸道中生長之方法，其包括對該動物投與有效量之藉由如請求項1至19中任一項之方法產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、如請求項20至23中任一項之飼料添加劑或如請求項24或25之組合物。
  35. 如請求項34之方法，其中該伺機性微生物係致病的。
  36. 如請求項34或35之方法，其中該伺機性微生物係沙氏桿菌或彎曲桿菌。
  37. 一種改善動物飲食中植物來源磷之生體可用率之方法，其包括對該動物投與有效量之藉由如請求項1至19中任一項之方法產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、如請求項20至23中任一項之飼料添加劑或如請求項24或25之組合物。
  38. 一種改善動物之生長表現之方法，其包括對該動物投與有效量之藉由如請求項1至19中任一項之方法產生之經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、如請求項20至23中任一項之飼料添加劑或如請求項24或25之組合物，其中該動物中之經改善生長表現係以下之改善：飼料攝取量、平均日增重、飼料轉化率、屠體增重、產乳動物之產乳量、家禽之產蛋量、骨礦化，或其組合。
  39. 如請求項27至38中任一項之方法，其中該等經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、該飼料添加劑或該組合物係在用食物飼餵該動物之前、同時或之後投與。
  40. 如請求項27至38中任一項之方法，其中該方法進一步包括在投與前，將該等經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞或該飼料添加劑與液體混合。
  41. 如請求項40之方法，其中該液體係口服或藉由對該動物噴霧該液體投與。
  42. 如請求項27至41中任一項之方法，其包括單次投與該等經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、飼料添加劑或組合物。
  43. 如請求項27至42中任一項之方法，其包括每日投與該等經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、飼料添加劑或組合物。
  44. 如請求項27至43中任一項之方法，其包括於一天內多於一次投與該等經電噴霧乾燥之埃氏巨球型菌細胞、飼料添加劑或組合物。
  45. 如請求項27至44中任一項之方法，其中該動物係反芻動物。
  46. 如請求項45之方法，其中該反芻動物係選自由以下組成之群：牛、綿羊、山羊、鹿、水牛及馴鹿。
  47. 如請求項27至44中任一項之方法，其中該動物係非反芻動物。
  48. 如請求項47之方法，其中該非反芻動物係選自由以下組成之群：馬類、家禽及豬。
  49. 如請求項48之方法，其中該家禽係選自由以下組成之群：雞、鵝、鴨、鵪鶉、火雞或鴿子。
  50. 如請求項48或49之方法，其中該家禽係選自由以下組成之群：肉雞、肉種雞及蛋雞。
  51. 如請求項48至50中任一項之方法，其中該家禽係雞。
  52. 如請求項48之方法，其中該馬類係馬、小馬、驢或騾。
  53. 如請求項1之系統，其中該載劑係選自由以下組成之群：蔗糖、糖、糖醇、多醣、囊封聚合物、糖衍生物或氮源，及其混合物。
  54. 如請求項1之系統，其中該乾燥粉末包含約1 x 10 3至約1 x 10 13CFU/公克之埃氏巨球型菌細胞。
  55. 如請求項1之系統，其中該乾燥粉末包含約1 x 10 3CFU/公克之埃氏巨球型菌細胞。
  56. 一種乾燥粉末，其包含藉由如請求項2至19中任一項之方法形成之複數個乾燥顆粒。
  57. 一種囊封於載劑內之埃氏巨球型菌細胞，其等藉由如請求項2至19中任一項之方法製備。
  58. 一種用於將厭氧細胞噴霧乾燥成乾燥粉末之系統，該系統包含： 水、載劑及厭氧細胞之來源； 包含攪拌裝置之貯槽，且該貯槽係經安置以自該來源接收該水、該載劑及該等厭氧細胞以形成黏度於約1 cP至約500 cP範圍內之漿料； 電極，其係經構形以使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料； 噴霧器； 包含入口端、出口端及位於該入口端與該出口端之間的內部體積之乾燥室，該內部體積係經構形以容納該漿料及乾燥流體， 其中該乾燥室係經構形以乾燥該漿料； 其中該噴霧器係經構形以： (i)自該貯槽接收該漿料；及 (ii)將該漿料排放至該乾燥室內用於與該乾燥流體接觸以形成含有該等厭氧細胞之乾燥粉末；及 其中該乾燥流體包含溫度介於約50℃與約100℃之間的氮或氬，且其中該整個系統低於2%氧。
  59. 一種將厭氧細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括： 製備包含厭氧細胞、生長培養基及滲透物保護劑分子之培養物； 收獲該等厭氧細胞； 形成包含水、載劑及該等厭氧細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度； 使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料； 使該漿料霧化以產生該漿料液滴之噴霧； 將該漿料液滴之該噴霧引入乾燥室內；及 將溫度介於約50℃至約100℃之間的乾燥流體進料至該乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之該等厭氧細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末，其中該乾燥粉末包含低於15%含水量，且其中該整個方法係在低於2%氧下進行。
  60. 一種將厭氧細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括： 製備包含厭氧細胞、生長培養基及滲透物保護劑分子之培養物，其中在培養期間，於一定時間週期內改變pH、溫度及/或滲透壓； 收獲該等厭氧細胞； 形成包含水、載劑及該等厭氧細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度； 使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料； 使該漿料霧化以產生該漿料液滴之噴霧； 將該漿料液滴之該噴霧引入乾燥室內；及 將溫度介於約50℃與約100℃之間的乾燥流體進料至該乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之該等厭氧細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末，其中該乾燥粉末包含低於15%含水量，且其中該整個方法係在低於2%氧下進行。
  61. 一種將厭氧細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括： 製備包含厭氧細胞及生長培養基之培養物； 添加滲透物保護劑分子； 收獲該等厭氧細胞； 形成包含水、載劑及該等厭氧細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度； 使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料； 使該漿料霧化以產生該漿料液滴之噴霧； 將該漿料液滴之該噴霧引入乾燥室內；及 將溫度介於約50℃至約100℃之間的乾燥流體進料至該乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之該等厭氧細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末，其中該乾燥粉末包含低於15%含水量，且其中該整個方法係在低於2%氧下進行。
  62. 一種將厭氧細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括： 製備包含厭氧細胞及生長培養基之培養物，其中在培養期間，於一定時間週期內改變pH、溫度及/或滲透壓； 添加滲透物保護劑分子； 收獲該等厭氧細胞； 形成包含水、載劑及該等厭氧細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度； 使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料； 使該漿料霧化以產生該漿料液滴之噴霧； 將該漿料液滴之該噴霧引入乾燥室內；及 將溫度介於約50℃至約100℃之間的乾燥流體進料至該乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之該等厭氧細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末，其中該乾燥粉末包含低於15%含水量，且其中該整個方法係在低於2%氧下進行。
  63. 一種將厭氧細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括： 製備包含厭氧細胞及生長培養基之培養物； 收獲該等厭氧細胞； 添加滲透物保護劑分子； 形成包含水、載劑及該等厭氧細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度； 使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料； 使該漿料霧化以產生該漿料液滴之噴霧； 將該漿料液滴之該噴霧引入乾燥室內；及 將溫度介於約50℃至約100℃之間的乾燥流體進料至該乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之該等厭氧細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末，其中該乾燥粉末包含低於15%含水量，且其中該整個方法係在低於2%氧下進行。
  64. 一種將厭氧細胞電噴霧乾燥成乾燥粉末之方法，其包括： 製備包含厭氧細胞及生長培養基之培養物，其中在培養期間，於一定時間週期內改變pH、溫度及/或滲透壓； 收獲該等厭氧細胞； 添加滲透物保護劑分子； 形成包含水、載劑及該等厭氧細胞之漿料，其中該載劑具有約1重量%至約50重量%之最終濃度且該漿料具有於約1 cP至約500 cP範圍內之黏度； 使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料； 使該漿料霧化以產生該漿料液滴之噴霧； 將該漿料液滴之該噴霧引入乾燥室內；及 將溫度介於約50℃與約100℃之間的乾燥流體進料至該乾燥室內來乾燥該等液滴以形成包含複數個含有囊封於該載劑內之該等厭氧細胞之乾燥顆粒之乾燥粉末，其中該乾燥粉末包含低於15%含水量，且其中該整個方法係在低於2%氧下進行。
  65. 一種形成包含囊封於載劑內之厭氧細胞之乾燥粉末之方法，該方法包括： 於混合貯槽中形成包含水、載劑及厭氧細胞之漿料，同時用攪拌裝置攪拌該混合貯槽； 使用電壓梯度或振盪電壓將靜電電荷施加至該漿料； 於噴霧器中使該漿料霧化並將霧化漿料排放至乾燥室內用於與乾燥流體接觸以形成含有囊封於該載劑內之該等厭氧細胞之乾燥粉末，且其中該乾燥流體包含溫度介於約50℃至約100℃之間的氮或氬，且其中該乾燥粉末包含低於15%含水量，且其中該整個方法係在低於2%氧下進行。
  66. 如請求項59至64中任一項之方法，其中該等厭氧細胞係在收獲前濃縮約20x至約100X。
  67. 如請求項59至66中任一項之方法，其進一步包括藉由將該乾燥流體進料至該乾燥室內前，施加約0.1 kV至約45 kV之電壓而將該乾燥流體加熱至介於約50℃至約100℃之間。
  68. 如請求項59至67中任一項之方法，其進一步包括藉由將該乾燥流體進料至該乾燥室內前，施加約10 kV至約30 kV之電壓而將該乾燥流體加熱至介於約50℃至約100℃之間。
  69. 如請求項59至65中任一項之方法，其中該乾燥流體溫度介於約60℃至約90℃之間。
  70. 如請求項69之方法，其進一步包括藉由將該乾燥流體進料至該乾燥室內前，施加約10 kV至約30 kV之電壓而將該乾燥流體加熱至介於約60℃至約90℃之間。
  71. 如請求項67、68及70中任一項之方法，其中該電壓係以恆定或脈衝方式施加。
  72. 如請求項59至71中任一項之方法，其中該載劑係選自由以下組成之群：蔗糖、糖、糖醇、多醣、囊封聚合物、糖衍生物或氮源，及其混合物。
  73. 如請求項59至72中任一項之方法，其中該乾燥粉末包含約1 x 10 3至約1 x 10 13CFU/公克之厭氧細胞。
  74. 如請求項73之方法，其中該乾燥粉末包含約1 x 10 3CFU/公克之厭氧細胞。
  75. 如請求項58之系統，其中該載劑係選自由以下組成之群：蔗糖、糖、糖醇、糖衍生物、多醣、囊封聚合物或氮源，及其混合物。
  76. 如請求項58之系統，其中該乾燥粉末包含約1 x 10 3至約1 x 10 13CFU/公克之厭氧細胞。
  77. 如請求項58之系統，其中該乾燥粉末包含約1 x 10 3CFU/公克之厭氧細胞。
  78. 一種乾燥粉末，其包含藉由如請求項59至74中任一項之方法形成之複數個乾燥顆粒。
  79. 一種囊封於載劑內之厭氧細胞，其等藉由如請求項59至74中任一項之方法製備。
  80. 一種改善動物中生長表現之方法，其包括對該動物投與有效量之藉由如請求項59至74中任一項之方法產生之經電噴霧乾燥之厭氧細胞，其中該動物中之經改善之生長表現係以下之改善：飼料攝取量、平均日增重、飼料轉化率、屠體增重、產乳動物之產乳量、家禽之產蛋量、骨礦化，或其組合。
  81. 一種用於預防或減少伺機性微生物於動物胃腸道中生長之方法，其包括對該動物投與有效量之藉由如請求項59至74中任一項之方法產生之經電噴霧乾燥之厭氧細胞。
  82. 一種組合物，其包含藉由如請求項59至74中任一項之方法產生之經電噴霧乾燥之厭氧細菌細胞。
  83. 如請求項2至7中任一項之方法，其中該等埃氏巨球型菌細胞在收獲前，生長在約30℃至約40℃、在約30℃、在約31℃、在約32℃、在約33℃、在約34℃、在約35℃、在約36℃、在約37℃、在約38℃、在約39℃或在約40℃下。
  84. 如請求項59至64中任一項之方法，其中該等厭氧細胞在收獲前，生長在約30℃至約40℃、在約30℃、在約31℃、在約32℃、在約33℃、在約34℃、在約35℃、在約36℃、在約37℃、在約38℃、在約39℃或在約40℃下。
  85. 如請求項2至7中任一項之方法，其中該載劑具有約2重量%至約30重量%之最終濃度。
  86. 如請求項59至64中任一項之方法，其中該載劑具有約2重量%至約30重量%之最終濃度。
  87. 如請求項1至7、9至19、59至64、66至74及83至86中任一項之方法，其中該乾燥流體係選自由氮及氬組成之群。
  88. 如請求項2至7中任一項之方法，其進一步包括藉由將該乾燥流體進料至該乾燥室內前，施加約11 kV至約25 kV之電壓而將該乾燥流體加熱至介於約50℃至約100℃之間。
  89. 如請求項59至64中任一項之方法，其進一步包括藉由將該乾燥流體進料至該乾燥室內前，施加約11 kV至約25 kV之電壓而將該乾燥流體加熱至介於約50℃至約100℃之間。
  90. 如請求項15之方法，其中該囊封聚合物係海藻酸鹽。
  91. 如請求項72或75之方法，其中該囊封聚合物係海藻酸鹽。
  92. 如請求項1至7、9至19、59至64、66至74及83至86中任一項之方法，其中該漿料係以介於約1 L/小時與約10,000 L/小時之間的速率處理。
TW112128493A 2022-07-29 2023-07-28 電噴霧乾燥厭氧細菌之方法及其組合物 TW202408639A (zh)

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