IT201900006056A1 - Procedimento per la preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate stabili e determinazione della loro stabilità mediante un metodo citofluorimetrico - Google Patents
Procedimento per la preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate stabili e determinazione della loro stabilità mediante un metodo citofluorimetrico Download PDFInfo
- Publication number
- IT201900006056A1 IT201900006056A1 IT102019000006056A IT201900006056A IT201900006056A1 IT 201900006056 A1 IT201900006056 A1 IT 201900006056A1 IT 102019000006056 A IT102019000006056 A IT 102019000006056A IT 201900006056 A IT201900006056 A IT 201900006056A IT 201900006056 A1 IT201900006056 A1 IT 201900006056A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- biomass
- cells
- fluorescent
- freeze
- bacterial
- Prior art date
Links
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 title claims description 232
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 56
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 176
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 77
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 55
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 35
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 34
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 25
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 20
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 20
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 19
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 18
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 claims description 16
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 claims description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 16
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 15
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 15
- 150000003017 phosphorus Chemical class 0.000 claims description 13
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 12
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 11
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 11
- 229940085991 phosphate ion Drugs 0.000 claims description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 10
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 9
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N diphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(O)=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims description 6
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 6
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 6
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 6
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 6
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 6
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 6
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 6
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 6
- 239000000832 lactitol Substances 0.000 claims description 6
- VQHSOMBJVWLPSR-JVCRWLNRSA-N lactitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O VQHSOMBJVWLPSR-JVCRWLNRSA-N 0.000 claims description 6
- 235000010448 lactitol Nutrition 0.000 claims description 6
- 229960003451 lactitol Drugs 0.000 claims description 6
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 6
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 6
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 6
- 229940005657 pyrophosphoric acid Drugs 0.000 claims description 6
- 238000000859 sublimation Methods 0.000 claims description 6
- 230000008022 sublimation Effects 0.000 claims description 6
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims description 5
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N phosphite(3-) Chemical compound [O-]P([O-])[O-] AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- ISIJQEHRDSCQIU-UHFFFAOYSA-N tert-butyl 2,7-diazaspiro[4.5]decane-7-carboxylate Chemical compound C1N(C(=O)OC(C)(C)C)CCCC11CNCC1 ISIJQEHRDSCQIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 2
- 235000007882 dietary composition Nutrition 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 51
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 48
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 16
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 16
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 13
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 11
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 11
- 229940048084 pyrophosphate Drugs 0.000 description 10
- RYCLIXPGLDDLTM-UHFFFAOYSA-J tetrapotassium;phosphonato phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O RYCLIXPGLDDLTM-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 10
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 9
- -1 pyrophosphate ions Chemical class 0.000 description 9
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 6
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 5
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 3
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-O azanium;hydron;hydroxide Chemical compound [NH4+].O VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 3
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 3
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 3
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 241000702460 Akkermansia Species 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000186840 Lactobacillus fermentum Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M dihydrogenphosphate Chemical compound OP(O)([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 235000019820 disodium diphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 229940012969 lactobacillus fermentum Drugs 0.000 description 2
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000009516 primary packaging Methods 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 2
- ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M thiazole orange Chemical compound CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1.C1=CC=C2C(C=C3N(C4=CC=CC=C4S3)C)=CC=[N+](C)C2=C1 ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 241000605059 Bacteroidetes Species 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 241000186018 Bifidobacterium adolescentis Species 0.000 description 1
- 241000901050 Bifidobacterium animalis subsp. lactis Species 0.000 description 1
- 241000186016 Bifidobacterium bifidum Species 0.000 description 1
- 241000186012 Bifidobacterium breve Species 0.000 description 1
- 241001608472 Bifidobacterium longum Species 0.000 description 1
- 241000186015 Bifidobacterium longum subsp. infantis Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000928573 Cutibacterium Species 0.000 description 1
- 241000186427 Cutibacterium acnes Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000186394 Eubacterium Species 0.000 description 1
- 241001608234 Faecalibacterium Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000616258 Intestinimonas Species 0.000 description 1
- 241000946243 Intestinimonas butyriciproducens Species 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 description 1
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 description 1
- 240000001929 Lactobacillus brevis Species 0.000 description 1
- 235000013957 Lactobacillus brevis Nutrition 0.000 description 1
- 241000186679 Lactobacillus buchneri Species 0.000 description 1
- 244000199885 Lactobacillus bulgaricus Species 0.000 description 1
- 235000013960 Lactobacillus bulgaricus Nutrition 0.000 description 1
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 1
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 description 1
- 241000218492 Lactobacillus crispatus Species 0.000 description 1
- 241001647786 Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii Species 0.000 description 1
- 241000186606 Lactobacillus gasseri Species 0.000 description 1
- 241001468157 Lactobacillus johnsonii Species 0.000 description 1
- 241000218587 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei Species 0.000 description 1
- 241000186684 Lactobacillus pentosus Species 0.000 description 1
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 1
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 1
- 241000186604 Lactobacillus reuteri Species 0.000 description 1
- 241000218588 Lactobacillus rhamnosus Species 0.000 description 1
- 241000917009 Lactobacillus rhamnosus GG Species 0.000 description 1
- 241000186869 Lactobacillus salivarius Species 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 241000588649 Neisseria lactamica Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192142 Proteobacteria Species 0.000 description 1
- 241000605947 Roseburia Species 0.000 description 1
- 241000872832 Roseburia hominis Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000610375 Sparisoma viride Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical class [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001531197 [Eubacterium] hallii Species 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000004378 air conditioning Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229940002008 bifidobacterium bifidum Drugs 0.000 description 1
- 229940004120 bifidobacterium infantis Drugs 0.000 description 1
- 229940009289 bifidobacterium lactis Drugs 0.000 description 1
- 229940009291 bifidobacterium longum Drugs 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- GYQBBRRVRKFJRG-UHFFFAOYSA-L disodium pyrophosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])(=O)OP(O)([O-])=O GYQBBRRVRKFJRG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 description 1
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 description 1
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 1
- 229940001882 lactobacillus reuteri Drugs 0.000 description 1
- 229940059406 lactobacillus rhamnosus gg Drugs 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002696 manganese Chemical class 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 150000004682 monohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000009965 odorless effect Effects 0.000 description 1
- 238000013386 optimize process Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 1
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000009517 secondary packaging Methods 0.000 description 1
- 239000003352 sequestering agent Substances 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000012430 stability testing Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- NCEXYHBECQHGNR-QZQOTICOSA-N sulfasalazine Chemical compound C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(\N=N\C=2C=CC(=CC=2)S(=O)(=O)NC=2N=CC=CC=2)=C1 NCEXYHBECQHGNR-QZQOTICOSA-N 0.000 description 1
- JLKIGFTWXXRPMT-UHFFFAOYSA-N sulphamethoxazole Chemical compound O1C(C)=CC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=N1 JLKIGFTWXXRPMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/06—Quantitative determination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
DESCRIZIONE dell ́invenzione avente per titolo:
“PROCEDIMENTO PER LA PREPARAZIONE DI UNA BIOMASSA DI CELLULE DI BATTERI LIOFILIZZATE STABILI E DETERMINAZIONE DELLA LORO STABILITA’ MEDIANTE UN METODO CITOFLUORIMETRICO”
CAMPO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce a una biomassa di cellule di batteri liofilizzate, ad elevata concentrazione e stabili. Inoltre, la presente invenzione si riferisce a un procedimento per la preparazione di detta biomassa di cellule di batteri liofilizzate, ad elevata concentrazione e stabili. Le cellule di batteri liofilizzate della presente invenzione hanno una stabilità in termini di vitalità espressa in AFU, determinata mediante un metodo citofluorimetrico, maggiore rispetto alla stabilità determinata sulle stesse cellule mediante conta in piastra ed espressa in UFC.
Infine, la presente invenzione si riferisce a una composizione farmaceutica, o una composizione per dispositivo medico, o una composizione per uso cosmetico, o una composizione per integratore alimentare o una composizione per un prodotto alimentare o una composizione per un alimento a fini medici speciali – AFMS (tutte quante queste composizioni denominate, per brevità, le “composizioni della presente invenzione”) comprendenti, dette composizioni, detta biomassa di cellule di batteri liofilizzate, ad elevata concentrazione e stabili.
SFONDO DELL’INVENZIONE.
Negli ultimi anni, i prodotti contenenti cellule di batteri stanno guadagnando quote di mercato sempre maggiori sia nel settore alimentare (ad esempio per la produzione di prodotti caseari), sia nel settore degli integratori alimentari (ad esempio prodotti probiotici), che in quello farmaceutico come Live Biotherapeutic Products (LBP).
In tali settori industriali, e con specifico riferimento a questo tipo di prodotti, sono di estrema importanza gli aspetti connessi alla stabilità e vitalità delle cellule di batteri. La stabilità in termini di vitalità ed integrità delle cellule di batteri dipende molto dal procedimento con il quale vengono prodotte. Infatti, i microrganismi o le cellule di batteri contenuti in detti prodotti sono molto sensibili alle condizioni e ai parametri di processo per la loro produzione e risentono molto anche delle condizioni ambientali di conservazione, in particolare le cellule di batteri sono sensibili e risentono della temperatura, luce, raggi UV, ossigeno, acqua libera, umidità dell’ambiente di produzione e conservazione a valle del processo produttivo. Inoltre, una gran parte dei microrganismi sono anaerobi o, comunque, estremamente sensibili all’esposizione all’ossigeno a causa della generazione di radicali liberi dell’ossigeno che riducono la loro vitalità.
Tale circostanza costituisce quindi uno dei principali limiti nella distribuzione di biomasse di cellule di batteri in determinate zone geografiche (a titolo di esempio, nelle zone IV.A e IV.B individuate dall’Organizzazione Mondiale della Sanità; World Health Organization), in cui è estremamente difficoltoso assicurare condizioni tali da garantire una vitalità di un numero di microrganismi o cellule di batteri sufficientemente elevato, e per tempi sufficientemente lunghi, da avere ancora un’efficacia significativa all’atto del loro impiego o consumo.
Nell'Ottobre del 2005, la WHO ha raccomandato di dividere in due diverse zone la zona climatica IV, introducendo la zona IV.A (calda e umida) e la zona IV.B (calda e molto umida). Quindi esistono oggi 5 diverse zone climatiche e 5 diverse condizioni per l'esecuzione degli studi di stabilità, da utilizzare a seconda del mercato target:
• ZONA I: Clima temperato – Condizioni di stoccaggio a lungo termine: 21°C / 45% U.R.
• ZONA II: Clima subtropicale e mediterraneo – Condizioni di stoccaggio a lungo termine: 25°C / 60% U.R.
• ZONA III: Clima caldo e secco – Condizioni di stoccaggio a lungo termine: 30°C / 35% U.R.
• ZONA IV.A: Clima caldo e umido – Condizioni di stoccaggio a lungo termine: 30°C / 65% U.R.
• ZONA IV.B: Clima caldo e molto umido – Condizioni di stoccaggio a lungo termine: 30°C / 75% U.R.
Allo scopo di facilitare la conoscenza delle condizioni richieste per l'esecuzione degli studi nei diversi Paesi, la WHO ha pubblicato una lista degli Stati aderenti, con la relativa condizione di stoccaggio a lungo termine nella linea guida WHO Technical report series N° 953, 2009, Annex 2 “Stability testing of active pharmaceutical ingredients and finished pharmaceutical products”.
Pertanto è sentita la necessità di poter disporre di un procedimento facile da eseguire e riproducibile per la preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate, ad elevate concentrazioni, stabili e vitali in grado di poter essere trasportate, lavorate, commercializzate e conservate in paesi presenti in zone climatiche IV.A e IV.B.
RIASSUNTO DELL’INVENZIONE.
La presente invenzione si colloca quindi nel precedente contesto, proponendosi di fornire (1) una biomassa di cellule di batteri liofilizzate, ad elevata concentrazione e stabili; (2) un procedimento per la preparazione di detta biomassa di cellule di batteri liofilizzate, ad elevata concentrazione e stabili; e (3) una composizione farmaceutica, o una composizione per dispositivo medico, o una composizione per uso cosmetico, o una composizione per integratore alimentare o una composizione per un prodotto alimentare o una composizione per un alimento a fini medici speciali – AFMS (tutte quante queste composizioni denominate, per brevità, le “composizioni della presente invenzione”) comprendenti, dette composizioni, detta biomassa di cellule di batteri liofilizzate, ad elevata concentrazione e stabili.
Le cellule di batteri liofilizzate, oggetto dell’invenzione, sono cellule con una parete cellulare (o parete di membrana cellulare) ben conservata in un buono stato fisiologico e, quindi, sono cellule integre e vitali. L’integrità della parete cellulare (o della parete di membrana cellulare) conferisce alle cellule stesse una maggiore stabilità in termini di vitalità espressa in AFU e determinata mediante un metodo citofluorimetrico. La stabilità è maggiore rispetto alla stabilità determinata sulle stesse cellule mediante conta in piastra ed espressa in UFC. Una maggiore stabilità consente di avere una biomassa di cellule di batteri con una shelf-life prolungata, mentre una maggiore vitalità delle cellule consente di avere un’attività ed un’efficacia superiore una volta impiegate o somministrate ad un soggetto in trattamento.
Forma oggetto della presente invenzione una biomassa di cellule di batteri liofilizzate, ad elevata concentrazione e stabili, avente le caratteristiche come definite nelle unite rivendicazioni.
Forma un altro oggetto della presente invenzione un procedimento per la preparazione di detta biomassa di cellule di batteri liofilizzate, ad elevata concentrazione e stabili, avente le caratteristiche come definite nelle unite rivendicazioni.
Forma un altro oggetto ancora della presente invenzione una composizione farmaceutica, o una composizione per dispositivo medico, o una composizione per uso cosmetico, o una composizione per integratore alimentare o una composizione per un prodotto alimentare o una composizione per un alimento a fini medici speciali – AFMS (tutte quante queste composizioni denominate, per brevità, le “composizioni della presente invenzione”) comprendenti, dette composizioni, detta biomassa di cellule di batteri liofilizzate, ad elevata concentrazione e stabili, avente le caratteristiche come definite nelle unite rivendicazioni.
Forme preferite della presente invenzione sono di seguito riportate in maggior dettaglio senza voler in nessun modo limitare la portata della presente invenzione.
BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI.
La presente invenzione verrà ora descritta con l’ausilio delle tavole allegate, fornite a solo scopo illustrativo, in cui:
- Figura 1 mostra un primo diagramma secondo l’Esempio 6, test A) discusso a seguire;
- Figura 2 mostra un secondo diagramma secondo l’Esempio 6, test B) discusso a seguire;
- Figura 3 mostra un terzo diagramma secondo l’Esempio 6, test C) discusso a seguire;
- Figura 4 esemplifica la velocità di decadimento (k) dell’Esempio 6, relativo alla ZONA IV.B, assimilabile alla pendenza della retta di interpolazione.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE.
Dopo un’intensa e prolungata attività di ricerca e sviluppo, motivata e supportata da una serie di dati sperimentali molto promettenti, la Richiedente è giunta a comprendere l’importanza che riveste la parete delle cellule dei batteri (parete cellulare) presenti in una biomassa (insieme di cellule di batteri).
Le risultanze sperimentali hanno confermato che il mantenimento di un buono stato di conservazione ed integrità della parete cellulare durante tutte le fasi di preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate consente di ottenere cellule di batteri stabili, vitali e ad elevata concentrazione, mediante un processo ottimizzato e riproducibile.
Quanto sopra è stato possibile grazie a uno specifico procedimento di preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate, oggetto della presente invenzione. Inoltre, quanto sopra è stato anche possibile grazie a una procedura, oggetto della presente invenzione, che prevede la combinazione di detto procedimento di preparazione con un metodo per valutare la parete cellulare. Il metodo per valutare la parete cellulare, anch’esso oggetto della presente invenzione, consente di valutare se detta parete cellulare è ben conservata in un buono stato fisiologico. La conservazione di un buono stato fisiologico e l’integrità della parete cellulare sono importanti per la stabilità e la vitalità (vitality) delle cellule.
Il monitoraggio e la valutazione di un buono stato di conservazione ed integrità della parete cellulare, eseguita in tutte le fasi del procedimento di preparazione di detta biomassa di cellule di batteri, consente di ottimizzare ciascuna delle singole fasi del procedimento di preparazione al fine di ottenere una biomassa di cellule di batteri liofilizzate, stabili, vitali e ad elevata concentrazione, mediante un processo riproducibile, affidabile e ottimizzato.
Vantaggiosamente, la procedura che comprende il procedimento di preparazione della presente invenzione unito al metodo per valutare il mantenimento di un buono stato di conservazione ed integrità della parete cellulare ha consentito di ottenere una biomassa di cellule di batteri liofilizzate con una parete cellulare integra e ben conservata (integrità di membrana) che conferisce alle cellule di batteri liofilizzate stesse una stabilità prolungata e un ottimo stato di vitalità.
Nel contesto della presente invenzione con “integra/e” si intende dire che la membrana cellulare o la parete di membrana cellulare non presenta elementi o zone di permeabilità dovute ad un incremento di un danno arrecato alla membrana stessa.
Il procedimento di preparazione della presente invenzione migliora la tenuta della membrana cellulare del batterio riducendo la permeabilità della cellula. Per stabilità prolungata si intende una stabilità alla conservazione (Shelf-life), determinata mediante un metodo citofluorimetrico, che risulta essere maggiore rispetto alla stabilità di una stessa biomassa di cellule di batteri misurata mediante il metodo standard di conta in piastra.
Inoltre una parete cellulare integra e ben conservata (integrità di membrana) conferisce alle cellule di batteri liofilizzate stesse una maggiore vitalità ed efficacia una volta che dette cellule sono state somministrate a un soggetto.
Grazie al procedimento di preparazione della presente invenzione è possibile preparare una biomassa di cellule di batteri in cui le cellule presentano una stabilità per un periodo di tempo compreso da 1 minuto a 10 anni, preferibilmente compreso da 1 giorno a 5 anni, più preferibilmente compreso da 4 mesi oppure da 12 mesi a 48 mesi, ancora più preferibilmente da 18 mesi a 32 mesi, ulteriormente, preferibilmente da 24 mesi a 30 mesi, anche in condizioni di zona IV.A e zona IV.B.
La presente invenzione si riferisce a un procedimento per la preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate, comprendente le seguenti fasi:
(i) fermentare una biomassa di cellule di batteri (biomassa di batteri) precedentemente preparata comprendente almeno un ceppo di cellule di batteri per ottenere una biomassa di cellule di batteri fermentata (biomassa fermentata);
(ii) concentrare la biomassa fermentata ottenuta dalla fase (i) fino ad ottenere una biomassa di cellule di batteri concentrata (biomassa concentrata) avente una concentrazione di cellule di batteri compresa da 1x10<6 >cellule/ml di biomassa liquida a 1x10<12 >cellule/ml di biomassa liquida;
(iii) miscelare la biomassa concentrata ottenuta dalla fase (ii) con una soluzione che comprende o, alternativamente, consiste di: (a) almeno un sale del fosforo scelto dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di un sale dello ione fosfato o acido fosforico, un sale dello ione fosfito o acido fosforoso, un sale dello ione mono-idrogeno fosfato, un sale dello ione di-idrogeno fosfato, un sale dello ione pirofosfato o acido pirofosforico, e loro miscele, e (b) almeno una sostanza poli-idrossi scelta dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di saccarosio, fruttosio, lattosio, lattitolo, trealosio o mannitolo, e loro miscele per ottenere una biomassa di cellule di batteri crioprotette (biomassa crioprotetta); (iv) liofilizzare la biomassa crioprotetta ottenuta dalla fase (iii) per ottenere una biomassa di cellule di batteri liofilizzate (biomassa liofilizzata).
Nella fase (iii) la biomassa concentrata della fase (ii) può essere miscelata con una soluzione che comprende o, alternativamente, consiste di (a) almeno un sale del fosforo, (b) almeno una sostanza poli-idrossi e (c) L-cisteina.
Il procedimento della presente invenzione può inoltre prevedere, oltre alle fasi (i), (ii), (iii) e (iv), una o più delle seguenti fasi preferite.
In una realizzazione preferita, il procedimento della presente invenzione può inoltre prevedere, oltre alle fasi (i), (ii), una fase preferita (ii.a) prima della fase (iii). Nella fase preferita (ii.a) la biomassa concentrata ottenuta dalla fase (ii) viene lavata a dare una biomassa lavata.
In accordo con una forma di realizzazione, nella fase (ii.a) la biomassa concentrata ottenuta dalla fase (ii) viene lavata con un liquido di lavaggio, preferibilmente acqua.
In una realizzazione preferita, il procedimento della presente invenzione può inoltre prevedere, oltre alle fasi (i), (ii), (ii.a), una fase preferita (ii.b) prima della fase (iii). Nella fase preferita (ii.b), la biomassa lavata ottenuta dalla fase (ii.a) viene riconcentrata a dare una biomassa riconcentrata.
In una biomassa riconcentrata secondo la presente invenzione, le cellule di batteri hanno preferibilmente una concentrazione compresa da 1x10<6 >cellule/ml a 1x10<12 >cellule/ml, preferibilmente compresa da 1x10<7 >cellule/ml a 1x10<12 >cellule/ml, ancora più preferibilmente compresa da 1x10<8 >cellule/ml a 1x10<11 >cellule/ml, più preferibilmente ancora compresa da 1x10<9 >cellule/ml a 1x10<11 >cellule/ml oppure compresa da 1x10<10 >cellule/ml a 1x10<11 >cellule/ml, per ogni millilitro di biomassa liquida riconcentrata.
In una realizzazione preferita, la biomassa lavata e riconcentrata ottenuta dalla fase (ii.a) e (ii.b) viene miscelata con una soluzione che comprende o, alternativamente, consiste di: (a) almeno un sale del fosforo scelto dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di un sale dello ione fosfato o acido fosforico, un sale dello ione fosfito o acido fosforoso, un sale dello ione mono-idrogeno fosfato, un sale dello ione di-idrogeno fosfato, un sale dello ione pirofosfato o acido pirofosforico, e loro miscele, e (b) almeno una sostanza poli-idrossi scelta dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di saccarosio, fruttosio, lattosio, lattitolo, trealosio, mannitolo, e loro miscele, per ottenere la biomassa crioprotetta. Preferibilmente, la soluzione comprende o, alternativamente, consiste di (a) almeno un sale del fosforo, (b) almeno una sostanza poli-idrossi, preferibilmente anche (c) L-cisteina.
In una realizzazione preferita, il procedimento della presente invenzione può inoltre prevedere, oltre alle fasi (i), (ii), (ii.a) e (ii.b), una fase preferita (ii.c) prima della fase (iii). Nella fase preferita (ii.c) il pH della biomassa riconcentrata ottenuta dalla fase (ii.b) viene regolato, se necessario, ad un valore di pH compreso da 5±0,1 a 7±0,1, a dare una biomassa a pH regolato; preferibilmente il valore di pH potrebbe essere compreso da 5,5±0,1 a 6,5±0,1, ancor più preferibilmente il valore di pH potrebbe essere di 6,2±0.1.
In accordo con una forma di realizzazione, la regolazione del valore di pH nella fase (ii.c) è eseguita attraverso un’aggiunta di una base debole, di preferenza inorganica. Preferibilmente, la base debole comprende oppure, alternativamente, consiste di idrato di ammonio (NH4OH; CAS N. 1336-21-6).
A titolo di esempio, un idrato di ammonio utilizzabile per regolare il valore di pH nella fase (ii.c) potrebbe essere una soluzione acquosa con un titolo in ammoniaca del 31-32%, e preferibilmente con un peso specifico di 0,887-0,890 g/cm<3>.
In una realizzazione preferita, la biomassa lavata, riconcentrata e a pH regolato ottenuta dalla fase (ii.a), (ii.b) e (ii.c) viene miscelata con soluzione che comprende o, alternativamente, consiste di: (a) almeno un sale del fosforo scelto dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di un sale dello ione fosfato o acido fosforico, un sale dello ione fosfito o acido fosforoso, un sale dello ione monoidrogeno fosfato, un sale dello ione di-idrogeno fosfato, un sale dello ione pirofosfato o acido pirofosforico, e loro miscele, e (b) almeno una sostanza poli-idrossi scelta dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di saccarosio, fruttosio, lattosio, lattitolo, trealosio, mannitolo, e loro miscele, per ottenere la biomassa crioprotetta. Preferibilmente, la soluzione che comprende o, alternativamente, consiste di (a) almeno un sale del fosforo, (b) almeno una sostanza poli-idrossi, e preferibilmente anche (c) L-cisteina.
Nella fase (iii) – successiva alla fase (ii), oppure successiva alla fase (ii.a) e (ii.b), oppure successiva alla fase (ii.a), (ii.b) e (ii.c) - la biomassa concentrata ottenuta dalla fase (ii), oppure la biomassa lavata e riconcentrata ottenuta dalla fase (ii.a) e (ii.b), oppure la biomassa lavata, riconcentrata e a pH regolato ottenuta dalla fase (ii.a), (ii.b) e (ii.c), viene miscelata con soluzione che comprende o, alternativamente, consiste di: (a) almeno un sale del fosforo scelto dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di un sale dello ione fosfato o acido fosforico, un sale dello ione fosfito o acido fosforoso, un sale dello ione mono-idrogeno fosfato, un sale dello ione di-idrogeno fosfato, un sale dello ione pirofosfato o acido pirofosforico, e loro miscele, e (b) almeno una sostanza poli-idrossi scelta dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di saccarosio, fruttosio, lattosio, lattitolo, trealosio, mannitolo, e loro miscele, per ottenere la biomassa crioprotetta. Preferibilmente, la soluzione che comprende o, alternativamente, consiste di (a) almeno un sale del fosforo, (b) almeno una sostanza poli-idrossi può inoltre comprendere anche (c) L-cisteina.
Il pirofosfato di sodio o di potassio Na4P2O7 o K4O7P2 è un sale di sodio o di potassio dell'acido pirofosforico H4P2O7. Il pirofosfato di sodio viene anche chiamato pirofosfato tetrasodico per distinguerlo dal pirofosfato acido di sodio Na2H2P2O7. A temperatura ambiente il pirofosfato di sodio o di potassio si presenta come un solido incolore, inodore, solubile in acqua. Assieme agli altri difosfati di sodio o di potassio è codificato nella lista degli additivi alimentari come E450.
Successivamente, la biomassa crioprotetta ottenuta dalla fase (iii) viene liofilizzata in accordo con la fase (iv) per ottenere una biomassa di cellule di batteri liofilizzate, stabili, vitali e ad elevata concentrazione, mediante un processo ottimizzato e riproducibile.
Si precisa che, nella presente descrizione il termine “concentrata” nell’espressione “biomassa concentrata” oppure nell’espressione “biomassa di cellule di batteri concentrata” si intende far riferimento a una biomassa ottenuta dalla fase (ii) in cui le cellule di batteri risultano aumentate in numero, per unità di volume, rispetto a quelle ottenute al termine della fase di fermentazione (i).
Nella biomassa concentrata le cellule di batteri hanno una concentrazione compresa da 1x10<6 >cellule/ml a 1x10<12 >cellule/ml, preferibilmente compresa da 1x10<7 >cellule/ml a 1x10<12 >cellule/ml, ancora più preferibilmente compresa da 1x10<8 >cellule/ml a 1x10<11 >cellule/ml, più preferibilmente ancora compresa da 1x10<9 >cellule/ml a 1x10<11 >cellule/ml oppure compresa da 1x10<10 >cellule/ml a 1x10<11 >cellule/ml, per ogni millilitro di biomassa liquida concentrata.
Quando la biomassa di cellule di batteri è prodotta in fase solida a seguito di un processo di essiccazione (ad esempio scaglie, granuli o polvere) o un processo di liofilizzazione (ad esempio polvere liofilizzata), il termine “concentrata” come impiegato in questa descrizione, indicherà una concentrazione di cellule di batteri compresa da 1x10<6 >cellule/g a 1x10<13 >cellule/g, preferibilmente una concentrazione compresa da 1x10<7 >cellule/g a 1x10<12 >cellule/g, ancora più preferibilmente una concentrazione compresa da 1x10<8 >cellule/g a 1x10<12 >cellule/g, più preferibilmente ancora una concentrazione compresa da 1x10<9 >cellule/g a 1x10<12 >cellule/g, per ogni grammo di biomassa essiccata, oppure di biomassa liofilizzata ottenuta dalla fase (iv).
Per quanto attiene al valore di attività di acqua libera Aw che consente, quanto più è basso, di ridurre/inibire l’attività metabolica delle cellule di batteri, è importante che il valore di Aw, presente nella biomassa liofilizzata ottenuta dalla fase (iv), sia compreso da 0,01 a 0,3; preferibilmente da 0,05 a 0,2; ancor più preferibilmente da 0,1 a 0,15. La misurazione e determinazione del valore di attività di acqua libera Aw possono essere eseguite utilizzando lo strumento modello “AQUALAB 4TE”, prodotto dalla società statunitense METER Group, Inc.
La tecnica sfruttata dallo strumento “AQUALAB 4TE” è quella del punto di rugiada su specchio raffreddato. Secondo tale tecnica, un campione da analizzare è introdotto in una camera dello strumento, successivamente chiusa in modo ermetico, e le condizioni di umidità della camera sono progressivamente portate in equilibrio con l’”acqua libera” di tale campione (definita come l’acqua non vincolata da legami cellulari alle cellule di batteri della biomassa). Lo strumento comprende inoltre almeno uno specchio termoregolato, inserito nella camera a chiusura ermetica, e uno o più sensori di rilevazione funzionalmente collegati con lo specchio termoregolato. Nel corso dell’analisi, con il raggiungimento delle condizioni di equilibrio tra camera e campione, una superficie dello specchio termoregolato viene progressivamente portata ad una temperatura pari o inferiore alla temperatura di rugiada dell’umidità alla pressione interna della camera. L’umidità della camera si deposita quindi su tale superficie dello specchio termoregolato in forma di condensa. Il sensore di rilevazione provvede quindi a rilevare una prima condensazione sulla superficie dello specchio, in modo che lo strumento possa visualizzare l’attività dell’acqua Aw (che corrisponde all’acqua libera del campione) e la temperatura della superficie dello specchio a cui è avvenuta la prima condensazione.
Il procedimento per la preparazione della biomassa liofilizzata secondo la presente invenzione comprende la fase (i) nella quale una biomassa di cellule di batteri (biomassa di batteri) precedentemente preparata e comprendente almeno un ceppo di cellule di batteri viene fermentata per ottenere una biomassa di cellule di batteri fermentata (biomassa fermentata).
La biomassa di batteri destinata alla fase (i) comprende almeno un ceppo di cellule di batteri scelto dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente dei ceppi di cellule batteriche appartenenti alle famiglie: Firmicutes, Actibacteria, Bacteroidetes, Proteobacteria, e loro miscele. Detto almeno un ceppo di cellule batteriche è scelto dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente dei ceppi di cellule batteriche appartenenti ai generi: Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Lactococcus, Akkermansia, Intestinimonas, Eubacterium, Faecalibacterium, Neisseria, Roseburia, Cutibacterium e loro miscele. Detto almeno un ceppo di cellule di batteri è scelto dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente dei ceppi di cellule di batteri appartenenti alle specie: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus salivarius subsp. salivarius, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Bifidobacterium breve, Bifobacterium catenulatum, Bifobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Akkermansia munichipila, Intestinimonas butyriciproducens, Eubacterium hallii, Faecalobacterium prausnitzii, Neisseria lactamica, Roseburia hominis, Cutibacterium acnes, e loro miscele.
In una forma di realizzazione, una biomassa di batteri destinata alla fase (i) del ceppo di batteri di interesse viene inoculata in un substrato di fermentazione liquido (o brodo di fermentazione) comprendente: i) una fonte di carbonio, preferibilmente destrosio in una concentrazione compresa da 20 g/l a 80 g/l, ii) una fonte di azoto, preferibilmente comprendente una combinazione di un peptone di origine vegetale (ad esempio, di patata, di riso oppure di pisello in funzione del ceppo di batteri fermentato), e iii) un estratto di lievito in una concentrazione compresa da 5 g/l a 50g/l.
In accordo con una forma di realizzazione, il substrato di fermentazione liquido può essere addizionato, in funzione della biomassa di batteri di interesse, con sali di fosfato o solfato di potassio, magnesio o manganese alla concentrazione di ciascuno di tali sali preferibilmente compresa da 10 g/l a 0,01 g/l di detto substrato o brodo di fermentazione.
La biomassa di batteri di interesse viene inoculata nel substrato di fermentazione liquido sopra descritto in ragione del 1-10%, preferibilmente 2-4%, in volume rispetto al volume del substrato di fermentazione liquido.
La biomassa di batteri così inoculata viene incubata ad una temperatura compresa da 30°C a 40°C, preferibilmente da 34°C a 37°C, per un tempo compreso da 1 ora a 48 ore, preferibilmente da 5 ore a 30 ore, in funzione dell’inoculo e dell’acidificazione del substrato di fermentazione liquido.
Al termine della fase di fermentazione (i) si ottiene una biomassa di batteri la quale viene sottoposta ad una concentrazione in accordo con la fase (ii).
La fase (ii), nella quale la biomassa di batteri della fase (i) viene concentrata, viene realizzata mediante una fase di separazione, in cui una frazione liquida viene separata da una frazione solida o cellulare costituita appunto dalle cellule di batteri cresciuti nel substrato di fermentazione liquido della fase (i). In una realizzazione, detta fase di separazione può essere realizzata mediante centrifugazione.
La fase di separazione consente di separare dalla biomassa di batteri, che si trova nello stato fisico di una soluzione, la frazione liquida in essa contenuta in modo che la stessa biomassa si concentri sempre più delle altre componenti quali ad esempio le cellule di batteri.
La concentrazione si realizza passando da una biomassa di batteri che contiene, nella fase (i), detto almeno un ceppo di batteri ad una concentrazione compresa da 1x10<6 >cellule/ml a 1x10<11 >cellule/ml di substrato o brodo di fermentazione, a una biomassa concentrata che contiene, dopo la fase (ii), detto almeno un ceppo di batteri ad una concentrazione compresa tra 1x10<6 >cellule/ml a 1x10<12 >cellule/ml.
La fase preferita (ii.a), aggiuntiva alle fasi (i), (ii) e precedente la fase (iii), prevede che la biomassa concentrata ottenuta dalla fase (ii) sia lavata con il liquido di lavaggio, preferibilmente acqua, a dare la biomassa lavata.
Nella fase (iii) la biomassa concentrata ottenuta dalla fase (ii), oppure la biomassa a pH regolato ottenuta dalla fase (ii.b), è miscelata con la soluzione che comprende o, alternativamente, consiste di (a) e (b), e opzionalmente (c).
Tale soluzione (o soluzione di crioprotezione) è in grado di conferire alla biomassa concentrata, o alla biomassa lavata, o alla biomassa a pH regolato, o alla biomassa riconcentrata, una crioprotezione nel senso che la biomassa di batteri viene crioprotetta. Questo significa che le cellule del ceppo di batteri impiegato, contenute in detta biomassa di batteri, vengono crioprotette. La crioprotezione delle cellule comporta che i tessuti biologici (ad esempio la membrana cellulare) delle cellule del ceppo di batteri risultano protetti da possibili danni conseguenti a un congelamento nella fase di liofilizzazione (iv) della biomassa crioprotetta. A titolo di esempio, un danno alle cellule potrebbe comprendere una lacerazione o una lesione della membrana cellulare, accompagnata da un possibile aumento della permeabilità attraverso la membrana stessa.
In accordo con una forma di realizzazione, detta soluzione della fase (iii) è una soluzione acquosa, ad esempio di acqua distillata oppure bidistillata a temperatura ambiente di 20°C – 25°C.
In accordo con una forma di realizzazione, il sale del fosforo (a) è un sale pirofosfato.
In accordo con un’altra forma di realizzazione, almeno un sale del fosforo (a) è scelto dai composti di potassio fosfato (K3PO4), potassio mono-idrogeno fosfato (K2HPO4), potassio di-idrogeno fosfato (KH2PO4) e/o potassio pirofosfato (K4P2O7).
A titolo di esempio, un potassio mono-idrogeno fosfato utilizzabile in questa invenzione è in forma di cristalli di colore bianco e ha un titolo compreso da 90% a 100% in peso, preferibilmente compreso da 95% a 99% in peso, ancora più preferibilmente compreso da 97% a 99% in peso.
A titolo di esempio ulteriore, un potassio pirofosfato (CAS N. 7320-34-5) utilizzabile in questa invenzione è in forma di particelle, di polvere o di granuli e ha un titolo compreso da 90% a 100% in peso, preferibilmente compreso da 95% a 99% in peso, ancora più preferibilmente compreso da 96% a 98% in peso.
In accordo con una forma di realizzazione, gli ioni fosfato, gli ioni mono-idrogeno fosfato, gli ioni diidrogeno fosfato e/o gli ioni pirofosfato potrebbero essere presenti nella soluzione (considerando tale soluzione prima della propria miscelazione alla biomassa di batteri nella fase (iii)) in una quantità compresa da 6 a 27% P/V, laddove % P/V intende una percentuale in peso (ossia grammi) dei suddetti composti rispetto al volume totale della soluzione.
In accordo con una forma di realizzazione, la concentrazione del sale o dei sali del fosforo (a) nella soluzione utilizzata nella fase (iii) potrebbe essere compresa da 6 a 20 % P/V, preferibilmente compresa da 6 a 15 % P/V, ancora più preferibilmente compresa da 10 a 14 % P/V.
La sostanza poli-idrossi (b) è scelta dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di saccarosio, fruttosio, lattosio, lattitolo, trealosio o mannitolo, e loro miscele.
In accordo con una forma di realizzazione, il saccarosio potrebbe essere impiegato nel ruolo di sostanza poliidrossi. In accordo con una forma di realizzazione, il saccarosio potrebbe avere una concentrazione compresa da 25 % P/V a 45 % P/V, laddove % P/V intende una percentuale in peso (ossia grammi) del saccarosio rispetto al volume totale della soluzione di crioprotezione (considerando tale soluzione prima della propria miscelazione alla biomassa di batteri nella fase (iii)).
A titolo di esempio, un saccarosio utilizzabile come sostanza poli-idrossi (b) potrebbe essere in forma di cristalli di colore bianco e solubili in acqua. Preferibilmente, una percentuale in peso compresa da 85% a 100%, preferibilmente compresa da 90% a 95%, dei cristalli di saccarosio ha una distribuzione delle dimensioni particellari compresa da 0,05 a 0,50 millimetri, preferibilmente compresa da 0,1 a 0,35 millimetri.
Pertanto, secondo una forma di realizzazione, la soluzione utilizzata nella fase (iii) potrebbe comprendere un solvente (preferibilmente acqua), ioni pirofosfato e/o ioni fosfato, ioni mono-idrogeno fosfato, e/o ioni di-idrogeno fosfato, preferibilmente L-cisteina, e saccarosio.
In accordo con una forma di realizzazione, la L-cisteina nella soluzione utilizzata nella fase (iii) potrebbe essere presente in una quantità compresa da 0,5 grammi di L-cisteina a 5 grammi di L-cisteina per ogni litro di soluzione, preferibilmente compresa da 1 grammo a 4 grammi di L-cisteina per ogni litro di soluzione, ancora più preferibilmente compresa da 2 grammi a 3 grammi di L-cisteina per ogni litro di soluzione.
Nello specifico, la L-cisteina (CAS N. 52-90-4) funziona da sequestrante dell’ossigeno e pertanto, quando aggiunta nella soluzione, limita o impedisce la formazione di specie radicaliche dell’ossigeno (ROS; reactive oxygen species). Inoltre, la L-cisteina è caratterizzata da un basso peso molecolare, e pertanto può penetrare facilmente le membrane cellulari delle cellule di batteri, in tal modo aumentando la protezione dai danni derivanti dai radicali liberi dell’ossigeno, e migliorando l’integrità di struttura della membrana stessa.
A titolo di esempio, una L-cisteina utilizzabile nell’ambito della presente invenzione potrebbe essere monoidrata.
In accordo con una forma di realizzazione, una L-cisteina utilizzabile in questa invenzione è in forma di polvere cristallina e ha un titolo compreso da 90% a 100% in peso, preferibilmente compreso da 95% a 100%.
Secondo una forma di realizzazione, la soluzione utilizzata nella fase (iii) potrebbe comprendere ioni pirofosfato e saccarosio in un rapporto molare ioni pirofosfato:saccarosio compreso da circa 1:1,5 a circa 1:6, preferibilmente di 1:3.
Secondo una forma di realizzazione ulteriore, la soluzione utilizzata nella fase (iii) potrebbe comprendere ioni fosfato, mono-idrogeno fosfato, diidrogeno fosfato e saccarosio in un rapporto molare ioni fosfato, mono-idrogeno fosfato, di-idrogeno fosfato:saccarosio compreso da circa 1:0,75 a circa 1:3, preferibilmente 1:1,5.
Pertanto, secondo tale forma di realizzazione, la soluzione della fase (iii) potrebbe comprendere un solvente (preferibilmente acqua), ioni pirofosfato e/o ioni fosfato, mono-idrogeno fosfato, di-idrogeno fosfato, saccarosio, e preferibilmente L-cisteina.
Nella fase (iv) la biomassa crioprotetta ottenuta dalla fase (iii) viene liofilizzata per ottenere la biomassa liofilizzata.
L’espressione "liofilizzare" o "liofilizzazione" - salvo che non sia diversamente indicato - farà riferimento a una disidratazione controllata della biomassa crioprotetta preventivamente congelata, e si riferirà all'intero processo di liofilizzazione (congelamento, essicamento primario ed essicamento secondario).
L’Esempio 4 descrive un processo di liofilizzazione secondo una possibile forma di realizzazione di questa invenzione.
In accordo con una forma di realizzazione, la liofilizzazione della fase (iv) comprende, dopo la fase (iii), le seguenti fasi:
(iv.a) congelamento della biomassa crioprotetta ottenuta dalla fase (iii) per ottenere una biomassa congelata; (iv.b) sublimazione del ghiaccio (o essiccamento) della biomassa congelata ottenuta dalla fase (iv.a) a dare la biomassa liofilizzata.
Preferibilmente, la sublimazione della fase (iv.b) comprende una fase di essiccamento primario (iv.b.1) della biomassa congelata ottenuta dalla fase (iv.a), e un successivo essiccamento secondario (o desorbimento) (iv.b.2), sulla biomassa ottenuta dalla fase (iv.b.1), a dare la biomassa liofilizzata.
Nella fase di essiccamento primario (iv.b.1), la biomassa congelata ottenuta dalla fase (iv.a) è inizialmente sottoposta ad una pressione ridotta, in modo da sublimare una parte della soluzione congelata, a dare una biomassa a pressione ridotta e successivamente, nella fase di essiccamento secondario (iv.b.2), la biomassa a pressione ridotta viene riscaldata a dare la biomassa liofilizzata.
Preferibilmente, la fase di essiccamento secondario (iv.b.2) inizia quando è sublimato tutto il ghiaccio dalla biomassa a pressione ridotta nella precedente fase di essiccamento primario (iv.b.1).
Nella fase di essiccamento secondario (iv.b.2) viene desorbita la soluzione adsorbita sulla biomassa a pressione ridotta ottenuta dalla fase di essiccamento primario (iv.b.1), tramite un innalzamento della temperatura della biomassa a pressione ridotta.
In accordo con una forma di realizzazione, la fase di essiccamento secondario (iv.b.2) termina quando l’umidità della biomassa è compresa da 0,5% a 2,5% in peso, preferibilmente compresa da 0,75% a 2,0% in peso, più preferibilmente compresa da 0,9% a 1,5% in peso, ancora più preferibilmente compresa da 0,95% a 1,1% in peso della biomassa.
Secondo una forma di realizzazione, il procedimento può comprendere, oltre alle fasi (i), (ii), (iii) e (iv), una fase (v) successiva alla fase (iv).
Nella fase preferita (v) la biomassa liofilizzata ottenuta dalla fase (iv) viene frantumata a dare una biomassa frantumata.
Infatti, la biomassa liofilizzata ottenuta dalla fase (iv) è una massa compatta (cake) che deve essere frantumata, o macinata, o disgregata, al fine di ottenere la biomassa frantumata. Preferibilmente, la frantumazione della fase (v) viene eseguita tramite una rete o un setaccio.
Più precisamente, nella fase preferita (v) la massa compatta o cake ottenuta dalla fase (iv) viene forzata attraverso la suddetta rete oppure il suddetto setaccio al fine di frantumare, o macinare, o disgregare la massa compatta.
Una biomassa frantumata, ottenuta al termine della fase (v), è in forma di polvere o di granulo, ed è più facilmente gestibile e manipolabile rispetto alla biomassa liofilizzata della fase (iv). Ad esempio, tale migliorata manipolazione si può rivelare utile in successive operazioni di pesatura e/o di confezionamento.
Secondo una forma di realizzazione, il procedimento può comprendere, oltre alle fasi (i), (ii), (iii) e (iv), una fase (vi) successiva alla fase (v).
Nella fase preferita (vi), la biomassa frantumata ottenuta dalla fase (v) viene confezionata in un contenitore sterile, preferibilmente in assenza di umidità, a dare una biomassa confezionata.
In una forma di realizzazione, la biomassa confezionata ottenuta dalla fase (vi) è confezionata nel contenitore sterile in modo tale che la quantità di spazio di testa nel contenitore sterile (nello specifico, la quantità di aria tra la biomassa confezionata e la parte superiore del contenitore) sia molto ridotta. Preferibilmente, la quantità di spazio di testa è trascurabile (ossia, quasi nulla).
In accordo con una forma di realizzazione, la biomassa confezionata ha una concentrazione di cellule di batteri compresa da 1x10<8 >cellule/g a 1x10<11 >cellule/g, preferibilmente una concentrazione compresa da 1x10<9 >cellule/g a 1x10<10 >cellule/g, per ogni grammo di biomassa confezionata ottenuta al termine della fase (vi).
Secondo una forma di realizzazione, il procedimento può comprendere, oltre alle fasi (i), (ii), (iii) e (iv), una fase (vii) successiva alla fase (vi).
Nella fase preferita (vii), la biomassa confezionata ottenuta dalla fase (vi) viene ricostituita con acqua dopo un tempo predefinito, a dare una biomassa ricostituita.
In merito al tempo predefinito della fase (vii), tale tempo è preferibilmente compreso da 1 minuto a 10 anni, preferibilmente compreso da 1 giorno a 5 anni, più preferibilmente compreso da 4 mesi oppure da 12 mesi a 48 mesi, ancora più preferibilmente da 18 mesi a 32 mesi, ulteriormente, preferibilmente da 24 mesi a 30 mesi, anche in condizioni di zona IV.A e zona IV.B.
In accordo con una forma di realizzazione, la ricostituzione della fase (vii) prevede una riaddizione di un volume di acqua alla biomassa confezionata ottenuta dalla fase (vi), tipicamente, ma non necessariamente, equivalente al volume ridotto durante la liofilizzazione della fase (iv).
In accordo con diverse forme di realizzazione, l’acqua utilizzata nella fase (vii) è selezionata dal gruppo comprendente oppure, alternativamente, consistente di acqua pura, soluzione fisiologica, o soluzione tampone.
In accordo con una forma di realizzazione, la biomassa liofilizzata confezionata ottenuta dalla fase (vi) potrebbe essere ricostituita (idratata) nella fase (vii) come soluzione acquosa, preferibilmente tramite una soluzione acquosa isotonica, ancora più preferibilmente ad un valore di pH sostanzialmente neutro o comunque compreso da 6.0 a 7.0. Tale valore di pH compreso da 6.0 a 7.0 è particolarmente preferito per una biomassa confezionata ottenuta dalla fase (vi) in cui le cellule di batteri sono cellule nude, vale a dire prive di un rivestimento esterno.
In accordo con una forma di realizzazione, la biomassa liofilizzata confezionata ottenuta dalla fase (vi) potrebbe essere ricostituita (idratata) nella fase (vii) come soluzione acquosa di una soluzione tampone borato a pH 8,4. Tale valore di pH 8,4 è particolarmente preferito per una biomassa confezionata ottenuta dalla fase (vi) in cui le cellule di batteri sono cellule micro-incapsulate, preferibilmente in una matrice lipidica oppure in una matrice glicoproteica.
Secondo una forma di realizzazione, nella ricostituzione della fase (vii), la biomassa confezionata ottenuta dalla fase (vi) è diluita sino ad ottenere una concentrazione di cellule di batteri nella biomassa ricostituita compresa da 10<5 >a 10<7 >cellule/ml, preferibilmente circa 10<6 >cellule/ml.
A tal proposito, la concentrazione di cellule di batteri nella biomassa ricostituita compresa da 10<5 >a 10<7 >cellule/ml, preferibilmente circa 10<6 >cellule/ml, è preferibilmente ottenuta tramite diluizioni successive con acqua.
Secondo una forma di realizzazione, il procedimento può comprendere, oltre alle fasi (i), (ii), (iii) e (iv), fasi preferite di:
(viii) mettere a contatto la biomassa fermentata ottenuta dalla fase (i), la biomassa concentrata ottenuta dalla fase (ii), la biomassa crioprotetta ottenuta dalla fase (iii), e la biomassa liofilizzata ottenuta dalla fase (iv) con due diversi coloranti fluorescenti, in modo da ottenere una biomassa fermentata fluorescente, una biomassa concentrata fluorescente, una biomassa crioprotetta fluorescente e una biomassa liofilizzata fluorescente (complessivamente indicate con l’espressione “biomasse fluorescenti”);
(ix) successivamente alla fase (viii), tramite citofluorimetria a flusso, rilevare una quantità di cellule di batteri con membrane cellulari integre (e pertanto vitali) nella biomassa fermentata fluorescente, nella biomassa concentrata fluorescente, nella biomassa crioprotetta fluorescente e nella biomassa liofilizzata fluorescente.
Pertanto, il procedimento secondo questa forma di realizzazione, in cui viene effettuata una rilevazione citofluorimetrica delle biomasse fluorescenti nelle diverse fasi di preparazione della biomassa liofilizzata, consente di monitorare (e quindi intervenire/regolare in maniera migliorativa) i parametri che governano la fase (i), la fase (ii), la fase (iii) e la fase (iv).
In accordo con una forma di realizzazione, nella fase di rilevazione della fase (ix) e in accordo al metodo sancito dalla norma ISO 19344:2015(E), un primo colorante permeabile attraverso le membrane cellulari (preferibilmente: arancio di tiazolo oppure, alternativamente, SYTO® 24 - un colorante fluorescente nello spettro del verde) è in grado di penetrare in tutte le cellule di batteri, fornendo le unità o cellule fluorescenti totali (TFU; total fluorescent units) delle biomasse fluorescenti. Un secondo colorante (preferibilmente: propidio ioduro) è in grado di penetrare solamente nelle cellule di batteri con una membrana cellulare danneggiata, fornendo le unità o cellule di batteri fluorescenti non attive o non vitali (nAFU= non active fluorescent unit) delle biomasse fluorescenti.
Secondo una forma di realizzazione particolarmente preferita, la quantità di cellule di batteri vitali, con membrane cellulari integre, può essere espressa come unità o cellule fluorescenti attive (AFU; active fluorescent units), ossia le unità che risultano positive solo al primo colorante nell’analisi in fluorescenza (preferibilmente: arancio di tiazolo oppure, alternativamente, SYTO® 24), per le quali vale la seguente correlazione:
TFU = AFU nAFU
dove:
- TFU sono le unità o cellule di batteri fluorescenti totali;
- nAFU sono le unità o cellule di batteri fluorescenti non attive, con una membrana cellulare non integra o danneggiata (ossia le unità che risultano positive al secondo colorante, preferibilmente ioduro di propidio).
In accordo con una forma di realizzazione, il citofluorimetro a flusso della fase (ix) è configurato e/o calibrato per effettuare una determinazione volumetrica delle biomasse fluorescenti analizzate, e per calcolare direttamente la concentrazione cellulare (AFU e TFU).
Secondo un’altra forma di realizzazione, per ricavare i valori di AFU e di TFU nelle biomasse fluorescenti, il citofluorimetro a flusso della fase (ix) utilizza almeno uno standard interno fluorescente aggiunto alle biomasse fluorescenti.
In accordo con una forma di realizzazione, lo standard interno fluorescente è in forma di sfera o di biglia fluorescente ed è aggiunto a ciascuna biomassa fluorescente da analizzare in concentrazione nota. Il valore di AFU e di TFU nella biomassa fluorescente analizzata potrà quindi essere calcolato in proporzione rispetto alle quantità note.
Secondo una forma di realizzazione ulteriore, la soluzione o soluzione di crioprotezione è priva di polimeri aventi peso molecolare tra circa 5.000 u a circa 80.000 u, e/o gli ioni fosfato eventualmente presenti nella soluzione miscelata alla biomassa concentrata della fase (ii) non sono parte di una soluzione tampone.
I predetti obiettivi sono raggiunti tramite una biomassa liofilizzata ottenuta tramite il procedimento secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione discusse in precedenza.
Secondo una forma di realizzazione, tale biomassa liofilizzata è in forma solida, preferibilmente in forma di granulo o di polvere.
I predetti obiettivi sono infine raggiunti tramite una composizione farmaceutica, o una composizione per dispositivo medico, o una composizione per uso cosmetico, o una composizione per integratore alimentare o una composizione per un prodotto alimentare o una composizione per un alimento a fini medici speciali – AFMS comprendenti, dette composizioni, la biomassa liofilizzata secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione discusse in precedenza.
In accordo a una forma di realizzazione, le composizioni della presente invenzione comprendono oppure, alternativamente, consistono di un Live Biotherapeutic Product (LBP), con tale espressione intendendosi una composizione biologica che contiene cellule di batteri (in particolare vitali) ed almeno un farmaco o principio attivo, applicabile per il trattamento, per la prevenzione o per la cura di un disturbo, di una malattia o di una condizione, e che non comprende né consiste in un vaccino immunogeno-specifico.
Qui di seguito la presente invenzione sarà illustrata in base ad alcuni esempi, forniti a solo titolo esemplificativo e non limitativo.
ESEMPI.
Esempio 1: Preparazione di una soluzione o soluzione di crioprotezione utilizzabile nella fase (iii).
In un contenitore di volume opportuno si versano, in un litro di acqua, le seguenti materie prime, nei rapporti indicati:
- saccarosio: 400 g/l;
- sodio citrato: 50 g/l;
- mono-idrogeno fosfato di potassio: 135 g/l
- L-cisteina: 2,5 g/l.
Un saccarosio utilizzabile in questa invenzione è il prodotto SACCAROSIO RFF EP, cod. 649400, prodotto da Suedzucker AG, commercializzato da Giusto Faravelli S.p.A. (www.faravelli.it).
Un sodio citrato utilizzabile in questa invenzione è in forma di cristalli solubili in acqua. Preferibilmente, una percentuale in peso compresa da 85% a 100%, preferibilmente compresa da 90% a 95%, dei cristalli di sodio citrato ha una distribuzione delle dimensioni particellari compresa da 149 micrometri a 595 micrometri.
A titolo di esempio, un sodio citrato utilizzabile in questa invenzione è il prodotto SODIO CITRATO TRIB.2H2O CRIST.FINI E331-BP-USP/NF-EP, cod. 674500, prodotto da S.A. Citrique Belge N.V., commercializzato da Giusto Faravelli S.p.A. (www.faravelli.it).
Un mono-idrogeno fosfato di potassio utilizzabile in questa invenzione è il prodotto POTASSIO FOSFATO BIB.ANIDRO E340, cod. 593500, commercializzato da Giusto Faravelli S.p.A. (www.faravelli.it).
Una L-cisteina utilizzabile in questa invenzione è il prodotto L-CISTEINA HCL MONOIDRATA da fermen, cod.
285400, commercializzato da Giusto Faravelli S.p.A. (www.faravelli.it).
La soluzione così ottenuta viene agitata fino a completa dissoluzione delle materie prime.
In una fase successiva, tale soluzione viene sterilizzata, in particolare per via termica. Più precisamente, tale soluzione viene riscaldata (pastorizzata) ad una temperatura di circa 90°C, e mantenuta a tale temperatura per circa 30-35 minuti.
Dopodiché, la soluzione viene raffreddata fino ad una temperatura di circa 6°C - 8°C ed è in tal modo pronta all’uso.
Durante il raffreddamento è possibile insufflare la soluzione con azoto gassoso per allontanare l’ossigeno disciolto e migliorare quindi la compatibilità della soluzione di crioprotezione nei confronti di microrganismi strettamente anaerobi.
Esempio 2: Preparazione di un’altra soluzione di crioprotezione utilizzabile nella fase (iii).
Si procede come nell’Esempio 1, utilizzando circa 128 g/l di pirofosfato alcalino, preferibilmente pirofosfato di potassio (CAS N. 7320-34-5), al posto del monoidrogeno fosfato di potassio, il solvente e le altre materie prime essendo immutate anche nei rapporti.
Un pirofosfato di potassio utilizzabile in questa invenzione è il prodotto “Potassium pyrophospate 97%”, numero prodotto 322431, commercializzato da SigmaAldrich (Saint Louis, MO 63103, Stati Uniti; sigmaaldrich.com).
Esempio 3: Preparazione di una biomassa fermentata secondo la fase (i) e di una biomassa concentrata secondo la fase (ii).
A partire da una coltura di cellule di batteri vitali (fattispecie di biomassa di batteri) contenente un ceppo di Lactobaccillus rhamnosus GG (ATCC 53103), si effettua una fermentazione in opportuno substrato (o brodo) di fermentazione, per circa 16-18 ore.
A titolo indicativo, una coltura attiva del ceppo suddetto viene inoculata in ragione del 2–4% V/V (percentuale in volume della coltura rispetto al volume del substrato), preferibilmente del 3%; nel substrato di fermentazione costituito da destrosio, peptone vegetale ed estratto di lievito nei quantitativi precedentemente indicati, più sali di manganese e tensioattivo. La coltura è incubata a 31°C–33°C per circa 16 ore, mantenendo costante il pH compreso tra 5,45 e 6,0 preferibilmente compreso tra 5,80 e 5,90.
Al termine della fase (i) di fermentazione, si procede con una prima concentrazione (fase (ii)) della biomassa fermentata, nello specifico centrifugando il brodo di fermentazione di cui sopra, e separando la fase acquosa dalla fase solida o cellulare.
I microrganismi contenuti nella fase solida possono quindi essere lavati (fase (ii.a)), utilizzando acqua sterile (preferibilmente bi-distillata) in un rapporto 4:1 rispetto al peso della biomassa di batteri.
Attraverso una seconda centrifugazione della biomassa di batteri miscelata all’acqua sterile nel suddetto rapporto, si provvede quindi a concentrare nuovamente la biomassa lavata (fase ii.b)), con un fattore di concentrazione in volume (FCV) complessivo compreso da circa 10 a 30 volte, preferibilmente di circa 20 volte. Ciò significa che il volume finale viene ridotto di circa 10-30 volte, preferibilmente circa 20 volte, rispetto al volume iniziale, a parità di cellule di batteri contenute.
Si ottiene quindi una biomassa lavata e riconcentrata. Si provvede a regolare il valore di pH (fase (ii.c)) della biomassa lavata e riconcentrata, attraverso un’aggiunta di una base debole, di preferenza inorganica (preferibilmente NH4OH), fino ad un pH di circa 6,2±0.1, in modo da ottenere una biomassa a pH regolato.
Un idrossido di ammonio utilizzabile in questa invenzione è il prodotto IDRATO DI AMMONIO, commercializzato da F.lli Bonafede S.a.s. (21013 Gallarate (VA), Italia).
Esempio 4: Fase di miscelazione – fase (iii), e fase di liofilizzazione – fase (iv).
Alla biomassa a pH regolato dell’Esempio 3, si aggiunge poi la soluzione di crioprotezione dell’Esempio 1 (oppure dell’Esempio 2), in tal modo ottenendo la biomassa crioprotetta (BC) come prodotto della fase (iii).
Il rapporto tra il peso della biomassa a pH 6,6 ed il volume della soluzione di crioprotezione potrebbe essere compreso da circa 80:20 a 75:25, dopodiché si procede alla liofilizzazione. Ciò significa miscelare la soluzione di crioprotezione dell’Esempio 1 (oppure dell’Esempio 2) in ragione del 20% calcolato sul volume della miscela finale complessiva, o preferibilmente in ragione del 25% sempre calcolato sul volume della miscela finale complessiva denominata biomassa crioprotetta (BC).
La BC viene quindi caricata ossia collocata in un liofilizzatore e sottoposta ad un processo di congelamento-essicamento denominato “freeze-drying” (liofilizzazione).
A tale scopo la temperatura della biomassa crioprotetta viene abbassata in modo progressivo al fine di favorire un congelamento completo della biomassa crioprotetta (fase (iv.a)) a dare una biomassa congelata. Nello specifico il prodotto viene raffreddato sino alla temperatura compresa da -40°C a -45°C raggiunta progressivamente (circa 1°C/4 min), in un tempo di circa 2 ore, ed è quindi mantenuto in congelamento alla suddetta temperatura per circa 2–4 ore.
A seguito di tale congelamento completo (iv.a), si provvede a ridurre la pressione della camera fino ad un valore di circa 5.00E-02 – 5.00E-03 mbar, preferibilmente 1.00E-03 mbar (fase (iv.b.1)).
Mantenendo questo valore di pressione, si provvede quindi ad innalzare nuovamente la temperatura (fase (iv.b.2)) al fine di provocare una sublimazione della soluzione di crioprotezione. Il fenomeno di sublimazione è dovuto fondamentalmente alla circostanza che, al di sotto del punto triplo del diagramma di stato di tale miscela, la soluzione solidificata per congelamento può modificare il proprio stato di aggregazione solamente in fase gas, senza liquefare.
Ad esempio, la rampa di riscaldamento applicabile al prodotto prevede che esso venga progressivamente portato da -45°C ad una temperatura compresa da -20°C a -10°C in circa 8 – 10 ore, ad esempio aumentando la temperatura con step di 5°C, quindi mantenuto alla temperatura di circa -10°C per altre 4–8 ore. Seguono almeno altre due fasi di riscaldamento prima a 0°C e mantenimento di questa temperatura per circa 4 ore, e poi sino a circa 15°C mantenuti per altre 4 ore circa. Il prodotto è quindi portato alla temperatura finale di circa 25°-30°C ad una velocità di 0,5°C/min, e mantenuto a detta temperatura finale per circa 8 ore – 12 ore.
Il processo di liofilizzazione (fase (iv)) dura generalmente 2-3 giorni, a seconda del ceppo coinvolto. Nel presente caso del Lactobaccillus rhamnosus GG (ATCC 53103), il processo di liofilizzazione è durato circa 60-72 ore.
La biomassa liofilizzata così ottenuta può essere conservata, preferibilmente dopo opportuna frantumazione/macinazione (fase (v)) del prodotto (cake) ottenuto al termine della liofilizzazione, tale conservazione potendo eventualmente essere effettuata a seguito di una fase di confezionamento (fase (vi)) in unità o dosi così come di seguito indicato all’Esempio 6.
Esempio 5: Analisi della biomassa liofilizzata.
Si è quindi provveduto ad analizzare i campioni ottenuti a seguito del procedimento illustrato nell’Esempio 4.
Nella seguente Tabella 1, nelle colonne da sinistra a destra, sono riportati i tipi di analisi condotte, i requisiti o valori ottenuti nelle analisi, ed i metodi applicati per testare le grandezze o i valori:
Tabella 1.
*<1 >FCM = citofluorimetria a flusso;
*<2 >Ph. Eur. = Farmacopea Europea;
*<3 >CFU = unità formanti colonia;
*<4 >AFU = unità fluorescenti attive;
*<5 >Met. Int. = metodo interno.
Si precisa che tutte le norme su indicate si intendono nella versione valida alla data di priorità di questa domanda di brevetto.
Esempio 6: Analisi della durata di conservazione.
Il prodotto dell’Esempio 5 è stato conservato all’interno di un packaging primario in carta e alluminio con le seguenti stratificazioni, dall’esterno del pacchetto verso l’interno: uno strato di carta (40 g/m<2>), due strati di alluminio ciascuno con uno spessore di 9 µm, ed uno strato di polietilene (spessore: 35 µm) direttamente in contatto con la composizione.
Come packaging secondario, accogliente il packaging primario, si è usata una scatola in cartone.
I parametri riportati nelle seguenti tabelle A), B), C) sono stati utilizzati nei test contraddistinti con A), B), C) per i periodi di tempo indicati (espressi in mesi), simulando le condizioni delle seguenti zone climatiche (secondo la linea guida WHO Technical report series N° 953, 2009, Annex 2, Appendix 1, Tavola 1, pag.
117):
A) ZONA II (clima subtropicale e mediterraneo) – Condizioni di stoccaggio a lungo termine: 25°C / 60±5% di umidità relativa (RH); durata del test: 30 mesi;
B) ZONA IV.B (clima caldo e molto umido) - Condizioni di stoccaggio a lungo termine: 30°C / 75±5% RH; durata del test: 30 mesi.
Si è inoltre condotta un’indagine accelerata, nelle condizioni estreme seguenti:
C) 40°C / 75±5% RH; durata del test: 6 mesi.
Tabella A): 25°C/60% RH.
I precedenti dati sperimentali di conta (CFU e AFU) sono riportati in forma di diagramma in figura 1.
Tabella B): 30°C/75% RH.
I precedenti dati sperimentali di conta (CFU e AFU) sono riportati in forma di diagramma in figura 2.
Nella figura 4 si riportano invece le velocità di decadimento (k) CFU e AFU come valori di pendenza delle rette di interpolazione dei dati sperimentali nel modello lineare di Arrhenius, come discusso oltre.
Tabella C): 40°C/75% RH.
I precedenti dati sperimentali di conta (CFU e AFU) sono riportati in forma di diagramma in figura 3.
Dai risultati sperimentali che precedono si può osservare come i dati relativi ai parametri chimicofisici e microbiologici (aspetto, aw, TAMC, TYMC, Batteri gram-negativi bile tolleranti, Escherichia coli, Staphyloccocus aureus e Salmonella spp.) si sono sempre rivelati conformi alle norme applicabili in tutte le condizioni applicate, anche quelle più estreme.
Inoltre è importante osservare il valore relativo alle unità fluorescenti attive (AFU) che – lo ricordiamo – è l’indice che definisce il numero di cellule di batteri con la membrana cellulare integra, e quindi ancora vitali.
Secondo gli ideatori della presente invenzione, i valori AFU sono di importanza estrema per comprendere a fondo la vitalità e funzionalità delle cellule di batteri analizzate, in quanto il valore CFU potrebbe essere falsato dalla presenza di cellule vitali non coltivabili (VBNC; viable but not culturable).
Infatti, il valore CFU non rende conto di cellule dormienti o che non generano colonie, ma che comunque manifestano un’attività metabolica oppure che – in condizioni ambientali opportune (ad esempio a contatto con il sistema enterico) – potrebbero recuperare da danni subletali.
Inoltre, le cellule integre (AFU), di cui le coltivabili (CFU) rappresentano un sottogruppo, possono essere intense come pacchetti di unità funzionali rappresentati dal genoma batterico; e che pertanto il monitoraggio di una popolazione batterica in termini di integrità di membrana supera il vincolo della coltivabilità e della funzionalità della cellula intesa solo come capacità di replicarsi ed eventualmente colonizzare, ma anche come vettore di informazione genetico. Tale approccio apre pertanto a un potenziale applicativo ancora inesplorato poiché, grazie alla capacità della cellula batterica di trasmettere informazione genetica per via orizzontale, è possibile integrare il microbioma intestinale con nuove informazioni trasportate dalla cellula integra (AFU). Per quanto attiene al modello Arrhenius menzionato in precedenza, tale modello è stato costruito per valutare l’influenza della temperatura sulla stabilità – a titolo di esempio - del Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53103).
La microbiologia predittiva descrive la perdita esponenziale della vitalità batterica nel tempo, seguendo un abbassamento di primo ordine, come indicato dalla rappresentazione del logaritmo naturale LN (Nt / N0) rispetto al tempo (t) come indicato nella seguente equazione:
in cui:
- Nt = conteggio batterico al tempo t;
- N0 = conteggio batterico al tempo zero;
- k = velocità di decadimento.
Dalla precedente equazione si rende quindi possibile calcolare il tempo di riduzione decimale (D1), che è definito come il tempo necessario affinché la concentrazione delle cellule di batteri vitali raggiunga un decimo della quantità iniziale. Ad esempio, il valore D1 mostrato nelle seguenti tabelle illustra i valori del tempo di riduzione decimale espresso in mesi, calcolato secondo l’equazione:
D1 = ln10/k
La velocità di decadimento (k) può essere determinata per qualsiasi temperatura, sulla base della pendenza di ciascuna retta di interpolazione.
In riferimento alla figura 4, i dati relativi alla velocità di decadimento sono mostrati nella seguente tabella D) per i valori CFU e nella tabella E) per i valori di AFU.
Tabella D): velocità di decadimento CFU (plate count).
Nella precedente tabella si riportano anche i calcoli relativi al test A) e al test C), benché tali dati non siano riportati in un diagramma come quello di figura 4 per il test B).
Tabella E): velocità di decadimento AFU (citofluorimetria a flusso).
Nella precedente tabella si riportano anche i calcoli relativi al test A) e al test C), benché tali dati non siano riportati in un diagramma come quello di figura 4 per il test B).
I tempi di riduzione decimale D1 esplicitati in tabella E) mostrano tempi di riduzione decimale delle cellule di batteri sorprendenti, che arrivano a più di 21 mesi nelle condizioni di conservazione più drastiche. Ne consegue che la stabilità della presente composizione è assicurata anche in periodi estivi, e in condizioni di aumento non controllato della climatizzazione.
È altresì importante notare come il parametro AFU consenta di ottenere una fedele fotografia della vitalità reale dei microrganismi, in virtù dell’integrità della membrana cellulare di questi e nonostante l’eventuale presenza di cellule vitali non coltivabili(VBNC).
Esempio 7: Individuazione analitica degli ioni pirofosfato.
Sono state condotte delle prove al fine di individuare gli ioni pirofosfato nella soluzione di crioprotezione, eseguita seguendo le indicazioni dei saggi riportati in Farmacopea Europea.
In particolare, a 5 ml di una soluzione contenente pirofosfato, neutralizzata se necessario, si addizionano 5 ml di una soluzione di nitrato di argento. Come conseguenza si forma un precipitato bianco.
Si è provveduto a ripetere la prova, in presenza delle cellule di batteri vitali liofilizzate e a seguito di una loro ricostituzione con acqua.
Da tale analisi è emerso che le cellule di batteri vitali non hanno effetti mascheranti nell’individuazione degli ioni pirofosfato.
Innovativamente, la presente invenzione consente di raggiungere gli obiettivi prefissati.
Più precisamente, la presente invenzione fornisce un procedimento in grado di liofilizzare cellule di batteri vitali in presenza di un crioprotettore, danneggiando una quantità esigua di membrane cellulari dei microorganismi.
Vantaggiosamente, la presente invenzione fornisce un protocollo analitico in grado di distinguere in modo affidabile le cellule di batteri vitali, pur non coltivabili, all’interno delle cellule di batteri totali presenti.
Alle forme di realizzazione del procedimento, delle composizioni e del prodotto suddetti, un tecnico del ramo potrà apportare sostituzioni o modifiche alle caratteristiche descritte a seconda delle contingenze. Anche tali forme di realizzazione sono da ritenersi ricomprese nell’ambito di tutela formalizzato nelle seguenti rivendicazioni.
Inoltre, si precisa che qualsiasi forma di realizzazione potrà essere implementata in modo indipendente dalle altre forme di realizzazione descritte.
Claims (13)
- RIVENDICAZIONI 1. Un procedimento per la preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate, comprendente le seguenti fasi: (i) fermentare una biomassa di cellule di batteri (biomassa di batteri) precedentemente preparata comprendente almeno un ceppo di cellule di batteri per ottenere una biomassa di cellule di batteri fermentata (biomassa fermentata); (ii) concentrare la biomassa fermentata ottenuta dalla fase (i) fino ad ottenere una biomassa di cellule di batteri concentrata (biomassa concentrata) avente una 6 concentrazione di cellule di batteri compresa da 1x10 12 cellule/ml di biomassa liquida a 1x10 cellule/ml di biomassa liquida; (iii) miscelare la biomassa concentrata ottenuta dalla fase (ii) con una soluzione che comprende o, alternativamente, consiste di: (a) almeno un sale del fosforo scelto dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di un sale dello ione fosfato o acido fosforico, un sale dello ione fosfito o acido fosforoso, un sale dello ione mono-idrogeno fosfato, un sale dello ione di-idrogeno fosfato, un sale dello ione pirofosfato o acido pirofosforico, e loro miscele, e (b) almeno una sostanza poli-idrossi scelta dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di saccarosio, fruttosio, lattosio, lattitolo, trealosio o mannitolo, e loro miscele per ottenere una biomassa di cellule di batteri crioprotette (biomassa crioprotetta); (iv) liofilizzare la biomassa crioprotetta ottenuta dalla fase (iii) per ottenere una biomassa di cellule di batteri liofilizzate (biomassa liofilizzata).
- 2. Il procedimento secondo la rivendicazione 1, comprendente, prima della fase (iii): (ii.a) lavare la biomassa concentrata ottenuta dalla fase (ii) a dare una biomassa lavata; (ii.b) riconcentrare la biomassa lavata ottenuta dalla fase (ii.a) a dare una biomassa riconcentrata; (ii.c) regolare un valore di pH della biomassa riconcentrata ottenuta dalla fase (ii.b), ad un valore di pH compreso da 5±0,1 a 7±0,1, a dare una biomassa a pH regolato.
- 3. Il procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la biomassa concentrata della fase (ii) è miscelata con una soluzione che comprende o, alternativamente, consiste dell’almeno un sale del fosforo (a), dell’almeno una sostanza poli-idrossi (b) e (c) L-cisteina.
- 4. Il procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la biomassa liofilizzata della fase (iv) ha una concentrazione di cellule di batteri compresa da cellule/g acellule/g, preferibilmente una concentrazione compresa da cellule/g a cellule/g, ancora più preferibilmente una concentrazione compresa dacellule/g a cellule/g, più preferibilmente ancora una concentrazione compresa da cellule/g acellule/g, per ogni grammo di biomassa liofilizzata ottenuta dalla fase (iv).
- 5. Il procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la liofilizzazione della fase (iv) comprende, dopo la fase (iii), le seguenti fasi: (iv.a) congelamento della biomassa crioprotetta ottenuta dalla fase (iii) per ottenere una biomassa congelata; (iv.b) sublimazione del ghiaccio della biomassa congelata ottenuta dalla fase (iv.a) a dare la biomassa liofilizzata.
- 6. Il procedimento secondo la rivendicazione precedente, in cui la sublimazione della fase (iv.b) comprende: (iv.b.1) una fase di essiccamento primario della biomassa congelata ottenuta dalla fase (iv.a), e (iv.b.2) un successivo essiccamento secondario o desorbimento, sulla biomassa ottenuta dalla fase (iv.b.1), a dare la biomassa liofilizzata.
- 7. Il procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, comprendente, oltre alle fasi (i), (ii), (iii) e (iv), fasi preferite di: (viii) mettere a contatto la biomassa fermentata ottenuta dalla fase (i), la biomassa concentrata ottenuta dalla fase (ii), la biomassa crioprotetta ottenuta dalla fase (iii), e/o la biomassa liofilizzata ottenuta dalla fase (iv) con due diversi coloranti fluorescenti, in modo da ottenere una biomassa fermentata fluorescente, una biomassa concentrata fluorescente, una biomassa crioprotetta fluorescente e/o una biomassa liofilizzata fluorescente; (ix) successivamente alla fase (viii), tramite citofluorimetria a flusso, rilevare una quantità di cellule di batteri con membrane cellulari integre nella biomassa fermentata fluorescente, nella biomassa concentrata fluorescente, nella biomassa crioprotetta fluorescente e/o nella biomassa liofilizzata fluorescente.
- 8. Il procedimento secondo la rivendicazione precedente, in cui detta quantità è espressa come unità o cellule fluorescenti attive (AFU; active fluorescent units) per le quali vale la seguente correlazione: TFU = AFU nAFU in cui: - TFU (total fluorescent units) sono le unità o cellule batteriche fluorescenti totali; - nAFU (non active fluorescent units) sono le unità o cellule batteriche fluorescenti non vitali, con una membrana cellulare danneggiata.
- 9. Il procedimento secondo la rivendicazione 7 o 8, in cui detta quantità di cellule di batteri con membrane cellulari integre è utilizzata per monitorare i parametri di processo che governano la fase (i), la fase (ii), la fase (iii) e/o la fase (iv).
- 10. Il procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, comprendente, oltre alle fasi (i), (ii), (iii) e (iv), una fase (v) successiva alla fase (iv) in cui la biomassa liofilizzata ottenuta dalla fase (iv) viene frantumata a dare una biomassa frantumata.
- 11. Una biomassa di cellule di batteri liofilizzate ottenuta tramite il procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti.
- 12. La biomassa secondo la rivendicazione precedente, caratterizzata per il fatto di essere in forma solida, preferibilmente in forma di granulo o di polvere.
- 13. Una composizione farmaceutica, o composizione per dispositivo medico, o una composizione per uso cosmetico, o composizione per integratore alimentare o composizione per un prodotto alimentare o composizione per un alimento a fini medici speciali (AFMS) comprendente, la biomassa di cellule di batteri liofilizzate secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 11-12.
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT102019000006056A IT201900006056A1 (it) | 2019-04-18 | 2019-04-18 | Procedimento per la preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate stabili e determinazione della loro stabilità mediante un metodo citofluorimetrico |
| KR1020217037689A KR20220007617A (ko) | 2019-04-18 | 2020-04-20 | 안정한 동결-건조된 박테리아 세포의 바이오매스의 제조 방법 및 세포 형광 측정법에 의한 안정성 측정 방법 |
| PCT/IB2020/053732 WO2020212961A1 (en) | 2019-04-18 | 2020-04-20 | Method for preparing a biomass of stable freeze-dried bacterial cells and determining the stability thereof by means of a cytofluorometry metho |
| CA3136174A CA3136174A1 (en) | 2019-04-18 | 2020-04-20 | Method for preparing a biomass of stable freeze-dried bacterial cells and determining the stability thereof by means of a cytofluorometry method |
| JP2021561632A JP2022529449A (ja) | 2019-04-18 | 2020-04-20 | 安定な凍結乾燥した細菌細胞のバイオマスを製造し、サイトフルオロメトリー法によってその安定性を決定するための方法 |
| US17/604,345 US20220195378A1 (en) | 2019-04-18 | 2020-04-20 | Method for preparing a biomass of stable freeze-dried bacterial cells and determining the stability thereof by means of a cytofluorometry method |
| EP20727702.1A EP3956434A1 (en) | 2019-04-18 | 2020-04-20 | Method for preparing a biomass of stable freeze-dried bacterial cells and determining the stability thereof by means of a cytofluorometry method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT102019000006056A IT201900006056A1 (it) | 2019-04-18 | 2019-04-18 | Procedimento per la preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate stabili e determinazione della loro stabilità mediante un metodo citofluorimetrico |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| IT201900006056A1 true IT201900006056A1 (it) | 2020-10-18 |
Family
ID=67660632
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT102019000006056A IT201900006056A1 (it) | 2019-04-18 | 2019-04-18 | Procedimento per la preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate stabili e determinazione della loro stabilità mediante un metodo citofluorimetrico |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220195378A1 (it) |
| EP (1) | EP3956434A1 (it) |
| JP (1) | JP2022529449A (it) |
| KR (1) | KR20220007617A (it) |
| CA (1) | CA3136174A1 (it) |
| IT (1) | IT201900006056A1 (it) |
| WO (1) | WO2020212961A1 (it) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG11201906748PA (en) | 2017-01-31 | 2019-08-27 | Univ Kansas State | Microbial cells, methods of producing the same, and uses thereof |
| US11814617B2 (en) | 2017-10-20 | 2023-11-14 | Kansas State University Research Foundation | Methods of producing ensiled plant materials using Megasphaera elsdenii |
| JP2024516110A (ja) * | 2021-04-08 | 2024-04-12 | エヴェロ バイオサイエンシズ，インコーポレーテッド | 細菌を含有する医薬組成物 |
| CN114236111B (zh) * | 2021-12-29 | 2024-03-08 | 江苏汇先医药技术有限公司 | 一种生物分子或细胞富集筛网的冻干保护方法及冻干保护液 |
| CN115044473B (zh) * | 2022-05-07 | 2024-07-02 | 北京航空航天大学 | 一种电化学活性细菌冻干粉制备工艺及即时检测水质生物毒性的方法 |
| CN115677039A (zh) * | 2022-11-03 | 2023-02-03 | 重庆大学 | 一种保持好氧颗粒污泥性能及结构稳定性的储存方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040043374A1 (en) * | 2000-07-26 | 2004-03-04 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Preservation and storage medium for biological materials |
| WO2014082050A1 (en) * | 2012-11-23 | 2014-05-30 | Seres Health, Inc. | Synergistic bacterial compositions and methods of production and use thereof |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1119154C (zh) * | 1998-01-20 | 2003-08-27 | 上海信谊药业有限公司 | 双歧三联活菌制剂及制备方法 |
| CN1623408A (zh) * | 2003-12-02 | 2005-06-08 | 北京三元食品股份有限公司 | 一种优化的乳酸菌和益生菌冷冻保护剂组合物 |
-
2019
- 2019-04-18 IT IT102019000006056A patent/IT201900006056A1/it unknown
-
2020
- 2020-04-20 CA CA3136174A patent/CA3136174A1/en active Pending
- 2020-04-20 WO PCT/IB2020/053732 patent/WO2020212961A1/en unknown
- 2020-04-20 EP EP20727702.1A patent/EP3956434A1/en active Pending
- 2020-04-20 JP JP2021561632A patent/JP2022529449A/ja active Pending
- 2020-04-20 US US17/604,345 patent/US20220195378A1/en active Pending
- 2020-04-20 KR KR1020217037689A patent/KR20220007617A/ko unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040043374A1 (en) * | 2000-07-26 | 2004-03-04 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Preservation and storage medium for biological materials |
| WO2014082050A1 (en) * | 2012-11-23 | 2014-05-30 | Seres Health, Inc. | Synergistic bacterial compositions and methods of production and use thereof |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| "Stability testing of active pharmaceutical ingredients and finished pharmaceutical products", WHO TECHNICAL REPORT SERIES NO. 953, 2009 |
| BD BIOSCIENCE: "A P P L I C A T I O N N O T E: Bacterial Detection and Live/Dead Discrimination by Flow Cytometry", 1 January 2002 (2002-01-01), pages 1 - 6, XP055324457, Retrieved from the Internet <URL:https://www.bdbiosciences.com/documents/Bacterial_Detection_Live_Dead.pdf> [retrieved on 20161130] * |
| CHEMICAL ABSTRACTS, Columbus, Ohio, US; abstract no. 7320-34-5 |
| WHO TECHNICAL REPORT SERIES NO. 953, 2009, pages 117 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA3136174A1 (en) | 2020-10-22 |
| KR20220007617A (ko) | 2022-01-18 |
| EP3956434A1 (en) | 2022-02-23 |
| JP2022529449A (ja) | 2022-06-22 |
| US20220195378A1 (en) | 2022-06-23 |
| WO2020212961A1 (en) | 2020-10-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| IT201900006056A1 (it) | Procedimento per la preparazione di una biomassa di cellule di batteri liofilizzate stabili e determinazione della loro stabilità mediante un metodo citofluorimetrico | |
| Arslan-Tontul et al. | Single and double layered microencapsulation of probiotics by spray drying and spray chilling | |
| Albadran et al. | Stability of probiotic Lactobacillus plantarum in dry microcapsules under accelerated storage conditions | |
| KR101605516B1 (ko) | 유산균의 생존율, 저장안정성, 내산성 또는 내담즙성을 증가시키는 방법 | |
| RU2560425C2 (en) | Stabiliser of colour in bacterial composition | |
| Tomás et al. | Encapsulation and subsequent freeze-drying of Lactobacillus reuteri CRL 1324 for its potential inclusion in vaginal probiotic formulations | |
| Lu et al. | Optimization of a cryoprotective medium to increase the viability of freeze-dried Streptococcus thermophilus by response surface methodology | |
| Roger et al. | Characterization of Streptococcus salivarius growth and maintenance in artificial saliva | |
| KR20180113981A (ko) | 생태계 내의 미생물상을 보존하기 위한 동결보존된 조성물 | |
| Haiping et al. | Protective effect of polysaccharides from Pholiota nameko on Lactobacillus casei ATCC 334 subjected to freeze-drying | |
| CA3061695C (en) | Methods and compositions for storing bacteria | |
| CN116096856A (zh) | 利用辛烯基琥珀酸酐淀粉-壳聚糖复合团聚体微囊化微生物培养物 | |
| CN100497594C (zh) | 一种高活性双歧杆菌干粉制剂的复合保护剂 | |
| Jokicevic et al. | Atomization gas type, device configuration and storage conditions strongly influence survival of Lactobacillus casei after spray drying | |
| Li et al. | Protective effect of sucrose on the membrane properties of Lactobacillus casei Zhang subjected to freeze-drying | |
| Tanimomo et al. | Growth and freeze-drying optimization of Bifidobacterium crudilactis | |
| Chen et al. | Effects of sugar alcohol and proteins on the survival of Lactobacillus bulgaricus LB6 during freeze drying | |
| US8501456B2 (en) | Method for making lactic acid bacteria composition | |
| CZ2014565A3 (cs) | Kmeny laktobacilů produkující látky účinné proti vaginálním patogenům, jejich použití a hygienické prostředky je obsahující | |
| Fortuin et al. | Stabilising and functional effects of Spirulina (Arthrospira platensis) protein isolate on encapsulated Lacticaseibacillus rhamnosus GG during processing, storage and gastrointestinal digestion | |
| US20220195482A1 (en) | Use of a cytofluorometry method for evaluating the stability and viability of a biomass of freeze-dried bacterial cells | |
| Adeoye et al. | The characterization and microbiological evaluation of probiotic isolated from bambara groundnut. | |
| Adeoye et al. | Isolation, characterization and storage of probiotics associated with the fermentation of Bambara groundnut bran | |
| You et al. | Optimization of Protective Agents and Freeze-Drying Conditions for Lactobacillus casei LT-L614 | |
| Ge et al. | Optimization of cryoprotectants for improving the freeze-dried survival rate of potential probiotic Lactococcus lactis ZFM559 and evaluation of its storage stability |