CZ2014565A3 - Kmeny laktobacilů produkující látky účinné proti vaginálním patogenům, jejich použití a hygienické prostředky je obsahující - Google Patents
Kmeny laktobacilů produkující látky účinné proti vaginálním patogenům, jejich použití a hygienické prostředky je obsahující Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2014565A3 CZ2014565A3 CZ2014-565A CZ2014565A CZ2014565A3 CZ 2014565 A3 CZ2014565 A3 CZ 2014565A3 CZ 2014565 A CZ2014565 A CZ 2014565A CZ 2014565 A3 CZ2014565 A3 CZ 2014565A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- ccm
- lactobacillus
- lactobacilli
- strains
- lbe
- Prior art date
Links
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 title claims abstract description 54
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 244000000072 vaginal pathogen Species 0.000 title claims abstract description 7
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 title claims description 19
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 8
- 244000005706 microflora Species 0.000 claims abstract description 8
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 241000218492 Lactobacillus crispatus Species 0.000 claims abstract description 6
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000003821 menstrual periods Effects 0.000 claims abstract description 6
- 241000186840 Lactobacillus fermentum Species 0.000 claims abstract description 3
- 241000186604 Lactobacillus reuteri Species 0.000 claims abstract description 3
- 229940012969 lactobacillus fermentum Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 229940001882 lactobacillus reuteri Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 18
- 230000000941 anti-staphylcoccal effect Effects 0.000 description 15
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 15
- 230000028654 Type IV pili-dependent aggregation Effects 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 9
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 9
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 8
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 8
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 8
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 7
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 7
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 6
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 241000186610 Lactobacillus sp. Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 5
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical group O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 206010007134 Candida infections Diseases 0.000 description 2
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 2
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 201000003984 candidiasis Diseases 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dimethoxybenzidine Chemical compound C1=C(N)C(OC)=CC(C=2C=C(OC)C(N)=CC=2)=C1 JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N Aesculin Natural products OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1Oc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 description 1
- WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N Cichoriin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)c1c(O)cc2c(OC(=O)C=C2)c1 WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 206010056344 Menstrual discomfort Diseases 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000192001 Pediococcus Species 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000012482 calibration solution Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 230000001609 comparable effect Effects 0.000 description 1
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940093496 esculin Drugs 0.000 description 1
- AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N esculin Natural products OC1OC(COc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O)C(O)C(O)C1O AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229940035901 lactobacillus sp Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000004224 potassium gluconate Substances 0.000 description 1
- 229960003189 potassium gluconate Drugs 0.000 description 1
- 235000013926 potassium gluconate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011150 reinforced concrete Substances 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000011121 vaginal smear Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
- A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/02—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for disorders of the vagina
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/02—Local antiseptics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/10—Antimycotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/225—Lactobacillus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Předkládané řešení poskytuje nové kmeny laktobacilů, produkující látky účinné proti vaginálním patogenům, Lactobacillus crispatus CCM 7997; Lactobacillus reuteri CCM 7998; Lactobacillus crispatus CCM 8522; Lactobacillus fermentum CCM 8523. Tyto nové kmeny laktobacilů jsou vhodné pro prevenci a/nebo léčbu chronických urogenitálních infekcí, znovuobnovení přirozené vaginální mikroflóry, a/nebo odstranění diskomfortu žen v premenstruační a menstruační periodě. Lze je použít jako účinné látky léčiv nebo hygienických prostředků.
Description
Kmeny laktobacilů produkující látky účinné proti vaginálním pato genům, jejich použití a hygienické prostředky je obsahující
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká nových kmenů laktobacilů produkujících látky účinné proti vaginálním patogenům, použití těchto nových kmenů, a hygienických prostředků obsahujících tyto kmeny laktobacilů.
Dosavadní stav techniky
Probiotické bakterie jsou používány k léčbě a prevenci infekcí urogenitálního traktu. S ohledem na měnící se životní styl, stoupá počet těchto infekcí zvláště u mladých žen. Léčení je zdlouhavé, k léčbě se používá celá řada prostředků, mezi nimiž probiotické bakterie získávají na významu díky minimu vedlejších účinků. Bakteriální infekce jsou převážně způsobeny Escherichia coli a Staphylococcus aureus, zatímco narůstající počet kvasinkových onemocnění označovaných jako kandidózy je vyvolán masivní infekcí druhu Candida albicans. V rozsáhlé studii (v horizontu 30 let) publikované v roce 2013 byl zjištěn signifikantně vyšší výskyt rakoviny u žen trpících kandidózami. V minulosti užívané probiotické kmeny BMK (bakterie mléčného kvašení) byly účinné především proti výše zmíněným bakteriálním kmenům (např. v CZ 302683, popisujícím probiotické kmeny laktobacilů účinných proti E. coli a S. aureus, ale již méně účinných proti C. albicans). Probiotických BMK, které by měly srovnatelný účinek proti bakteriím i kandidám, není mnoho.
í
Významný je způsob aplikace těchto BMK pro prevenci infekcí urogenitálního traktu pomocí běžných dámských hygienických prostředků (tampony, vložky). Jsou rovněž známy hygienické prostředky obsahující tyto probiotické bakterie. Například EP 0594628 popisuje hygienické potřeby obsahující bakterie rodu Pediococcus, US 2004/0241151 popisuje polymemí matrici obsahující bakterie produkující kyselinu mléčnou, US 6359191, US 7960604, WO 02/28446 a WO 03/038068 popisují hygienické prostředky obsahující bakterie produkující kyselinu mléčnou. Z nej novějších patentů popisují aplikace probiotických laktobacilů pro aplikace do dámských hygienických prostředků patenty EP 1824500 Bl, US 2013/0171253 a WO 2013/093941.
Dosavadní řešení využívají BMK produkující jako účinnou látku kyselinu mléčnou, tj. působící proti bakteriálním patogenům snížením pH, ale jsou už méně účinné vůči kandidám, které jsou acidotolerantní. Nově izolované BMK, které jsou předmětem tohoto vynálezu, produkují různá spektra antimikrobiálních látek, a proto je vhodné pro aplikaci do hygienických prostředků kombinovat tyto kmeny s různým účinkem.
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu jsou nové kmeny laktobacilů, produkující látky účinné proti vaginálním patogenům, vybrané ze skupiny zahrnující:
- Lactobacillus crispatus CCM 7997
- Lactobacillus reuteri CCM 7998
- Lactobacillus crispatus CCM 8522
- Lactobacillus fermentum CCM 8523
Všechny uvedené kmeny byly uloženy v České sbírce mikroorganismů (CCM) v Brně, výše uvedená čísla jsou ukládací čísla CCM.
Nové kmeny laktobacilů identifikované v rámci tohoto vynálezu vykazují kombinovanou vysokou antibakteriální a antimykotickou (baktericidní a kandidacidní) aktivitu vhodnou pro použití pro prevenci a léčbu zejména chronických urogenitálních infekcí, znovuobnovení přirozené vaginální mikroflóry a dále odstranění diskomfortu žen v premenstruační a menstruační periodě. Uvedené kmeny byly izolovány z vaginální mikroflóry zdravých žen diversifikovaného etnického původu umožňující aplikaci u široké diversifikované populace.
Bylo prokázáno, že účinnost těchto nových kmenů nespočívá pouze ve snížení pH prostředí, ale že nové kmeny kromě produkce kyseliny mléčné a peroxidu vodíku produkují i další účinné látky neznámého původu proti vaginálním patogenům, například účinné termolabilní látky nebílkovinné povahy vylučované do supematantu. Dlouhodobá stabilita kmenů byla prokázána u lyofilizovaných vzorků skladovaných samostatně a navázaných na nosiči, což umožňuje jejich formulaci do hygienických prostředků. Izoláty laktobacilů zároveň vykazují dobré autoagregační charakteristiky, umožňující následnou kolonizaci urogenitálního traktu.
Předkládaný vynález tedy poskytuje uvedené nové kmeny laktobacilů pro použití jako léčivo. Konkrétněji předkládaný vynález poskytuje použití jednoho uvedeného kmene nebo směsi více uvedených kmenů laktobacilů pro přípravu léčiva pro prevenci a/nebo léčbu chronických urogenitálních infekcí, znovuobnovení přirozené vaginální mikroflóry, a/nebo odstranění diskomfortu žen v premenstruační a menstruační periodě. Dále vynález poskytuje léčivo obsahující alespoň jeden nový kmen laktobacilů podle předkládaného vynálezu.
Předmětem překládaného vynálezu jsou dále hygienické prostředky, jako jsou vložky či tampóny, obsahující alespoň jeden nový kmen laktobacilů podle vynálezu; a rovněž použití alespoň jednoho kmene laktobacilů pro přípravu hygienického prostředku pro prevenci či léčbu chronických urogenitálních infekcí, znovuobnovení přirozené vaginální mikroflóry a/nebo pro odstranění diskomfortu žen v premenstruační a menstruační periodě. Způsoby inkorporace mikroorganismů do hygienických prostředků jsou v oboru známé, například z dokumentů citovaných v kapitole popisující stav techniky.
S výhodou jsou laktobacily při použití podle předkládaného vynálezu nebo v hygienických prostředcích dle tohoto vynálezu v lyofílizované formě. Mohou však být i v jiné vhodné formě, například upravené sprej ovým sušením.
Přehled obrázků
Obr. 1 znázorňuje autoagregaci čerstvých kmenů Lactobacillus sp., při teplotě 37 °C, po dobu 24 h, za aerobních podmínek (příklad 4). Lbe. Crispatus CCM 8522, Lbe. Fermentum CCM 8523, Lbe. crispatus CCM 7997, Lbe. Reuteri CCM 7998.
Obr. 2 znázorňuje autoagregaci lyofilizovaných kmenů Lactobacillus sp., při teplotě 37 °C, po dobu 24 h, za aerobních podmínek (příklad 4). Lbe. Crispatus CCM 8522, Lbe. Fermentum CCM 8523, Lbe. crispatus CCM 7997, Lbe. Reuteri CCM 7998.
Obr. 3 znázorňuje životaschopnost vybraných lyofilizovaných laktobacilů při 5 °C (příklad 6). 8522 - Lbe. Crispatus CCM 8522, 7998 - Lbe. Reuteri CCM 7998, 8523 - Lbe. Fermentum CCM 8523, 7997 - Lbe. crispatus CCM 7997.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Izolace a charakterizace kmenů
Nové kmeny byly izolovány zpoševních stěrů zdravých žen diversifikovaného etnického původu.
Nově izolované kmeny byly typizovány a identifikovány pomocí tří metod:
1. Feno typizace isolátů na základě jejich biochemických aktivit
2. Genotypizace isolátů na základě rep-PCR a detekce genu kódujícího 16S rRNA pomocí PCR s využitím druhově specifických primerů pro Lactobacillus sp
3. Přesná genotypizace byla provedena pomocí amplifikace genu kódujícího 16S rRNA s využitím druhově specifických primerů a jeho následné sekvenace
Tabulka I:
Fenotypizace laktobacilových izolátů zjištěná pomocí testu API 50 CH
| Izolát | CCM 8523 | CCM 7997 | CCM 8522 | CCM 7998 |
| Růst 15 °C | - | - | - | - |
| Růst 45 °C | + | + | + | + |
| Fermentace sacharidů: | ||||
| Rib | + | - | - | + |
| Gal | + | - | - | + |
| Glu | + | + | + | + |
| Fru | + | + | + | + |
| Ng | - | + | + | - |
| Cel | - | + | + | - |
| Mal | + | + | + | + |
| Lac | + | + | - | + |
| Mel | + | - | - | + |
| Sac | + | + | + | + |
| Raf | + | - | + | + |
| Gd | + | - | - | + |
| Ara | - | - | - | - |
| Esc | - | + | + | - |
| Xyl | - | - | - | + |
| Sal | » | - | + | - |
| Tre | - | - | + | - |
| Amd | - | - | + | - |
| Mdx | - | - | - | + |
| Mdg | - | - | - | + |
| Tur | - | - | - | + |
| Lara | - | - | - | + |
+ pozitivní reakce; - negativní reakce; Rib - ribosa; Glu - glukosa; Ng - N - acetylglukosamin; Cel - celobiosa; Fru - fruktosa, Gal - galaktosa; Lac - laktosa; Mal - maltosa; Sac - sacharosa; Mel - melibiosa; Raf - rafinosa; Gd - glukonát draselný; Ara - arabinosa; Esc - eskulín; Xyl - xylosa; Tre - trehalosa; Tur - turanosa; Sal salicin; Amd - amidon; Mdx - methyl-p,D-xylopyranosid; Mdg - methyl-a,D-glukopyranosid (všechny sacharidy jsou ve formě D - izomeru, výjimka: Lara - L - arabinosa)
Tabulka II
Sekvence 16S rRNA testovaných kmenů. Izoláty rodu Lactobacillus byly identifikovány na úrovni druhu pomocí sekvenace 16S rRNA genu (obecné primery W001 a W002).
| Sekvence (5'- 3') | Identifikace (BLAST- NCBI), ukládací číslo |
| GTTACCCCACCGACTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTC ACCGCGGCATGCTGATCCGCGAnACTAGCGATTCCGACTTCGTGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAGTCCGAACTGA GAACGGTTTTAAGAGATTTGCTTGCCCTCGCGAGTTCGCGACTCGTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCA GGTCATAAGGGGCATGATGATCTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACTAGAGTGCCC AACTTAATGCTGGCAACTAGTAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGA CGACGACCATGCACCACCTGTCAKGCGTTCCCGAAGGAAACGCCCTATCTCTAGGGnGGCGCAAGATGTCAAGA CCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGA GTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTC CAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGTCTC AGCGTCAGTTGCAGACCAGGTAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACAT GGAGTTCCACTACCCTCTTCTGCACTCAAGTTATCCAGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACA TCAGACTTAGAAAACCGCCTGCACTCTCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCG GCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTGGTTAAATACCGTCAACGTATGAACAGTTACTCTCATACGTGTTCTT CTTTAACAACAGAGCTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGTGTTGCTCCATCAGGCTTGCGCCCATTGTG GAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTATGGGCCGTGTCTCAGTCCCATTGTGGCCGATCAGTCTCTCAACT CGGCTATGCATCATCGCCTTGGTAGGCCGTTACCCCACCAACAAGCTAATGCACCGCAGGTCCATCCAGAAGTGATA GCGAGAAGCCATCTTTTAAGCGTTGTTCATGCGAACAACGTTGKATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTGTC CCCCGCTTCTGGGCAGGTTACCTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCGTTGGCGACCAAAATCAATCAGGTGCAA GCACCATCAATCAATTGGGCCAACGCGTCGACTGC | Lbe. fermentum CCM 8523 |
| GGTTAGGCCACCGGCTTTGGGCATTGCAGACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTAT TCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCGTGCAGTCGAGTTCAGACTGCAGTCCGAACTG AGAACAGCTTTCAGAGATTCGCTTGCCTTCGCAGGCTCGCTTCTCGTTGTACTGCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCC CAGGTCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCATTAGAGTGC CCAACTTAATGCTGGCAACTAATAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCT GACGACAGCCATGCACCACCTGTCTTAGCGTCCCCGAAGGGAACTTTGTATCTCTACAAATGGCACTAGATGTCAAG ACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTG | Lbe. erispatus CCM 7997 |
| AGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAGAGGCGGAAACCTC CCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCT CAGCGTCAGTTGCAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACA TGGAGTTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGAAAAACAGTTTCCGATGCAGTTCCTCGGTTAAGCCGAGGGCTTTCAC ATCAGACTTATTCTTCCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCG GCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGALI1 ICIGGI IGAI IACCGICAAAIAAAGGCCAGI IACIACLILI1 ICCTTCTT CACCAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTG GAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAGTCTCTCAACT CGGCTATGCATCATCGCCTTGGTAAGCCTTTACCTTACCAACTAGCTAATGCACCGCGGGGCCATCCCATAGCGACA GCTTACGCCGCCTTTTAAAAGCTGATCATGCGATCTGCTTTCTTATCCGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGGTATCC CAGACTATGGGGCAGGTTCCCCACGTGTTACTCACCCATCCGCCGCTCGCTTTCCTAACGTCATTACCGAAGTAAAT CTGTTAGTCCGCTCGCTCG | |
| GGTTAGGCCACCGGCTTTGGGCATTGCAGACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTAT TCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCGTGCAGTCGAGTTGCAGACTGCAGTCCGAACT GAGAACAGCTTTCAGAGATCCGCTTGCCTTCGCAGGCTCGCTTCTCGTTGTACTGCCCATTGTAGCACGTGTGTAGC CCAGGTCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCATTAGAGTG CCCAACTTAATGCTGGCAACTAATAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCT GACGACAGCCATGCACCACCTGTCTTAGCGTCCCCGAAGGGAACTTTGTATCTCTACAAATGGCACTAGATGTCAAG ACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTG AGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAGAGGCGGAAACCTC CCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCACTACCCATGCTTTCGAGCCT CAGCGTCAGTTGCAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACA TGGAGTTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGAAAAACAGTTTCCGATGCAGTTCCTCGGTTAAGCCGAGGGCTTTCAC ATCAGACTTATTCTTCCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCG GCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTGGTTGATTACCGTCAAATAAAGGCCAGTTACTACCTCTATCCTTCTT CACCAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTG GAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAGTCTCTCAACT CGGCTATGCATCATCGCCTTGGTAAGCCTTTACCTTACCAACTAGCTAATGCACCGCGGGGCCATCCCATAGCGACA GCTTACGCCGCCTTTTAAAAGCTGATCATGCGATCTGCTTTCTTATCCGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGGTATCC CAGACTATGGGGCAGGTTCCCCACGTGTTACTCACCCATCCGCCGCTCGCTTTCCTAACGTCATTACCGAAGTAAAT CTGHAGTTCCGCTCGCTCGACTGCA | Lbe. erispatus CCM 8522 |
| TAAAGGTTAGGCCCCGACTTTGGGCGTTACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG TATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAA CTGAGAACGGCrTTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGTTrGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTA GCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATCTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACTAGAG TGCCCAACTTAATGCTGGCAACTAGTAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGA GCTGACGACGACCATGCACCACCTGTCATTGCGTCCCCGAAGGGAACGCCTTATCTCTAAGGKAGCGCAAGATGT CAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTC CTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAA ACCCTCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCG AGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTA CACATGGAGTTCCACTGTCCTCnCTGCACTCAAGTCGCCCGGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTAAGCCGAAGGCTT TCACATCAGACCTAAGCAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTAC CGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTGGTTGGATACCGTCACTGCGTGAACAGTTACTCTCACGCACG TTCTTCTCCAACAACAGAGCTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGTGTTGCTCCATCAGGCTTGCGCCCA KGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTATGGACCGTGTCTCAGTTCCATTGTGGCCGATCAGTCTCT CAACTCGGCTATGCATCATCGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTACCAACTAGCTAATGCACCGCAGGTCCATCCCAGAG TGATAGCCAAAGCCATCnTCAAACAAAAGCCATGTGGCTTTTGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGT TATCCCCCGCTCCGGGGCAGGTTACCTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCACTGGTGATCCATCGTCAATCAGG TGCAAGCACCATCAATCAGTTGGGCCAGTGCGTACGACTGC | Lbe. reuteri CCM 7998 |
Identifikace izolovaných kmenů s antimikrobiální aktivitou byla provedena metodou 16S rRNA a je uvedena v Tabulce III.
Tabulka III. Identifikace a typizace izolovaných kmenů
| Izolát | Identifikace dle 16S rRNA (pojmenování) | Fenotypická charakterizace (API 50) |
| CCM 8522 | Lbe. erispatus | Lbe. erispatus |
| CCM 7998 | Lbe. reuteri | Lbe. brevis |
| CCM 8523 | Lbe. fermentum | Lbe. fermentum |
| CCM 7997 | Lbe. erispatus | Lbe. acidophilus |
Na základě Gramova barvení bylo zjištěno, že všechny kmeny jsou grampozitivní. Kmeny byly uloženy v České sbírce mikroorganismů (CCM) v Brně.
Příklad 2: Stanovení antikandidózní a antistafylokokové aktivity
Izolované kmeny byly testovány na antikandidózní aktivitu, která byla stanovena následovně: Testovaný kmen Lactobacillus spp. byl nejprve kultivován v MRS růstovém bujónu (Merck Milipore) po dobu 24 h anaerobně při teplotě 37 °C. Z čerstvě narostlé kultury bylo připraveno pomocí fyziologického roztoku inokulum o koncentraci odpovídající 2 McF (McFarland). 1 ml tohoto inokula byl přelit 15 ml MRS agaru a kultivován při 37 °C anaerobně po dobu 24 h. Následně byly Petriho misky převrstveny 10 ml ME agaru (Merck Milipore), na jehož povrch bylo rozetřeno 100 μΐ suspenze C. albicans 2186 o koncentraci 0,5 McF. Následovala anaerobní kultivace nejprve při 37 °C po dobu 24 h a dále při pokojové teplotě (25 °C) po dobu 24 h. Ke každému stanovení byl připraven slepý vzorek, který byl připraven z 15 ml MRS agaru převrstveného 10 ml ME agaru s rozetřením 100 μΐ suspenze C. albicans 2186 o koncentraci 0,5 McF. Slepý vzorek byl kultivován za stejných podmínek jako ostatní vzorky. Hodnocení inhibice C. albicans 2186 jednotlivými kmeny laktobacilů se hodnotilo dle míry nárůstu kvasinky na povrchu misky vůči slepému vzorku.
Dále byly izolované kmeny testovány na antistafylokokovou aktivitu, která byla stanovena pomocí vpichové metody následovně: Rozehřátý agar soft BHI byl zaočkován 1 % (obj.) inokula čerstvě narostlého indikátorového kmene S. aureus CCM 4516 o denzitě přibližně 105 KTJ ml’1, poté rozdělen po 10 ml do Petriho misek. Po zatuhnutí a předsušení bylo do agaru vpichem dávkováno 10 μΐ živých buněk testovaného kmene Lactobacillus spp. ěi jeho upraveného supematantu. Misky byly následně obaleny petrifilmem a kultivovány při teplotě °C po dobu 18 h. Antistafylokoková aktivita byla posuzována podle průměru inhibičních zón růstu vzniklých kolem místa vpichu testovaného kmene do agaru se zaočkovaným indikátorovým kmenem.
Antikandidózní a antistafylokoková aktivita byla vyhodnocována následovně:
+ ... inhibiční zóna < 5 mm (nízká aktivita) ++ ... inhibiční zóna 5 až 10 mm (střední aktivita) +++ ... inhibiční zóna >10 mm (vysoká aktivita)
Výsledky antistafylokokové aktivity laktobacilů jsou uvedeny v Tabulce IV a jsou vyjádřeny jako průměrné hodnoty ze tří uskutečněných měření.
Tabulka IV. Antistafylokoková a antikandidózní aktivita kmenů
| Izoláty | Inhibice S. aureus 4516 | Inhibice C. albicans 2186 |
| CCM 8522 | ++ | +++ |
| CCM 7998 | +++ | ++ |
| CCM 8523 | +++ | + |
| CCM 7997 | +++ | +++ |
Příklad 3: Vliv lyofílizace na antistafylokokovou aktivitu laktobacilů
Antistafylokoková aktivita laktobacilů byla testována pomocí agarové vpichové metody (viz Příklad 2). Jako testované mikroorganismy byly použity vybrané vaginální izoláty laktobacilů, a to ve formě čerstvých a lyofilizovaných kultur. V případě lyofilizovaných kultur byla testována antistafylokoková aktivita laktobacilů po rehydrataci lyofilizátu (0,1 g) ve fyziologickém roztoku (1 ml) a po rekultivaci lyofilizované kultury (0,1 g) v bujónu MRS (pH 5,6 před sterilací, 5 ml) při teplotě 37 °C, po dobu 24 h, za aerobních podmínek. Testování lyofilizovaných kultur probíhalo ihned po lyofilizaci a následně po skladování takto připravených kultur při teplotě 25 °C po dobu 1 měsíce. Jako indikátorový kmen pro testování antistafylokokové aktivity laktobacilů byl vybrán Staphylococcus aureus CCM 4516. Antistafylokoková aktivita byla posuzována podle průměru inhibičních zón vzniklých kolem místa vpichu testovaného kmene do agaru se zaočkovaným indikátorovým takto:
+ ... inhibiční zóna < 5 mm (nízká aktivita), ++ ... inhibiční zóna 5 až 10 mm (střední aktivita), +++ ... inhibiční zóna> 10 mm (vysoká aktivita).
Výsledky antistafylokokové aktivity laktobacilů jsou uvedeny v Tabulkách V a VI a jsou vyjádřeny jako průměrné hodnoty ze tří uskutečněných měření.
Tabulka V. Antistafylokoková aktivita vaginálních izolátů Lactobacillus sp. (měřeno ihned po lyofilizaci)
| Kmen | Antistafylokoková aktivita laktobacilů (5. aureus CCM 4516) | ||
| Čerstvá kultura | Lyofilizovaná kultura* | Lyofilizovaná kultura ** | |
| Lbe. erispatus CCM 8522 | +++ | +++ | +++ |
| Lbe. reuteri CCM 7998 | +++ | ++ | +++ |
| Lbe. fermentum CCM 8523 | +++ | +++ | +++ |
| Lbe. erispatus CCM 7997 | +++ | +++ | +++ |
* po rehydrataci lyofilizátů ve fyziologickém roztoku (1 ml), ** po rekultivaci lyofilizátů v bujónu MRS (pH 5,6 před sterilací) při teplotě 37 °C po dobu 24 h, za aerobních podmínek. + ... inhibiční zóna < 5 mm (nízká aktivita), ++ ... inhibiční zóna 5 až 10 mm (střední aktivita),+++ ... inhibiční zóna > 10 mm (vysoká aktivita).
Tabulka VI. Antistafylokoková aktivita vaginálních izolátů Lactobacillus sp. (měřeno po skladování lyofilizátů při 25 °C po dobu 1 měsíce)
| Kmen | Antistafylokoková aktivita laktobacilů (S', aureus CCM 4516) | ||
| Čerstvá kultura | Lyofilizovaná kultura* | Lyofilizovaná kultura ** | |
| Lbe. erispatus CCM 8522 | +++ | +++ | +++ |
| Lbe. reuteri CCM 7998 | +++ | ++ | +++ |
| Lbe. fermentum CCM 8523 | +++ | ++ | +++ |
| Lbe. erispatus CCM 7997 | +++ | +++ | +++ |
* po rehydrataci lyofilizátů ve fyziologickém roztoku (1 ml), ** po rekultivaci lyofilizátů v bujónu MRS (pH 5,6 před sterilací) při teplotě 37 °C po dobu 24 h, za aerobních podmínek, + ... inhibiční zóna < 5 mm (nízká aktivita), ++ ... inhibiční zóna 5 až 10 mm (střední aktivita), +++ ... inhibiční zóna > 10 mm (vysoká aktivita).
Příklad 4: Autoagregace laktobacilů
Autoagregace laktobacilů byla testována u 4 vybraných vaginálních izolátů laktobacilů. K testování autoagregace laktobacilů byly použity jak čerstvé kultury těchto bakterií, tak i kultury po lyofilizaci. Autoagregace čerstvých buněk laktobacilů byla testována v bujónu MRS (pH 5,6 před sterilací, 10 ml), při teplotě 37 °C, po dobu 24 h. Pro testování autoagregace byl v časech 0, 2, 4, 7 a 24 h odebírán vzorek (1 ml) z povrchu suspenze, u kterého byla měřena absorbance při vlnové délce 600 nm. Procento autoagregace laktobacilů bylo vypočítáno podle následující rovnice:
Autoagregace =
[%]
Ao... absorbance v čase 0 h [-]
At... absorbance v čase 2, 4, 7 a 24 h [-]
Autoagregace lyofilizovaných buněk laktobacilů byla měřena podle stejné metodiky jako v případě čerstvých buněk. Lyofilizované kmeny však musely být před měřením rekultivovány v bujónu MRS (pH 5,6 před sterilací, 5 ml) při teplotě 37 °C, po dobu 24 h, za aerobních podmínek a následně ještě jednou přeočkovány (1 % obj. kultury) do bujónu MRS (pH 5,6 před sterilací, 5 ml) a kultivovány za stejných podmínek.
Výsledky autoagregace jsou shrnuty na Obr. 1 a 2 a jsou vyjádřeny jako aritmetické průměry ze tří uskutečněných paralelních stanovení.
Z výsledků uvedených na Obr. 1 je patrné, že kmeny Lbe. erispatus CCM 7997 a Lbe. reuteri CCM 7998 dosáhly 100% autoagregace po 24 h měření. U kmene Lbe. erispatus CCM 8522 byla zjištěna minimálně 50% a u kmene Lbe. fermentum CCM 8523 34% autoagregace po 24 h měření.
Obr. 2 znázorňuje vliv lyofilizačního procesu na schopnost autoagregace laktobacilů. U většiny testovaných kmenů byla zaznamenána stejná popř. zvýšená schopnost autoagregace. Kmeny Lbe. erispatus CCM 7997 a Lbe. reuteri CCM 7998 dosáhly, stejně jako v předchozím případě, 100% autoagregace po 24 h měření. U vaginálních izolátů Lbe.
crispatus CCM 8522 a Lbc. fermentum CCM 8523 pak došlo ke zvýšení schopnosti autoagregace, a to až o 40 % ve 24 h měření.
Příklad 5: Stanovení charakteru účinné antimikrobiální látky
K charakteristice antimikrobiálně aktivních látek produkovaných laktobacily byly použity supematanty získané odstředěním (9000 ot min'1, 5 min, 4 °C) testovaného kmene. Supematanty byly dále neutralizovány pomocí 10% (hm.) roztoku NaOH, popřípadě 10% (obj.) roztoku HCI na pH 7, aby se vyloučilo působení kyselin. K zjištění tepelné stability antimikrobiální látky byly neutralizované supematanty (pH 7) zahřívány ve vodní lázni při teplotě 90 °C po dobu 10 min. K vyloučení působení peroxidu vodíku byly neutralizované supematanty (pH 7) ošetřeny katalasou. K vyloučení působení antimikrobiální látky bílkovinné povahy (bakteriocinu) byly pak neutralizované supematanty (pH 7) ošetřeny proteinasou K. Enzymy byly vždy připraveny rozpuštěním ve sterilní demineralizované vodě a následně přidány k supernatantu na výslednou koncentraci 1 mg ml'1. Supematanty s aplikovaným enzymem byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 2 h. Ošetřené supematanty byly testovány pomocí agarové vpichové metody. Výsledky analýzy jsou shrnuty v Tabulce VII.
Ke stanovení produkce peroxidu vodíku byl MRS zaočkován 1 % (obj.) inokula testovaného kmene a kultivován aerobně při teplotě 37 °C po dobu 24 h. Po této době byla suspenze buněk odstředěna (5000 ot min'1, 15 min, 4 °C). Vzniklý supernatant byl odlit a buňky byly dvakrát promyty fosfátovým pufrem a opětovně odstředěny. Po posledním odstředění byl k buňkám přidán vychlazený fosfátový pufr (20 ml). Vzniklá suspenze buněk byla kultivována při teplotě 5 °C po dobu 48 h. Po kultivaci byla suspenze buněk odstředěna (5000 ot min'1, 15 min, 4 °C) a získaný supernatant se použil pro stanovení H2O2.
Vzorky byly připraveny přidáním 0,001% (hm.) vodného roztoku HRP (1 ml) a 1% (hm.) methanolického roztoku o-dianisidinu (0,1 ml) k 5 ml supematantu/roztoku H2O2 (kalibrační křivka). Takto upravené vzorky byly kultivovány při teplotě 37 °C po dobu 10 min. Následně byla reakce zastavena přidáním 4 mol Γ1 HCI (0,2 ml). Poté se proměřila absorbance vzorků při 400 nm (A400). Výsledky analýzy jsou shrnuty v Tabulce VII.
Pro interpretaci naměřených hodnot s touto metodou bylo zapotřebí sestavit kalibrační přímky H2O2. Nejdříve byly připraveny kalibrační roztoky H2O2 ve fosfátovém pufru o následující koncentraci H2O2 (0,5; 0,8; 1,0; 2,0; 3,0 a 4,0 mg Γ1 fosfátového pufru). Kalibrační přímka se vyjádřila jako závislost absorbance na koncentraci H2O2.
Ke stanovení produkce kyselin byly testované kmeny kultivovány 24 h při 37 °C v MRS bujónu pH 5,4 po sterilizaci (zaočkováno 1% inokulum). Poté bylo stanoveno pH bakteriální suspenze. Výsledky analýzy jsou shrnuty v Tabulce VIL
Tabulka VII. Charakterizace antimikrobiálních látek u identifikovaných isolátů laktobacilů
| Izolát | Lbe. erispatus CCM 8522 | Lbe. reuteri CCM 7998 | Lbe. fermentum CCM 8523 | Lbe. erispatus CCM 7997 |
| ŽB | 8,3 ± 0,5 | 11,7 ±0,9 | 15,0 ±0,8 | 10,0 ±0,8 |
| S | 0 | 5,3 ± 0,5 | 12,0 ±0,0 | 7,0 ± 0,0 |
| SN7 | 0 | 3,7 ±0,9 | 10,5 ±0,5 | 0 |
| SNI7 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| SNP7 | 0 | 0 | 10,0 ± 1,0 | 0 |
| SNK7 | 0 | 4,3 ± 0,9 | 11,0 ± 1,0 | 0 |
| Ch2O2 [mg.l '] | 5,87 | 3,60 | 0,08 | 3,35 |
| Ch2O2 [mg.l ‘1 produkovaného jednou buňkou * 1012 | 1190 | 690 | 3,17 | 86,6 |
| Produkce kyselin [pH po 12h kultivace] | 4,27 | 4,10 | 4,11 | 4,16 |
Vysvětlivky: ŽB - živé buňky; S - neupravený supernatant; SN7 - supernatant neutralizovaný na pH 7; SNI7 supernatant neutralizovaný na pH 7 a tepelně ošetřený záhřevem při teplotě 90 °C po dobu 10 min; SNP7 supernatant neutralizovaný na pH 7 a ošetřený proteinasou K; SNK.7 - supernatant neutralizovaný na pH 7 a ošetřený katalasou.
Příklad 6: Skladovací testy vybraných kmenů (32 týdnů)
Výsledky skladovacích testů nových kmenů Lactobacillus sp. lyofilizovaných v kryoprotektivním médiu při teplotě 5 °C, v průběhu 48 týdnů, za aerobních podmínek, jsou znázorněny na Obr. 3.
Z výsledků skladovacích zkoušek lyofilizovaných izolátů laktobacilů uvedených na Obr. 3 je patrné, že všechny testované kmeny si zachovaly vysokou životaschopnost během skladování při 5 °C po dobu 48 týdnů. Množství životaschopných laktobacilů se pohybovalo při této teplotě v rozmezí 108 až 1010 KTJ.g'1 lyofilizátu.
Příklad 7: Příprava funkčního vzorku dámského hygienického prostředku s probiotickým účinkem
Funkční vzorky byly připraveny dle postupu popsaném v WO 02/28446 Al následovně:
Do sterilního nosiče byl vmíchán lyofílizát příslušného probiotického kmene laktobacilů (Lbe.renter i 291, Lbc.fermentum Gl). Vzniklá směs byla poté nanášena na hygienické prostředky ve sterilních podmínkách. Pro přípravu funkčních vzorků byly použity komerčně dostupné prostředky od fi Johnson & Johnson, G.m.b.H, Německo. Připravené vzorky byly asepticky vloženy jednotlivě do sterilních uzavíratelných vzorkovnic a skladovány při 25 °C v běžné atmosféře.
Průmyslová využitelnost
Nové kmeny lactobacilů jsou využitelné jako účinné složky léčiv a hygienických prostředků k prevenci a léčbě urogenitálních infekcí, ke znovuobnovení přirozené vaginální mikroflóry, a/nebo odstranění diskomfortu žen v premenstruační a menstruační periodě.
Claims (8)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Kmen laktobacilů, produkující látky účinné proti vaginálním patogenům, vybraný ze skupiny zahrnující:- Lactobacillus crispatus CCM 7997;- Lactobacillus reuteri CCM 7998;- Lactobacillus crispatus CCM 8522;- Lactobacillus fermentum CCM 8523.
- 2. Kmen laktobacilů podle nároku 1 pro použití jako léčivo.
- 3. Použití alespoň jednoho kmene laktobacilů podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro prevenci a/nebo léčbu chronických urogenitálních infekcí, znovuobnovení přirozené vaginální mikroflóry, a/nebo odstranění diskomfortu žen v premenstruační a menstruační periodě.
- 4. Použití podle nároku 3, vyznačené tím, že kmen laktobacilů je v lyofilizované formě.
- 5. Léčivo, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden kmen laktobacilů podle nároku 1.
- 6. Použití alespoň jednoho kmene laktobacilů podle nároku 1 pro přípravu hygienického prostředku pro prevenci či léčbu chronických urogenitálních infekcí, znovuobnovení přirozené vaginální mikroflóry a/nebo pro odstranění diskomfortu žen v premenstruační a menstruační periodě.
- 7. Hygienický prostředek, vyznačený tím, že obsahuje alespoň jeden nový kmen laktobacilů podle nároku 1.
- 8. Hygienický prostředek podle nároku 7, vyznačený tím, že kmen laktobacilů je v lyofilizované formě.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2014-565A CZ2014565A3 (cs) | 2014-08-22 | 2014-08-22 | Kmeny laktobacilů produkující látky účinné proti vaginálním patogenům, jejich použití a hygienické prostředky je obsahující |
| PCT/CZ2015/000093 WO2016026474A1 (en) | 2014-08-22 | 2015-08-21 | Strains of lactobacteria producing active compounds acting against vaginal pathogens, use thereof and sanitary products |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2014-565A CZ2014565A3 (cs) | 2014-08-22 | 2014-08-22 | Kmeny laktobacilů produkující látky účinné proti vaginálním patogenům, jejich použití a hygienické prostředky je obsahující |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2014565A3 true CZ2014565A3 (cs) | 2016-03-02 |
Family
ID=54251895
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2014-565A CZ2014565A3 (cs) | 2014-08-22 | 2014-08-22 | Kmeny laktobacilů produkující látky účinné proti vaginálním patogenům, jejich použití a hygienické prostředky je obsahující |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2014565A3 (cs) |
| WO (1) | WO2016026474A1 (cs) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107267415B (zh) * | 2017-06-23 | 2020-02-14 | 广东强基药业有限公司 | 一种罗伊氏乳杆菌及其用于制备阴道抑菌药物的应用 |
| GB201816425D0 (en) * | 2018-10-09 | 2018-11-28 | Tervisetehnoloogiate Arenduskeskus As | Probiotics |
| CN111893057B (zh) * | 2020-06-29 | 2021-04-23 | 哈尔滨美华生物技术股份有限公司 | 一株用于防治妇女泌尿生殖道感染的卷曲乳杆菌及其应用 |
| WO2022140401A1 (en) * | 2020-12-23 | 2022-06-30 | Church & Dwight Co., Inc. | Lactobacillus compositions and methods for prevention and treatment of microbial infection |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE9100364L (sv) | 1991-02-05 | 1992-08-06 | Bac Dev In Sweden Ab | Tampong eller binda impregnerad med en kultur av levande mjoelksyrabakterier i avsikt att minska risken foer urogenitala infektioner |
| DE19713908A1 (de) | 1997-04-04 | 1998-10-08 | Symbio Herborn Group Gmbh & Co | Vaginaltampon und Verfahren zu seiner Herstellung |
| SE521022C2 (sv) | 2001-09-20 | 2003-09-23 | Ellen Ab | Mjölksyraproducerande bakterier för användning som probiotiska organismer i vaginan hos människa |
| SE518097C2 (sv) | 2000-10-03 | 2002-08-27 | Ellen Ab | Förfarande för framställning av en absorberande sanitetsartikel som innefattar mjölksyraproducerande bakterier samt sådant alster |
| US20040241151A1 (en) | 2003-05-27 | 2004-12-02 | Sca Hygiene Products Ab | Polymer matrix with lactic acid producing bacteria |
| SE528382C2 (sv) | 2004-10-05 | 2006-10-31 | Probi Ab | Probiotiska lactobacillusstammar för förbättrad vaginal hälsa |
| EP2158916A1 (en) * | 2008-08-27 | 2010-03-03 | Ellen Aktiebolag | Administration unit comprising lactic acid bacteria |
| EP2428214A1 (en) | 2010-09-14 | 2012-03-14 | HSO Health Care GmbH | Compositions for the vaginal and oral administration of lactobacillus and uses thereof |
| CZ302683B6 (cs) * | 2010-12-15 | 2011-08-31 | Valosun A.S. | Probiotické kmeny Lactobacillus fermentum 16A/1 a Lactobacillus crispatus 13A a jejich využití k vaginální aplikaci |
| WO2013093941A2 (en) | 2011-12-21 | 2013-06-27 | Talwar Research Foundation | Compositions comprising probiotic lactobacillus strains for improved vaginal health |
-
2014
- 2014-08-22 CZ CZ2014-565A patent/CZ2014565A3/cs unknown
-
2015
- 2015-08-21 WO PCT/CZ2015/000093 patent/WO2016026474A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2016026474A1 (en) | 2016-02-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jordan et al. | Inhibition of experimental caries by sodium metabisulfite and its effect on the growth and metabolism of selected bacteria | |
| ES2688538T3 (es) | Composiciones crioprotectoras y uso de las mismas | |
| CN104140937B (zh) | 植物乳杆菌klds1001及其在抑制口腔变异链球菌中的用途 | |
| KR102047459B1 (ko) | 락토바실러스 플랜타룸 WiKim0088 | |
| CN103911306B (zh) | 加氏乳杆菌菌株及其用途 | |
| Guo et al. | Effects of extracellular DNA on dual-species biofilm formed by Streptococcus mutans and Candida albicans | |
| CA3018416A1 (en) | Vaginal preparations for maintaining and/or restoring healthy female microbiota | |
| RU2460778C1 (ru) | Способ получения аутопробиотика на основе enterocuccus faecium, представителя индигенной микрофлоры кишечника хозяина | |
| CN114591875B (zh) | 一种改善阴道环境的嗜酸乳杆菌la88及其培养方法与应用 | |
| Lin et al. | Inhibitory effect of Lactobacillus paracasei subsp. paracasei NTU 101 on rat dental caries | |
| Lee et al. | Antimicrobial activity of Bifidobacterium spp. isolated from healthy adult Koreans against cariogenic microflora | |
| CZ2014565A3 (cs) | Kmeny laktobacilů produkující látky účinné proti vaginálním patogenům, jejich použití a hygienické prostředky je obsahující | |
| Elgamily et al. | Microbiological and environmental assessment of human oral dental plaque isolates | |
| Pankratov | Acidobacteria in microbial communities of the bog and tundra lichens | |
| CN103911309B (zh) | 加氏乳杆菌菌株及其用途 | |
| KR20110009626A (ko) | 신규 락토바실러스 루테리 및 이를 포함하는 사료첨가제 조성물 | |
| KR20110009516A (ko) | 신규한 락토바실러스 살리바리우스 균주 및 이를 함유하는 사료첨가제 조성물 | |
| KR20210154341A (ko) | 락토바실러스 플란타럼 배양액을 포함하는 소독용 조성물 | |
| Abdulhadi et al. | Investigate the spread of Streptococcus mutans for patients with tooth decay in Samarra city | |
| Ambade et al. | Effect of lemongrass essential oil based mouthwash against microflora associated with dental plaque | |
| Hezam | Evaluate the efficacy of probiotic lactobacilli on growth and biofilm formation in Streptococcus mutans isolated from gingivitis | |
| Chen et al. | Evaluation of a Burkholderia ambifaria strain from plants as a novel promising probiotic in dental caries management | |
| Lauw | Study of Lacid Acid Bacteria Activities from Human Oral Mucosa for Candida albicans Inhibition | |
| KR100720025B1 (ko) | 프로바이오틱 유산균 및 이를 포함하는 조성물 | |
| Mathew et al. | Assessment of probiotic potential of lactic acid bacteria isolated from curd and its application using fruit juice |