KR20110009516A

KR20110009516A - 신규한 락토바실러스 살리바리우스 균주 및 이를 함유하는 사료첨가제 조성물

Info

Publication number: KR20110009516A
Application number: KR1020090066955A
Authority: KR
Inventors: 재 명 김; 종 만 김; 향 미 남; 금 찬 장; 희 수 이; 석 찬 정
Original assignee: 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 국립수의과학검역원)
Priority date: 2009-07-22
Filing date: 2009-07-22
Publication date: 2011-01-28
Also published as: KR101098946B1

Abstract

본 발명은 내산성, 내담즙, 및 장부착능이 있고, 한국농업미생물지원센터(KACC)에 기탁번호 KACC91449P로 기탁된 균주인 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) G1-1 및 이를 유효성분으로 함유한 사료첨가제 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 락토바실러스 살리바리우스 G1-1 균주는 다양한 병원성 세균에 대해 우수한 항균활성을 나타냄은 물론 내산성 및 내담즙성 등이 우수하므로, 장내 병원성 세균 억제제, 소화제, 정장제 등의 프로바이오틱 조성물로 제조하여 사료 및 동물용 의약품에 유용하게 활용될 수 있고, 축산 농가의 가축질병으로 인한 경제적 피해를 크게 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 수입 동물용 의약품을 대체할 수 있다.

락토바실러스 살리바리우스, 항균활성, 내담즙성, 내산성

Description

신규한 락토바실러스 살리바리우스 균주 및 이를 함유하는 사료첨가제 조성물{A compound for feed additive comprising novel Lactobacillus salivarius G1-1}

본 발명은 락토바실러스 살리바리우스 G1-1 및 이를 함유하는 사료첨가제 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 항균력, 내산성, 내담즙, 및 장부착능이 있고, 2009년 2월 20일 한국농업미생물지원센터(KACC)에 기탁번호 KACC91449P로 기탁된 균주인 락토바실러스 살리바리우스 G1-1 및 이를 유효성분으로 함유한 사료첨가제 조성물에 관한 것이다.

살아있는 미생물인 프로바이오틱스(probiotics)는 장내에서 미생물의 기능을 활성화하여 동물의 건강을 증진한다(Fuller, 1989). 많은 연구자들이 락토바실러스와 비피도박테리움과 같은 프로바이오틱스(probiotics)가 설사 등과 같은 증상을 감소시키거나, 방어한다는 사실을 보고하였다(Gilliland, 1990). 또 다른 프로바이오틱스의 장점은 혈중 콜레스테롤의 수치를 낮추거나 영양소의 이용률을 높이는데 기여하는 것이다.

유산균은 자연계에 널리 존재하며 탄수화물을 혐기적으로 이용하여 유산을 생산한다. 유산균이 발견되는 자연환경은 다양한데, 사람이나 동물의 장내에 존재할 뿐 아니라, 다양한 채소와 과일에서도 발견되며 요구르트, 우리나라의 김치나 독일의 사우어크라우트(sauerkraut)와 같은 발효식품에서 그 발효과정에 중요한 역할을 담당한다. 이러한 유산균으로는 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 페디오코커스 속(Pediococcus sp.), 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 스포로락토바실러스 속(Sporolactobacilus sp.), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.) 등이 있다. 이들 유산균은 장내로 유입된 후 장내 상피세포에 착생하게 되어 유해 미생물의 장 정착을 방지하고 항균 물질을 분비함으로써 유해 미생물의 생육을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐만 아니라, 면역활성 증진, 항암 작용 등의 효능을 가지고 있다. 유산균이 장내에 유입되어 자체적인 대사활동을 통해 분비하는 물질은 숙주에 많은 이로움을 주기 때문에 유산균을 이용한 많은 연구가 진행되고 있다. 유산균은 대부분 동물의 장내에 정상적으로 존재하며 장내 미생물의 균형을 유지하고 숙주의 건강에 유익한 영향을 끼친다. 따라서 장내 유용한 프로바이오틱스를 선정하기 위해서는 다음의 몇 가지 중요한 성상을 확인하며 선정한다(Fuller, 1989; Garriga et al., 1998; Martin et al., 2006; Mishra and Prasad, 2005). 즉, 유산균이 소화관 내에서도 생존해야하므로, 내산성이나 내담즙성을 가져야하고, 장에 도달할 때까지 소화관에서 콜로니를 형성해야한다. 또한, 식품이나 사료 또는 임상적으로 사용 시 안전해야하며 동시에 숙주에 유 익한 영향을 줄 수 있어야한다. 최근에는 많은 기능적인 특성을 가지고 있는 유산균들이 개발되고 있는데, 병원체의 증식을 억제하는 기능을 갖는 유산균들이 있고, BSH 활성(Begley et al., 2006; Pereira et al., 2003) 또는 전분가수분해 활성(amylolytic activity, Lee et al., 2001; Vizoso Pinto et al., 2006)을 갖는 유산균들이 있다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 장점을 갖고 사료첨가제로 사용할 수 있는 프로바이오틱스 균주를 찾기 위해 예의 연구 노력한 결과, 돼지소장에서 항균 활성을 갖는 신규한 락토바실러스 살리바리우스를 동정하여 사료첨가제로 사용하는 경우, 장내 병원성 세균 억제제, 소화제, 정장제 등의 프로바이오틱 조성물로 제조하여 사료 및 동물용 의약품에 유용하게 활용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 주된 목적은 다양한 병원성 세균에 대해 우수한 항균활성을 나타냄은 물론 내산성 및 내담즙성을 갖는 락토바실러스 살리바리우스 G1-1 균주를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 락토바실러스 살리바리우스 G1-1 균주를 사료첨가제로 사용하여 장내 병원성 세균 억제제, 소화제, 정장제 등의 프로바이오틱 조성물로 제조하여 사료 및 동물용 의약품을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 한국농업미생물지원센터(KACC)에 기탁번호 KACC91449P로 기탁된 균주인 락토바실러스 살리바리우스 G1-1을 제공한다.

본 발명의 락토바실러스 살리바리우스 G1-1에서, 상기 균주는 서열번호 1의 16s rDNA를 갖는다.

본 발명의 락토바실러스 살리바리우스 G1-1에서, 상기 균주는 내산성, 내담즙, 및 장부착능이 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 살리바리우스 G1-1을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제 조성물을 제공한다.

본 발명의 사료첨가제 조성물에서, 상기 사료첨가제는 병원성 세균의 체내 증식을 억제하는 사료첨가제인 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 단계별로 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명은 동물의 건강한 생장을 돕기 위한 목적으로 병원성 미생물에 대한 항균력을 나타내는 새로운 락토바실러스를 동정하고 이를 사료첨가제에 적용한 것이다.

본 발명에서는 상기와 같은 유용한 락토바실러스 즉, 프로바이오틱스(probiotics)로 사용할 수 있는 균주를 얻기 위하여 건강한 돼지의 소장을 채취하여 이용하였다. 이러한 프로바이오틱스 균주를 얻기 위해서는 바닷물, 토양, 식 물, 동물과 같은 자연계의 어떠한 곳에서 채취한 것을 이용하여도 가능하나 가축의 사료첨가물로 사용하기 위한 균주의 동정을 위해서는 건강한 동물의 소화기관을 채취하여 이용하는 것이 바람직하다.

상기 돼지 소장으로부터 순수 분리 배양방법을 이용하여 락토바실러스의 특징을 나타내는 균주들을 순수 분리하였고, 순수 분리된 균주들 중 본 발명에 사용하기에 접합한 균주를 선별하기 위하여 병원성 미생물에 대한 항균력을 평가하였다. 본 발명에서는 Escherichia coli O55, Staphylococcus aureus 및 Salmonella typhimurium을 대상으로 하여 본 발명 락토바실러스 균주의 항균력을 평가하였지만, 이 외에도 병원성 세균으로 알려진 다른 미생물을 사용하여 가능한 많은 병원성 세균에 대한 항균력을 평가하는 것이 더욱 바람직하다.

상기와 같은 조사를 통하여 항균력이 우수한 락토바실러스를 선별한 다음, 이들을 동정하기 위하여 16s rDNA 염기서열을 분석하고, 염기서열을 데이터베이스틀 통해 기존에 알려진 균주들의 염기서열과 비교함으로써 상기 락토바실러스를 동정할 수 있다. 본 발명에서는 상기 방법을 통해 본 발명의 락토바실러스가 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius subsp. salivarius UCC118)와 99% 상동성을 보인다는 것을 확인하였고, 따라서 락토바실러스 살리바리우스 G1-1이라 명명하였다.

이렇게 동정된 락토바실러스를 실제 동물에 적용하였을 때, 상기와 같은 유용한 능력 즉, 항균력 등을 발휘할 수 있는지 확인할 필요가 있다. 본 발명은 상기 락토바실러스를 사료첨가제로 사용하여 동물이 섭취할 수 있도록 하는 것이므로, 섭취된 이후 동물의 소화기관에서 생존할 수 있어야 하며, 장에서 오랫동안 머물러 효과를 발휘해야 하고, 인위적으로 생장이 조절될 수 있어야 하므로 이에 대한 평가를 시도하였다.

상기 평가 방법으로 내산성, 내담즙성, 장내 부착성 및 항생제 내성 평가를 실시하였다. 내산성 평가를 위해서는 동정된 균주를 액체배지에서 배양한 다음 균수를 동일하게 조절하고 각각 pH를 다르게 조절하여 추가 배양하였을 때, 변화된 균수의 차이를 확인함으로써 평가할 수 있고, 내담즙성 평가를 위해서는 내산성 평가와 유사하게 배지에 담즙염을 첨가한 경우와 그렇지 않은 경우의 균수 변화를 확인하여 평가할 수 있다.

장내 부착능의 평가를 위해서는 균주 세포 표면의 비극성을 조사할 수 있는데, 이는 일반적으로 비극성율이 높은 균주가 장관의 뮤코스(mucus)나 상피세포에 잘 부착하고, 비극성율과 대장관 상피세포 부착 사이에는 높은 상관관계를 갖기 때문이다.

항생제 내성 평가를 위해서는 기존에 사용되는 여러 가지 항생제를 디스크를 이용한 방법 또는 배지에 항생제를 첨가하여 이용하는 방법 등으로 균주의 민감도를 확인하여 평가할 수 있다.

상기와 같이 시험관내 실험을 통하여 프로바이오틱스 균주의 유용성을 확인 할 수 있지만, 실제로 동물에 적용하였을 때 효과를 나타낼 수 있는지 확인이 필요하다. 따라서 실제 동물모델을 이용하여 균주를 적용한 다음 이에 따른 동물의 신진대사의 변화를 확인하는 것이 좋다. 이때 동물모델로는 실험을 목적으로 사용할 수 있는 어떠한 동물도 사용할 수 있으나 비교적 사육이 간편한 실험용 렛드를 사용하는 것이 좋다.

균주의 적용에 따른 동물의 신진대사 변화를 평가하기 위해서는 균주를 음수 또는 사료 등을 통해 동물이 섭취하도록 한 다음 증체량의 변화, 혈액 화학치의 변화, 분변 중 미생물 조성, pH 및 수분량의 변화 등을 조사하는 방법을 사용할 수 있다. 또한 동일한 조건으로 병원균을 공격 접종한 다음 상기와 같은 신진대사 변화를 관찰함으로써 실제 동물의 건강 유지에 있어서 본 발명 균주의 항균력을 확인할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 유산균 분리

건강한 돼지에서 유래한 소장을 1g 정도 채취한 후 멸균 식염수로 세척하여 세절하였다. 세절된 소장을 MRS broth에 넣어 24시간 배양 하였다. 배양액 0.1㎖ 취하여 0.5% CaCO₃가 함유된 MRS(100그램 당 포도당 2그램 중, 트윈 80 0.1그램 중, 암모늄 시트레이트 0.2그램 중, 초산염 0.5그램 중, 가수황산마그네슘 0.01그 램 중, 무수황산망간 0.005그램 중, 2염기 인산칼륨 0.2그램 중, 비프 추출물 1그램 중, 효모 추출물 0.5그램 중, 단백질효소처리 펩톤 1그램 중) 한천배지에 스트리킹한 후, 37℃에서 48시간 배양하였다. 콜로니 주위에 투명한 환이 생성된 단일 콜로니를 MRS 한천배지에 접종하여 순수 분리하였다.

실시예 2. 순수 분리된 유산균의 항균력 평가

MRS 한천배지에서 배양한 순수 분리된 락토바실러스 콜로니 10개를 각각 MRS broth에 접종하여 18 내지 20시간 배양하였을 때, 각 락토바실러스 배양액의 pH는 3.79 내지 3.94였다. 이 배양 상층액과 여기에 5N 수산화나트륨으로 pH를 각각 4.5 및 5.0으로 조절한 배양 상층액을 이용하여 Escherichia coli O55, Staphylococcus aureus(ATCC 25923) 및 Salmonella typhimurium(ST302)과 같은 병원성 세균에 대한 항균력을 조사하였다(표 1, E. coli O55에 대한 항균력은 도 1 참조).

[표 1] 병원성 세균 E. coli O55에 대한 항균력

균주명	배양액의 pH	억제환의 직경(mm)
		E. coli O55
		Origin(pH 3.7)	pH 4.5	pH 5.0
A11-1	3.94±0.01	19.7±0.3	14.4±0.6	11.7±0.4
A2-3	3.79±0.01	19.9±0.2	13.2±0.4	12.1±0.2
B4-5	3.88±0.02	17.7±0.6	13.5±0.5	12.0±1.0
E4	3.86±0.03	19.7±0.3	14.5±0.5	12.1±0.1
G1-1	3.89±0.04	20.0±0.0	16.3±0.3	14.8±0.7
G3-4	3.86±0.04	20.0±0.0	16.7±0.7	14.0±0.2
G7-2	3.88±0.01	20.0±0.0	15.2±0.4	13.5±0.5

(평균±표준편차로 표시)

[표 2] 병원성 세균 S. aureus ATCC 25923에 대한 항균력

균주명	배양액의 pH	억제환의 직경(mm)
		E. coli O55
		Origin(pH 3.7)	pH 4.5	pH 5.0
A11-1	3.94±0.01	18.5±0.5	14.5±0.8	±
A2-3	3.79±0.01	19.0±1.0	13.3±0.3	±
B4-5	3.88±0.02	17.9±0.4	13.7±1.2	10.8±0.3
E4	3.86±0.03	20.1±1.0	14.4±0.6	±
G1-1	3.89±0.04	19.6±0.5	16.4±0.4	14.1±0.1
G3-4	3.86±0.04	20.5±0.5	15.6±1.4	14.1±1.0
G7-2	3.88±0.01	19.0±0.3	15.7±0.4	12.1±0.2

(평균±표준편차로 표시)

[표 3] 병원성 세균 S. typhimurium ST302에 대한 항균력

균주명	배양액의 pH	억제환의 직경(mm)
		E. coli O55
		Origin(pH 3.7)	pH 4.5	pH 5.0
A11-1	3.94±0.01	19.2±1.1	15.1±0.1	11.9±0.1
A2-3	3.79±0.01	19.3±1.1	13.5±0.4	11.3±0.3
B4-5	3.88±0.02	19.2±0.8	13.9±0.4	11.7±0.3
E4	3.86±0.03	19.7±0.6	14.5±0.6	11.5±0.5
G1-1	3.89±0.04	20.4±0.5	15.9±0.7	13.1±0.1
G3-4	3.86±0.04	19.1±1.2	15.9±0.8	13.4±0.4
G7-2	3.88±0.01	19.3±0.6	14.7±0.6	12.2±0.3

(평균±표준편차로 표시)

이의 결과, 상기 표 1 내지 표 3에서 보는 바와 같이, 본 발명의 신규 균주인 락토바실러스 G1-1은 위해 병원성세균들에 대한 억제 활성이 우수한 균주인 것으로 확인되었다. 한편, 락토바실러스 G1-1의 중화된 상층액(pH 6.5)을 trypsin과 α-chymiotrypsin으로 처리했을 때 항균력이 완전히 소실되는 것으로 관찰되어 본 발명의 균주 G1-1이 박테리오신을 생성하는 균주임을 확인할 수 있었다(도 2).

실시예 3. 락토바실러스 G1-1의 동정

상기 G1-1 균주를 종 수준에서 동정하기 위해 분자 유전학적 균주 동정 방법인 16S rDNA 부분 서열분석(partial sequecing) 방법을 사용하였고, 16S rDNA 부분 의 염기서열을 결정하였다.

그 결과 서열번호 1의 염기서열이 결정되었고, 결정된 염기서열에 대하여 NCBI(National Center for Biotechnological Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)의 자료를 검색한 결과, 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius subsp. salivarius UCC118)와 99% 상동성을 보였으므로, 이를 락토바실러스 살리바리우스 G1-1로 명명하였다.

상기 균주를 2009년 2월 20일부로 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국농업미생물지원센터(KACC)에 기탁하여 수탁번호 KACC91449P를 부여받았다.

실시예 4. 락토바실러스 살리바리우스 G1-1의 내산성 및 내담즙성 평가

병원성 세균에 대한 억제능이 검증된 본 발명의 균주가 이와 같은 능력을 동물의 소화기관에서 발휘하기 위해서는 소화기관에서 생존하여야 한다. 따라서 본 발명의 균주가 동물의 소화기관에서 생존할 수 있는지를 확인하기 위하여 균주에 대한 내산성 및 내담즙성을 평가하였다.

4-1. 내산성 평가

본 발명의 락토바실러스 살리바리우스 G1-1을 MRS broth에서 18시간 배양한 후 원심분리(3000×g, 15분)하여 펠렛을 인산염완충액(pH 7.2)으로 2번 세척하였다. 세척된 펠렛을 부유액 1㎖에 인산완충액 9㎖를 넣고 용해하여 최종 접종량을 7.2×log CFU/㎖로 맞춘 다음, 4N 염산을 이용하여 pH를 각각 7.2, 3.0 및 2.0로 조절하였다. pH가 조절된 각각의 배양액을 3시간 배양한 후 균수를 log CFU/㎖로 표기 하였을 때, 균수가 각각 7.14±0.05, 7.14±0.03 및 3.97±0.18로 증가하여 본 발명의 균주는 낮은 pH 환경에서도 생장력이 우수한 내산성을 갖는 균주임을 확인할 수 있었다(표 4).

[표 4] 내산성

균주명	내산성(균주수, log₁₀CFU/㎖)
	pH 7.2	pH 3.0	pH 2.0
G1-1	7.14±0.05	7.14±0.03	3.97±0.18*

* Student's t-test 결과 유의성 있는 차이가 있음(P < 0.05).

4-2. 내담즙성 평가

0.3% 담즙염(Difco, 미국)을 첨가한 MRS 배지에서도 균수가 유의성 있는 차이를 보이지 않아(7.0×log CFU/㎖) 본 발명의 균주가 우수한 내담즙성을 갖는 균주임을 확인하였다(표 5).

[표 5] 내담즙성

균주명	내담즙성
	0.3%	1.0%
G1-1	+	-

(- : 자라지 않음, + : 자람)

실시예 5. 락토바실러스 살리바리우스 G1-1의 항생제 내성 평가

본 발명의 균주를 동물에게 사용한 다음 항생제의 사용으로 균주의 생장을 조절할 수 있는지 확인하기 위하여 항생제 내성 양상을 확인하였다. 항생제 내성 평가는 시판되는 항생제 감수성 키트(Sensi-Disc^®, BD Biosciences, Sparks, MD)를 사용하여 수행하였다.

본 발명의 락토바실러스 살리바리우스 G1-1 균주를 MRS 액체배지에 18시간 배양한 후 원심분리(3000×g, 15 min)하여, 펠렛을 두 번 식염수로 세척하였고 식염수에 용해하여 최종 접종량을 10⁸ CFU/㎖의 균수로 조정하였다. 이 용액의 200㎕를 100㎖ 연질 아가(soft agar)에 넣고, 15㎖ 씩 페트리 디쉬(9cm)에 부어 배지를 굳힌 다음 항생제를 함유한 디스크를 배지위에 얹어 37℃에서 48시간 배양한 후 억제환을 측정함으로써 항생제에 대한 감수성을 확인하였다. 이의 결과 대부분의 항생제에 대하여 감수성이 있는 것으로 나타나 본 발명의 균주를 생균제로 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다(표 6).

[표 6] 항생제 내성 양상

항생제	G1-1
Ampicillin(10㎍)	S(sensitive)
Cephalothin(30㎍)	S
Penicillin(10㎍)	S
Vancomycin(30㎍)	R(resistant)
Amikacin(30㎍)	R
Chloramphenicol(30㎍)	S
Erythromycin(15㎍)	S
Rifampin(5㎍)	S

실시예 6. 락토바실러스 살리바리우스 G1-1의 장내 부착능 평가

본 발명 균주가 동물의 소화기관에 장기간 머물러 상기와 같은 효과를 나타내기 위해서는 장내 부착능이 높은 것이 바람직하므로, 균주의 장내 부착능을 평가하였다. 이러한 장내 부착능을 평가하기 위하여 세포표면의 비극성을 조사하였고, 비극성율은 하기 식 1에 의해 평가하였다.

[식 1]

[비극성율(H%) = (1-A1/A0)×100]

세포 표면의 비극성을 조사하기 위해 헥사데칸(hexadecane, Sigma)을 이용하였다. 균주를 MRS 액체배지에서 18시간 배양한 후 원심분리(3000×g, 15 min)하였고, 펠렛을 두 번 식염수로 세척한 다음 깨끗한 식염수에 부유하여 흡광도 600nm에서 0.5로 맞추었다(A0). 1.5㎖의 세척한 균주가 들어있는 시험관에 1.5㎖의 헥사데칸을 가하여 2분간 격렬하게 흔들어 준 다음 시험관을 15분간 정치하여 수용액층이 분리되도록 하였고, 하층의 수용액층을 멸균피펫을 이용하여 주의해서 수집한 다음 600nm에서 흡광도를 측정하였다(A1).

이의 결과, 본 발명의 락토바실러스 살리바리우스 G1-1은 비극성율이 90.1%로 조사되었고, 대조균주로 사용한 락토바실러스 코리니포미스(Lactobacillus coryniformis KCTC 3159)는 5.3%로 매우 낮은 비극성을 보였다(표 7).

[표 7]

균주명	비극성율(%)
G1-1	90.1±6.5
L. coryniformis KCTC 3159	5.3±0

(평균±표준편차, 3반복)

일반적으로 비극성율이 높은 균주가 장관의 뮤코스(mucus)나 상피세포에 잘 부착하고, 비극성율과 대장관 상피세포 부착 사이에는 높은 상관관계를 갖기 때문에 상기 결과를 통하여 본 발명의 균주는 우수한 장 부착능을 보임을 알 수 있었다.

실시예 7. 락토바실러스 살리바리우스 G1-1이 실제 동물에 미치는 영향 평가

본 발명의 균주를 실제로 동물에 적용했을 때, 동물의 신진대사에 미치는 영향 및 유해 미생물의 감염에 대한 방어능력 등을 확인하기 위하여, 균주의 사용에 따른 동물의 체중 변화, 혈액 화학치, 분변 중 미생물의 조성, pH 및 수분량에 미치는 영향 뿐만 아니라 병원균의 공격 접종에 대한 변화를 확인하였다.

락토바실러스 살리바리우스 G1-1을 MRS 배지에서 배양한 후 원심분리(3000×g, 15 min)하여 펠렛을 두 번 식염수로 세척하고 깨끗한 식염수에 용해시킨 다음, 음수에 균주가 5±10⁶CFU/㎖(병원성 세균 실험에서는 5±10⁷CFU/㎖)이 되도록 하여 렛드가 섭취하도록 하였다(처리군).

양성대조군으로는 락토바실러스 에시도필러스(L. acidophilus), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 비피덤(Bifidobacterium bifidum) 이 함유된 시판 생균제(프리마락, 바이엘동물약품)를 사용하여 약 1g의 시판 생균제를 MRS 액체배지에 접종한 다음 상기 G1-1과 동일한 방법으로 준비하였고, 음성대조군으로는 깨끗한 증류수를 사용하여 렛드가 섭취하도록 하였다.

7-1. 증체량의 변화

실험 전 랫드의 평균체중은 122±6g이었으며 실험은 17일간 수행하였고, 체중과 사료섭취량은 초일과 17일째에 측정하였다. 사료효율은 사료섭취량을 증체량으로 나눈 수치로 사료효율 수치가 낮을수록 사료효율이 우수한 것으로 판단할 수 있다.

[표 8] 증체량의 변화

실험군	증체량(g/d)	사료섭취량(g/d)	사료효율	음수섭취량(㎖/d)
음성대조군	9.04±0.31	22.30±0.62	2.47±0.04	36.8±2.7
처리군	9.12±0.37	22.17±0.88	2.43±0.01^*	35.4±1.5
양성대조군	9.01±0.60	21.36±0.90	2.37±0.06^*	36.6±2.6

(* : P < 0.05)

이의 결과 상기 표 8에서와 같이 본 발명의 G1-1 투여군(처리군)에서 사료 효율 수치가 낮게 나와 본 발명의 균주가 사료첨가제로 사용 시에 시판 생균제와 같이 우수한 효과를 가짐을 알 수 있었다.

7-2. 분변의 변화

8, 17일째에 신선한 분변을 채취하고 식염수로 10배 희석하여 혼합한 다음 균질액을 만들어 pH를 측정하였고, 수분은 동결 건조하여 측정하였다. 미생물 측정을 위해서는 분변을 10배씩 단계별로 희석하여 희석한 균질액 중 0.1㎖를 균수측정용 배지인 MRS agar, MacConkey agar, Brilliant Green agar에서 배양하여 미생물수를 측정하였다.

[표 9] 분변의 미생물, pH 및 수분의 변화

실험군	8일
	LAB	Coliform	pH	Moisture
	(log₁₀CFU/g)	(log₁₀ CFU/g)		(%)
음성대조군	9.30±0.11	7.41±0.27	6.13±0.22	50.3±4.1
처리군	9.37±0.05*	7.01±0.25*	6.02±0.07*	47.4±4.5
양성대조군	9.45±0.26*	7.19±0.43*	6.07±0.10*	51.3±5.2
실험군	17일
	LAB	Coliform	pH	Moisture
	(log10 CFU/g)	(log10 CFU/g)		(%)
음성대조군	9.15±0.09	7.13±0.05	5.86±0.02	45.3±3.8
처리군	9.19±0.07*	6.81±0.25*	5.83±0.07	52.8±3.8*
양성대조군	9.30±0.16*	7.05±0.24	5.81±0.05	52.7±0.5*

(LAB : Lactic acid bacteria, * : P < 0.05)

이의 결과, 상기 표 9에서와 같이 처리군의 유해미생물 Coliform이 대조군에 비해 다소 감소한 것으로 확인되어 본 발명의 균주를 사료 첨가제로 사용할 때 장내 유해 미생물을 억제함을 알 수 있었다.

7-3. 혈액 화학치의 변화

17일째에 혈액을 채취하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후 2,000×g에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리한 후, 총콜레스테롤(TCHO), 총글리세라이드(total glyceride, TG), 빌리루빈(Bilirubin, BUN), 리포프로틴(High density lipoprotein, HDLD) 및 아밀레아제의 수준(enzymatic diagnostic kits 사용, Sigma co, USA)을 측정하였다.

[표 10] 혈액 화학치의 변화

실험군	TG	TCHO	BUN	HDLD	AMYL
실험군	(㎎/㎗)	(㎎/㎗)	(㎎/㎗)	(㎎/㎗)	(U/ℓ)
음성대조군	137±29	81±9	15.4±1.1	157±13	2748±132
처리군	139±45	73±6*	14.8±0.9*	161±14*	2830±134
양성대조군	150±33	78±6*	12.4±2.1*	165±18*	2703±122

(* : P < 0.05)

이의 결과, 상기 표 10에서와 같이 본 발명의 G1-1을 투여했을 때(처리군) 혈청 중의 총콜레스테롤치가 유의성 있게 감소하였다.

7-4. 병원성 세균에 대한 방어 효과

병원성 세균으로 사용할 살모넬라균(Salmonella typhimurium D45)은 육계의 설사변에서 분리하였으며, BHI 액체배지(Difco)를 이용하여 37℃에서 24시간 배양하였고, 균수는 BHI 고형배지에 희석법을 사용하여 3회 이상 반복 시험하여 측정하였다.

살모넬라균주를 공격접종 하였을 때, 공격접종 후 11일 간 죽거나 임상증상을 보인 랫드는 없었으며, 표 11에서와 같이 G1-1 투여군에서 증체량, 사료섭취량이 유의성 있게 증가하였다. 사료효율도 우수한 것으로 확인되었다. 시험결과는 평균±표준편차로 표시하였으며, 락토바실러스의 구성분차이는 일방향 아노바 테스트(one-way ANOVA test)를 이용하여 분석하였다.

[표 11] 살모넬라균주에 대한 방어 효과

실험군	증체량(g/d)	사료섭취량(g/d)	사료효율	음수섭취량(㎖/d)
처리군	7.97±1.25^*	19.44±1.52^*	2.48±0.29^*	55.67±5.92
음성대조군	6.05±0.80	16.65±1.59	2.77±0.29	51.77±11.71

(*: P < 0.05)

또한 락토바실러스 살리바리우스 G1-1이 살모넬라균주의 배설에 미치는 영향에 대해 조사하였다. 이의 결과 1일 차에는 8마리 모두에서 살모넬라가 검출되었다. 공격접종 1일 후에 배설되는 살모넬라 균수를 조사한 결과 본 발명의 락토바실러스 균주를 투여한 랫드에서 배설되는 살모넬라 균수의 수가 유의하게 감소하였다(표 12). 3일과 6일 경과 후에 살모넬라가 검출된 개체수를 비교한 결과 본 발명의 락토바실러스 균주 투여군에서 대조군과 비교하여 살모넬라가 검출된 개체수가 유의하게 감소하였다(표 12). 따라서 본 발명의 유산균의 투여가 병원성 세균의 체내 증식을 억제함을 알 수 있었다.

[표 12] 살모넬라균의 체외배출 효과

실험군	접종 후 경과일수
실험군	1일(평균균수)	3일(검출개체)	6일(검출개체)
음성대조군	6.92±0.22	3/8	2/8
처리군	6.00±0.32*	1/8	0/8

(*: P < 0.05)

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 본 발명의 락토바실러스 살리바리우스 G1-1 균주는 다양한 병원성 세균에 대해 우수한 항균활성을 나타냄은 물론 내산성 및 내담즙성 등이 우수하므로, 장내 병원성 세균 억제제, 소화제, 정장제 등의 프로바이오틱 조성물로 제조하여 사료 및 동물용 의약품에 유용하게 활용될 수 있고, 축산 농가의 가축질병으로 인한 경제적 피해를 크게 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 수입 동물용 의약품을 대체할 수 있다.

도 1은 본 발명의 락토바실러스 살리바리우스 G1-1의 E. coli O55에 대한 항균력 평가를 나타내는 사진이다(상: Lactobacillus sp. G1-1, 좌:Lactobacillus sp. B4-5, 우:Lactobacillus sp. A2-3, 및 아래: Lactobacillus sp. E2).

도 2는 본 발명의 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) G1-1(pH 6.5)의 중화된 상층액을 trypsin과 α-chymiotrypsin으로 처리 시 억제환이 사라지고 항균력이 완전히 소실되는 것을 나타내는 사진이다(1: G1-1 원액, 2: catalse 처리, 3: trypsin 처리, 4: pepsin 처리, 5: α-chymotrypsin 처리).

<110> REPUBLIC OF KOREA(Management : Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries. National Veterinary Research and Quarantine Service(NVRQS)) <120> A compound for feed additive comprising Lactobacillus salivarius G1-1 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 807 <212> DNA <213> Lactobacillus salivarius G1-1 <400> 1 gtttgatcat ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtcgaacgaa 60 actttcttac accgaatgct tgtattcacc gtaagaagtt gagtggcgga cgggtgagta 120 acacgtgggt aacctgccta aaagaagggg ataacacttg gaaacaggtg ctaataccgt 180 atatctctaa gggtcgcatg atccttagat gaaagatggt tctgctatcg cttttagatg 240 gacccgcggc gtattaacta gttggtgggg taacggccta ccaaggtgat gatacgtagc 300 cgaactgaga ggttgatcgg ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag 360 gcagcagtag ggaatcttcc acaatggacg caagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg 420 aagaaggtct tcggatcgta aaactctgtt gttagagaag aacacgagtg agagtaactg 480 ttcattcgat gacgtatcta accagcaagt cacggctaac taactacgtg ccagcagccg 540 cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gatttattgg gcgtaaaggg aacgcaggcg 600 gtcttttaag tctgatgtga aagccttcgg cttaaccgga gtagtgcatt ggaaactgga 660 agacttgagt gcagaagagg agagtggaac tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat 720 tatggaagaa caccagtggc gaaagcggct ctctggtctg taactgacgc tgaggttcga 780 aagcgtgggt agcaaacagg attagat 807

Claims

한국농업미생물지원센터(KACC)에 기탁번호 KACC91449P로 기탁된 균주인 락토바실러스 살리바리우스 G1-1.
제 1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 16s rDNA를 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 살리바리우스 G1-1.
제 1항에 있어서, 상기 균주는 항균력, 내산성, 내담즙, 및 장부착능이 있는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 살리바리우스 G1-1.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 락토바실러스 살리바리우스 G1-1을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 사료첨가제는 병원성 세균의 체내 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 사료첨가제 조성물.