KR101978455B1 - 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01 균주 및 이를 포함하는 면역 증강용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 락토바실러스 살리바리우스 균주 DJ-sa-01(Lactobacillus salivarius DJ-sa-01 strain) 및 이를 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 면역 증강 및 항바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 살리바리우스 균주, 상기 균주를 포함하는 면역 증강용 조성물, 사료 또는 사료 첨가제용 조성물에 관한 것이다.

Description

락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01 균주 및 이를 포함하는 면역 증강용 조성물{Lactobacillus salivarius DJ-sa-01 strain and composition for immune enhancement comprising the same}

본 발명은 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01 균주(Lactobacillus salivarius DJ-sa-01 strain) 및 이를 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 면역 증강 효과가 있는 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01 균주, 상기 균주를 포함하는 면역 증강용 조성물, 사료 또는 사료 첨가제용 조성물에 관한 것이다.

가축 사료 내 항생제는 가축 생산성 향상, 유해균 억제, 질병 예방, 사육환경 개선을 목적으로 사용되어 오늘날의 대규모 집약적 축산을 가능하게 하였고, 특히 고밀도 밀집 사육이 이루어지는 양계, 양돈에서 더욱 중요한 역할을 수행하여 왔다. 그러나 가축의 항병성 저하, 내성균 출현, 축산물 내 항생제 잔류, 생태계 파괴 등의 문제가 제기되면서 항생제 사용에 대한 제한 및 규제가 강화되고 있다.

EU에서는 2006년부터 가축사료 내 성장촉진용 항생제의 사용을 전면 금지하였으며, 국내에서도 국가 항생제 내성관리사업의 일환으로 2005년부터 항생제 등 항균 물질 사용 절감 방안이 추진되었다. 이에 사용 가능한 배합사료 제조용 항생제의 종류가 44종에서 16종으로, 2009년에는 9종으로 단계적으로 축소되었으며, 2011년 7월에는 그 사용이 전면 금지되었다. 따라서 항생제 내성 문제를 회피할 수 있고, 친환경적인 새로운 형태의 사료 첨가제 개발에 대한 요구가 있어 왔다.

한편, 김치와 같은 전통 발효 음식에 풍부하게 존재하는 유산균은 인체의 소화계에 공생하면서 섬유질 및 복합 단백질들을 분해하여 중요한 영양 성분으로 만드는 역할을 담당한다. 이와 같이 사람을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물을 통칭하여 프로바이오틱스라고 한다. 프로바이오틱스로서 효과가 있기 위해서는 경구로 섭취하여 소장에 도달해서 장 표면에 부착하여 유지되어야 하므로, 기본적으로 내산성, 내담즙산성, 및 장상피세포 부착능력이 우수하여야 한다.

김치와 같은 전통발효식품에서 발견되는 대표적인 프로바이오틱스로서 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 유산균이 있다. 락토바실러스속 미생물은 동형 또는 이형발효를 하는 젖산 간균으로서 사람을 포함한 동물의 장관 및 유제품이나 채소의 발효과정에서 흔히 볼 수 있다. 락토바실러스속 미생물은 장내 pH를 산성으로 유지시켜 대장균(E. coli)이나 클로스트리디움(Clostridium)과 같은 유해균의 번식을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐만 아니라 비타민 합성, 항암 작용, 혈청콜레스테롤 저하 등의 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 배경기술로는 한국공개특허 제10-2011-0046020(2011.05.04.)이 있으며, 상기 특허에는 신규한 락토바실러스 플란타륨을 이용하여, 이를 포함하는 식품용 조성물, 사료 또는 사료 첨가제용 조성물, 및 화장품용 조성물에 관하여 개시되어 있다.

본 발명의 목적은 항생제 내성 문제를 회피할 수 있고 친환경적인 면역증강 효과가 있는 신규한 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 균주를 외래 유전자가 포함된 벡터(vector)로 형질전환시킨 형질전환체를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 균주를 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 균주를 포함하는 면역 증강용 사료 또는 사료 첨가제용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명자들은 항생제 내성 문제를 회피할 수 있고 친환경적인 면역증강 효과가 있는 새로운 프로바이오틱스 균주를 찾기 위하여, 닭의 장내에서 분리한 신규한 락토바실러스 살리바리우스 균주를 동정하여 이에 대해 유산균으로 활용 가능성을 검정하였다. 또한, 상기 동정한 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01 균주를 동물에게 경구 투여할 경우 체내 독성이 없고, 면역증강 효과가 있다는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 측면에 의하면, 한국농업미생물지원센터(KACC)에 기탁번호 KACC 92210P로 기탁된 균주인 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01(Lacbotacillus salivarius DJ-sa-01)가 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA를 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 균주는 닭의 소장으로부터 분리된 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 균주는 면역증강 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 면역증강은 동물의 장 내 사이토카인을 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 사이토카인은 IFN-β, TNF-α, 및 IL-6 중 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 균주는 항바이러스 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 항바이러스 활성은 동물의 장 내 IFN-γ를 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 동물은 설치류, 조류 또는 포유류일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 균주를 외래 유전자가 포함된 벡터(vector)로 형질전환시킨 형질전환체가 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 균주를 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 사료 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제용 조성물이 제공된다.

본 발명에 의하면, 닭의 소장에서 유래한 신규한 균주인 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01는 면역력 증강 및 항바이러스 활성이 있어 이를 이용하면, 항생제 내성 문제를 회피할 수 있고 친환경적으로 동물의 면역력 및 항바이러스 활성을 개선시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 항바이러스 활성이 있는 단백질 등 기능성 단백질의 운반수단으로서 상기 유산균을 활용할 수 있다.

나아가, 상기 닭의 소장에서 유래한 신규한 균주인 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01를 생쥐에 식이하여 면역증강효과를 확인함으로써, 대상에 적합한 프로바이오틱스로서의 사용뿐 아니라 이를 이용한 항생제 내성이 없는 친환경적인 사료 또는 첨가제의 개발이 가능하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 닭의 소장으로부터 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01를 분리하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 의한 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01 균주의 16S rRNA의 전기영동한 결과이고, 도 2b 내지 도 2e는 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01 균주의 16S rRNA의 염기서열을 나타낸 도면이다.
도 3a 내지 도 3f는 본 발명의 일 실시예에 의한 DNA gyrase subunit B를 이용하여 닭에서 분리 및 동정한 락토바실러스 살리바리우스와 직접염기서열 분석 방법으로 분석한 결과를 다정렬(multialignment)한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의해 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01 균주를 형질전환시키는 Cam 저항성 유전자를 가진 벡터의 모식도이다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 일 실시예에 의한 락토바실러스 살리바리우스DJ-sa-01 균주를 경구 투여 시, 장에서의 지속 시간을 나타낸 그래프이다. 도 5a는 대조군으로서 락토바실러스 카제이의 장에서의 지속시간을 나타내고, 도 5b는 본 발명의 일 실시예에 의한 락토바실러스 살리바리우스의 장에서의 지속시간을 나타낸다.
도 6a 및 도 6b는 본 발명의 일 실시예에 의한 락토바실러스 살리바리우스DJ-sa-01 균주를 경구 투여 시, 각각 생쥐의 체중 및 사료 섭취량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7a 내지 도 7c는 본 발명의 일 실시예에 의한 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01 균주를 경구 투여 시, 각각 생쥐의 장기(간, 장, 비장)의 무게를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01 균주의 경구 투여에 따른 면역증강 및 항바이러스 활성을 나타낸 그래프이다.

본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 뿐만 아니라, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함할 것이다. 일반적으로, 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질과 핵산 화학, 그리고 혼성화와 관련되어 사용되는 명명법과 이와 관련된 기술들은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있는 것이며, 또한 본 발명이 속하는 기술분야에서 일반적으로 사용되고 있는 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 한국농업미생물지원센터(KACC)에 기탁번호 KACC 92210P로 기탁된 균주인 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01(Lacbotacillus salivarius DJ-sa-01)가 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 균주는 닭의 소장으로부터 분리된 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01일 수 있다.

본 발명에서는 상기와 같은 유용한 락토바실러스 즉, 프로바이오틱스(probiotics)로 사용할 수 있는 균주를 얻기 위하여 건강한 닭의 소장을 채취하여 이용하였다. 이러한 프로바이오틱스 균주를 얻기 위해서는 바닷물, 토양, 식물, 동물과 같은 자연계의 어떠한 곳에서 채취한 것을 이용하여도 가능하나 가축의 사료첨가물로 사용하기 위한 균주의 동정을 위해서는 건강한 동물의 소화기관을 채취하여 이용하는 것이 바람직하다(도 1).

닭의 소장으로부터 분리된 락토바실러스 살리바리우스를 동정하기 위하여 16S rRNA 염기서열을 분석하고(도 2b 내지 도 2e), 염기서열을 데이터베이스틀 통해 기존에 알려진 균주들의 염기서열과 비교하였다. 그 결과 본 발명의 락토바실러스는 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius subsp. salivarius UCC118)와 99% 상동성을 보인다는 것을 확인하였고, 따라서 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01라고 명명하였다.

본 발명에 의한 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01 균주는 장에서 지속시간이 상대적으로 길어, 지속시간이 적어도 6일 이상일 수 있다(도 5b). 이러한 특징은 상기 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01 균주를 사료첨가제로 사용하여 동물이 섭취하는 경우, 섭취된 이후 동물의 소화기관에서 생존할 수 있어야 하며 장에서 오랫동안 머물러야 균주의 활성을 발휘할 수 있다는 점에서 중요하다.

상기 본 발명에 의한 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01 균주는 경구 투여 시 동물에서 체내 독성이 없다(도 6a 내지 도 7c).

체내 독성을 확인하기 위해, 실제 동물모델을 이용하여 균주를 적용한 다음 이에 따른 동물의 신진대사의 변화를 확인하는 것이 바람직하다. 이때 동물모델로는 실험을 목적으로 사용할 수 있는 어떠한 동물도 사용할 수 있으나 비교적 사육이 간편한 실험용 랫트를 사용하는 것이 좋다.

균주의 적용에 따른 동물의 신진대사 변화를 평가하기 위해서는 균주를 음수 또는 사료 등을 통해 동물이 섭취하도록 한 다음 증체량의 변화, 혈액 화학치의 변화, 분변 중 미생물 조성, pH 및 수분량의 변화 등을 조사하는 방법을 사용할 수 있다.

보다 구체적으로 살펴보면, 도 6a 및 도 6b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 의한 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01 균주를 경구 투여 시, 생쥐의 체중 및 사료 섭취량에는 변화가 없다. 또한, 도 7a 내지 도 7c에 나타난 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 의한 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01 균주를 경구 투여 시, 생쥐의 장기(간, 장, 비장)의 무게에 변화가 없다. 나아가 본 발명의 일 실시예에 의한 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01 균주를 경구 투여 시, 혈액 내 간 수치, 특히 병원체 침입 시 수치가 증가하는 AST 및 ALT도 정상범위 내에 있다(표 1).

본 발명의 일 실시예에 의한 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01 균주를 경구 투여 시, 세균 전위(bacterial translocation)를 관찰한 결과 미생물의 감염은 없는 것으로 나타났다(표 2).

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 균주는 면역력 증강 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 면역증강은 동물의 장 내 사이토카인 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 사이토카인은 IFN-β, TNF-α, 및 IL-6 중 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 동물은 설치류, 조류 또는 포유류일 수 있다.

상기 균주는 항바이러스 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01일 수 있다.

상기 항바이러스 활성은 동물의 장 내 IFN-γ를 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명에 의한 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01 균주는 경구 투여 시 사이토카인 및 IFN-γ가 크게 증가하여 면역증강 및 항바이러스 활성이 확인되었다(도 8). 상기 면역증강 효과는 IFN-β, TNF-α, 및 IL-6의 증가로 확인할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 균주를 외래유전자를 포함하는 벡터로 형질전환시킨 형질전환체가 제공된다.

본 발명에서 사용되는 용어 "벡터" 는 그것이 결합되어 있는 다른 유전자를 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미하는 것이다. 몇몇 실시예에 있어서, 상기 벡터로서는 플라스미드 즉, 부가 DNA 분절이 결찰될 수 있는 DNA의 환형 이중 사슬 조각이 있다. 몇몇 실시예에 있어서, 상기 벡터로서는 바이러스 벡터 즉, 부가의 DNA 분절이 바이러스 게놈 내에 결찰될 수 있는 벡터가 있다. 몇몇 실시예에 있어서, 상기 벡터는 이 벡터가 도입된 숙주 세포 내에서 자율적으로 복제할 수 있다[예를 들어, 박테리아 복제 기원을 가지는 박테리아 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터]. 다른 실시예에 있어서, 상기 벡터(예를 들어, 비-에피좀 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입됨에 따라서 이 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있으며, 이로써, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 뿐만 아니라, 임의의 벡터는 이 벡터에 작동 가능하도록 결합되어 있는 유전자를 발현시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 “외래유전자”“외래단백질”등은 상기 단백질을 발현하는 형질전환된 숙주세포에서는 정상적으로는 존재할 수 없는 유전자 또는 단백질을 의미한다. 예를 들어 유산균에서 항바이러스 활성이 있는 단백질을 인위적으로 발현하도록 조작하였을 경우, 상기 유전자 또는 단백질을 외래유전자 또는 외래단백질이라고 한다.

유산균은 원유나 자연계에서 분리되어 사용되어 왔으나, 대사 능력이 불안정하고, 제품의 특성에 따라 적합한 균주의 개량이 필요하게 되었다. 형질전환은 새로운 균주를 개발하는데 필수적인 방법이며, 산업적으로 중요한 유산균의 형질분석 및 재조합 유전자 기술은 cloning vector system의 개발이 선행되어야하고, host-vector 체계의 선택이 중요하다(Chassy 등 (1976)).

본 발명에 있어, 형질 전환은 당해 기술 분야에 공지되어 있는 통상적인 기술을 이용하여 수행될 수 있고, 형질 전환 방법에 특별한 제한은 없다. 형질 전환 방법은 protoplast transformation (Lin et al., 1986), conjugation (Ves covo et al., 1983), protoplast fusion(Gasson 1980) 등의 방법이 있다.

Neumann 등(1982)에 의하여 eukaryotic cell의 형질 전환에 이용되었던 electroporation이 최근 electrotransformation과 electrofusion 방법으로 유산균주의 개량에 이용되고 있다. 이는 세포에 강한 전기장을 형성하면 임계전압에서 세포벽과 막이 탈 분극되어 거대분자들이 이동할 수 있는 pore가 형성되는 원리를 이용하여 세포간 유전자의 전이(Reed 1987) 또는 세포 내로의 외부 유전자의 도입 (Hashiba et al., 1990) 그리고 세포 외로의 유전자 전이 등에 응용되고 있다. 이 방법은 외부 유전자의 도입을 위하여 원형질체의 형성 및 재생 과정이 필요하지 않으므로 빠르고 간편하게 수행할 수 있고 plasmid를 갖는 전이균주의 회복에 적절하다는 장점이 있다 (Chassy et al., 1987, Harlander, 1987). McIntyre 등(1989)은 DL- threonine이 성장 배지에 첨가되었을 때, 그리고 Holo와 Nes (1989)는 glys ine과 sucrose 존재 하에서 L. lactis의 형질전환에, 그리고 Hashba 등 (1990)은 Lactobacillus helveticus 균주에서, Aukrus t 등(1988)과 Cosby 등(1989)은 L. plantarum 균주에서 glysine의 첨가가 긍정적인 효과를 나타낸다고 보고하였다. 일반적으로 형질전환에서 DNA의 크기가 클수록 형질전환 효율은 감소하며 DNA의 농도가 증가할수록 형질전환 효율 또한 증가하는 것으로 알려져 있으나, Powell 등(1988)과 McIntyre와 Harender (1989)는 L. lactis 균주에서의 DNA 크기는 형질전환 효율과 관계가 없다고 하였으며, DNA의 농도가 낮을수록 형질전환 효율이 증가하였다고 보고하였다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 외래단백질은 항바이러스 활성이 있는 단백질 등 기능성 단백질일 수 있어, 본 발명의 균주는 이들 단백질의 운반수단으로서 활용 가능하다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 균주를 포함하는 면역 증강용 조성물이 제공된다. 본 발명에 의한 락토바실러스 살리바리우스 균주는 상술한 바와 같은 면역증강 작용 효과가 있어, 이를 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공할 수 있다.

상기 본 발명의 면역 증강용 조성물의 투여방법은 특별히 한정되는 것은 아니나, 경구로 투여하는 것이 바람직하다. 투여량은 면역 증강이 필요한 질환의 종류, 질환의 정도, 연령, 성별, 인종, 치료 또는 예방 목적 등에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 성인을 기준으로 하루에 1천만 마리에서 1000억 마리를 투여할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 면역 증강용 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

상기 "약학적으로 허용 가능한 담체" 는 생리적으로 혼화 가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅물, 항 박테리아 제제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 의미하는 것이다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 예는 물, 염수, 인산염 완충 염수, 덱스트로즈, 글리세롤 및 에탄올 등과 이들의 혼합물이 있다. 다수의 경우, 등장제 예를 들어, 당, 다가 알콜 예를 들어, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 약학적으로 허용 가능한 물질의 부가 예로서는, 항체의 유통 기한 또는 효능을 연장 및 증강시키는 습윤제 또는 최소량의 보조 물질 예를 들어, 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충액이 있다.

본 발명의 조성물은 다양한 형태 예를 들어, 액체, 반고체 및 고체 투여형 예를 들어, 액체 용액(예를 들어, 주사 가능하고, 주입 가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환약, 분말, 리포좀 및 좌제의 형태를 가질 수 있다. 바람직한 형태는 의도로 하는 투여 방식과 치료 방법에 따라서 달라진다. 본 발명의 조성물은 현탁액, 용액 또는 유질 또는 수성 비이클 중 유액의 형태를 취할 수 있으며, 제형화 제제 예를 들어, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전, 적당한 비이클과 함께 사용될 분말형으로 존재할 수 있다.

상기 본 발명에 따른 조성물은 식품으로서 이용될 수 있다. 상기 식품은 건강기능식품 뿐만 아니라, 인간이 널리 통상적으로 매일 섭취하는 일반적인 식품을 포함하는 것이다. 건강기능식품으로서 이용될 경우 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제와 함께 당해 기술 분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 건강기능식품은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 엑스제, 차, 젤리, 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 상기 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제는 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 균주를 포함하는 사료 또는 사료 첨가제용 조성물로서 제공될 수 있다.

본 발명에 의한 균주는 닭 유래 균주로써 독성이 없고 사료 또는 사료첨가제로 이용되어 항바이러스 및 면역증진 효과를 동시에 도모하여 항생제 대체 효과가 있다.

사료로서 이용될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화될 수 있으며, 통상의 사료 성분을 함께 포함할 수 있다.

사료 첨가제로서 이용될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립형태로 제조될 수 있다. 상기 사료 첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 사료 또는 사료첨가제는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성장 촉진제 등을 더 포함할 수 있다.

상기 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구 제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료 첨가제를 동물 사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토오스, 수크로오스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.

상기 사료는 동물의 식이 욕구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분을 포함할 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분, 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다.

또한, 상기 사료 또는 사료 첨가제는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료 첨가제는 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.

본 발명의 사료 또는 사료 첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다. 상기 포유류로서 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물, 및 실험용 설치 동물뿐만 아니라, 애완동물(예: 개, 고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서 송어 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 미생물 락토바실러스 살리바리우스 균주의 분리 및 동정

닭의 소장을 적출하여 균질화(homogenization)하여, 미생물 배양 접시에 스프레딩하여 각 콜로니를 피킹하였다. 분리된 락토바실러스 살리바리우스 균주를 MRS 에 1.5% 의 microagar 가 포함된 고체배지(Difco, USA)에 도말하여 37℃에서 24시간 배양한 후 순수 분리되었음이 확인된 집락(colony)을 취하여 MRS 액체 배지(Difco, US)에서 37℃에서 18-24시간 배양하였다. 도 1에 닭의 소장으로부터 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)를 분리하는 과정을 개략적으로 나타내었다.

또한, 유산균 동정 및 분류를 위한 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다. 16S rRNA 유전자의 염기서열 결정 및 분석은 Marta Encheva-Malinova 등(Marta Encheva-Malinova et. al., Antibacterial potential of streptomycete strains from Antarctic soils. Biotechnology & Biotechnological Equipment, Volume28, June 2014, pages 721-727)의 방법을 사용하였다. 그 결과 확인된 Lactobacillus salivarius의 16S rRNA 유전자의 염기서열은 서열목록에 기재하였다(서열번호 1). 도 2b 내지 도 2e에 16S rRNA 유전자의 염기서열을 나타내었다.

락토바실러스 균주는 16S rRNA 염기서열 분석 결과 락토바실러스 살리바리우스(Lacbotacillus salivarius)와 가장 높은 상동성(99.9%)을 나타내어 락토바실러스 살리바리우스(Lacbotacillus salivarius)으로 동정하고, 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01으로 명명하였으며, 한국 미생물보존센터에 2017년 11월 21일자로 기탁하였다(수탁번호 KACC 92210P).

보존된 유전자(Conserved gene) 중 하나인 DNA gyrase subunit B를 이용하여 닭에서 분리·동정한 락토바실러스 살리바리우스와 NCBI 데이터베이스에 등재된 다른 락토바실러스 살리바리우스 스트레인과 그 서열을 비교해 보았다. 다정렬(Multialign) 프로그램을 통해 DNA gyrase subunit B 서열(서열번호 2)을 비교, 분석해 보았을 때 기존의 락토바실러스 살리바리우스와는 차이가 있음을 확인하였다(도 3a 내지 도 3f 참조).

실시예 2: 락토바실러스 살리바리우스 균주 DJ-sa-01를 외래 유전자가 포함된 벡터로 형질전환시킨 형질전환체 구축

본 발명의 형질전환체는, pSLP111.3 vector로 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01(Lacbotacillus salivarius DJ-sa-01)를 형질전환시켜, 이를 이용하여 클로람페니콜(Chloramphenicol, Cam) 항생제가 첨가된 배지에서 선별할 수 있도록 하였다. 도 4에는 그 결과 구축된 Cam 저항성 유전자를 가진 벡터의 모식도를 나타내었다. 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01의 형질전환 과정은 다음과 같다. Small scale 로 총 3ml 의 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01를 37도 배양기에서 18시간 동안 배양한 이후 MRS 배지에 1% glycine 이 포함된 용액 27ml 을 넣고 O.D 값이 0.3~0.4 가 될 때까지 키웠다. 원심분리 이후 상층액만 버린 이후 남은 pellet을 5mM sodium phosphate 와 1mM MgCl2 가 포함된 washing buffer 1ml로 두 번 washing 하여 원심분리 하였다. 이후 0.9M sucrose 와 3mM MgCl2 가 포함된 electroporation buffer 1ml 로 1번 washing 후 원심분리하여 상층액을 버린 이후 다시 동일한 buffer 1ml을 넣고 잘 섞어주었다. Plasmid 인 pSLP111.3 vector를 700ng 의 농도로 준비하여 준비된 유산균 50ul 와 잘 섞어준 이후 0.2mm cuvette에 넣고 전기 천공을 가하였다. 2.5kV, 25uF, 400Ω 의 조건으로 전기 천공법을 진행한 이후 MRS 450ul를 넣고 e-tube 로 옮겨주었고 37도 배양기에서 2시간~3시간 정도 cell 이 잘 회복이 되도록 배양한 뒤 클로람페니콜 (3ug/ml) 이 포함된 MRS 고체배지에 spreading을 하였다. 산소가 통하지 않도록 차단하고 37도 배양기에서 이틀간 배양 후 나타나는 colony 들을 확보하였고 확보한 colony 들은 형질전환체 균주로 사용되었다.

실시예 3: 락토바실러스 살리바리우스 균주 DJ-sa-01의 장내 생존 평가

상기 실시예 1에서 분리된 균주를 실제로 동물에 적용했을 때, 동물의 장에서의 상기 균주 및 타 균주의 장내 생존 시간을 비교하여 확인하였다.

상기 형질전환된 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01(Lacbotacillus salivarius DJ-sa-01)를 6일 동안 2일 간격으로 3회 생쥐에게 경구 투여를 진행하였다. 상기 벡터로 락토바실러스 살리바리우스를 형질전환 시킨 후 배양하여 수확한 후, 1억 CFU 가 되도록 cell을 확보하였다. 원심분리기를 이용하여 상층액만 버린 이후 MRS 액체 배지 200ul를 넣어주었다. zonde를 이용하여 1억 CFU/200ul 의 형질전환된 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01를 경구 투여한 이후 생쥐 cage 내에 절식판을 설치하여 생쥐가 분변을 다시 재 섭취함으로써 나타나는 변수를 차단하고자 하였다.

매일 생쥐의 분변을 받아 이를 Cam 선별 배지에 도말하여 콜로니(colony)를 관찰하였다. 도 5의 a에 나타난 대조군(control) 그룹인 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)에 비해서 높은 수준으로 콜로니(colony)가 관찰됨을 확인하였으며 상대적으로 긴 시간동안 장에서 지속됨을 확인하였다(도 5의 b).

실시예 4: 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01 균주의 쥐에서의 체내 독성 평가

상기 실시예 2에서 상기 벡터로 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01를 형질전환 시킨 후 배양하여 수확한 후, 1억 CFU/200ul 의 균을 준비하여 6주령의 BALB/C 암컷 마우스에 실제로 생쥐에 경구투여 하였을 때 체내독성이 나타나는지 확인하기 위하여, 14일 동안 1일 1회 생쥐에게 경구 투여를 진행하고 생쥐의 체중 변화 및 사료 섭취량을 측정하였다. 생쥐의 체중 변화 및 사료 섭취량을 측정한 결과를 도 6a 및 도 6b에 나타내었다.

또한, 상기 분리된 균주를 생쥐에게 14일 동안 1일 1회 경구 투여를 진행한 후, 생쥐의 간, 장, 비장을 적출하여 각 장기들의 무게를 측정하였다. 생쥐의 간, 장, 비장의 무게를 측정한 결과를 도 7a 내지 도 7c에 나타내었다.

도 6a 및 도 6b에 따르면, 상기 분리된 균주를 경구투여한 생쥐의 체중 변화 및 사료 섭취량은 PBS를 먹인 그룹과 비교하였을 때, 차이가 나타나지 않음을 확인하였다.

도 7a 내지 도 7c에 따르면, 상기 분리된 균주를 경구투여한 생쥐의 각 장기들의 무게는 PBS를 먹인 그룹과 비교하였을 때, 차이가 나타나지 않음을 확인하였다.

또한, 상기 분리된 균주를 생쥐에게 14일 동안 1일 1회 경구 투여를 진행한 후, 생쥐에서 혈액을 채취하여 혈액 내 성분을 분석하였다. 생쥐의 혈액 내 간 효소인 ALT(Aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransferase)의 수치를 분석한 결과를 모두 정상 범위 내에 있음을 확인하였다(표 1). ALT/AST는 세균(bacteria) 또는 병원균(pathogen)의 침입 시 수치가 상승하는 것으로 알려져 있고, ALT의 정상 범위는 17~77U/L이고, AST의 정상범위는 54~298U/L이었다.

또한, 상기 분리된 균주를 생쥐에게 14일 동안 1일 1회 경구 투여를 진행한 후, 생쥐에서 혈액, 비장, 간 등을 채취하여 미생물의 감염 여부를 세균 전위(bacterial translocation)로 관찰하였다(표 2 참조). 표 2에 따르면, 상기 분리된 균주를 생쥐에게 14일 동안 1일 1회 경구 투여를 진행한 후, 생쥐의 혈액, 비장, 간의 세균 전위는 대조군과 비교하였을 때 문제가 없음을 확인하였다.

실시예 5: 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01 균주의 면역증강효과 확인

락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01의 경구투여에 따른 면역 증강효과를 확인하기 위하여, 다음과 같이 시험을 진행하였다. 2주 동안 1일 1회로 1억 CFU/200ul 의 유산균을 BALB/C 6주령 암컷 마우스에게 투여한 이후 소장 조직을 추출하여 액화질소로 균질화하였다. TRIZOL을 이용하여 장 조직으로부터 total RNA를 추출하였고 DNA 오염을 방지하기 위하여 Recombinant DNase I을 처리하여 DNA를 모두 제거하였다. 사이토카인의 발현 양상을 확인하기 위하여 RNA에서 cDNA로 합성할 때 Oligo dT primer를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 면역 증강효과를 분석하기 위하여 사이토카인의 발현이 증가되었는지의 여부를 quantitative realtime PCR 로 확인하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, 여러 가지 사이토카인인 IFN-β, TNF-α, 및 IL-6의 분비능이 증가한 것은 물론, 항바이러스 단백질인 IFN-γ의 경우에도 대조군인 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)에 비하여 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Lactobacillus salivarius DJ-sa-01 strain and composition for immune enhancement comprising the same <130> NPF-31243 <160> 2 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1550 <212> DNA <213> Lactobacillus salivarius <400> 1 agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac 60 gaaactttct tacaccgaat gcttgcattc accgtaagaa gttgagtggc ggacgggtga 120 gtaacacgtg ggtaacctgc ctaaaagaag gggataacac ttggaaacag gtgctaatac 180 cgtatatctc taaggattgc atgatcctta gatgaaagat ggttctgcta tcgcttttag 240 atggacccgc ggcgtattaa ctagttggtg gggtaacggc ctaccaaggt gatgatacgt 300 agccgaactg agaggttgat cggccacatt gggactgaga cacggcccaa actcctacgg 360 gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg acgcaagtct gatggagcaa cgccgcgtga 420 gtgaagaagg tcttcggatc gtaaaactct gttgttagag aagaacacga gtgagagtaa 480 ctgttcattc gatgacggta tctaaccagc aagtcacggc taactacgtg ccagcagccg 540 cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gatttattgg gcgtaaaggg aacgcaggcg 600 gtcttttaag tctgatgtga aagccttcgg cttaaccgga gtagtgcatt ggaaactgga 660 agacttgagt gcagaagagg agagtggaac tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat 720 atggaagaac accagtggcg aaagcggctc tctggtctgt aactgacgct gaggttcgaa 780 agcgtgggta gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgaatgct 840 aggtgttgga gggtttccgc ccttcagtgc cgcagctaac gcaataagca ttccgcctgg 900 ggagtacgac cgcaaggttg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 960 gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcctttgacc 1020 acctaagaga ttaggttttc ccttcgggga caaagtgaca ggtggtgcat ggctgtcgtc 1080 agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gttgtcagtt 1140 gccagcatta agttgggcac tctggcgaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg 1200 acgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggacggt 1260 acaacgagtc gcgagaccgc gaggtttagc taatctctta aagccgttct cagttcggat 1320 tgtaggctgc aactcgccta catgaagtcg gaatcgctag taatcgcgaa tcagcatgtc 1380 gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatgag agtttgtaac 1440 acccaaagcc ggtggggtaa ccgcaaggag ccagccgtct aaggtgggac agatgattgg 1500 ggtgaagtcg taacaaggta gccgtaggag aacctgcggc tggatcacct 1550 <210> 2 <211> 2022 <212> DNA <213> Lactobacillus salivarius <400> 2 atgccaaaga ataattataa tgatgactca attcaagttc taaaaggcct agaagctgtt 60 agaaagcgtc ctgggatgta cataggttct acagattcac gtggattaca tcacttagta 120 tatgaaatat ttgataacgc agttgatgaa gcactatctg gttatggcaa ggaaattaac 180 gttattattc ataaagatga ttcaataaca gtagtcgata acggacgtgg aatgccagtt 240 ggaatgcatt caatgggaat tccaacagta gaagtaattt ttactgtttt acatgcaggt 300 ggtaaatttg gccaaggcga ctataaaact tcaggcggat tacacggcgt tggtgcttct 360 gtcgttaacg cactctcctc aaagttaact gtaaatactg ttcgagatgg cattgaatat 420 gaagaagatt ttgttaacgg tgggcaacct gtaggaactt tacgtaaaat tggtaaggcc 480 aaacgtaaaa gcggtacaaa agtaactttt aaacctgatg ctaatatttt ttcaacaaca 540 aaatataatt ttaatacttt agcagaaaga ttaagagaat ctgctttctt attaaagggt 600 gtaaagatta ctttaacaga tgaaagaacc gacccatata ctgaagaaga attcttatat 660 gcggaaggaa ttaaagaatt cgtagaatat ttaaatgaag ataaagatgt attaggtcct 720 gtcatgtact ttgaaggtaa aaaagatggt atcgaagttg aagttgcggg ccaatataat 780 gatggatatt ctgaaaatat aatgtcattt gttaataatg tccgtactaa agatggtgga 840 acacacgaag ctggaatgaa agctgcatgg actaagtctt ttaatgagta tgctagaaaa 900 attaaccttc ttaaagacaa agataagaat cttgaaggta gtgacgttcg tgaaggactt 960 tcagcagttg tttctgttcg cattcctgaa gaattactac agtttgaagg acaaactaaa 1020 ggaaaattag gaactcctga agctcgtcaa attgttgata gtgttgttaa tgagcaatta 1080 ggttatttct taatggaaaa tggtgatttt gcccaagagt tagttcgaaa atctattaag 1140 gcacgcgaag cacgtgaagc agcacgtaaa gcacgtgatg aaagtagaaa tggcaaaaag 1200 agacgtaaaa gcgaacgcct attatcaggt aagttaactc ctgcgcaatc taagaatgct 1260 aagcgtaatg aattgttcct agtcgaaggt gattctgctg gtggttcagc aaaacaagga 1320 agagatagaa aattccaagc aatcctacca ttacgaggaa aagtattaaa tacacaaaaa 1380 gccaaattac aagatatcat gaaaaatgaa gaaatcaata ccatgattta tactattggt 1440 gctggagtag gtgcagaatt taacatcgat gatgcaaatt atgataaggt tattatcatg 1500 actgatgctg atactgatgg tgcacatatc cagacattgt tattaacgtt cttctataag 1560 tatatgcgac caatgattaa tgcagggaga gtatacatcg cattaccacc attatataag 1620 attgaaaaaa ctgttaagaa aaagcgcgtt attaagtatg catggactga tgctgaatta 1680 gaaagtgcta ctaaagaact taaaaaagga tacactttac aaagatataa agggttagga 1740 gaaatgaacg ctgatcagct ttgggaaaca actatgaatc cggaaacaag aacgttggtt 1800 cgtgtgagaa tagatgatga tacaatagct gaaaaacgtg ttacaactct aatgggtgat 1860 aaagtagaac ctcgtcgtaa gtggattgaa aaaaatgtta aatttacttt agaagaagat 1920 ggaagcttgt tagatacagt tgtcgctgaa ggagctcatg gcgaaatttc tgacgataag 1980 ttaaaggata cagaggcttt atttgataaa aatgattatt aa 2022

Claims (17)

1. 한국농업미생물지원센터(KACC)에 기탁번호 KACC 92210P로 기탁된 균주이고,
   상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA를 가지며,
   상기 균주는 닭의 소장으로부터 분리된, 면역증강 효과를 갖는, 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01(Lacbotacillus salivarius DJ-sa-01).
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   상기 면역증강은 동물의 장 내 사이토카인을 증가시키는 것으로,
   상기 사이토카인은 IFN-β, TNF-α, 및 IL-6 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01.
6. 삭제
7. 제1항에 있어서, 상기 균주는 항바이러스 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01.
8. 제7항에 있어서,
   상기 항바이러스 활성은 동물의 장 내 IFN-γ를 증가시키는 것인, 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01.
9. 제5항에 있어서,
   상기 동물은 설치류, 조류 또는 포유류인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 살리바리우스 DJ-sa-01.
10. 제1항, 제5항, 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 균주가 포함된 벡터(vector)로 형질전환시킨 형질전환체.
11. 제1항, 제5항, 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 균주를 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 조성물.
12. 제11항에 있어서,
    면역증강은 동물의 장 내 사이토카인을 증가시키는 것으로,
    상기 사이토카인은 IFN-β, TNF-α, 및 IL-6 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 면역 증강용 조성물.
13. 제11항에 있어서,
    항바이러스 활성을 가지는 면역 증강용 조성물.
14. 제11항에 있어서,
    동물의 장 내 IFN-γ를 증가시키는 항바이러스 활성을 가지는, 면역 증강용 조성물.
15. 제11항에 있어서,
    상기 동물은 설치류, 조류 또는 포유류인 것을 특징으로 하는 면역 증강용 조성물.
16. 제1항, 제5항, 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 균주를 유효성분으로 포함하는 사료 조성물.
17. 제1항, 제5항, 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 균주를 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제용 조성물.

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