KR20160007964A - 락토바실러스플란타룸 ｗｉｋｉｍ１８ 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

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KR20160007964A
KR20160007964A KR1020140086872A KR20140086872A KR20160007964A KR 20160007964 A KR20160007964 A KR 20160007964A KR 1020140086872 A KR1020140086872 A KR 1020140086872A KR 20140086872 A KR20140086872 A KR 20140086872A KR 20160007964 A KR20160007964 A KR 20160007964A
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wikim18
lactobacillus plantarum
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lactobacillus
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이종희
박해웅
김태운
강미란
최학종
장자영
임형인
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한국식품연구원
농림수산식품기술기획평가원
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Abstract

본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18은 내산성 및 내담즙성이 우수할 뿐만 아니라 다양한 항생제에 대한 내성이 우수하여 프로바이오틱스로서 사람 또는 동물의 정장, 면역강화 등의 용도를 위해 다양하게 활용될 수 있다.

Description

락토바실러스플란타룸 ＷＩＫＩＭ１８ 및 이를 포함하는 조성물{Lactobacillus plantarum WIKIM18 and composition for comprising the same}
본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
김치와 같은 전통발효음식에 풍부하게 존재하는 유산균은 인체의 소화계에 공생하면서 섬유질 및 복합단백질들을 분해하여 중요한 영양성분으로 만드는 역할을 담당하며, 이와 같이 사람을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물을 통칭하여 프로바이오틱스라고 한다. 프로바이오틱스로서 효과가 있기 위해서는 경구로 섭취하여 소장에 도달해서 장 표면에 부착하여 유지되어야 하므로, 기본적으로 내산성, 내담즙산성, 및 장 상피세포 부착능력이 우수하여야 한다.
김치와 같은 전통발효식품에서 발견되는 대표적인 프로바이오틱스로서 락토바실러스속 (Lactobacillus sp.) 유산균이 있다. 락토바실러스속 미생물은 동형 또는 이형발효를 하는 젖산간균으로서 사람을 포함한 동물의 장관 및 유제품이나 채소의 발효과정에서 흔히 볼 수 있다. 락토바실러스속 미생물은 장내 pH를 산성으로유지시켜 대장균(E. coli)이나 클로스트리디움(Clostridium)과 같은 유해균의 번식을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐만 아니라 비타민 합성, 항암 작용, 혈청 콜레스테롤 저하 등의 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
젖산간균에 의해 생산되는 아시도필린(acidophillin)은 이질균, 살모넬라균, 포도상구균, 대장균 등의 성장을 저해한다고 알려져있다. 또한, 설사원인균의 증식을 억제하고 장내균총을 정상화함으로 설사를 멈추게 하는 작용을 한다(Michael and Philippe, Probiotics and prebiotics: Effects on diarrhea, The journal ofnutrition, Volume 137, March 2007, pages 803S-811S; Roberfroid, Prebiotics and probiotics: Are theyfunctional foods, American journal of clinical nutrition, Volume 71, June 2000, pages 1682S-1687S).
이에 락토바실러스속 미생물의 특성을 이용하여 생균제 및 사료로 개발하고자하는 연구가 활발히 진행되고 있다.
본 발명은 프로바이오틱스로서 요구되는 기본 특성인 내산성 및 내담즙산성이 우수할 뿐만 아니라, 다양한 항생제에 대한 저항성이 우수하고, 설사 환자의 불균형한 장내균총을 정상화시켜 주는 효과가 우수한 신규한 락토바실러스속 유산균 균주를 제공하는 것이다.
이에, 본 발명자들은 전통발효식품으로부터 프로바이오틱스로서 우수한 효과는 나타내는 유산균 균주를 찾고자 노력한 결과, 신규한 락토바실러스속 유산균 균주인 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18을 분리, 동정하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18(Lactobacillus plantarum WIKIM18)은 김치 유래의 락토바실러스 플란타룸 신규 균주이다. 비록 본 발명에서의 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18을 김치에서 분리, 동정하기는 하였으나, 이의 입수 경로가 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에의 실시예를 통해 분리된 전통발효식품으로부터 프로바이오틱스로서 우수한 효과를 나타내는 유산균 균주는 미생물의 동정 및 분류를 위한 16S rRNA 염기서열 분석 결과, 서열번호 1의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다. 또한, 분석 결과, 상기 유산균 균주는 도 1의 트리에서 볼 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 플란타룸과 가장 높은 분자계통학적 유연 관계를 보였다.
따라서, 본 발명의 미생물을 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18(Lactobacillus plantarum WIKIM18)으로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2014년 7월 4일자로기탁하였다(수탁번호 KFCC 11588P).
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18은 그람양성균이며 호기적 조건과 혐기적조건에서 모두 성장이 가능한 통성 혐기성(facultive anaerobe)이며 포자를 형성하지 않고 운동성이 없으며 세포의 형태는 간균이다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18은 프로바이오틱스로서, 유산균의 일반적인 정장 효과 및 면역증강효과를 갖는다.
본 발명에 있어서, '프로바이오틱스(probiotics)'는 사람을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물'이라는 의미로 이해된다. 프로바이오틱스는 프로바이오틱 활성을 갖는 살아있는 미생물로 단일 또는 복합균주 형태로 사람이나 동물에 건조된 세포 형태나 발효산물 형태로 급여될 경우, 숙주의 장내 균총에 유익한 영향을 미칠 수 있다.
프로바이오틱스로 활용되기 위해서는 기본적으로 내산성과 내담즙성을 갖추어야 하며, 사료에 포함시켜 사용할 경우 항생제에 대한 내성이 있어야 한다. 하기 실시예에서는, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18이 pH 4와 0.3% 담즙산염 조건에서 약 20% 생존하여, 낮은 pH와 높은 담즙산염 농도에서도 생육이 유지되는 것을 확인하였다. 11종의 항생제 중 6종의 항생제에 매우 강한 저항성을 보였으며 나머지 5종의 항생제에도 저항성이 뛰어난 것을 알 수 있었다. 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18은 설사 환자의 불균형한 장내 균총을 다시 정상화시키는 것으로 나타났다.
그러므로, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18은 프로바이오틱스로서 사람 또는 동물의 정장, 면역강화 등의 용도를 위해 다양하게 활용될 수 있다.
이에 본 발명의 한 구체예에서는 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18을 포함하는 포함하는 프로바이오틱스 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18은 생균체 또는 사균체로서 존재할 수 있으며, 또한 건조 또는 동결건조된 형태로 존재할 수도 있다. 다양한 조성물 내에 포함시키기 적합한 유산균의 형태 및 제제화 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 한 구체예에서는 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18을 포함하는 정장제 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 정장제 조성물은 사람을 포함한 동물의 장질환의 예방, 치료, 개선에 이용될 수 있으며, 바람직하게는 상기 동물은 소, 말, 돼지와 같은 가축을 포함한다. 상기 '장질환'으로는 장 위해 세균감염 및 염증성 장 질환을 모두 포함하며, 예를 들어 병원성 미생물(대장균, 살모넬라, 클로스트리디움등)에 의한 감염성 설사, 위장염, 염증성 장 질환, 신경성 장염 증후군, 소장 미생물 과성장증, 장 급이성 설사 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 정장제 조성물은 경구로 투여하는 것이 바람직하다. 투여량은 장 질환의 종류, 질환의 정도, 연령, 성별, 인종, 치료 또는 예방 목적 등에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 성인을 기준으로 하루에 1천만 마리에서 1000억마리를 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18을 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공한다. 락토바실러스 속의 유산균이 정장효과 면역 증강 효과를 갖는다는 것은 잘 알려져 있는 사실이다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18은 이러한 정장 및 면역 증강 작용으로 인해 의약, 건강기능식품, 식품, 사료, 또는 사료 첨가제 조성물 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 활용될 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연당, 옥수수감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐아세테이트, 소듐 클로라이드등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
나아가 해당 분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company,Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명은 또한 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 비타민복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아추출물 (예를 들어 레바우디오시드A, 글리시르히진 등]) 및 합성향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종식물추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
상기 본 발명에 따른 조성물은 사료첨가제 또는 사료로서 이용될 수 있다.
사료 첨가제로서 이용될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립 형태로 제조될 수 있다. 상기 사료첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산등의 유기산이나 인산 나트륨, 인산 칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 이용될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화 될 수 있으며, 통상의 사료성분을 함께 포함할 수 있다.
상기 사료첨가제 및 사료는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분,육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분 등을 더포함할 수 있으며, 이외에도 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제 등을 더포함할 수 있다.
상기 사료첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료첨가제는 탑드레싱으로서 또는 이들을 동물사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료첨가제를 동물사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수전분,락토오스, 수크로오스, 콩플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.
상기 사료는 동물의 식이욕구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기곡분을 포함할 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩곡분, 또는 옥수수/콩곡분믹스로 주로 구성되어 있다.
또한, 상기 사료첨가제 및 사료는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료첨가제는 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 발명의 사료 또는 사료첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물식이에 적용할 수 있다.
상기 포유류로서 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치동물, 및 실험용 설치동물 뿐만 아니라, 애완동물(예:개, 고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서송어 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18은 내산성 및 내담즙성이 우수할 뿐만 아니라 다양한 항생제에 대한 내성이 우수하여 프로바이오틱스로서 사람 또는 동물의 정장, 면역강화 등의 용도를 위해 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18의 분자계통학적 유연 관계를 보여주는 트리이다.
도 2는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18의 내산성과 내담즙성 실험 결과를 보여준다.
도 3은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18의 복용 전후의 설사환자의 장내균총에 존재하는 락토바실러스와 클로스트리듐의 수를 비교한 결과를 보여준다.
이하에서, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18의 동정
김치 추출물의 원액을 MRS 배지에 도말하여 얻은 균단일집락을 루프로 수거하여 MRS broth에 배양하였다. DNA추출은 QIAamp DNA Mini Kit (QIAgen, Germany)를 사용하여 추출하였다. 추출된 DNA는 1% 아가로스 겔을 이용하여 확인하였으며, 16S rRNA gene을 증폭하기 위하여 추출된 genomic DNA를 주형으로 하여 518F(5'-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3', forward), 800R (5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3', reverse) 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하였다. PCR 조건은 denaturation 95℃ 1 분, annealing 45℃ 1 분, extension 72℃ 1 분 30초로 30 사이클을 수행하였다. 얻어진 PCR 산물은 마크로젠(Seoul, Korea)에 의뢰하여 서열을 분석하였다. 세균의 동정은 16SrRNA 서열을 National Center for Biotechnology Information(NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov)의 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)검색엔진의 유사도 분석을 통해 수행하였다.
본 발명에의 실시예를 통해 분리된 균주는 미생물의 동정 및 분류를 위한 16S rRNA 염기서열 분석 결과, 서열번호 1의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다. 또한, 분석 결과, 상기 유산균 균주는 neighbor-joining 방법으로 도시한 도 1의 트리에서 볼 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 플란타룸과 가장 높은 분자계통학적 유연 관계를 보였다.
<서열번호 1> 16S rRNA of Lactobacillus plantarum WIKIM18
ACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGAACCTTTAGAACCGCCGCTAAGTGACATGTT
따라서, 본 발명의 미생물을 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18(Lactobacillus plantarum WIKIM18)으로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2014년 7월 4일자로기탁하였다(수탁번호 KFCC 11588P).
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18은 형태학적, 생리학적, 생화학적 분석 결과, 그람양성균이고, 호기적 조건과 혐기적조건에서 모두 성장이 가능한 통성 혐기성(facultive anaerobe)이며 포자를 형성하지 않고 운동성이 없으며 세포의 형태는 간균이다.
실시예 2: 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18의 내산성 , 내담즙성분석
락토바실러스 플란타룸 WIKIM18의 배양은 유산균 배지로 잘 알려진 MRS broth (Difco)를 사용하였다. 산에 대한 유산균의 저항성을 측정하기 위해 HCl로 pH를 조절한 배지를 사용하였으며, 담즙에 대한 저항성 시험은 bile salt로 조절한배지를 사용하였다. 30℃에서 20시간 동안 MRS broth 배지에 배양한 균액을 각 조건배지에 접종(108cfu/ml)하였다. 내산성 시험에 사용된 조건배지는 HCl로 pH를 2, 4로 맞춘 MRS broth 배지이며, 내담즙성 시험에 사용된 조건배지는 bile salt를 각각 0.3%, 1.0% 포함한 MRS broth 배지이다. 각 조건배지에 접종한 후 37℃에서 2시간동안 배양하고 이 균액을 다시 MRS 플레이트에 접종한후 30℃에서 36시간 배양하여 증식 유무를 관찰하고 순수한 MRS broth 배지에 배양한 균집락의 개수와 비교하였다.
도 2는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18의 내산성과 내담즙성 실험 결과를 보여준다. 내산성 시험의 결과 순수한 MRS broth 배지에서 배양한 것과 비교하였을 때, HCl을 첨가하여 pH 4를 맞춘 MRS broth 배지에서 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18 이 18%의 생존율을 보였다. 그러나 pH 2에서는 생존하지 않았다. 내담즙성시험의 결과 0.3% bile salt를 포함한 MRS broth 배지에서 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18 이 15% 생존하였다. 1% bile salt 조건에서는 pH 2에서와 마찬가지로 생존하지 않았다.
실시예 3 :항생제에 대한 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18 의 최소 저해 농도 측정
분리된 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18을 대상으로 반코마이신, 시프로플록사신, 페니실린 G, 케토코나졸, 암포테리신 B, 세파클로르, 트리메토프림, 미노사이클린, 에르트로마이신, 토브라마이신, 리팜피신, 목시플록사신, 젠타마이신, 테트라사이클린, 클로르암페니콜, 플루코나졸에 대한 감수성을 측정하였다. 항생제 농도는 최고 농도 10μg/ml부터 2배 계열희석하여 최소 농도가 0.01μg/ml이 되도록 하였다. 여기에 전배양한 균액을 106 CFU/ml이 되도록 MRS broth 배지로 희석한 후 100μl씩 항생제에 접종하여 배양하고 균주의 성장을 확인할 수 없는 가장 낮은 항생제의 농도를 최소 억제농도(MIC)로 결정하였다. 표준균주로는 E. coli를 사용하였다.
표 1은 항생제 저항성 실험의 결과로 나타난 균주의 최소억제농도를 나타낸 것이다.
[표 1]
Figure pat00001
VAN, 반코마이신; CIP,시프로플록사신; PEN,페니실린 G; KET,케토코나졸; AMP,암포테리신 B; CEF, 세파클로르; TRI,트리메토프림; MIN,미노사이클린; TET, 테트라사이클린; CHL,클로르암페니콜; FLU,플루코나졸;
표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18은 반코마이신, 시프로플록사신, 케토코나졸, 암포테리신 B, 트리메토프림, 플루코나졸 등 6종의 항생제에 10ug/ml 농도에서도 저항성을 가지는 것을 확인하였다. 테트라사이클린은 5ug/ml, 클로르암페니콜은 2.5ug/ml, 페니실린 G와 미노사이클린은 1.25ug/ml농도에 저항성을 보였으며, 세파클로르는 0.15ug/ml 농도 이하에서는 생육이 억제되었다.
실시예 3 : 동결건조 후 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18 의 장내 생존율 측정
세계김치연구소의 기존 연구 결과에 따라 20% 콩가루 수용액을 동결건조보호제로 선정하였다. 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18을 약 1.2 × 1010cfu/ml의 농도로 30℃에서 배양하고 균액을 8000 rpm에서 원심분리한 다음, 상층액을 제거하고 남은 균을 0.85%의 NaCl을 이용하여 세척하였다. 세척이 끝난 균은 20%의 콩가루 수용액과 동일 부피로 혼합하여 2일의 기간 동안 동결건조하였다. 동결건조된 균은 파쇄하여 분말화 시킨 후 캡슐제조장치를 이용하여 약 300 mg의 양이 캡슐에 포함되도록 포장하였다.
임상시험은 자원자에 한하여 인체적용시험예정일(1일)로부터 2주 이내에 병력 및 약물 투여력 조사, 신체검진, 진단검사의학검사 등 스크리닝 검사를 시행하여 연구대상자로서 적합하다고 판단되는 자를 선정하였다. 연구대상자는 전북대학교병원에서 김치 유산균 복합제를 섭취하기 전에 분변을 제공하였다. 그 다음 김치유산균 복합제를 제공받아 7일 동안 항생제유발설사(CDI)에 대한 의학적 표준치료(반코마이신 1회 250mg, 1일 1,000mg 복용)와 유산균 복합제 섭취를 병행하고 7일후에 분변을 제공하였다.
동결건조된 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18을 섭취하였을 때, 섭취 전과 비교하여 장내 미생물 균총의 변화를 분변을 이용하여 metagenomic analysis로 확인하였다.
도 3은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18의 복용 전후의 설사환자의 장내균총에 존재하는 락토바실러스와 클로스트리듐의 수를 비교한 결과를 보여준다.
도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 환자에 따라 약간의 차이는 있었지만 장내에 존재하는 락토바실러스의 비율이 증가하였으며, 유해균속(屬)으로 알려진 클로스트리듐의 비율이 감소한 것을 알 수 있었다.
한국미생물보존센터(국내) KFCC11588 20140704
<110> Korea Food Research Institute Korea institute of planing and evaluation for technology in food, agriculture, forestry and fisheries <120> Lactobacillus plantarum WIKIM19 and composition for comprising the same <130> P14E10C0596 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1456 <212> RNA <213> 16S rRNA of Lactobacillus plantarum WIKIM19 <400> 1 ggcagggcgc tatctgcagt cgacgaactc tggtattgat tggtgcttgc atcatgattt 60 acatttgagt gagtggcgaa ctggtgagta acacgtggga aacctgccca gaagcggggg 120 ataacacctg gaaacagatg ctaataccgc ataacaactt ggaccgcatg gtccgagttt 180 gaaagatggc ttcggctatc acttttggat ggtcccgcgg cgtattagct agatggtggg 240 gtaacggctc accatggcaa tgatacgtag ccgacctgag agggtaatcg gccacattgg 300 gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cacaatggac 360 gaaagtctga tggagcaacg ccgcgtgagt gaagaagggt ttcggctcgt aaaactctgt 420 tgttaaagaa gaacatatct gagagtaact gttcaggtat tgacggtatt taaccagaaa 480 gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga 540 tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt tttttaagtc tgatgtgaaa gccttcggct 600 caaccgaaga agtgcatcgg aaactgggaa acttgagtgc agaagaggac agtggaactc 660 catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa ggcggctgtc 720 tggtctgtaa ctgacgctga ggctcgaaag tatgggtagc aaacaggatt agataccctg 780 gtagtccata ccgtaaacga tgaatgctaa gtgttggagg gtttccgccc ttcagtgctg 840 cagctaacgc attaagcatt ccgcctgggg agtacggccg caaggctgaa actcaaagga 900 attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagct acgcgaagaa 960 ccttaccagg tcttgacata ctatgcaaat ctaagagatt agacgttccc ttcggggaca 1020 tggatacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc 1080 gcaacgagcg caacccttat tatcagttgc cagcattaag ttgggcactc tggtgagact 1140 gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct 1200 gggctacaca cgtgctacaa tggatggtac aacgagttgc gaactcgcga gagtaagcta 1260 atctcttaaa gccattctca gttcggattg taggctgcaa ctcgcctaca tgaagtcgga 1320 atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac 1380 cgcccgtcac accatgagag tttgtaacac ccaaagtcgg tggggaacct ttagaaccgc 1440 cgctaagtga catgtt 1456

Claims (5)

  1. 수탁번호 KFCC11588P의 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18(Lactobacillus plantarum WIKIM18).
  2. 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18을 포함하는 정장제 조성물.
  3. 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18을 포함하는 면역증강용 조성물.
  4. 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18을 포함하는 식품 조성물.
  5. 락토바실러스 플란타룸 WIKIM18을 포함하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물.
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