KR20180044245A - 변비 개선 효능을 갖는 신규한 유산균 및 이의 용도 - Google Patents
변비 개선 효능을 갖는 신규한 유산균 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 변비 개선 효능을 갖는 신규한 유산균 및 이를 포함하는 장 기능 개선 또는 변비 개선용 조성물을 제공한다. 본 발명의 신규 유산균은 프로바이오틱스로서 장내 유해효소를 생성하지 않으며, 소화액 내성, 병원성 미생물 억제능, 항산화능, 세포소수성 및 과산화수소 내성을 보유하고, 분말 조제 시 내산성, 내담즙성 및 가공안정성이 우수하다. 본 발명의 조성물은 장 운동을 증가시키고, 장내 유익균의 분포를 증가시킴으로써 장내 환경을 조절하여 장 기능 및 변비 개선에 효과적으로 작용한다. 본 발명의 신규 유산균 또는 이의 조합을 포함하는 조성물은 장 기능 및 변비 개선 기능성 식품으로 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 변비 개선 효능을 갖는 신규한 유산균 및 이의 용도에 관한 것으로 상기 유산균을 포함하는 장 기능 개선 및 변비 개선용 조성물을 제공한다.
현대 사회의 서구화된 식생활로 인해 육류와 인스턴트 위주의 식품 섭취가 늘어남에 따라 고지혈증, 비만, 장 기능 저하로 인한 변비와 같은 성인병 환자가 급격히 증가하고 있다. 장 기능 저하로 인한 변비는 변비를 유발하는 다양한 원인 중 특발성으로 발생하는 변비로 분류된다. 변비환자 중 90% 이상이 만성 특발성 변비이며 대부분의 경우 대장운동의 저하 또는 직장항문의 운동 이상이 있다. 만성변비는 삶의 질을 저하하고 결장 및 직장암 유발 위험성과 관련이 있는 것으로 보고되고 있다(Gastroenterology Clinics of North America, 1996, Vol. 25(1), pp. 1-19; Diseases of the Colon and Rectum, 2006, Vol. 49(2), pp. 219-227). 이러한 변비 개선을 위해 충분한 식이섬유 등을 섭취하여 증상을 완화시킬 수 있으나, 단지 섬유질의 섭취를 늘리는 것만으로 변비가 해결되는 것은 아니므로 이차적 방법으로 부피형성 완화제 및 삼투성 완화제의 약물을 사용한다. 이러한 약물 복용은 복부 팽만, 설사 등이 동반될 수 있으며, 자극성 하제의 경우, 장기간 복용 시 여러 합병증을 유발할 수 있다. 또한 장기적인 자극성 하제 사용 시, 대장운동을 저하시키는 원인이 되어 지속적으로 복용 시 장 무력증과 같은 부작용이 나타나게 된다. 이러한 부작용들을 고려하였을 때 장 기능 및 변비 개선용 건강기능식품의 개발이 중요하다. 특히 프로바이오틱스의 섭취는 장내 미생물 균총의 조절을 통해 장관 내 음식물 소화시간 개선에 효과를 줄 수 있으며, 몇몇의 연구 결과들을 통해 프로바이오틱스의 섭취가 변비개선에 효과가 있다는 것이 입증되었다(Scand J Gastroenterol Suppl. 2003, Vol.239, pp. 15-23; Symp Swd Nutr Found, 1983, Vol.15, pp. 131-138).
프로바이오틱스에 사용되는 균들은 주로 건강한 사람을 포함한 동물의 장관 및 유제품이나 채소 발효과정에서 흔하게 발견되는 상주균들로 락토바실러스와 비피더스균이 주종을 이룬다(J. Appl. Microbiol., 1989, Vol.66, pp. 365-378). 프로바이오틱 생균제로서 필요한 특성은 안전성(장내 유해효소 생산 가능성), 기능적 측면(생존성, 정착성, 서식성, 병원성 세균의 억제능, 면역 촉진능), 기술적 측면(관능적 특성, 안정성, 제조과정 중의 생존성)을 포함하며 GRAS(Generally Recognized As Safe) 미생물이여야 한다(Journal of the American Dietetic Association, 2001, Vol.101, pp. 229-241; Clin. Infect. Dis., 2008, 1;46 Suppl 2:S115-8).
이러한 프로바이오틱스 미생물들은 장내 환경을 조절하는 장내 세균총을 변화시키고, 숙주의 특정 기관에 영향을 미친다. 특히, 장내 균총과 장 점막 간 상호작용에 영향을 미치는데, 장 점막 부착능과 점액질 분비량, 뮤신(mucin)과 같은 방어물질의 생성 및 장의 운동성을 증진시킨다(Current Drug Metabolism, 2009, Vol. 10, pp. 68-78). 정상적인 장의 운동성은 외재성 신경 세포(extrinsic neuron), 장 운동 신경 세포(enteric motor neuron), 카할 간질세포(interstitial cells of Cajal) 및 평활근 세포(smooth muscle cell)를 통해 조절되며, 이들은 장 신경계로 포함된다. 그리고 장 신경계는 위장관의 기능성을 조절하는 하나의 복잡한 통합된 장뇌를 이루며, 특히 장 신경계 세포 중 카할 간질세포는 평활근과 상호작용하여 장 운동성에 직접적인 영향을 미친다. 몇몇의 연구에서 특정 락토바실러스 계열의 유산균이 in vivo 상에서 장의 운동성에 영향을 미친다는 보고가 있다(Curr. Opin. Pediatr., 2011, Apr;23(2), pp. 145-50).
한편, 프로바이오틱스 미생물은 배양 시점부터 삼투압, pH, 산소 등 다양한 스트레스에 노출될 수 있고 이에 따라 외부환경 변화에 대응하기 위하여 다양한 생리적 반응을 나타낸다는 것이 알려져 있으며, 배양 조건에 따라 이후 공정인 동결건조 과정에서의 생존율에 차이가 난다는 것이 보고되어 있다(Comparative Biochemistry and Physiology Part A, 2001, Vol. 130, pp. 437-460; Journal of Applied Microbiology, 2005, Vol. 99, pp. 13301339; J. Dairy Sci., 2005, Vol. 88, pp. 21-29; Biochemical Engineering Journal, 2010, Vol. 52, pp. 65-70). 또한 섭취한 프로바이오틱스 유산균은 대장에 도달하는 과정에서 다양한 장내 스트레스 환경에 노출된다. 특히, 위장에서는 pH 3 이하의 강한 산성 환경에 노출되고, 소장에서는 분비되는 소화효소와 담즙산 등의 영향을 받아 생존율이 크게 감소할 수 있다. 또한 장에 도달해서도 기존 장내 정착한 미생물과 경쟁함과 동시에 각종 유해성분과 활성산소 등에 의한 성장 저해를 받게 된다(Immunology and Cell Biology, 2000. Vol. 78. pp. 8088; Am J Clin Nutr, 2001, Vol. 73, PP. 393-398(suppl); Probiotics bacteria and Enteric Infections, 2011, Chap. 2, pp. 41-63). 따라서 생균으로서 장 기능성을 개선하기 위해서는 가공안정성 및 장관 환경 안정성을 보유한 유산균 또는 혼합 유산균을 투여하여 장내 정착률을 높여야 한다.
또한 대표적인 프로바이오틱스 유산균들에 관해 장내 우점율 및 유산균 제품 섭취를 통한 장내 유익균총 분포에 대한 다양한 연구들이 진행되고 있다. 장내 균총 분포의 확인을 위한 Microbial community 분석에 대한 연구는 메타게놈(Metagenome)의 연구가 발전하면서 2000년 초부터 많이 이루어지고 있다. 메타게노믹스(Metagenomics) 분야의 발전을 통해 특정 환경에서 기존의 배양 가능한 미생물만 분석하는 것이 아니라 장관 내 존재하는 배양이 어려운 절대 혐기성의 미생물까지 DNA 수준에서 분포를 분석할 수 있게 되었으며, 미생물들의 상호작용에 대한 다양한 연구들을 수행할 수 있게 되었다(Crit. Rev. Microbiol., 1999, Vol.25, pp. 19-38; Crit. Rev. Microbiol., 2000, Vol.26, pp. 37-57; FEMS Microbiol. Lett., 2002, Vol.208, pp. 1-7). 특히, 미생물의 유전자 분석 기술의 적용은 공생 관계의 Lactobailli 속에 대한 생물학적 이해에 많은 장점을 가져다 줄 수 있다 (Nat. Rev. Microbiol., 2009, Vol.7, pp. 61-71). 이러한 관점에서 Next Generation Sequencing(NGS) 기술을 통해 미생물의 whole genome sequence 및 Microbial community에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 기술을 통한 Lactobacillus 종에 대한 연구가 활발히 이루어지고있다(J. Bacteriol., 2008, Vol.190, pp. 3161-3168; Environ. Microbiol., 2009, Vol.12, pp. 758-773). NGS 기술은 시퀀서(sequencer)로부터 얻어진 짧은 단편서열을 참조 서열에 맵핑하여 전체 서열을 완성시킨다. 참조 서열은 각 종별로 다양하게 진행된 유전체 서열 분석 프로젝트가 완성됨에 따라 얻을 수 있다(Curr. Opi. Genet. & Devel., 2006, Vol.16, pp. 545-552). NGS에서의 유전자 구조와 기능 그리고 진화에 대한 대부분의 정보는 시퀀스, 염기서열의 데이터를 통해 얻어지며, 각기 다른 종들에 대한 고품질의 참조 유전자 서열을 통한 가용성 범위의 증가는 전례 없는 규모의 유전적 다양성을 연구 할 수 있는 새로운 기회를 제공한다(Nat., 1998, Vol.393, pp. 537-544; Curr. Opi. Genet. & Devel., 2006, Vol.16, pp. 545-552; Nat., 1997, Vol.387, (6632 Suppl):5; Sci., 1998, Vol.282, pp. 2012-2018; Nat., 2004, Vol.431, pp. 931-945). 또한 차세대 염기서열 분석기술을 뛰어넘은 3세대 염기서열 분석기술이 도래하고 있으며, 다양하고 방대한 양의 미생물 유전자 연구에서 적은 비용으로 단시간에 실험 결과를 얻을 수 있게 되어 새로운 미생물 유전자 분석과 비교분석학의 발전에 기여할 것으로 사료된다. 그러나 이러한 차세대 기술을 활용하여 현재 산업적인 제품으로 응용되는 경우는 매우 적은 실정이며, 기초 단계에서의 연구들이 진행되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 우수한 변비 개선 효능을 나타내고 안정성이 우수한 신규 유산균을 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 과일 발효물, 신생아분변 또는 원유로부터 분리한 균주 가운데 배양성이 우수한 신규 유산균을 선별하고, 이 유산균들이 병원성 미생물에 대하여 항균력을 나타내고, 소화액 및 과산화수소에 대한 내성을 나타내며, 항산화 효능 및 우수한 장내 부착능력을 갖는다는 것을 확인하고, 상기 신규 유산균 단독 또는 이들의 혼합 조성물이 장 점막세포의 생리적인 활성을 유도하고 장내 SCFAs(Short Chain Fatty Acids)의 함량과 장내 유익균총을 증가시킴으로써 배변 활성을 증가시킨다는 것을 실험적으로 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 장 기능 개선 또는 변비 개선용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 변비 개선 효능을 갖는 신규 유산균을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 엔테로코터스 페시움(Enterococcus faecium) CKDB003(수탁번호: KCTC13115BP), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) CKDB007(수탁번호: KCTC13117BP), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) CKDB021(수탁번호: KCTC13118BP), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) CKDB0005(수탁번호: KCTC13116BP) 및 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) CKDB001(수탁번호: KCTC13114BP)로 구성된 유산균으로부터 선택되는 1종 이상의 균주를 혼합하여 제조한 것을 특징으로 하는 장 기능 개선 또는 변비 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 우수한 변비 개선 효능을 나타내고 안정성이 우수한 신규 유산균을 개발하기 위하여 연구 노력하였고 그 결과, 과일 발효물, 신생아분변 또는 원유로부터 분리한 균주 가운데 배양성이 우수한 신규 유산균을 선별하고, 이 유산균이 병원성 미생물에 대하여 항균력을 나타내고, 소화액 및 과산화수소에 대한 내성을 나타내며, 항산화 효능 및 우수한 장내 부착능력을 갖는다는 것을 확인하고, 상기 유산균 또는 이들의 혼합 조성물이 장 점막세포의 생리적인 활성을 유도하고 장내 유익균총을 증가시킴으로써 배변 활성을 증가시킨다는 것을 실험적으로 규명하였다.
본 발명의 장 기능 개선 또는 변비 개선용 조성물에 포함되는 유산균인 엔테로코터스 페시움 CKDB003(수탁번호: KCTC13115BP)은 과일 발효물로부터 분리하였고, 락토바실러스 애시도필러스 CKDB007(수탁번호: KCTC13117BP), 비피도박테리움 락티스 CKDB0005(수탁번호: KCTC13116BP) 및 비피도박테리움 비피덤 CKDB001(수탁번호: KCTC13114BP)은 신생아 분변으로부터 분리하였으며, 스트렙토코커스 써모필러스 CKDB021(수탁번호: KCTC13118BP)은 원유로부터 분리한 신규 유산균이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기의 신규한 유산균들은 프로바이오틱스로서의 기본 성질인 내산성, 내담즙성을 나타내고, 우레아제(Urease), 젤라티나아제(gelatinase) 및 베타글루코시다아제(β-glucosidase)와 같은 장내 유해효소를 생산하지 않으며, 병원성 미생물에 대하여 항균력을 나타낼 뿐 아니라 우수한 항산화능 및 장내 부착능을 나타낸다. 또한, 건강기능식품 원료로서 상용성을 위한 가공안정성이 우수하며, 특히 장 점막의 길이, 점액 분비량, 위장관 운동을 조절하는 카할 간질 세포(interstitial cell of cajal)의 성장을 증진하는 효과가 매우 우수하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 장 기능 개선 또는 변비 개선용 조성물은 상술한 5종의 신규 유산균으로부터 선택되는 1종 이상의 균주를 혼합하여 제조한다. 바람직하게는 상술한 5종의 신규 유산균으로부터 얻은 분말을 1:1:1:1:1의 중량비로 혼합하여 제조한다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 장 기능 개선 또는 변비 개선용 조성물은 상술한 5종의 신규 유산균으로부터 선택되는 1종 이상의 유산균과 식품첨가물로서 사용될 수 있는 유산균 종인 패디오코커스 팬토사세우스(Pediococcus pentosaceus) KID7(수탁번호: KCTC18308P)을 추가적으로 혼합하여 제조할 수 있다. 바람직하게는 상술한 5종의 신규 유산균 및 패디오코커스 팬토사세우스 KID7로부터 얻은 분말을 1:1:1:1:1:1의 중량비로 혼합하여 제조한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 상술한 유산균을 배양하여 균체를 회수하고, 동결건조한 후 분쇄하여 얻은 분말을 혼합하여 생균제 형태로 제조한다. 유산균을 배양한 후 동결건조하여 분말을 얻는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있다. 바람직하게는 배양액을 원심분리한 다음, -60℃ 냉동고에서 급속 동결하고, 0-45℃ 온도 조건에서 동결건조를 실시한 후 분쇄하여 분말을 수득한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 유산균 배양 시 아미노산인 프롤린을 첨가하여 배양함으로써 유산균 자체의 안정성을 높여 장관 내 안정성 및 가공안정성을 증가시킬 수 있다. 바람직하게는 유산균의 배양 후 12-18시간에 프롤린을 1 g/L 내지 10 g/L의 농도로 배지에 첨가하고 4-8시간 추가배양을 실시한다. 하기 실시예에서 검증된 바와 같이, 프롤린을 첨가하여 배양한 후 동결건조한 유산균은 현저히 증가한 내산성, 내담즙성, 동결건조 생존율 및 가속시험 생존율을 나타냈다.
본 발명의 조성물에 포함되는 상기 유산균 분말은 당업계에서 사용되는 통상적인 유산균 코팅제를 첨가하여 제조할 수 있다. 본 발명에서 사용가능한 코팅제로는 키토산(chitosan), 말토덱스트린(malto-dextrin), 난소화성 덱스트린(indigestible dextrin), 잔탄검(xanthan gum, XG), 구아검(guar gum, GG), 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose, CMC), 하이드록시에틸셀룰로오스(hydroxyethylcellulose, HEC), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrroridone, PVP), 카보폴(carbopol), 소듐알기네이트(sodium alginate), 프로필렌글리콜 알기네이트(propylene glycol alginate), 알지네이트(alginate), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG), 트리아세틴(triacetin), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 아세틸트리에틸 시트레이트(acetyl triethyl citrate) 및 트리에틸 시트레이트(triethyl citrate)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 유산균 배양 후 균체를 회수하고, 코팅제 또는 동결보호제로서 말토덱스트린, 트레할로오스, 셀룰로오스 및 프롤린을 추가적으로 첨가한 다음, 동결건조 후 분쇄하여 유산균 분말을 수득한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 변비를 유도한 동물모델에서 본 발명의 조성물은 변의 수, 변의 중량, 변의 수분 함량을 증가시키고, 장 운동을 활성화시켜 분변 및 장내 물질의 이동률을 증가시켰으며, 장 운동성과 관련있는 장 점막 세포의 길이 및 장 점액 분비를 증가시키고, 장 점막 내 평활근을 조절하는 세포로 장의 수축 및 이완 등 장 운동에 관여하는 카할 간질세포(Interstitial cells of Cajal)의 성장을 증가시켰으며, 맹장 내 SCFAs의 함량을 증가시키고, 장내 유익균인 비피도박테리아(Bifidobacteria)의 생장 촉진 및 장내 유익균총인 락토바실러스(Lactobacillus) 속 미생물의 분포를 증가시켰다. 요컨대, 본 발명의 조성물은 장 운동을 증가시키고, 장내 유익균의 분포를 증가시킴으로써 장내 환경을 조절하여 장 기능 및 변비 개선에 효과적으로 작용한다.
본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 상기 유산균 뿐 만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라 이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트 린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스 파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분인 상기 균주 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 대추 추출액 또는 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 식품조성물은 식품, 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 천연소재의 가공 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 상기 유산균 자체를 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 유산균과 변비 개선 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 유산균을 첨가하여 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 유산균을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다.
본 발명에 약제학적 조성물은 하기의 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제. 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 활택제, 결합제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 1종 이상 사용할 수 있다. 붕해제로는 한천, 전분, 알긴산 또는 이의 나트륨염, 무수인산일수소 칼슘염 등이 사용될 수 있고, 활택제로는 실리카, 탈크, 스테아르산 또는 이의 마그네슘염 또는 칼슘염, 폴리에틸렌 글리콜 등이 사용될 수 있으며, 결합제로는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨카복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리딘, 저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스 등이 사용될 수 있다. 이외에도 락토즈, 덱스트로오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로오스. 글리신 등을 희석제로 사용할 수 있으며, 경우에 따라서는 일반적으로 알려진 비등 혼합물, 흡수제, 착색제, 향미제, 감미제 등을 함께 사용할 수 있다.
상기 조성물은 멸균되거나 또는 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 변비 개선 효능을 갖는 엔테로코터스 페시움(Enterococcus faecium) CKDB003(수탁번호: KCTC13115BP)을 제공한다. 엔테로코터스 페시움 CKDB003은 서열목록 제1서열의 16S rRNA 서열을 갖는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 변비 개선 효능을 갖는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) CKDB007(수탁번호: KCTC13117BP)을 제공한다. 락토바실러스 애시도필러스 CKDB007은 서열목록 제2서열의 16S rRNA 서열을 갖는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 변비 개선 효능을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) CKDB021(수탁번호: KCTC13118BP)를 제공한다. 스트렙토코커스 써모필러스 CKDB021는 서열목록 제3서열의 16S rRNA 서열을 갖는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 변비 개선 효능을 갖는 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) CKDB0005(수탁번호: KCTC13116BP)를 제공한다. 비피도박테리움 락티스 CKDB0005는 서열목록 제4서열의 16S rRNA 서열을 갖는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 변비 개선 효능을 갖는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) CKDB001(수탁번호: KCTC13114BP)을 제공한다. 비피도박테리움 비피덤 CKDB001은 서열목록 제5서열의 16S rRNA 서열을 갖는다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 변비 개선 효능을 갖는 신규한 유산균 및 이를 포함하는 장 기능 개선 또는 변비 개선용 조성물을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명의 신규 유산균은 프로바이오틱스로서 장내 유해효소를 생성하지 않으며, 소화액 내성, 병원성 미생물 억제능, 항산화능, 세포소수성 및 과산화수소 내성을 보유하고, 분말 조제 시 내산성, 내담즙성 및 가공안정성이 우수하다.
(ⅲ) 본 발명의 조성물은 장 운동을 증가시키고, 장내 유익균의 분포를 증가시킴으로써 장내 환경을 조절하여 장 기능 및 변비 개선에 효과적으로 작용한다.
(ⅳ) 본 발명의 신규 유산균 또는 이의 조합을 포함하는 조성물은 장 기능 및 변비 개선 기능성 식품으로 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 유산균 혼합 분말의 섭취가 체중 및 식이효율에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 유산균 혼합 분말의 섭취가 변의 개수, 변의 무게, 변의 수분함량에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 유산균 혼합 분말의 섭취가 장관 내 이동률에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 유산균 혼합 분말의 섭취가 장 점막의 길이에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 5는 본 발명의 유산균 혼합 분말의 섭취가 장 점액질 분비에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 6은 본 발명의 유산균 혼합 분말의 섭취가 카할 간질세포(Interstitial cells of Cajal)의 분포에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 7은 본 발명의 유산균 혼합 분말의 섭취가 장내 비피도박테리움(Bifidobacterium)의 분포에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 8은 맹장 내 분변의 미생물 균총의 16s rRNA 유전자서열 분석을 통하여 장내 유익균인 Lactobacillus 계열의 미생물 군집을 분석한 결과이다.
도 9는 맹장 내 분변의 미생물 중 우점율이 5% 이상인 균종에 대한 처리구간 유사도 차이를 분석한 결과이다.
도 10은 본 발명의 유산균을 이용한 안정성을 높인 유산균 혼합 분말을 제조하는 공정을 도식화 한 것이다.
도 2는 본 발명의 유산균 혼합 분말의 섭취가 변의 개수, 변의 무게, 변의 수분함량에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 유산균 혼합 분말의 섭취가 장관 내 이동률에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 유산균 혼합 분말의 섭취가 장 점막의 길이에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 5는 본 발명의 유산균 혼합 분말의 섭취가 장 점액질 분비에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 6은 본 발명의 유산균 혼합 분말의 섭취가 카할 간질세포(Interstitial cells of Cajal)의 분포에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 7은 본 발명의 유산균 혼합 분말의 섭취가 장내 비피도박테리움(Bifidobacterium)의 분포에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 8은 맹장 내 분변의 미생물 균총의 16s rRNA 유전자서열 분석을 통하여 장내 유익균인 Lactobacillus 계열의 미생물 군집을 분석한 결과이다.
도 9는 맹장 내 분변의 미생물 중 우점율이 5% 이상인 균종에 대한 처리구간 유사도 차이를 분석한 결과이다.
도 10은 본 발명의 유산균을 이용한 안정성을 높인 유산균 혼합 분말을 제조하는 공정을 도식화 한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
Ⅰ. 신규한 유산균의 분리 및 동정
실시예 1: 엔테로코커스 페시움 CKDB003(
Enterococcus faecium
CKDB003)의 동정 및 특성 확인
<1-1> 신규 미생물 분리
본 발명에 사용된 엔테로코커스 페시움 CKDB003 균주는 과일 발표물(토마토,키위, 우유 발효물)에서 시료를 채취하여 멸균 혐기수에 현탁하고 십진희석 후 MRS(ManRogosaSharpe) 고체배지에 도말하고 37℃에서 48시간 동안 배양한 다음 순수 분리하였다. 분리된 균주는 생화학적, 분자생물학적 동정을 실시하였다. 엔테로코커스 페시움 종으로 동정된 33개의 균주에 대한 생리적 특성을 확인하였다. 안전성을 확인하기 위해 용혈 현상 검사, 젤라티나아제(gelatinase) 생성 여부, 우레아제(urease) 생성 여부를 확인하였다. 먼저, 비병원성 균임을 확인하기 위한 용혈 현상 검사는 혈액 한천 배지에 분리된 상기 33개의 균주를 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 균락 주위에 나타나는 용혈환을 관찰하였다. 젤라티나아제 생성 여부는 0.3 g 육분, 0,5 g 펩톤, 12 g 젤라틴 및 100 ml의 MRS 배지를 포함하는 젤라틴 영양 배지를 준비하여, 33개의 균주를 접종하고 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 젤라틴 영양배지를 4℃에 약 4시간 동안 냉장 방치하여 배지의 응고 여부를 확인하였다. 배지가 응고되지 않으면 액화 반응 양성으로 판정하였다. 또한 우레아제 생성 여부는 우레아(urea)와 지시성분인 페놀레드를 포함하는 한천배지를 제조하여 균주 접종 후 암모니아 생성에 대한 지시성분의 색 변화를 통해 생성 유무를 확인하였다. 이후, 최종적으로 배양성과 안전성이 가장 뛰어난 균주 엔테로코커스 페시움 1종을 선별하였다.
<1-2> 미생물 동정(당이용성 분석, 16s rRNA 동정)
① 당 이용성 분석
상기와 같이 선별된 유산균에 대하여 API CHL50 키트를 이용하여 당 이용성을 조사하였다. 분석 결과, 하기 표 1과 같이 글리세롤, L-아라비노오스, 리보오스, 갈락토오스, D-글루코오스, D-프럭토오스, 람노오스, 만니톨, N-아세틸 글루코사민, 알부틴, 에스쿨린, 살리신, 셀로비오스, 말토오스, 락토오스, 멜리비오스, 사카로오스, 트레할로오스, β-겐티오비오스의 당을 이용하는 것을 확인하였다.
기질 | 반응 | 기질 | 반응 |
Blank | - | 에스쿨린 | + |
글리세롤 | w | 살리신 | + |
에리트리톨 | - | 셀로비오스 | + |
D-아라비노오스 | - | 말토오스 | + |
L-아라비노오스 | + | 락토오스 | + |
리보오스 | + | 멜리비오스 | + |
D-자일로스 | - | 사카로오스 | + |
L-자일로스 | - | 트레할로오스 | + |
안도니톨 | - | 이눌린 | - |
β-메틸-자일로사이드 | - | 멜레지토오스 | - |
갈락토오스 | + | D-라피노오스 | - |
D-글루코오스 | + | 아미돈 | - |
D-프럭토오스 | + | 글리코겐 | - |
D-만노오스 | + | 자일리톨 | - |
L-소르보오스 | - | β-겐티오비오스 | + |
람노오스 | w | D-투라노오스 | - |
덜시톨 | - | D-릭소오스 | - |
이노시톨 | - | D-타가토오스 | - |
만니톨 | + | D-푸코오스 | - |
소르비톨 | - | L-푸코오스 | - |
α-메틸-D-만노사이드 | - | D-아라비톨 | - |
α-메틸-D-글루코사이드 | - | L-아라비톨 | - |
N-아세틸 글루코사민 | + | 글루코네이트 | - |
아미그달린 | - | 2-케토-글루코네이트 | - |
알부틴 | + | 5-케토-글루코네이트 | - |
② 16s rRNA 동정
MRS 배지에서 자란 집락(colony)을 채취하여 이중가닥 DNA 시퀀싱(Solgent, Korea)을 실시하였다. 얻어진 서열은 BLAST로 검색하여 스트레인을 동정한 결과, 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium)과 99%의 상동성을 보여, 본 발명의 신규한 미생물이 엔테로코커스 페시움 종에 속하는 균주임을 확인하였다.
실시예 2: 락토바실러스 애시도필러스 CKDB007(
Lactobacillus acidophilus
CKDB007)의 동정 및 특성 확인
<2-1> 신규 미생물 분리
본 발명에 사용된 락토바실러스 애시도필러스 CKDB007 균주는 신생아 분변에서 시료를 채취하여 멸균 혐기수에 현탁하고 십진희석 후 MRS 고체배지에 도말하고 37℃에서 48시간 동안 배양한 다음 순수 분리하였다. 분리된 균주는 생화학적, 분자생물학적 동정을 실시하였다. 락토바실러스 애시도필러스 종으로 동정된 13개의 균주에 대한 생리적 특성을 확인하였다. 안전성을 확인하기 위해 용혈 현상 검사, 젤라티나아제(gelatinase) 생성 여부, 우레아제(urease) 생성 여부를 확인하였다. 먼저, 비병원성 균임을 확인하기 위한 용혈 현상 검사는 혈액 한천 배지에 분리된 상기 13개의 균주를 접종하여 37℃에서 24시간 배양하여 균락 주위에 나타나는 용혈환을 관찰하였다. 젤라티나아제 생성 여부는 0.3 g 육분, 0.5 g 펩톤, 12 g 젤라틴 및 100 ml의 MRS 배지를 포함하는 젤라틴 영양 배지를 준비하여, 13개의 균주를 접종하고 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 젤라틴 영양배지를 4℃에 약 4시간 동안 냉장 방치하여 배지의 응고 여부를 확인하였다. 배지가 응고되지 않으면 액화 반응 양성으로 판정하였다. 또한 우레아제 생성 여부는 우레아(urea)와 지시성분인 페놀레드를 포함하는 한천배지를 제조하여 균주 접종 후 암모니아 생성에 대한 지시성분의 색 변화를 통해 생성 유무를 확인하였다. 이후, 최종적으로 배양성과 안전성이 가장 뛰어난 균주 락토바실러스 애시도필러스 1종을 선별하였다.
<2-2> 미생물 동정(당이용성 분석, 16s rRNA 동정)
① 당 이용성 분석
상기와 같이 선별된 유산균에 대하여 API CHL50 키트를 이용하여 당 이용성을 조사하였다. 그 결과, 하기 표 2와 같이 갈락토오스, D-글루코오스, D-프럭토오스, D-만노오스, α-메틸-D-글루코사이드, N-아세틸 글루코사민, 아미그달린, 에스쿨린, 살리신, 셀로비오스, 말토오스, 락토오스, 사카로오스, 트레할로오스, β-겐티오비오스의 당을 이용하는 것을 확인하였다.
기질 | 반응 | 기질 | 반응 |
Blank | - | 에스쿨린 | + |
글리세롤 | - | 살리신 | w |
에리트리톨 | - | 셀로비오스 | w |
D-아라비노오스 | - | 말토오스 | + |
L-아라비노오스 | - | 락토오스 | + |
리보오스 | - | 멜리비오스 | - |
D-자일로스 | - | 사카로오스 | + |
L-자일로스 | - | 트레할로오스 | + |
안도니톨 | - | 이눌린 | - |
β-메틸-자일로사이드 | - | 멜레지토오스 | - |
갈락토오스 | + | D-라피노오스 | - |
D-글루코오스 | + | 아미돈 | - |
D-프럭토오스 | + | 글리코겐 | - |
D-만노오스 | + | 자일리톨 | - |
L-소르보오스 | - | β-겐티오비오스 | w |
람노오스 | - | D-투라노오스 | - |
덜시톨 | - | D-릭소오스 | - |
이노시톨 | - | D-타가토오스 | - |
만니톨 | - | D-푸코오스 | - |
소르비톨 | - | L-푸코오스 | - |
α-메틸-D-만노사이드 | - | D-아라비톨 | - |
α-메틸-D-글루코사이드 | w | L-아라비톨 | - |
N-아세틸 글루코사민 | + | 글루코네이트 | - |
아미그달린 | w | 2-케토-글루코네이트 | - |
알부틴 | - | 5-케토-글루코네이트 | - |
② 16s rRNA 동정
MRS 배지에서 자란 집락(colony)을 채취하여 이중가닥 DNA 시퀀싱(Solgent, Korea)을 실시하였다. 얻어진 서열은 BLAST로 검색하여 스트레인을 동정한 결과, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)와 100%의 상동성을 보여, 본 발명의 신규한 미생물이 락토바실러스 애시도필러스 종에 속하는 균주임을 확인하였다.
실시예 3: 스트렙토코커스 써모필러스 CKDB021(
Streptococcus thermophilus
CKDB021)의 동정 및 특성 확인
<3-1> 신규 미생물 분리
본 발명에 사용된 스트렙토코커스 써모필러스 CKDB021 균주는 원유에서 시료를 채취하여 멸균 혐기수에 현탁하고 십진희석 후 MRS 고체배지에 도말하고 37℃에서 48시간 동안 배양한 다음 순수 분리하였다. 분리된 균주는 생화학적, 분자생물학적 동정을 실시하였다. 스트렙토코커스 써모필러스 종으로 동정된 25개의 균주에 대한 생리적 특성을 확인하였다. 안전성을 확인하기 위해 용혈 현상 검사, 젤라티나아제(gelatinase) 생성 여부, 우레아제(urease) 생성 여부를 확인하였다. 먼저, 비병원성 균임을 확인하기 위한 용혈 현상 검사는 혈액 한천 배지에 분리된 상기 25개의 균주를 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 균락 주위에 나타나는 용혈환을 관찰하였다. 젤라티나아제 생성 여부는 0.3 g 육분, 0.5 g 펩톤, 12 g 젤라틴 및 100 ml의 MRS 배지를 포함하는 젤라틴 영양 배지를 준비하여, 25개의 균주를 접종하고 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 젤라틴 영양배지를 4℃에 약 4시간 동안 냉장 방치하여 배지의 응고 여부를 확인하였다. 배지가 응고되지 않으면 액화 반응 양성으로 판정하였다. 또한 우레아제 생성 여부는 우레아(urea)와 지시성분인 페놀레드를 포함하는 한천배지를 제조하여 균주 접종 후 암모니아 생성에 대한 지시성분의 색 변화를 통해 생성 유무를 확인하였다. 이후, 최종적으로 배양성과 안전성이 가장 뛰어난 균주 스트렙토코커스 써모필러스 1종을 선별하였다.
<3-2> 미생물 동정(당이용성 분석, 16s rRNA 동정)
① 당 이용성 분석
상기와 같이 선별된 유산균에 대하여 API CHL50 키트를 이용하여 당 이용성을 조사하였다. 그 결과, 하기 표 3과 같이 D-글루코오스, 락토오스, 사카로오스의 당을 이용하는 것을 확인하였다.
기질 | 반응 | 기질 | 반응 |
Blank | - | 에스쿨린 | - |
글리세롤 | - | 살리신 | - |
에리트리톨 | - | 셀로비오스 | - |
D-아라비노오스 | - | 말토오스 | - |
L-아라비노오스 | - | 락토오스 | + |
리보오스 | - | 멜리비오스 | - |
D-자일로스 | - | 사카로오스 | + |
L-자일로스 | - | 트레할로오스 | - |
안도니톨 | - | 이눌린 | - |
β-메틸-자일로사이드 | - | 멜레지토오스 | - |
갈락토오스 | - | D-라피노오스 | - |
D-글루코오스 | + | 아미돈 | - |
D-프럭토오스 | - | 글리코겐 | - |
D-만노오스 | - | 자일리톨 | - |
L-소르보오스 | - | β-겐티오비오스 | - |
람노오스 | - | D-투라노오스 | - |
덜시톨 | - | D-릭소오스 | - |
이노시톨 | - | D-타가토오스 | - |
만니톨 | - | D-푸코오스 | - |
소르비톨 | - | L-푸코오스 | - |
α-메틸-D-만노사이드 | - | D-아라비톨 | - |
α-메틸-D-글루코사이드 | - | L-아라비톨 | - |
N-아세틸 글루코사민 | - | 글루코네이트 | - |
아미그달린 | - | 2-케토-글루코네이트 | - |
알부틴 | - | 5-케토-글루코네이트 | - |
② 16s rRNA 동정
MRS 배지에서 자란 집락(colony)을 채취하여 이중가닥 DNA 시퀀싱(Solgent, Korea)을 실시하였다. 얻어진 서열은 BLAST로 검색하여 스트레인을 동정한 결과, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)와 99%의 상동성을 보여, 본 발명의 신규한 미생물이 스트렙토코커스 써모필러스 종에 속하는 균주임을 확인하였다.
실시예 4: 비피도박테리움 비피덤 CKDB001(
Bifidobacterium bifidum
CKDB001)의 동정 및 특성 확인
<4-1> 신규 미생물 분리
본 발명에 사용된 비피도박테리움 비피덤 CKDB001 균주는 신생아의 분변에서 시료를 채취하여 멸균 혐기수에 현탁하고 십진희석 후 BL 한천배지에 도말하고 37℃에서 48시간 동안 혐기적으로 배양한 다음 순수 분리하였다. 분리된 균주는 생화학적, 분자생물학적 동정을 실시하였다. 비피도박테리움 비피덤 종으로 동정된 7개의 균주에 대한 생리적 특성을 확인하였다. 안전성을 확인하기 위해 용혈 현상 검사, 젤라티나아제(gelatinase) 생성 여부, 우레아제(urease) 생성 여부를 확인하였다. 먼저, 비병원성 균임을 확인하기 위한 용혈 현상 검사는 혈액 한천 배지에 분리된 상기 7개의 균주를 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 균락 주위에 나타나는 용혈환을 관찰하였다. 젤라티나아제 생성 여부는 0.3 g 육분, 0.5 g 펩톤, 12 g 젤라틴 및 100 ml의 MRS 배지를 포함하는 젤라틴 영양 배지를 준비하여, 7개의 균주를 접종하고 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 젤라틴 영양배지를 4℃에 약 4시간 동안 냉장 방치하여 배지의 응고 여부를 확인하였다. 배지가 응고되지 않으면 액화 반응 양성으로 판정하였다. 또한 우레아제 생성 여부는 우레아(urea)와 지시성분인 페놀레드를 포함하는 한천배지를 제조하여 균주 접종 후 암모니아 생성에 대한 지시성분의 색 변화를 통해 생성 유무를 확인하였다. 이후, 최종적으로 배양성과 안전성이 가장 뛰어난 균주 비피도박테리움 비피덤 1종을 선별하였다.
<4-2> 미생물 동정 (당이용성 분석, 16s rRNA 동정)
① 당 이용성 분석
상기와 같이 선별된 유산균에 대하여 API CHL50 키트를 이용하여 당 이용성을 조사하였다. 그 결과, 하기 표 4와 같이 리보오스, 갈락토오스, D-글루코오스, D-프럭토오스, N-아세틸 글루코사민, 락토오스, β-겐티오비오스, 5-케토-글루코네이트의 당을 이용하는 것을 확인하였다.
기질 | 반응 | 기질 | 반응 |
Blank | - | 에스쿨린 | - |
글리세롤 | - | 살리신 | - |
에리트리톨 | - | 셀로비오스 | - |
D-아라비노오스 | - | 말토오스 | - |
L-아라비노오스 | - | 락토오스 | + |
리보오스 | w | 멜리비오스 | - |
D-자일로스 | - | 사카로오스 | - |
L-자일로스 | - | 트레할로오스 | - |
안도니톨 | - | 이눌린 | - |
β-메틸-자일로사이드 | - | 멜레지토오스 | - |
갈락토오스 | + | D-라피노오스 | - |
D-글루코오스 | + | 아미돈 | - |
D-프럭토오스 | + | 글리코겐 | - |
D-만노오스 | - | 자일리톨 | - |
L-소르보오스 | - | β-겐티오비오스 | + |
람노오스 | - | D-투라노오스 | - |
덜시톨 | - | D-릭소오스 | - |
이노시톨 | - | D-타가토오스 | - |
만니톨 | - | D-푸코오스 | - |
소르비톨 | - | L-푸코오스 | - |
α-메틸-D-만노사이드 | - | D-아라비톨 | - |
α-메틸-D-글루코사이드 | - | L-아라비톨 | - |
N-아세틸 글루코사민 | + | 글루코네이트 | - |
아미그달린 | - | 2-케토-글루코네이트 | - |
알부틴 | - | 5-케토-글루코네이트 | w |
② 16s rRNA 동정
BL 한천배지에서 자란 집락(colony)을 채취하여 이중가닥 DNA 시퀀싱(Solgent, Korea)을 실시하였다. 얻어진 서열은 BLAST로 검색하여 스트레인을 동정한 결과, 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)와 100%의 상동성을 보여, 본 발명의 신규한 미생물이 비피도박테리움 비피덤 종에 속하는 균주임을 확인하였다.
실시예 5: 비피도박테리움 락티스 CKDB005(
Bifidobacterium lactis
CKDB005)의 동정 및 특성 확인
<5-1> 신규 미생물 분리
본 발명에 사용된 비피도박테리움 락티스 CKDB005 균주는 신생아 분변에서 시료를 채취하여 멸균 혐기수에 현탁하고 십진희석 후 BL 한천배지에 도말하고 37℃에서 48시간 동안 혐기적으로 배양한 다음 순수 분리하였다. 분리된 균주는 생화학적, 분자생물학적 동정을 실시하였다. 비피도박테리움 락티스 종으로 동정된 16개의 균주에 대한 생리적 특성을 확인하였다. 안전성을 확인하기 위해 용혈 현상 검사, 젤라티나아제(gelatinase) 생성 여부, 우레아제(urease) 생성 여부를 확인하였다. 먼저, 비병원성 균임을 확인하기 위한 용혈 현상 검사는 혈액 한천 배지에 분리된 상기 16개의 균주를 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 균락 주위에 나타나는 용혈환을 관찰하였다. 젤라티나아제 생성 여부는 0.3 g 육분, 0.5 g 펩톤, 12 g 젤라틴 및 100 ml의 MRS 배지를 포함하는 젤라틴 영양 배지를 준비하여, 16개의 균주를 접종하고 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 젤라틴 영양배지를 4℃에 약 4시간 동안 냉장 방치하여 배지의 응고 여부를 확인하였다. 배지가 응고되지 않으면 액화 반응 양성으로 판정하였다. 또한 우레아제 생성 여부는 우레아(urea)와 지시성분인 페놀레드를 포함하는 한천배지를 제조하여 균주 접종 후 암모니아 생성에 대한 지시성분의 색 변화를 통해 생성 유무를 확인하였다. 이후, 최종적으로 배양성과 안전성이 가장 뛰어난 균주 비피도박테리움 락티스 1종을 선별하였다.
<5-2> 미생물 동정(당이용성 분석, 16s rRNA 동정)
① 당 이용성 분석
상기와 같이 선별된 유산균에 대하여 API CHL50 키트를 이용하여 당 이용성을 조사하였다. 그 결과, 하기 표 5와 같이 L-아라비노오스, 리보오스, D-자일로스, 갈락토오스, D-글루코오스, D-프럭토오스, α-메틸-D-글루코사이드, 아미그달린, 알부틴, 에스쿨린, 살리신, 셀로비오스, 말토오스, 락토오스, 멜리비오스, 사카로오스, D-라피노오스, β-겐티오비오스, D-투라노오스, 5-케토-글루코네이트의 당을 이용하는 것을 확인하였다.
기질 | 반응 | 기질 | 반응 |
Blank | - | 에스쿨린 | + |
글리세롤 | - | 살리신 | + |
에리트리톨 | - | 셀로비오스 | + |
D-아라비노오스 | - | 말토오스 | + |
L-아라비노오스 | + | 락토오스 | + |
리보오스 | + | 멜리비오스 | + |
D-자일로스 | + | 사카로오스 | + |
L-자일로스 | - | 트레할로오스 | - |
안도니톨 | - | 이눌린 | - |
β-메틸-자일로사이드 | - | 멜레지토오스 | - |
갈락토오스 | + | D-라피노오스 | + |
D-글루코오스 | + | 아미돈 | - |
D-프럭토오스 | w | 글리코겐 | - |
D-만노오스 | - | 자일리톨 | - |
L-소르보오스 | - | β-겐티오비오스 | + |
람노오스 | - | D-투라노오스 | w |
덜시톨 | - | D-릭소오스 | - |
이노시톨 | - | D-타가토오스 | - |
만니톨 | - | D-푸코오스 | - |
소르비톨 | - | L-푸코오스 | - |
α-메틸-D-만노사이드 | - | D-아라비톨 | - |
α-메틸-D-글루코사이드 | + | L-아라비톨 | - |
N-아세틸 글루코사민 | - | 글루코네이트 | - |
아미그달린 | + | 2-케토-글루코네이트 | - |
알부틴 | w | 5-케토-글루코네이트 | w |
② 16s rRNA 동정
BL 한천배지에서 자란 집락(colony)을 채취하여 이중가닥 DNA 시퀀싱(Solgent, Korea)을 실시하였다. 얻어진 서열은 BLAST로 검색하여 스트레인을 동정한 결과, 비피도박테리움 애니말리스 subsp. 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis)와 100%의 상동성을 보여, 본 발명의 신규한 미생물이 비피도박테리움 애니말리스 subsp. 락티스 종에 속하는 균주임을 확인하였다.
Ⅱ. 신규한 유산균의 특성 비교 평가
실시예 6: 유산균 안전성 평가
상기에 선별된 유산균들의 안전성을 평가하기 위해 장내 유해효소의 일종인 우레아제(Urease), 젤라티나아제(Gelatinase) 및 베타글루코시다아제(β-glucosidase) 생성 여부를 확인하였다. 선별된 유산균들과 유산균 표준 균주와의 비교를 위해 스트랩토코커스 써모필러스 KCTC5098(Streptococcus thermophilus KCTC5098)을 한국생명공학연구원(KCTC)에서 분양받아 비교 검증을 수행하였다.
상세하게는, 우레아제(Urease) 분비능을 확인하기 위해 하기 표 6과 같은 조성의 배지를 제조하였으며, 그 방법은 전체용량의 1.5%의 한천(agar)을 정량한 후에 전체용량의 90% 증류수에 녹여 고압멸균한 후, 한천을 제외한 나머지 성분을 전체용량의 10% 증류수에 녹여 준 후 필터하여 식은 한천 용액과 섞어 고체배지로 만들었다. 이후 배지적합성 확인을 위해 NaOH를 떨어뜨려 페놀레드에 의해 붉은색으로 변색 유무를 확인하였다. 확인된 배지에 상기 신규 유산균 및 표준 유산균을 도말한 후 37℃에서 48시간 동안 배양하여 유산균이 우레아제를 생성하여 생산된 암모니아에 의해 배지가 붉은색으로 변색되는지 유무를 확인하였다.
성분명 | 첨가량 (g/100ml) |
우레아(Urea) | 2 |
염화나트륨(NaCl) | 0.5 |
인산칼륨(KH2PO4) | 0.2 |
펩톤(Peptone No.3) | 0.1 |
포도당(Glucose) | 0.1 |
페놀 레드(Phenol red) | 0.0012 |
한천(Agar) | 1.5 |
그 결과, 표준 균주 및 신규 유산균 모두 배지가 변색되지 않아 우레아제를 생성하지 않는 것을 확인하였다(표 8).
추가적으로 젤라티나아제(gelatinase) 효소 활성을 배지 액화반응으로 확인하였다. 세균의 병원성은 세포의 침입능력에 좌우되는 경우가 많으며, 세포침입에는 단백질 분해력이 필요하다. 젤라틴 액화시험은 젤라틴을 가수분해하는 능력을 판정하는 시험으로 단백질 분해능을 조사하는 방법 중 하나이다. 하기 표 7과 같은 조성으로 배지를 제조하여 멸균 후, 충분히 식힌 다음 상기 유산균 각각을 1%씩 접종하여 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 이후, 냉장 보관하여 배지의 고화 또는 액화 상태를 확인하였다.
성분명 | 첨가량 (g/100ml) |
육분(Beef extract) | 0.3 |
펩톤(Peptone No.3) | 0.5 |
젤라틴(Gelatin) | 12 |
MRS 액체 배지 | 5.5 |
유산균이 젤라티나아제를 분비할 경우, 젤라틴이 가수분해되어 액화상태가 되는데, 상기 균주들을 접종한 배지는 모두 고체화되어 젤라티나아제를 생성하지 않는 것을 확인하였다(표 8).
베타글루코시다아제의 생성 유무를 판단하기 위하여, 2 mM p-nitriphenyl-β-D-glucopyranoside 0.8 ml 과 유산균이 현탁된 샘플 0.2 ml로 구성된 반응액 1 ml을, 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 0.5 N NaOH 1 ml을 첨가하여 효소 활성 반응을 불활성화 시켰다. 효소 반응이 종결된 용액을 3,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후, 상등액에 대하여 405 nm에서 흡광도를 측정하여 역가를 확인하였다. 그 결과, 상기의 모든 유산균들이 베타글루코시다아제를 생성하지 않는 것을 확인하였다(표 8).
신규한 유산균들이 모두 장내 유해효소를 생성하지 않는 것을 확인함으로써, 안전성을 입증하였다.
- | 유해 효소 | ||
우레아제 | 젤라티나아제 | 베타글루코시다아제 | |
E. faecium CKDB003 | 음성 | 음성 | 음성 |
L. acidophilus CKDB007 | 음성 | 음성 | 음성 |
S. thermophilus CKDB021 | 음성 | 음성 | 음성 |
B. bifidum CKDB001 | 음성 | 음성 | 음성 |
B. lactis CKDB005 | 음성 | 음성 | 음성 |
S. thermophilus KCTC5098 | 음성 | 음성 | 음성 |
실시예 7: 신규한 유산균들의 병원성균 억제능 비교 평가
상기에 선별된 유산균들과 대조군 유산균으로 스트랩토코커스 써모필러스 KCTC5098의 장내 유해세균 및 식중독 유발 병원성 미생물에 대한 억제능을 비교 분석하였다.
구체적으로, 신규한 유산균 및 종래의 유산균 표준 균주를 37℃에서 12시간 동안 배양한 후, spot-on-lawn assay(Int. J. Food Microbiol., 2001, Vol.70, pp. 291301) 방법을 통해 병원성균 억제능을 확인하였다. 대표적인 식중독 유발 원인균인 리스테리아 모노사이토제네스 2가지 균주(Listeria monocytogenes KCCM43155, Listeria monocytogenes KCCM40307)와 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus ATCC 6538) 균주를 지시균으로 고체배지에 도말한 후 배양한 유산균 배양액 및 상등액을 채취하여 20 μl 씩 접종하고 37℃에서 24시간 배양한 후 투명환의 유무를 확인하여 항균력을 확인하였다. 그 결과, 대조구 스트랩토코커스 써모필러스 KCTC5098와 5종의 신규 유산균 모두 리스테리아 모노사이토제네스 KCCM40307 균주에 대한 항균활성 양성반응이 있음을 확인하였다. 또한 신규 유산균 중 스트랩토코커스 써모필러스 CKDB021과 비피도박테리움 락티스 CKDB005는 리스테리아 모노사이토제네스 KCCM43155 균주에 대한 항균력도 보유하고 있는 것을 확인하였다. 특히, 신규 유산균 중 엔테로코커스 페시움 CKDB003은 스타필로코쿠스 아우레우스 ATCC6538에 대한 항균력도 보유하는 것을 확인하였다(표 9).
유산균 | 항균활성(+ ; 양성, - ; 음성) | ||
L. monocytogenes | S. aureus KCTC1916 | ||
KCCM43155 | KCCM40307 | ||
E. faecium CKDB003 | - | + | + |
L. acidophilus CKDB007 | - | + | - |
S. thermophilus CKDB021 | + | + | - |
B. bifidum CKDB001 | - | + | - |
B. lactis CKDB005 | + | + | - |
S. thermophilus KCTC5098 | + | + | - |
실시예 8: 신규한 유산균들의 소화액 내성 비교 평가
상기에 선별된 유산균들과 대조군 유산균(스트랩토코커스 써모필러스 KCTC5098)의 pH 내성 및 담즙산염에 대한 내성을 비교 분석하였다.
pH에 대한 내성을 확인하기 위하여, 염산을 이용하여 pH 2.5로 조절한 MRS 액체배지를 제조하였다. 각각의 균주들을 상기 배지에 1%씩 접종한 후 초기균수를 측정하기 위하여 혐기희석액(pH 6.2)으로 십진 희석한 후 1 ml 분주하고 MRS 고체배지를 이용하여 pouring 후 37℃에서 48시간 배양하였다. 균주를 접종한 pH 2.5인 MRS 액체배지를 37℃ 수조에서 2시간 동안 정치배양 한 후 위와 동일한 방법으로 MRS 고체배지에 배양하였다. 배양 후에 나타난 집락(colony)을 계수하여 pH에 대한 내성을 측정하였다. 실험 결과, 표 10에서와 같이 pH 2.5에서 비피도박테리움 락티스 CKDB005의 내산성이 가장 우수한 것으로 확인되었으며, 신규한 유산균들 모두 대조군인 스트렙토코커스 써모필러스 KCTC5098(내산성 10%)보다 높은 12% 이상의 생존력을 유지하는 것을 확인하였다.
담즙내성을 확인하기 위하여, Gilliland와 Walker(1990)의 방법을 이용하여 MRS 액체배지에 0.3% 옥스갈(Sigma, USA)을 첨가하여 2차 계대배양이 끝난 유산균을 1% 접종하였다. 대조군으로는 0.3% 옥스갈을 첨가하지 않은 MRS 액체배지에 유산균을 동량 접종하였다. 모든 시료들은 37℃ 수조에서 배양하여 2시간 후에, 각각의 유산균 생장 고체배지에서 배양하여 통상적인 방법에 따라 미생물수를 계측하였다. 실험 결과, 5종의 유산균 중 락토바실러스 애시도필러스 CKDB007의 생존율이 65%로 가장 높았으며 스트랩토코커스 써모필러스 CKDB021을 제외한 4종의 균주 모두 대조군에 비해 23% 이상의 담즙내성을 보였다(표 10).
균주 | 내산성 | 담즙내성 |
(인공위액 pH 2.5) | (0.3% oxgall) | |
생존율(%) | 생존율(%) | |
E. faecium CKDB003 | 38 | 50 |
L. acidophilus CKDB007 | 45 | 65 |
S. thermophilus CKDB021 | 12 | 25 |
B. bifidum CKDB001 | 15 | 50 |
B. lactis CKDB005 | 49 | 55 |
S. thermophilus KCTC5098 | 10 | 27 |
실시예 9: 신규한 유산균들의 항산화능 평가
상기 신규한 유산균과 표준 균주의 항산화 효과를 비교 확인하기 위하여, DPPH 용액을 이용하여 proton-radical scavanger에 의한 탈색 여부 확인 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 균주들을 MBS 액체배지에서 18시간 배양한 후 원심분리하여 상등액 200 μl를 획득한 다음 메탄올(Methanol)에 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)를 용해한 0.2 mM DPPH 용액 1ml과 섞고 30분 동안 암실에서 정치시켜 반응하도록 하였고, 항산화능 비교를 위한 대조구로서 아스코르브산을 상등액 대신 DPPH 용액과 동일하게 처리하여 반응시켰다. 이후, 517 nm에서 흡광도를 확인하여 하기의 식으로 항산화능을 확인하였다.
실험결과, 표 11에서 나타낸 바와 같이, E. faecium CKDB003의 항산화능이 가장 우수한 결과를 확인하 였으며, 5종 균주 모두 항산화능이 표준 균주보다 우수한 것을 확인하였다.
균주 | 항산화 활성(%) |
E. faecium CKDB003 | 60.3±8.5 |
L. acidophilus CKDB007 | 44.1±3.0 |
S. thermophilus CKDB021 | 42.5±2.8 |
B. bifidum CKDB001 | 50.2±4.5 |
B. lactis CKDB005 | 59.0±3.1 |
S. thermophilus KCTC5098 | 40±2.6 |
실시예 10: 신규한 유산균들의 세포 소수성 평가
효과적인 프로바이오틱스 유산균은 일반적으로 섭취 후 일시적으로나마 장 점막에 상주하여 장내에서 집락(colony)을 형성할 수 있어야 한다(Microbiol. Immun., 1992, Vol.36, pp. 683694; Scand. J. Infect. Dis., 1987, Vol.19, pp. 531-537; Lactic Acid Bacteria. Marcel Dekker, New York, 1993, pp. 199225; Gastroenterol Jpn., 1983, Vol.18, pp. 17-24). 미생물의 세포 외 소수성 및 응집성은 세포표면 단백질의 특성이나 표면 구조의 영향을 나타낸 것이다. 특히 이는 대장의 상피세포나 세포 외 단백질에 대한 부착 및 집락형성인자로 작용하기도 한다. 그러므로 in vitro상에서 균주의 소수성 확인을 통해 유산균의 장내 부착능력을 간접적으로 알 수 있다. 소수성을 지니는 유산균은 장 점막성분인 뮤신과 소수성 결합이 가능하므로 소수성이 높으면 장내 부착능도 높을 것이라고 예상된다.
본 실험에서 신규한 유산균과 표준 균주의 소수성을 비교 확인하였다. 상세하게는, MRS 액체배지에 배양된 유산균을 17,949ⅹg에서 15분 동안 원심분리하여 균체를 회수한 뒤 1X 인산완충액(pH 7.2) 5 ml로 2번 세척하였다. 균체의 OD600값이 0.5가 되도록 희석한 유산균 3 ml에 1 ml의 톨루엔을 첨가하여 90초 동안 볼텍싱하였다. 이후, 37℃ 수조에서 1시간 동안 방치한 뒤 톨루엔을 제거한 후 수용액 층의 OD600을 측정하였다. 소수성(%)은 100ⅹ(초기 OD600 - 1시간 OD600) / 초기 OD600으로 계산하였다.
실험 결과, 표 12에서 보는 바와 같이, 신규 유산균 중 비피도박테리움 락티스 CKDB005 균주의 소수성이 65%로 가장 높은 소수성을 보였다. 또한 5종의 유산균 모두 대조군에(S. thermophilus KCTC5098) 비해 높은 소수성을 보유하는 것을 확인하였다.
이러한 결과는, 숙주의 장내에 살아남아 정착하기 위한 능력을 간접적으로 입증하는 것이며 정장제로서 숙주에게 최대의 이익을 줄 수 있는 잠재적인 수단이 될 수 있다.
균주 | 소수성(%) |
E. faecium CKDB003 | 50 |
L. acidophilus CKDB007 | 50 |
S. thermophilus CKDB021 | 57 |
B. bifidum CKDB001 | 35 |
B. lactis CKDB005 | 65 |
S. thermophilus KCTC5098 | 30 |
실시예 11: 신규한 유산균들의 과산화수소(hydrogen peroxide) 내성 확인
상기 신규한 유산균들의 산소 내성을 확인하기 위해 간접적인 방법으로 과산화수소에 대한 내성 실험을 수행하였다. 37℃에서 12시간 배양한 상기 유산균 및 대조군을 각각 과산화수소 0%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%를 포함하고 있는 0.05 M 인산 버퍼(pH 6.8)에 현탁한 후 37℃에서 1분간 반응시켰다. 그리고 반응액 1 ml을 취하여 2 mg/ml 카탈라아제를 포함하고 있는 버퍼에 현탁하고 십진희석하여 MRS 고체배지에 도말하여 생균수를 측정하였다. 그 결과 표 13에서 보는 바와 같이, 과산화수소 2% 처리 용액에서 균주의 생존율이 가장 높았고, 신규한 유산균들 중 Bifidobacterium 계열의 균주는 약간 낮았으며 나머지 3종의 균주는 과산화수소에 의한 생존율이 대조군보다 높은 것을 확인하였다(표 13).
- | 과산화수소 처리 농도(%) | ||||
0 | 0.5 | 1 | 1.5 | 2 | |
E. faecium CKDB003 | 97 | 71 | 52 | 36 | 25 |
L. acidophilus CKDB007 | 99 | 75 | 58 | 32 | 20 |
S. thermophilus CKDB021 | 98 | 68 | 54 | 39 | 26 |
B. bifidum CKDB001 | 93 | 59 | 38 | 15 | 10 |
B. lactis CKDB005 | 96 | 56 | 45 | 16 | 12 |
S. thermophilus KCTC5098 | 97 | 57 | 49 | 29 | 18 |
Ⅲ. 유산균 원말 및 혼합 제제의 제조
실시예 12: 유산균 원말의 제조
상기 선별된 유산균 엔테로코터스 페시움(Enterococcus faecium CKDB003, 이하 EF), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus CKDB007, 이하 LA), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus CKDB021, 이하 ST), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis CKDB0005, 이하 BL), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum CKDB001, 이하 BB)의 고농도 분말제조를 위해 각각의 균주에 최적화된 증균배지와 배양조건을 설정하여 배양하였으며, 이후 균체 회수 및 동결건조 공정부분은 통상적인 방법(원심분리 후 60℃ 냉동고에서 급속 동결한 다음 0℃에서 45℃ 사이의 조작 조건에서 동결건조 수행)을 적용하였다. 균체 회수 후 농축액 대비 말토덱스트린 5-50(부피/중량)% 또는 트레할로스 5-50(부피/중량)% 또는 셀룰로오스 5-50(부피/중량)% 첨가하고, 동결건조 후 분쇄하여 유산균 원말을 제조하였다. 상기 신규 유산균 5종 및 패디오코커스 팬토사세우스 KID7(이하, PP)에 대해 각각의 원말을 제조하였고, 생산된 원말을 EF:LA:ST:BB:BL = 1:1:1:1:1로 혼합하여 5종 유산균 혼합 분말을 제조하였으며, 추가로 상기의 5종 균주 생산 분말과 패디오코커스 팬토사세우스 KID7의 생산 분말을 EF:LA:ST:BB:BL:PP = 1:1:1:1:1:1로 혼합하여 6종 유산균 혼합 분말을 제조하였다.
Ⅳ. 변비 유도 모델을 이용한 동물실험
실시예 13: 실험동물 및 실험설계
<13-1> 재료 및 시약
상기 유산균 제제 및 유산균 혼합 조성물의 장 기능성 및 변비 개선 효과를 확인하기 위해 동물실험을 진행하였다. 상기 분말화된 단일 유산균 제제 및 혼합 유산균 조성물을 사용하였으며, 변비 유발 물질인 로페라마이드(loperamide)(L4762)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, Mo, USA) 제품을 구입하여 변비유도 실험에 사용하였다.
<13-2> 실험동물 및 처치
실험군은 총 9군으로, 정상대조군(Normal group, NOR), 음성대조군(Control group, CON), 단일 유산균 및 혼합 제제 군으로 분류할 수 있다. 각 실험군의 조건 및 약어는 하기의 표 14의 내용과 같다. 각 실험군 별 개체수는 6마리로, 실험동물은 SD-Rat(160-180g, 6주령) 수컷을 개별 케이지에서 사육하였으며, 사육실 환경 온도는 21±1℃, 상대습도 50-55%, 명암은 12시간 주기로 조절하였고 음수와 사료는 자유급식하였다. 실험동물은 5일 동안의 적응기를 거친 후 정상대조군을 제외한 8군에 1일 1회 동일시간에 로페라마이드(3 mg/kg/day)를 경구 투여하여 변비를 유발하였으며, 실험동물의 변비 유발이 확인된 후부터 14일 동안 각각의 유산균 제제(108 CFU/kg)을 1일 1회 경구 투여한 후 희생하였다.
실험구 | 약어 | 실험동물의 수(n) |
정상대조군 (Normal) ; 로페라마이드, 유산균 비처리구 | NOR | 6 |
음성대조군 (Control) ; 로페라마이드 처리구 | CON | 6 |
유산균 단일 균주 ; 로페라마이드 + E.faecium CKDB003 처리구 | EF | 6 |
유산균 단일 균주 ; 로페라마이드 + L.acidophilus CKDB007 처리구 | LA | 6 |
유산균 단일 균주 ; 로페라마이드 + S. thermophilus CKDB021 처리구 | ST | 6 |
유산균 단일 균주 ; 로페라마이드 + B.bifidum CKDB001 처리구 | BB | 6 |
유산균 단일 균주 ; 로페라마이드 + B. lactis CKDB005 처리구 | BL | 6 |
유산균 혼합 균주 ; 로페라마이드 + 5종 혼합 (EF+LA+ST+BB+BL) 처리구 | CKDB | 6 |
유산균 혼합 균주 ; 로페라마이드 + CKDB + Pediococcus pentosaceus (KCTC 18308P) 처리구 | CKDB+PP | 6 |
실시예 14: 분변 지수에 미치는 영향
<14-1> 체중 및 식이효율에 미치는 영향
실험 동물은 처치 기간 동안 3일마다 체중, 사료 섭취량을 측정하였으며, 로페라마이드를 투여한 기간에는 1일 1회 측정하였다. 식이효율은 변비유발 시작일과 희생하는 날을 기점으로 사료 섭취량을 체중 증가량으로 나누어 산출하였다. 그 결과, 정상대조군(176.41 g)에 비해 음성대조군(122.2 g)의 체중이 감소하였으며, 유산균을 섭취한 실험군은 모두 정상대조군과 유사한 체중을 보였다. 식이효율은 실험군간 차이가 없는 것을 확인하였다(도 1).
<14-2> 변의 수, 변의 중량, 변의 수분함량에 미치는 영향
배변 활동에 대한 영향을 확인하기 위해 변의 수, 변의 중량, 변의 수분함량과 같은 분변지수를 조사하였다. 분변 지수들은 로페라마이드 투여 전(변비 유발 전)과 투여 후(변비 유발 기간)로 나누어 조사하였으며, 변비 유발 전 기간에는 1일 1회 일정시간에 변을 수거하였고, 처치 기간 동안에는 3일 1회 일정시간에 변을 수거하여 변의 수, 변의 중량, 변의 수분함량을 측정하였다. 변의 수분함량 분석을 위하여 70℃에서 12시간 동안 건조시켜 건조 중량을 측정하였고, 건조 전, 후의 중량 차이를 변 중량으로 나누어 수분함량을 계산하였다. 그 결과, 변의 수는 정상대조군(47개)이 음성대조군(42개)보다 많았으며, 유산균 제제 섭취구들은 음성대조군에 비해 높고, 특히 혼합 유산균 투여구에서 크게 증가하였다(CKDB : 53개, CKDB+PP : 52개). 변의 중량은 정상대조군이 1일 평균 무게 6.43 g으로 음성대조군의 평균 무게인 5.99 g보다 높았으며, 유산균 섭취 처리구 EF, LA, ST, BB, BL, CKDB, CKDB+PP는 각각 평균 6.89 g, 6.99 g, 6.58 g, 6.50 g, 6.47 g, 6.95 g, 6.95 g으로 모두 음성처리군 및 정상대조군 대비 높은 것을 확인하였다. 변의 수분함량 또한 음성대조군(27.51%)이 정상대조군(29.01%) 대비 낮은 수분함량을 나타내었고, 유산균 처리구에서 음성대조군보다 수분함량이 28.06%-33.18%로 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 2).
<14-3> 장내 이동률에 미치는 영향
제조된 유산균 분말 제제를 투여했을 때 분변 및 장내 물질의 이동률을 확인하기 위해 Baik 등의 방법을 변형하여 활성탄 식이 이동 실험을 진행하였다. 8%의 활성탄을 실험동물에 경구 투여하고, 30분 후에 희생시켜 위 장관을 적출하였다. 장의 길이를 잰 후 절개하여 활성탄의 이동거리를 측정한 다음, 활성탄 장관 이동거리를 전체 장 길이로 나누어 소화관 이동률을 산출하였다. 그 결과, 유산균 제제를 투여했던 실험군들 모두 음성대조군에 비하여 현저히 높은 장 이동률을 보였고, 정상대조군보다도 높은 이동률을 나타내어 유산균 투여에 의하여 상대적으로 장운동이 활발히 진행되었음을 알 수 있는 결과이다. 특히, CKDB+PP를 투여한 처리구에서 50.45%로 가장 높은 장내 이동률이 확인되었다(도 3).
실시예 15: 장 점막 세포의 발달에 미치는 영향
<15-1> 장 점막 조직에 미치는 영향
장 점막의 길이가 길수록 장의 운동성이 높아진다는 보고가 있어, 상기 유산균 제제를 섭취한 후 맹장의 장 점막 길이를 측정하였다. 조직을 관찰하기 위해 탈파라핀화 및 수화 과정을 거친 후 헤마톡실린 용액에 염색한 뒤 수세하여 다시 에오신 용액으로 염색하고 수세 및 탈수 과정을 거쳐 자일렌(xylene)으로 씻은 다음 광학현미경으로 조직을 관찰하였다. 장 점막 세포의 길이는 Image J를 이용하여 측정하였으며, 그 결과, 정상대조군(NOR: 83.25 μm)에 비하여 음성대조군(CON: 71.13 μm)은 장 점막의 길이가 감소하는 것을 확인하였고, 유산균 제제를 투여한 모든 실험군들은 음성대조군에 비하여 유의적으로 증가하였다. 특히, 혼합 균주 CKDB(91.10 μm)와 CKDB+PP(89.11 μm)는 정상대조군보다 장 점막 길이가 크게 증가하였다(도 4).
<15-2> 장 점막의 점액 분비에 미치는 영향
장 점액의 분비는 장의 운동성을 증가시키기 때문에 상기 유산균 실험군들에 대하여 이러한 점액 분비 및 운동성을 조절하는 crypto 세포를 측정하였다. 이를 위해 탈파라핀화 및 수화 과정을 거친 후 알시안 블루(Alcian Blue) 염색을 수행하였다. 이후, 광학 현미경을 통해 염색된 crypt 세포를 관찰하고 Matlab을 이용하여 픽셀을 계산하였다. 그 결과, 정상대조군(NOR: 53170.14 픽셀)에 비하여 음성대조군(CON: 3314.58 픽셀)의 픽셀이 감소하였고, 유산균 제제를 섭취한 실험군들은 모두 음성대조군에 비하여 그 값이 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 단일 유산균 제제인 LA(53421.20 픽셀), ST(52829.20 픽셀), BL(53574.53 픽셀)과 혼합 균주 CKDB(49441.73 픽셀), CKDB+PP(50043.20 픽셀) 처리구가 높은 값을 나타내었다(도 5).
<15-3> 카할 간질세포(Interstitial cells of Cajal)에 미치는 영향
카할 간질세포는 장 점막 내의 평활근을 조절에 관여하는 세포로, 그 수가 많을수록 장의 수축, 이완 등이 증가하게 된다. 상기 대조군 및 유산균 제제 섭취군에 대하여 카할 간질세포 조직을 관찰하기 위해 탈파라핀화 및 수화 과정을 거친 후 면역조직화학(immunohistochemistry, IHC) 염색을 진행하였다. 염색된 ICC는 광학현미경으로 관찰하였고, Matlab을 이용하여 픽셀을 계산하였다. 관찰 결과, 정상대조군(NOR: 196334.58 픽셀)에 비교하여 음성대조군(CON: 193006.73 픽셀)의 픽셀 값이 감소하였다. 반면, 유산균 제제를 섭취한 실험군들 모두 음성대조군에 비하여 그 값이 증가하였으며, 혼합 균주 CKDB+PP(199396.44 픽셀) 처리구가 가장 높은 값을 나타내었다(도 6).
실시예 16: Short Chain Fatty Acids (SCFAs) 함량
맹장은 쥐에서 소화되지 않은 올리고당이나 다당들이 미생물 발효에 의해 분해되는 중요한 소화기관이다. 맹장 내 미생물에 의해 최종 산물로 SCFAs가 생성되는데 이러한 유기산들은 장내 상피세포로 흡수되어 맹장 점막에 영양을 공급해주는 역할을 하며, 몇몇의 연구들에서 항염증 반응 및 암 발생률을 저하시키는 결과들이 보고되고 있으며 특히, SCFAs와 G 단백질-커플링된 수용체를 통한 염증 병태의 조절 간의 관련성이 보고되었다(Nature, 2009, Vol.461(7268), pp. 1282-1286).
맹장에서 상기 단쇄지방산의 함량을 측정하기 위해 GC(gas chromatography)를 이용하였다. 분석 결과, 전체 SCFAs 함량은 정상대조군(80.01 mM)에 비해 음성대조군(56.76 mM)이 낮게 나타났으며, 음성대조군에 비해 유산균 제제를 섭취한 실험군은 모두 SCFAs 함량이 증가한 것을 확인하였다. 특히, CKDB+PP(88.87 mM)에서 가장 높은 총 SCFAs 함량을 보이는 것을 확인하였다. SCFAs 종류 별로 살펴보면, 아세트산의 경우 정상대조군(42.98 mM)에 비해 변비를 유발시킨 음성대조군(33.86 mM)에서 함량이 감소하였으며, 유산균 제제를 섭취한 실험군들은 음성대조군에 비해 그 함량이 증가하였다. 프로피온산 함량 역시 정상대조군(6.40 mM)에 비해 변비를 유발시킨 음성대조군(4.65 mM)은 낮은 값을 나타내었으며, 유산균 제제를 섭취한 처리구 모두에서 음성대조군보다 높은 함량을 나타내었으며 특히, 혼합 유산균 제제 섭취구인 CKDB(6.5 mM)와 CKDB+PP(7.9 mM)에서 함량이 현저히 높았다. 부티르산 함량의 경우에서도 정상대조군(29.33 mM)에 비하여 음성대조군(17.42 mM)의 함량이 낮게 나타났으며, 유산균 제제를 섭취한 처리구 모두에서 음성대조군보다 높은 함량을 나타내었으며, 실험군들 중 CKDB+PP 처리구(27.87 mM)와 EF 처리구(29.2 mM)가 정상대조군에 유사한 함량으로 회복되었다(표 15). 맹장 내 부티르산은 점막 세포의 에너지원으로 이용되는 성분으로 상피세포의 분화를 촉진하며, 발암억제율과 상관관계가 있다고 보고되고 있는 유익한 유기산이며 특유의 냄새로 인하여 직접적인 섭취보다는 프로바이오틱스를 이용하여 대장 내 함량을 증가시키는 것이 바람직하다(Adv. Exp. Med. Biol., 1999, Vol.472, pp. 149158; World J Gastroenterol., 2007, Vol.13, pp. 28262832).
아세트산(mM) | 프로피온산(mM) | 부티르산(mM) | 발레르산(mM) | 총 SCFAs (mM) | |
NOR | 43.0 | 6.4 | 29.3 | 1.3 | 80.0 |
CON | 33.9 | 4.6 | 17.4 | 0.8 | 56.8 |
EF | 47.6 | 7.3 | 29.2 | 1.0 | 85.0 |
LA | 41.1 | 5.6 | 22.8 | 1.1 | 70.5 |
ST | 40.0 | 7.7 | 19.2 | 1.1 | 68.0 |
BB | 40.7 | 7.0 | 20.7 | 1.2 | 69.7 |
BL | 47.7 | 8.5 | 22.0 | 0.9 | 79.1 |
CKDB | 38.8 | 6.5 | 21.1 | 0.9 | 67.2 |
CKDB+PP | 52.3 | 7.9 | 27.9 | 0.9 | 88.9 |
실시예 17: 배양 방법을 이용한 비피더스균 미생물상(Bifidobacterium microflora) 조사
본 발명의 유산균 섭취 시 맹장 내 분변의 비피더스균(Bifidobacteria) 분포에 대한 영향을 파악하기 위하여 각 실험군의 맹장 내용물 1 g을 취하여 9 ml의 혐기 희석액에 현탁한 후 십진희석한 다음 BL 한천배지에 배양하여 균수를 확인하였다. 정상대조군의 맹장에서 채취한 분변에서는 1.67 x 109 CFU/g인 반면, 음성대조군은 6.30 x 108 CFU/g으로 감소하는 것을 확인하였다. 하지만 유산균 제제를 섭취한 실험군은 모두 비피더스균의 분포가 증가하였고 특히 CKDB+PP 섭취군(3.20 x 109 CFU/g)이 가장 높은 값을 나타냈다(도 7).
실시예 18: 메타지노믹스(Metagenomics)를 이용한 장내 미생물 균총 분석
<18-1> 메타지노믹(Metagenomic) DNA의 추출
본 발명의 유산균 제제를 섭취한 후 맹장 내 분변 내 균총 변화를 분석하기 위해 메타지노믹스를 이용하여 미생물 균총을 분석하였다. 먼저 채취한 맹장 내용물에서 시료 자체의 미생물 군집 구조를 그대로 반영할 수 있는 DNA를 얻기 위해 시료 채취 후 한 시간 이내에 DNA 추출 kit와 bead beater를 이용하여, 메타지노믹 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 아가로스 겔상에서 전기영동을 통하여 DNA의 상태를 확인하고 차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing, NGS)을 위한 total DNA 시료를 각 처리구 별로 준비하였다. 이후, NGS의 수행은 전문 분석 업체인 천랩(Chunlab, Inc., Korea)에 의뢰하였다.
<18-2> NGS에 의한 맹장 샘플 내 미생물 군집 분석
본 발명의 유산균 제제의 섭취가 장내균총 변화에 미치는 영향을 조사하기 위해 16S rRNA 유전자에 대한 높은 효율(High throughput)의 분석기법인 NGS(Next Generation Sequencing) 기술을 이용하였다. 앞서 추출한 DNA 시료는 Next Generation Sequencer인 Illumina MiSeq 장비를 이용하여 맹장 내 미생물의 유전자서열을 분석하였고, 정상대조군과 음성대조군을 포함한 총 9개의 실험군에 대한 결과 데이터베이스를 NGS분석 비주얼라이제이션 소프트웨어(pyrosequencing visualization software)인 CLcommunity™를 이용하여 조사하였다. 분석결과, 유익균인 Lactobacillus 속(Genus)의 균이 속해있는 Lactobacillaceae 과(Family)의 분포가 변비 유도 후 유산균 미처리군(음성대조군)에 비해 유산균 처리구에서 높은 비율로 존재하는 것을 확인하였다.
그리고 Lactobacillus 속 내에서 5% 이상을 점유하는 균종은 Lactobacillus intestinalis, Lactobacillus HQ768009_s, Lactobacillus reuteri 였으며, 이 세가지 균종의 Lactobacillus 속 내에서 비율이 음성대조군에서는 11.11%로 가장 낮았고 정상대조군에서는 56.86%로 높게 비율을 나타났다. 그리고 유산균 제제를 섭취한 실험군들의 Lactobacillus 속 내에서 위 세가지 균종들의 비율을 살펴보면 EF, LA, ST, BB, BL가 각각 40.74%, 20.68%, 35.11%, 37.54%, 20.84%로 모두 음성대조군보다 높은 분포를 나타내었으며 특히, CKDB+PP 섭취구와 CKDB 섭취구가 각각 51.94%와 60.31%로 매우 높은 비율을 나타내는 것을 확인하였다(도 8).
또한 우점율 5% 이상(Lactobacillus intestinalis, Lactobacillus HQ768009_s, Lactobacillus reuteri, Blautia wexlerae)을 차지하는 균종의 분포에 대한 처리구간의 유사도에 대해 분석한 결과, 정상대조군과 CKDB+PP 섭취구가 균종 분포 유사도가 가장 높은 것으로 확인되어, 본 연구의 혼합 유산균 조성물 섭취 시, 장내 유익균총을 정상화시켜 장 기능 및 변비 개선을 유도하는 것으로 사료된다(도 9).
또한, 우점율이 높지는 않았지만, Lactobacillus 속 내에서 Lactobacillus gasseri의 경우 정상대조구가 2.32%, 음성대조구가 1.52%로 확인되었다. 그리고 단일 유산균 처리구인 EF, LA, BL은 각각 3.48%, 3.44%, 3.45%로 음성대조군 및 정상대조군보다 증가하였으며, 혼합 균주 제제인 CKDB 처리구는 4.45%로 음성대조군 및 정상대조군보다 크게 증가한 결과를 보여주었다. Lactobacillus 속의 균종 중 본 연구에서 우점율이 높은 Lactobacillus reuteri 종은 그 기능성에 대해 다양한 연구들이 보고되어져 있다. 특히, 면역 시스템의 향상을 통한 외부 병원체에 대한 감염을 예방하며, 결장에 대한 치유 능력이 있으며, 설사를 예방 및 치료하는 효과가 보고되어 있다(Applied and Environmental Microbiology, 2012, Vol.78(15), pp. 5119-5126; Pediatrics, 2010, Vol.126(3), pp. 526-533; J Pediatr Gastroenterol Nutr., 1997, Vol.24(4), pp. 399-404). 또한 Lactobacillus gasseri 종은 체지방을 감소시키며, 면역을 증진시키고, 염증 반응을 억제하는 효과들이 보고되어져 있다(Korean J Fam Med., 2013, Vol.34(2), pp. 80-89; BMC Microbiol., 2013, 13:298; J Microbiol Immunol Infect., 2014, Vol.47(2), pp. 81-86; World J Gastroenterol., 2013, Vol.19(43), 75317543).
Ⅴ. 안정성을 높인 유산균 원말 및 혼합 제제의 제조
실시예 19: 프롤린 첨가 공정 도입 원말의 제조
상기 선별된 유산균 엔테로코터스 페시움(Enterococcus faecium CKDB003, 이하 EF), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus CKDB007, 이하 LA), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus CKDB021, 이하 ST), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis CKDB0005, 이하 BL), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum CKDB001, 이하 BB)의 분말제조를 위해 각각의 균주에 최적화된 증균배지와 배양조건을 설정하여 배양하였으며, 배양종료 2시간 전에 프롤린을 0.1~10 g/L의 농도로 첨가하여 배양하였다. 균체 회수 후 농축액 대비 말토덱스트린 5-50(부피/중량)% 또는 트레할로스 5-50(부피/중량)% 또는 셀룰로오스 5-50(부피/중량)% 첨가하고, 프롤린 0-5(부피/중량)%를 추가로 첨가하여 동결건조 후 분쇄하여 유산균 원말을 제조하였다(도 10). 상기 신규 유산균 5종 및 패디오코커스 팬토사세스 KID7에 대해 각각의 원말을 제조하였고, 생산된 원말을 EF:LA:ST:BB:BL = 1:1:1:1:1로 혼합하여 5종 유산균 혼합 분말을 제조하였고, 상기의 5종 균주 생산 분말과 패디오코커스 팬토사세우스 KID7의 생산 분말을 EF:LA:ST:BB:BL:PP = 1:1:1:1:1:1로 혼합하여 6종 유산균 혼합 분말을 제조하였다.
실시예 20: 유산균 원말 안정성 평가
<20-1> 프롤린 첨가 원말의 소화액 내성 분석
상기 제조된 프롤린 첨가 유산균 원말 및 혼합 분말들이 위의 낮은 pH 및 소장의 담즙산염 농도에 견딜 수 있는지 확인하였다.
내산성을 확인하기 위하여, 염산을 이용하여 pH 2.5로 조절한 MRS 액체배지를 제조하였다. 각각의 원말 및 유산균 혼합분말들은 1 g씩 pH 내성 시험용 액체배지에 첨가하였으며, 37℃에서 2시간 동안 배양 및 희석 후 각각의 균주에 적합한 고체배지에 도말한 다음 배양하여 살아있는 미생물의 수를 계측하였다. 상기 유산균 원말 및 혼합분말의 내산성을 표 16에 나타내었으며, 앞서 확인된 표 10의 결과와 비교하여 5종의 신규한 균주 자체의 내산성보다 최소 10%에서 최대 50%까지 향상되었다.
담즙산염에 대한 내성을 확인하기 위하여, 옥스갈(Oxgall) 담즙산염을 0.3% 함유하는 MRS 및 LB 액체배지를 제조하였다. 각각의 유산균 분말을 1 g씩 취하여 9 ml의 옥스갈을 포함한 MRS 액체배지에 첨가 후 37℃에서 2시간 배양 및 희석 후 내산성 실험과 같은 방법으로 살아있는 미생물 수를 계측하였다. 표 16과 같이 모든 균주가 우수한 생존율을 보이는 것을 확인하였으며, 특히, 5종류의 균주 및 패디오코커스 팬토사세우스 균주 혼합 유산균 분말이 생존율 61%로 가장 높은 담즙내성을 보였다. 이러한 결과는 앞서 확인된 표 10의 결과와 비교하여 5종의 신규한 균주 자체의 내담즙성보다 최소 6%에서 최대 12%까지 향상된 결과이다.
균주 원말 | 초기 균수 | 내산성 | 내담즙성 |
(인공위액 pH 2.5) | (0.3% 옥스갈) | ||
생존율(%) | 생존율(%) | ||
EF | 3.03E+11 | 73 | 56 |
LA | 1.67E+11 | 62 | 75 |
ST | 5.36E+11 | 22 | 37 |
BB | 2.25E+11 | 65 | 61 |
BL | 2.21E+11 | 69 | 62 |
PP | 5.30E+11 | 24 | 59 |
CKDB | 2.00E+11 | 71 | 60 |
CKDB+PP | 2.00E+11 | 66 | 61 |
<20-2> 프롤린 첨가 원말의 가공안정성 평가
상기 제조된 프롤린 첨가 유산균 원말 및 혼합 분말들의 동결건조 후 안정성과 가속안정성을 확인하였다. 동결건조 전, 후의 생균수는 원말을 희석하고 각각의 유산균에 적합한 고체배지에 배양하여 통상적인 방법에 따라 미생물수를 계측하였다. 또한 상기 원말들에 대해 4주 동안 가속 시험(40℃, 습도 70%)을 진행하여 유산균 생존율을 확인하였다. 표 17의 결과와 같이 동결건조 시 모든 원말 내 유산균 생존율은 27% 이상이었으며, 가속 시험 시 생존율은 12% 이상으로 확인되었다. 특히, 프롤린 첨가 배양 시, 5종 유산균 중 EF 단일균주 분말의 동결건조 생존율이 16%로 현저히 증가되었으며, LA 단일균주 분말의 가속 시험 생존율이 21% 향상된 것을 확인하였다.
유산균 원말 | 동결건조 생존율(%) | 가속시험 생존율(%) | ||
프롤린 미첨가 | 프롤린 첨가 | 프롤린 미첨가 | 프롤린 첨가 | |
EF | 65 | 81 | 76 | 85 |
LA | 22 | 29 | 11 | 32 |
ST | 55 | 70 | 42 | 56 |
BB | 20 | 27 | 10 | 12 |
BL | 25 | 35 | 15 | 30 |
PP | 40 | 45 | 58 | 52 |
CKDB | 64 | 71 | 72 | 81 |
CKDB+PP | 58 | 70 | 78 | 79 |
따라서, 상기 유산균 단일 제제 및 혼합 조성물의 안정성을 높이는 기술을 추가하여 제조 시, 소화기관 내에 안정성 및 가공 시 동결건조 안정성과 보관안정성을 향상시킬 수 있으며, 이러한 안정성이 높은 상기 유산균 제제들을 섭취했을 시, 장내에서 효율을 극대화할 수 있을 것으로 사료된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Chong Kun Dang Bio. Co., Ltd.
<120> Novel Lactic Acid Bacteria Having Constipation Improvement Effect
and Use Thereof
<130> PN160340D
<160> 5
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1414
<212> RNA
<213> E. faecium CKDB003 16s rRNA
<400> 1
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac gcttcttttt ccaccggagc 60
ttgctccacc ggaaaaagag gagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggt aacctgccca 120
tcagaagggg ataacacttg gaaacaggtg ctaataccgt ataacaatcg aaaccgcatg 180
gttttgattt gaaaggcgct ttcgggtgtc gctgatggat ggacccgcgg tgcattagct 240
agttggtgag gtaacggctc accaaggcca cgatgcatag ccgacctgag agggtgatcg 300
gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc 360
ggcaatggac gaaagtctga ccgagcaacg ccgcgtgagt gaagaaggtt ttcggatcgt 420
aaaactctgt tgttagagaa gaacaaggat gagagtaact gttcatccct tgacggtatc 480
taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc 540
gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa 600
gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggag acttgagtgc agaagaggag 660
agtggaattc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat ggaggaacac cagtggcgaa 720
ggcggctctc tggtctgtaa ctgacgctga ggctcgaaag cgtggggagc aaacaggatt 780
agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttggagg gtttccgccc 840
ttcagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa 900
actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca 960
acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctttgaccac tctagagata gagcttcccc 1020
ttcgggggca aagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080
gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tgttagttgc catcattcag ttgggcactc 1140
tagcaagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc 1200
cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tgggaagtac aacgagttgc gaagtcgcga 1260
ggctaagcta atctcttaaa gcttctctca gttcggattg cagctgcaac tcgcctgcat 1320
gaagccggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcacgccgcg tgaatacgtt cccgggcctt 1380
gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgta 1414
<210> 2
<211> 1505
<212> RNA
<213> L. acidophilus CKDB007 16s rRNA
<400> 2
gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgagcgagc tgaaccaaca 60
gattcacttc ggtgatgacg ttgggaacgc gagcggcgga tgggtgagta acacgtgggg 120
aacctgcccc atagtctggg ataccacttg gaaacaggtg ctaataccgg ataagaaagc 180
agatcgcatg atcagcttat aaaaggcggc gtaagctgtc gctatgggat ggccccgcgg 240
tgcattagct agttggtagg gtaacggcct accaaggcaa tgatgcatag ccgagttgag 300
agactgatcg gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta 360
gggaatcttc cacaatggac gaaagtctga tggagcaacg ccgcgtgagt gaagaaggtt 420
ttcggatcgt aaagctctgt tgttggtgaa gaaggataga ggtagtaact ggcctttatt 480
tgacggtaat caaccagaaa gtcacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 540
ggtggcaagc gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcgga agaataagtc 600
tgatgtgaaa gccctcggct taaccgagga actgcatcgg aaactgtttt tcttgagtgc 660
agaagaggag agtggaactc catgtgtagc ggtggaatgc gtagatatat ggaagaacac 720
cagtggcgaa ggcggctctc tggtctgcaa ctgacgctga ggctcgaaag catgggtagc 780
gaacaggatt agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttgggag 840
gtttccgcct ctcagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacgaccg 900
caaggttgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta 960
attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc tagtgcaatc cgtagagata 1020
cggagttccc ttcggggaca ctaagacagg tggtgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt 1080
gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttgt cattagttgc cagcattaag 1140
ttgggcactc taatgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt 1200
catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagtac aacgaggagc 1260
aagcctgcga aggcaagcga atctcttaaa gctgttctca gttcggactg cagtctgcaa 1320
ctcgactgca cgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcacgccgc ggtgaatacg 1380
ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tctgcaatgc ccaaagccgg 1440
tggcctaacc ttcgggaagg agccgtctaa ggcagggcag atgactgggg tgaagtcgta 1500
agggg 1505
<210> 3
<211> 1477
<212> RNA
<213> S. thermophilus CKDB021 16s rRNA
<400> 3
ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtagaacgct gaagagagga 60
gcttgctctt cttggatgag ttgcgaacgg gtgagtaacg cgtaggtaac ctgccttgta 120
gcgggggata actattggaa acgatagcta ataccgcata acaatggatg acacatgtca 180
tttatttgaa aggggcaatt gctccactac aagatggacc tgcgttgtat tagctagtag 240
gtgaggtaat ggctcaccta ggcgacgata catagccgac ctgagagggt gatcggccac 300
actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttcggcaa 360
tgggggcaac cctgaccgag caacgccgcg tgagtgaaga aggttttcgg atcgtaaagc 420
tctgttgtaa gtcaagaacg ggtgtgagag tggaaagttc acactgtgac ggtagcttac 480
cagaaaggga cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtc ccgagcgttg 540
tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggtttga taagtctgaa gttaaaggct 600
gtggctcaac catagttcgc tttggaaact gtcaaacttg agtgcagaag gggagagtgg 660
aattccatgt gtagcggtga aatgcgtaga tatatggagg aacaccggtg gcgaaagcgg 720
ctctctggtc tgtaactgac gctgaggctc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata 780
ccctggtagt ccacgccgta aacgatgagt gctaggtgtt ggatcctttc cgggattcag 840
tgccgcagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca 900
aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 960
aagaacctta ccaggtcttg acatcccgat gctatttcta gagatagaaa gttacttcgg 1020
tacatcggtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080
gtcccgcaac gagcgcaacc cctattgtta gttgccatca ttcagttggg cactctagcg 1140
agactgccgg taataaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat 1200
gacctgggct acacacgtgc tacaatggtt ggtacaacga gttgcgagtc ggtgacggcg 1260
agctaatctc ttaaagccaa tctcagttcg gattgtaggc tgcaactcgc ctacatgaag 1320
tcggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcac gccgcggtga atacgttccc gggccttgta 1380
cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagg taaccttttg 1440
gagccagccg cctaaagtgg gacagatgat tggggtg 1477
<210> 4
<211> 1440
<212> RNA
<213> B. lactis CKDB005 16s rRNA
<400> 4
tcaggatgaa cgctggcggc gtgcttaaca catgcaagtc gaacgggatc cctggcagct 60
tgctgtcggg gtgagagtgg cgaacgggtg agtaatgcgt gaccaacctg ccctgtgcac 120
cggaatagct cctggaaacg ggtggtaata ccggatgctc cgctccatcg catggtgggg 180
tgggaaatgc ttttgcggca tgggatgggg tcgcgtccta tcagcttgtt ggcggggtga 240
tggcccacca aggcgttgac gggtagccgg cctgagaggg tgaccggcca cattgggact 300
gagatacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgcaa 360
gcctgatgca gcgacgccgc gtgcgggatg gaggccttcg ggttgtaaac cgcttttgtt 420
caagggcaag gcacggtttc ggccgtgttg agtggattgt tcgaataagc accggctaac 480
tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gtgcgagcgt tatccggatt tattgggcgt 540
aaagggctcg taggcggttc gtcgcgtccg gtgtgaaagt ccatcgccta acggtggatc 600
tgcgccgggt acgggcgggc tggagtgcgg taggggagac tggaattccc ggtgtaacgg 660
tggaatgtgt agatatcggg aagaacacca atggcgaagg caggtctctg ggccgtcact 720
gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780
gtaaacggtg gatgctggat gtggggccct ttccacgggt cccgtgtcgg agccaacgcg 840
ttaagcatcc cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaagaaa ttgacggggg 900
cccgcacaag cggcggagca tgcggattaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctggg 960
cttgacatgt gccggatcgc cgtggagaca cggtttccct tcggggccgg ttcacaggtg 1020
gtgcatggtc gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080
accctcgccg catgttgcca gcgggtgatg ccgggaactc atgtgggacc gccggggtca 1140
actcggagga aggtggggat gacgtcagat catcatgccc cttacgtcca gggcttcacg 1200
catgctacaa tggccggtac aacgcggtgc gacacggtga cgtggggcgg atcgctgaaa 1260
accggtctca gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaaggcgga gtcgctagta 1320
atcgcggatc agcaacgccg cggtgaatgc gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380
agtcatgaaa gtgggtagca cccgaagccg gtggcccgac ccttgtgggg ggagccgtct 1440
1440
<210> 5
<211> 1436
<212> RNA
<213> B. bifidum CKDB001 16s rRNA
<400> 5
gctcaggatg aacgctggcg gcgtgcttaa cacatgcaag tcgaacggga tccatcgggc 60
tttgcttggt ggtgagagtg gcgaacgggt gagtaatgcg tgaccgacct gccccatgct 120
ccggaatagc tcctggaaac gggtggtaat gccggatgtt ccacatgatc gcatgtgatt 180
gtgggaaaga ttctatcggc gtgggatggg gtcgcgtcct atcagcttgt tggtgaggta 240
acggctcacc aaggcttcga cgggtagccg gcctgagagg gcgaccggcc acattgggac 300
tgagatacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgca 360
agcctgatgc agcgacgccg cgtgagggat ggaggccttc gggttgtaaa cctcttttgt 420
ttgggagcaa gccttcgggt gagtgtacct ttcgaataag cgccggctaa ctacgtgcca 480
gcagccgcgg taatacgtag ggcgcaagcg ttatccggat ttattgggcg taaagggctc 540
gtaggcggct cgtcgcgtcc ggtgtgaaag tccatcgctt aacggtggat ctgcgccggg 600
tacgggcggg ctggagtgcg gtaggggaga ctggaattcc cggtgtaacg gtggaatgtg 660
tagatatcgg gaagaacacc gatggcgaag gcaggtctct gggccgtcac tgacgctgag 720
gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacggt 780
ggacgctgga tgtggggcac gttccacgtg ttccgtgtcg gagctaacgc gttaagcgtc 840
ccgcctgggg agtacggccg caaggctaaa actcaaagaa attgacgggg gcccgcacaa 900
gcggcggagc atgcggatta attcgatgca acgcgaagaa ccttacctgg gcttgacatg 960
ttcccgacga cgccagagat ggcgtttccc ttcggggcgg gttcacaggt ggtgcatggt 1020
cgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aaccctcgcc 1080
ccgtgttgcc agcacgttat ggtgggaact cacgggggac cgccggggtt aactcggagg 1140
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Claims (13)
- 엔테로코터스 페시움(Enterococcus faecium) CKDB003 균주(수탁번호: KCTC13115BP), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) CKDB007 균주(수탁번호: KCTC13117BP), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) CKDB021 균주(수탁번호: KCTC13118BP), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) CKDB0005 균주(수탁번호: KCTC13116BP) 및 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) CKDB001 균주(수탁번호: KCTC13114BP)로 구성된 균주로부터 선택되는 1종 이상의 균주를 혼합하여 제조한 것을 특징으로 하는 장 기능 개선 또는 변비 개선용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 상기 균주를 동결건조하여 생균제 형태로 제조한 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 균주는 배양 시 프롤린(proline)을 첨가하여 배양한 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 내산성, 내담즙성, 동결건조 안정성 및 가속안정성을 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 배변 활동을 증진시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 섭취 시 맹장 내 SCFAs(Short Chain Fatty Acids)의 함량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 섭취 시 장 점막 길이 증가, 장 점액질 분비 증가 및 장 세포의 성장 증진 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 섭취 시 장내 유익균인 비피도박테리아(Bifidobacteria)의 생장을 촉진시키고, 장내 유익균총인 락토바실러스(Lactobacillus) 속의 미생물의 분포를 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 변비 개선 효능을 갖는 엔테로코터스 페시움(Enterococcus faecium) CKDB003 균주(수탁번호: KCTC13115BP).
- 변비 개선 효능을 갖는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) CKDB007 균주(수탁번호: KCTC13117BP).
- 변비 개선 효능을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) CKDB021 균주(수탁번호: KCTC13118BP).
- 변비 개선 효능을 갖는 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) CKDB0005 균주(수탁번호: KCTC13116BP).
- 변비 개선 효능을 갖는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) CKDB001 균주(수탁번호: KCTC13114BP).
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