KR101580616B1

KR101580616B1 - 내산성, 내담즙산성 및 항균 활성을 갖는 바실러스 메틸로트로피쿠스 c14 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101580616B1
Application number: KR1020140028165A
Authority: KR
Inventors: 김도중; 박애니; 임영희; 심인숙
Original assignee: 주식회사 유니바이오테크
Priority date: 2014-03-11
Filing date: 2014-03-11
Publication date: 2015-12-28
Also published as: KR20150106093A

Abstract

본 발명은 내산성, 내담즙산성 및 그람 음성 병원성 미생물에 대한 항균 활성을 가지는 바실러스 메틸로트로피쿠스(Bacillus methylotrophicus) C14 균주 (KFCC11570P)와 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제 및 항균 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 균주 및 이의 배양액은 식품 및 사료 등 다양한 산업분야에 이용될 것으로 기대된다.

Description

내산성, 내담즙산성 및 항균 활성을 갖는 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주 및 이의 용도{Bacillus methylotrophicus C14 strain having acid-resistance, bile acid-resistance and antimicrobial activity and uses thereof}

본 발명은 내산성, 내담즙산성 및 항균 활성을 갖는 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 내산성, 내담즙산성 및 그람 음성 병원성 미생물에 대한 항균 활성을 가지는 바실러스 메틸로트로피쿠스(Bacillus methylotrophicus) C14 균주 (KFCC11570P), 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제 및 항균 조성물, 상기 프로바이오틱스 제제를 포함하는 식품, 사료 첨가제 및 상기 항균 조성물을 포함하는 식품 보존제에 관한 것이다.

항생제(antibiotics)는 병원성 미생물의 성장이나 증식을 억제하고 영양소의 이용률을 개선시켜 성장 촉진 효과가 있기 때문에 현재까지 가장 경제적인 사료첨가제로 사용되어 왔다. 항생제 사용을 통해 축산업의 생산성이 개선되었고, 대규모 집단 사육이 가능케 되어 축산업의 발전에 많은 기여를 해왔지만, 최근에는 항생제의 오남용으로 가축의 면역력이 저하되어 질병에 쉽게 걸리며, 많은 종류의 항생제 내성 미생물이 출현하였고, 인수공통 전염병의 경우에는 사람에게도 치명적인 위협을 가할 수 있는 위험성이 대두된 상태이다. 또한, 축산물의 항생제 잔류 문제는 축산 분뇨의 자원 재활용화를 불가능하게 하여 경제적인 손실은 물론 환경오염을 가중시키는 문제가 있으며, 육류를 섭취하는 사람에게 항생제가 전이되어 축산물의 안전성이 사회적 문제가 되고 있다. 이에 선진국에서는 인체의 건강에 미치는 영향을 고려하여 사료첨가용 항생제에 대한 사용규제를 위한 논의가 오래전부터 진행되어 오고 있으며(Guest GB, 1976, J. Ani. Sci. 68:1318), 우리나라에서는 2005년부터 사료첨가용 항생제 사용이 단계적으로 금지되기 시작하여 2011년부터는 전면적으로 그 사용이 금지되었다. 이러한 축산물의 안전성에 대한 소비자들의 관심과 무항생제 사용 축산물에 대한 요구가 높아짐에 따라 항생제 대체물질의 개발 필요성은 더욱 커지고 있다.

항생제 대체제로 사용되고 있는 것들은 생균제(프로바이오틱스; probiotics), 올리고당, 효소제, 유기산제(organic acids), 식물 추출물, 미네랄 등이 있으며, 그 각각의 효능에 따라 시장에서 사용되고 있다. 그 중 생균제는 항생제 대체제로 주목받고 있다. 생균제란 장내미생물 균형에 도움을 주고 항균활성과 효소활성을 가지면서 숙주에 유용한 각종 대사 산물을 생산함으로써 숙주의 건강증진과 사료효율을 증대시키는 효과를 보이는 미생물을 말하며(Fuller, R., 1989, J. Appl. Bacteriol. 66:365-378), 사람이나 동물 숙주의 장내를 서식지로 하고, 비병원성, 무독성, 장으로 가는 동안 살아남는 특성을 지녀야 하고, 장내 환경에서 산, 효소, 담즙에 대한 내성을 갖춰야 한다. 따라서 생균제제로 사용되기 위해 필요한 기본적인 조건은 안정성, 기능성(생존성, 정착성, 항미생물제 생성능, 면역 촉진능, 항유전독성 활성, 병원성 세균의 억제능), 장내 높은 생존능력임을 알 수 있다.

이에 본 발명에서는 재래 장류에서 분리·동정한 신규 바실러스 균주가 생균제제로 사용될 수 있는 주요 특성을 확인하고 본 균주와 균주에서 생산된 배양물을 제공하고자 한다.

한편, 한국등록특허 제1346698호에는 '식물병원성 세균 및 진균을 방제하는 기능과 약제 다제내성 세균에 대한 억제활성이 있는 바실러스 메틸로트로피쿠스 EML-CAP7'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2013-0096870호에는 '항진균 활성을 가지는 신규의 미생물 바실러스 메틸로트로피쿠스 엘케이에스26'이 개시되어 있으나, 본 발명의 내산성, 내담즙산성 및 항균 활성을 갖는 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 본 발명자들은 국산 된장 및 고추장으로부터 바실러스 속의 신규한 균주인, 바실러스 메틸로트로피쿠스(Bacillus methylotrophicus) C14 균주를 분리·동정하였고, 상기 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주가 높은 내산성 및 내담즙산성을 보임과 동시에, 상기 균주 배양액이 위해 미생물에 대한 우수한 항균활성을 보이는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 내산성, 내담즙산성 및 그람 음성 병원성 미생물에 대한 항균 활성을 가지는 바실러스 메틸로트로피쿠스(Bacillus methylotrophicus) C14 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프로바이오틱스 제제를 포함하는 식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프로바이오틱스 제제를 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 그람 음성 병원성 미생물에 대한 항균 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항균 조성물을 포함하는 식품 보존제를 제공한다.

본 발명에 따른 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주는 뛰어난 내산성, 인공위액 내성 및 내담즙산성을 보였으며, 상기 균주의 배양액은 여러 병원성 미생물에 대한 강한 항균 활성을 보였다. 따라서 본 발명의 균주 및 이의 배양액은 프로바이오틱스 제제 및 항균 조성물, 식품 또는 사료 등 다양한 산업분야에 이용될 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명에 따른 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주의 16s rRNA의 염기서열을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주의 바실러스 속에서의 계통발생학적 위치를 보여주는 계통도이다.
도 3은 본 발명에 따른 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주 배양액을 이용하여 병원성 미생물에 대한 항균활성을 디스크 확산법으로 분석한 결과로, (a)는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium ATCC 13311)에 대한 항균활성을, (b)는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis ATCC 13076)에 대한 항균활성을 그리고 (c)는 대장균(Escherichia coli ATCC 25922)에 대한 항균활성을 보여주는 증식억제대의 모습을 나타낸 사진이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 내산성, 내담즙산성 및 그람 음성 병원성 미생물에 대한 항균 활성을 가지는 바실러스 메틸로트로피쿠스(Bacillus methylotrophicus) C14 균주를 제공한다.

본 발명자들은 재래식 장류(된장 및 청국장)로부터 다양한 바실러스 종들을 분리하고 내산성, 인공위액 내성 및 담즙산 내성시험, 위해 미생물에 대한 항균 활성 검정을 통하여, 생균제제로 사용될 수 있는 특성인 내산성, 내담즙산성 및 위해 미생물에 대한 항균성 활성이 우수한 균주를 분리, 동정하여 바실러스 메틸로트로피쿠스(Bacillus methylotrophicus) C14로 명명하고 한국미생물보존센터에 2013년 11월 27일 기탁하였다 (수탁번호 : KFCC11570P).

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에 있어서, 상기 내산성은 pH 1.5~3.0의 액체배지에서 37℃, 1~5시간 배양시 생존율 80% 이상, 바람직하게는 80~90%를 나타내는 것일 수 있고, 상기 내담즙산성은 담즙산이 1~3%(w/v) 함유된 고체배지에서 37℃, 24시간 배양시 생존율 80% 이상, 바람직하게는 80~90%를 나타내는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주는 장내 유익한 세균인 유산균에는 항균 활성을 보이지 않으나, 그람 음성 병원성 미생물에 대해서는 항균 능력을 보유하고 있으며(표 4 참고), 내산성 및 인공위액에 대한 내성(표 2 참고), 내담즙산성(표 3 참고)을 보유하고 있으므로 프로바이오틱스로서 유용하게 이용될 수 있다.

상기 프로바이오틱스 제제는 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물은 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하여 산제(powder), 액제(liquids and solutions), 정제(tablet), 캡슐(capsule), 시럽(syrup), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조되어 투여될 수 있다. 상기 담체로는 예를 들어, 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 투여 용량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성률, 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 축종, 상태 및 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.

본 발명의 상기 프로바이오틱스 제제는 내산성, 내담즙산성 및 그람 음성 병원성 세균에 대한 항균 활성을 가지는 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함한다.

본 발명의 상기 프로바이오틱스를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 프로바이오틱스를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 프로바이오틱스는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 혼합양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 혼합양은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 프로바이오틱스를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 빵, 캔디류, 스낵류, 과자류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 사료 첨가제에는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분; 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제와 같은 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 사료첨가제는 분말 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 사료 첨가용 부형제로는 예를 들어, 탄산칼슘, 말분, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 사료 첨가제는 하나 이상의 효소 제제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 리파제와 같은 지방 분해효소, 피틴산(phytic acid)을 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합(α-1,4-glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제, 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 말토오스를 두 분자의 글루코스로 가수분해하는 말타제 및 사카로스를 가수분해하여 글루코스-프룩토스 혼합물을 만드는 전환효소 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 가축 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 또한, 상기 가축 사료 첨가용 조성물에는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 가축 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다. 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 섭취량 또는 분할 일일 섭취량을 사용할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제가 사용될 수 있는 동물은 예를 들어 식용우, 젖소, 송아지, 돼지, 자돈, 양, 염소, 말, 토끼, 개, 고양이 등과 같은 가축, 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 작은새 등과 같은 가금류를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 그람 음성 병원성 세균에 대한 항균 조성물을 제공한다.

본 발명의 항균 조성물이란 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항진균제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 바람직하게는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 대장균(Escherichia coli) 또는 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 등을 포함하는 병원성 미생물, 특히 그람 음성 병원성 미생물의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 항균 조성물은 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물 외에 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류를 포함할 수 있다. 상기 당질, 단백질, 지질, 비타민류 또는 미네랄류는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일 예로 상기 당질은 벌꿀, 덱스트린, 수크로오스, 팔라티노스, 포도당, 과당, 물엿, 당알콜(sugar alcohol), 소르비톨, 크실리톨, 말티톨일 수 있고 상기 단백질은 카제인(casein), 유청 단백질(whey protein) 등의 우유 유래 단백질, 대두 단백질, 이들 단백질의 트립신, 펩신 등의 동물 유래 효소 및 뉴트라아제(neutrase), 알칼라아제(alkilase)에 의한 가수분해물일 수 있으며, 상기 지질은 제1가 포화지방산, 다가 불포화지방산을 포함하는 해바라기유, 채종유(rapeseed oil), 올리브유, 홍화유(safflower oil), 옥수수유, 대두유, 팜유(palm oil), 야자유 등의 각종 식물 유래 유지, 중쇄 지방산(middle-chain fatty acid), EPA, DHA, 대두유래 인지질, 우유 유래 인지질일 수 있고, 상기 미네랄류는 인산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨, 유산칼슘, 글루콘산칼슘, 판토텐산칼슘, 카제인칼슘, 염화마그네슘, 황산제1철, 탄산수소나트륨일 수 있으나, 각각의 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류 중 어느 것에 대해서도, 조성물의 항균성이 유지되는 한 상기 구체 예에 한정되지 않고 다른 성분을 포함할 수 있으며, 각각의 함량은 항균성이 유지되는 한 제한되지 아니하고, 바람직하게는 전체 조성물 대비 0.1 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 10 중량%일 수 있다.

상기 항균 조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용되어 항균 활성을 나타낼 수도 있고, 곡류 등을 포함하는 식품, 화장품 또는 의약품에 적용되어 그람 음성 미생물에 의한 제품의 부패를 억제하거나 예방할 수도 있다.

본 발명의 항균 조성물은 그람 음성 병원성 세균에 대한 항균 활성을 가지는 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함한다.

본 발명의 상기 식품 보존제는 세균, 곰팡이 및 효모 등의 위해 미생물 또는 부패 미생물의 증식을 억제하거나 살균하여, 위해 미생물 또는 부패 미생물에 의해 감염되거나 부패될 수 있는 보존대상의 변질, 산패 또는 부패를 방지하고 보존대상의 상태를 유지하기 위하여 사용되는 물질을 의미한다.

상기 식품은 통조림식품 등을 포함하는 식품가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 건강보조식품, 조미식품, 제빵 및 제과류, 유제품을 포함하는 유가공품, 절임식품, 발효유 및 발효알콜음료를 포함하는 발효식품 또는 음료 등을 포함하며, 상기 사료는 일 예로 가축 사료일 수 있고, 그 용도에 제한되지 아니하고, 고체 또는 액체일 수 있다.

상기 식품 보존제는 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 포함하는 것을 제외하고는 보존제에 포함되는 통상의 물질을 추가로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 균주의 분리

장류로부터 균주를 분리하기 위해 재래시장에서 구매한 된장류 및 청국장 10g에 멸균수를 가한 후 80℃에서 15분간 물중탕을 하고, 희석액 1㎖를 취해 10⁵, 10⁶및 10⁷배율로 단계별 희석하였다. 각 희석액을 0.1㎖씩 취하여 LB(Luria bertani) 고체배지(트립톤 10g/ℓ, 효모추출물 5g/ℓ, 염화나트륨 10g/ℓ, 한천 15g/ℓ)에 도말하고 37℃에서 24-48시간 배양한 후, 각각의 고체배지에서 콜로니의 형태와 크기를 기준으로 바실러스(Bacillus) 균으로 추정되는 6~8개의 콜로니를 채취하여 총 264종의 균주를 1차 선발하였다. 1차 선발된 균주들의 유해 미생물에 대한 억제능을 확인하기 위해 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis ATCC 13076)에 대하여 미량희석법(microdilution method)으로 실험을 수행하여, 살모넬라 엔테리티디스의 성장 억제능이 가장 우수한 균주를 선발하였다.

실시예 2. 분리 균주의 동정

선별한 균주의 동정을 위해 형태적, 생리적, 생화학적 특성을 조사하였으며, 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석함으로써 균주를 최종적으로 동정하였다. 형태학적인 특성은 그람염색 후 현미경으로 관찰하였으며, 생리적, 생화학적 특성 조사는 API 50 CHB 키트(biomerieux Vitek, Inc. 프랑스)를 이용하여 37℃에서 48시간 배양 후 그 결과를 분석하였다.

바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주의 생화학적 특성

특성	반응결과	특성	반응결과
형태학적 모양	rod	알부틴(Arbutin)	+
그람 염색	+	에스쿨린(Esculin)	+
대조구	-	살리신(Salicin)	+
글리세롤(Glycerol)	+	셀로비오스(Cellobiose)	+
에리쓰리톨(Erythritol)	-	말토스(Maltose)	+
D-아라비노스(D-arabinose)	-	락토스(Lactose)	+
L-아라비노스(L-arabinose)	+	멜리비오스(Melibiose)	+
리보스 D-리보스 (Ribose D-ribose)	+	수크로스(Sucrose)	+
D-자이로스(D-xylose)	+	트레할로스(Trehalose)	+
L-자이로스(L-xylose)	-	이눌린(Inulin)	-
D-아도니톨(D-adonitol)	-	멜레지토스(Melezitose)	-
메틸-BD-자이로피라노시클 (Methyl-BD-xylopyranosicle)	-	라피노스(Raffinose)	+
D-갈락토스(D-galactose)	-	녹말(Starch)	+
D-글루코스(D-glucose)	+	글리코겐(Glycogen)	+
D-프룩토스(D-fructose)	+	자이리톨(Xylitol)	-
D-만노스(D-mannose)	+	겐티오비오스(Gentiobiose)	+
L-소르보스(L-sorbose)	-	D-투라노스(D-turanose)	-
람노스(Rhamnose)	-	D-릭소오스(D-lyxose)	-
둘시톨(Dulcitol)	-	D-타가토스(D-tagatose)	-
이노시톨(Inositol)	+	D-푸코스(D-fucose)	-
만니톨(Mannitol)	+	L-푸코스(L-fucose)	-
소르비톨(Sorbitol)	+	D-아라비톨(D-arabitol)	-
α-메틸-D-만노시드 (α-Methyl-D-mannoside)	-	L-아라비톨(L-arabitol)	-
α-메틸-D-글루코시드 (α-Methyl-D-glucoside)	+	글루코네이트(Gluconate)	-
N-아세틸-글루코사민 (N-Acethyl-glucosamine)	-	2-케토-글루코네이트 (2-keto-gluconate)	-
아미그달린(Amygdalin)	+	5-케토-글루코네이트 (5-keto-gluconate)	-

+; 양성, -; 음성.

선별된 균주의 형태적, 생리적 및 생화학적 특성을 조사한 결과(표 1)와 균주의 16S rRNA 분석을 통한 유전적 특성 조사 결과(도 1(서열번호 1) 및 도 2), 분리된 균주는 바실러스 메틸로트로피쿠스(Bacillus methylotrophicus)에 속하는 것으로 나타났고, 본 발명에서는 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주로 명명하였다.

실시예 3. 균주의 내산성 및 인공위액 내성 검사

선발된 균주를 TSB 액체배지(트립톤 17g/ℓ, 소이톤 3g/ℓ, 덱스트로오스 2.5g/ℓ, 염화나트륨 5g/ℓ 및 인산칼륨 2.5g/ℓ) 20㎖가 들어있는 100㎖ 삼각 플라스크에 접종하고 항온 진탕 배양기에서 160rpm의 속도로 72시간 진탕 배양한 후, 내산성 및 인공위액 내성 검사를 실시하였다.

내산성 측정을 위해 선발된 균주를 TSB 액체배지에 접종하여 37℃에서 72시간 배양한 후, 3M 염산으로 pH 2 및 3으로 조정된 새로운 TSB 액체배지에 10⁶ CFU/㎖가 되도록 희석하였다. 희석된 균체들을 37℃에서 2시간 및 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지 산성도를 중화시키기 위해서 0.1M 나트륨 인산염 완충액(sodium phosphate buffer, pH 6.2)으로 균체를 연속적으로 희석시키고 37℃에서 48시간 배양한 후 TSA 고체배지(트립톤 15g/ℓ, 소이톤 5g/ℓ, 염화나트륨 5g/ℓ 및 한천 15g/ℓ) 상에서 생균수를 측정하였다. 생존율은 초기 균의 농도와 TSA 고체배지 상에서 형성된 균의 콜로니의 비율을 비교하여 계산하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

또한, 인공위액에 대한 내성의 측정은 TSA 액체배지에 1% 펩신을 첨가하여 pH 3으로 맞춰 인공위액을 만든 후, 상기에서 설명된 내산성 측정과 동일하게 실시하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주의 내산성 및 인공위액에 대한 내성

생존율(%)
산(pH 2.0)		산(pH 3.0)		인공위액 산(pH 3.0)
2시간	4시간	2시간	4시간	2시간	4시간
85.2±3.62	81.5±1.08	89.2±2.62	87.2±2.56	85.4±3.48	84.3±1.73

측정 결과, 선별된 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주는 산(pH 2, 3)과 인공위액 산(pH 3)에서 4시간 배양하여도 80% 이상이 생존하는 높은 생존율을 보여주었으며, 상기의 결과를 통해 본 발명의 균주가 생균제(프로바이오틱스; probiotics)로서 사용이 가능함을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 균주의 내담즙산성 검사

내담즙산성 측정은 다음과 같이 실시하였다. 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주를 TSB 액체배지에서 37℃에서 48시간 배양한 후, 0.05, 0.1, 0.5, 1 및 2%(w/v) 농도의 옥스갈(Oxgall, Sigma, 미국)이 함유된 TSB 고체배지에 도말하여 37℃에서 24시간 배양하며 균의 성장 여부를 관찰하였다.

Gilliland 등(J. Dairy Sci. 67:3045-3051, 1984)은 생균 활성이 있는 생균이 가져야 할 담즙액에 대한 내성은 옥스갈이 0.3% 함유된 배지에서도 성장할 수 있다고 보고하였으나, 실제로는 더 높은 옥스갈이 함유된 배지에서도 성장할 수 있어야 한다. 하기 표 3에서와 같이 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주는 2% 옥스갈이 함유된 배지에서 초기 균수의 83.3%가 생존하는 높은 생존율을 나타내어 강한 내담즙산성을 보여주었다.

바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주의 내담즙산성

담즙산(옥스갈) %(w/v)	생존율(%)
0.05	94.2± 2.94
0.1	90.9± 2.11
0.5	90.8± 1.53
1	89.1± 2.75
2	83.3± 1.84

실시예 5. 균주의 항균 활성 측정

병원균에 대한 항균활성은 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)의 디스크 확산법(NCCLS M2-A7, 2000)에 준하여 측정하였다. 250㎖의 삼각플라스크에 50㎖의 가용성 전분이 들어간 액체배지(가용성 전분 1%, 효모 추출물 0.5%, 펩톤 0.5%, 염화마그네슘육수화물(MgCl₂ _·6H₂O) 0.05%)를 넣고 살균한 후, 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주 전배양액을 1% 접종하여 37℃ 온도, 180rpm의 조건으로 24시간 진탕배양하고, 그 배양액을 8,000xg에서 원심분리하여 얻은 상층액을 0.2μm 멤브레인 필터로 여과하여 항균활성 측정시료로 사용하였다. 측정법은 MH(Mueller Hinton) 고체배지(소고기 추출물 2g/ℓ, 카제인 가수분해물 17.5g/ℓ, 전분 1.5g/ℓ 및 한천 17g/ℓ)에 각 측정 대상 병원성균의 농도가 1.5x10⁸ CFU/㎖가 되도록 멸균 생리 식염수에 희석한 접종 균액을 만든 후 면봉을 이용하여 고체배지 표면에 균일하게 도포하였다. 그리고 항균활성 측정시료 100㎕씩을 흡착시켜 건조시켜 둔 8mm 페이퍼 디스크(Toyo Rhosi kaisha,Ltd., 일본)를 배지 위에 얹어 37℃ 항온기에서 18~24시간 배양하고 생육저해를 나타내는 증식억제대(inhibition zone)의 직경(mm)을 측정하여 표 4에 나타내었다.

조사결과 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주에서 분비하는 항균물질은 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium ATCC 13311), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis ATCC 13076), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis KCCM 12021), 대장균(Escherichia coli ATCC 25922) 및 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853)에 대해 높은 항균활성이 관찰되었다. 하지만, 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주는 그람 양성 미생물 균주 및 유산균(lactic acid bacteria)에 대해서는 증식 억제 활성을 나타내지 않았다. 이상의 결과를 통해 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주가 생산하는 항균물질의 경우, 유해균을 제어하고 장내 미생물 균총 안정화에 기여하는 유산균에는 영향을 주지 않아 유용한 생균제(probiotics)로의 가능성이 크다고 평가할 수 있다.

바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주의 항균활성

균주	증식억제대(mm)
그람 양성 미생물( Gram - positive bacteria )
Staphylococcus aureus ATCC 29213	-
Methicillin-resistant S. aureus (MRSA) ATCC 33592	-
Enterococcus faecalis ATCC 19433	-
Vancomycin-resistant E. faecalis (VRE) ATCC 52199	-
Bacillus cereus	-
그람 음성 미생물( Gram - negative bacteria )
Salmonella typhimuriumATCC 13311	15±1.2
Salmonella enteritidis ATCC 13076	24±1.0
Salmonella enteritidisKCCM 12021	16.5±1.5
Escherichia coli ATCC 25922	26±2.0
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853	15±2.0
유산균( Lactic acid bacteria )
Lactobacillus rhamnosus KCTC 3418	-
Lactobacillus acidophilus	-
Bifidobacterium bifidum KCTC 5033	-

한국미생물보존센터(국내)

KFCC11570P

20131127

<110> UNIBIOTECH CO.,LTD. <120> Bacillus methylotrophicus C14 strain having acid-resistance, bile acid-resistance and antimicrobial activity and uses thereof <130> PN14039 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1435 <212> DNA <213> Bacillus methylotrophicus C14 <400> 1 tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60 acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120 atggttgttt gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180 ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag 240 ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300 ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360 gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc cgttcaaata 420 gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480 ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540 tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600 aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660 tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa 720 gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780 agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840 gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900 catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960 tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020 gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg 1080 ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140 tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa 1200 caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc 1260 gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320 cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380 cccgaagtcg gtgaggtaac cttttaggag ccagccgccc gaagggtgga ccacg 1435

Claims

내산성, 내담즙산성 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 대장균(Escherichia coli) 및 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 그람 음성 병원성 세균에 대한 항균 활성을 가지는 바실러스 메틸로트로피쿠스(Bacillus methylotrophicus) C14 균주 (KFCC11570P).
제1항에 있어서, 상기 내산성은 pH 1.5~3.0의 액체배지에서 37℃, 1~5시간 배양시 생존율 80% 이상을 나타내는 것을 특징으로 하는 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주.
제1항에 있어서, 상기 내담즙산성은 담즙산이 1~3%(w/v) 함유된 고체배지에서 37℃, 24시간 배양시 생존율 80% 이상을 나타내는 것을 특징으로 하는 바실러스 메틸로트로피쿠스 C14 균주.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제.
제4항의 프로바이오틱스 제제를 포함하는 식품.
제4항의 프로바이오틱스 제제를 포함하는 사료 첨가제.
제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 대장균(Escherichia coli) 및 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 그람 음성 병원성 미생물에 대한 항균 조성물.
삭제
제7항의 항균 조성물을 포함하는 식품 보존제.