KR101618220B1

KR101618220B1 - 신규 바실러스 속 균주 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101618220B1
Application number: KR1020140020365A
Authority: KR
Inventors: 김영옥; 남보혜; 안철민; 이상준; 김동균; 지영주
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2014-02-21
Filing date: 2014-02-21
Publication date: 2016-05-18
Also published as: KR20150098953A

Abstract

항균활성 및 프로바이오틱스 활성을 갖는 신규 바실러스속 균주가 제공된다. 본 발명의 균주는 다양한 어류 병원성 세균뿐만 아니라, 화장품 표준균주 및 치아우식균에 대한 광범위한 항균활성을 가지고 있을 뿐만 아니라, 프로테아제, 아밀라제, 셀룰라제, 자일라제 등 사료의 소화흡수에 도움을 주는 유용한 효소를 분비하는 등 프로바이오틱스로서 기능을 하기 때문에, 어류 및 갑각류의 사료 첨가제는 물론, 항균제와 식품 및 화장품 분야의 보존용 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규 바실러스 속 균주 및 그의 용도{A novel Bacillus sp. strain and use thereof}

본 발명은 신규 균주 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항균활성을 갖고 프로바이오틱스로 작용 가능한 신규 바실러스 균주 및 그의 용도에 관한 것이다.

현재, 바다양식은 대량, 고밀도 사육이 행해지고 있고, 이러한 양식어류는 많은 스트레스와 병원성 세균에 노출되고 있어 각종 항생제 제품을 사료와 합하여 투여하므로써 질병예방 및 증체율향상을 유도하고 있다. 그러나, 최근에는 동물 및 어류에게 예방학적 차원에서 사용하고 있는 항생제를 경보호차원에서 그 사용을 규제하고 있고, 또한 일부 이에 대해 법적 규제를 행하고 있다. 따라서, 항생제 대신에 천연 유래의 프로바이오틱스를 사용하고자 하는 시도가 등장했고, 실제로, 동물 및 어류에 프로바이오틱스로서 유산균을 투여했을 때, 그 효과가 우수한 것으로 보고된 바도 있다(Simirnov, V.V. et al., Microbiol. Z. 55(4): 92, 1993).

프로바이오틱스(Probiotics)란 살아있는 생균제로서 사람 및 동물에 투여된 생균이 장내의 소화관 벽에 밀집, 정착하여 유해균이 정착하지 못하게 하는 작용을 하며, 유산을 생성하여 장내의 pH를 낮추어서 유해세균이 증식하지 못하게 하는 역할을 수행한다. 또한, 투여된 생균제는 박테리오신(Bacteriocin) 혹은 과산화물을 생성하여 병원균의 증식을 억제하며 영양분의 흡수를 담당하는 장융모의 활동을 도와준다. 이밖에도, 생균제는 영양소의 흡수와 이용을 돕는 물질을 생성하고, 사료요구율을 개선시키며, 병원균이 생성하는 독성물질을 중화하는 물질을 생성하기도 한다. 생균제는 대체로 동물 혹은 어류가 스트레스로 인한 소화관의 유용균 감소를 제할 목적으로 이용되며, 항생물질을 경구투여하고 난 후 병원균보다 먼저 세균이 없는 소화관 벽에 부착하여 병원균이 정착하는 것을 방지한다.

그러나, 유산균은 종-특이성(Species-specificity)이 있어 사용하고자 하는 동물의 장세포와 어떤 친화력이 있어서 분과 함께 증식되는 데로 배설되지 않고, 장내 흡착하는 특성이 있어야 효과적인 질병 예방 및 치료효과를 얻을 수 있다(Conway, P.L. et al., J. Dairy Sci. 70:1, 1987), Fuller et al., Am. J. Clin. Nutri. 27: 1305, 1974). 그럼에도 불구하고, 현재 프로바이오틱스(Probiotics)로서 사용하고 있는 대부분의 유산균 속들은 사람 및 육상동물의 장내에서 쉽게 분리되는 특성이 있으며, 이를 사람 및 육상동물 뿐만 아니라 해상 및 담수에 생육하는 어류에도 적용하고 있는 실정이다.

더구나, 가축에 대한 생균제의 개발은 전 세계적으로 많이 연구되어 있어 많은 제품들이 상품화되어 있으나, 어류에 대한 생균제의 제품은 그렇게 많지가 않으며, 현재까지 국내에서 사용되고 있는 어류 전용 프로바이오틱스 제품은 대부분 외국에서 수입되는 균주로써 국내의 어류의 생육환경에 잘 적응하지 못하고 있는 실정이다. 또한, 해양어류에 프로바이오틱스로 사용하는 미생물의 유래가 어류에서 분리된 균주라기보다는, 대부분이 포유동물에서 분리되어 포유동물과 함께 사용하고 있어 어류에 대한 효과에 의구심을 불러일으킨다. 게다가, 원료의 수입으로 인하여, 수입에서 국내 유통간의 시간적인 차이로 인한 안정성의 결핍으로 균체의 콜로니형성도(Colony Forming Unit)가 낮다는 점도 상당한 문제점으로 제시되고 있다.

어류용 프로바이오틱스와 관련하여 국내의 선행기술을 살펴보면, 대한민국 특허등록 제206454호는 어류의 장에서 분리한 락토바실러스속 DS-12 균주 및 이를이용한 프로바이오틱스를 개시하고 있고, 대한민국 공개특허 제2008-0104846호는 뱀장어 유래의 락토바실러스 펜토서스 PL-11 균주 및 이를 이용한 뱀장어 전용 프로바이오틱스를 개시하고 있다.

그러나, 상술한 선행기술의 경우 넙치 및 방어의 연쇄구균증의 원인균인 스트렙토코커스속 균에 대한 항균활성이 없거나 배양상등액을 고농도로 처리하는 경우에만 항균활성을 나타나내며, 뱀장어 전용이라는 점 등 활용도가 떨어지는 단점이 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 신규 바실러스 균주 및 그의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 신규 바실러스 속(Bacillus sp.) SW 1-1균주가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 신규 Bacillus sp. 균주를 포함하는 프로바이오틱스 제제가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 신규 Bacillus sp. 균주를 포함하는 어류 및/또는 갑각류 양식용 사료 첨가제가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 사료 첨가제를 포함하는 어류 및/또는 갑각류 양식용 사료가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 신규 Bacillus sp. 균주, 상기 Bacillus sp. 균주의 파쇄물 또는 상기 Bacillus sp. 균주의 배양상등액을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 신규 Bacillus sp. 균주의 파쇄물 또는 배양상등액을 유효성분으로 함유하는 식품 보존용 첨가제가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 신규 Bacillus sp. 균주의 파쇄물 도는 배양상등액을 유효성분으로 함유하는 화장품 보존용 첨가제가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 신규 Bacillus sp. 균주의 파쇄물 도는 배양상등액을 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 신규 Bacillus sp. 균주의 파쇄물 또는 배양상등액을 함유하는 치약 조성물이 제공된다.

본 발명의 신규 Bacillus subtilis는 어류의 부화 및 어류의 먹이인 물벼룩 및 알테미아 새우의 활력에 아무 영향을 주지 않으면서도, 어류의 병원균인 Edwardisella tarda, Streptococcus iniae 및 Vibrio anguillarum에 대한 강한 항균활성을 보일 뿐만 아니라, 생체에 유용한 다양한 효소를 분비하므로, 프로바이오틱스 및 사료 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 신규 Bacillus sp. 균주의 한천배지에서의 배양된 모습을 촬영한 사진(a) 및 상기 균주의 16S rDNA의 염기서열을 나타낸 그림(b)이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 신규 Bacillus sp. 균주의 16S rDNA 염기서열 비교에 기반한 계통수이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따른 신규 Bacillus sp. 균주의 온도 및 배양 시간에 따른 세포성장을 나타낸 그래프이다
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 Bacillus sp. 균주의 온도 및 배양 시간에 따른 항균활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 신규 Bacillus sp. 균주의 어류 병원성 세균에 대한 항균활성을 나타낸 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 신규 Bacillus sp. 균주의 다양한 화장품 표준 균주 및 치아우식균에 대한 항균활성을 나타낸 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 신규 Bacillus sp. 균주의 다양한 효소 생산능을 나타내는 사진이다:
a: protease, b: amylase, c: xylase, d: CMCase.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 신규 Bacillus sp. 균주의 프로바이오틱스 활성을 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 신규 Bacillus sp. 균주의 배양상등액의 E. tarda 균주 세포벽 분해활성을 나타내는 그래프이다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 신규 바실러스 속(Bacillus sp.) SW 1-1 균주(KCCM 11517P)가 제공된다.

본 발명의 신규 Bacillus sp. SW 1-1균주(KCCM 11517P)는 새우내장으로부터 분리되었다. 구체적으로 본 발명자들은 국내양식장에서 수득한 새우 내장에서 MRS 한천 배지를 이용한 스크리닝을 수행하여 형태학적으로 구분되는 300균주를 선별하였고, 한천 배지를 이용한 항균 활성 스크리닝을 통해 10 균주를 2차 선별하였으며, 최종적으로 항균활성이 가장 강한 균주를 선별하여, 이에 대한 16S rDNA 염기서열을 결정한 결과(서열번호 1), 상기 선별된 균주의 16S rDNA가 공시균주인 Bacillus amyloiquefaciens FZB42T 균주의 그것과 99%의 상동성을 나타내어, Bacillus 속에 속하는 신규한 균주임을 확인하였다(도 1 및 2 참조).

상기 신규 Bacillus sp. 균주는 중온(30℃) 및 고온(37℃)에서는 24시간을 정점으로 세포 수가 감소하나, 저온(25℃)에서는 완만하게 성장을 지속하여 저온선호도를 나타냈다(도 3 참조). 아울러 상기 신규 Bacillus sp. 균주의 배양 온도 및 배양시간에 따른 항균활성을 확인한 결과, 상기 신규 Bacillus sp. 균주는 고온(37℃)에서는 항균활성이 떨어지고, 중온(30℃)에서는 24시간까지 항균활성이 증가하나, 그 이후 48시간까지 정체현상을 나타내다가 48시간 경과 후 항균활성이 감소하기 시작하며, 저온(25℃)에서는 24시간 경과 후에도 일정한 항균활성을 나타냈다(도 4 참조).

아울러, 상기 신규 Bacillus sp. 균주는 대표적인 어류 병원균인 Edwardsiella tarda, Streptococcus iniae, Vibrio harveyi 및 Streptococcus parauberis에 대하여 강력한 항균활성을 나타냈고, Vibrio anguillarum에 대해서는 중간 정도의 항균활성을 나타냈다(도 5 참조).

한편, 상기 신규 Bacillus sp. 균주의 효소 분비능을 조사한 결과, 상기 신규 Baciilus sp. 균주는 protease, amylase, xylase, 및 CMCase를 분비하는 것으로 확인되어, 사료첨가제로 매우 적절한 균주임을 알 수 있었다(도 7 참조).

따라서, 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 신규 Bacillus sp. 균주를 유효성분을 함유하는 사료첨가제가 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따른 사료첨가제는 상기 유효성분 외에도 약학적, 식품학적 또는 사료용으로 허용되는 공지의 담체 또는 안정제 등 첨가제를 가할 수 있으며, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료첨가제를 공급하는 경우는 어류 또는 갑각류에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.

본 발명의 대상이 되는 어류는 도미, 넙치, 우럭, 참돔, 민어, 숭어, 능성어 등의 해산어류 및 뱀장어, 은어, 산천어, 송어, 쏘가리 등의 육상어류인 것이 바람직하며, 도미인 것이 더욱 바람직하나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다. 갑각류는 흰다리 새우(Litopenaeus vannamei), 보리새우(Marsupenaeus japonicus), 페나에우스 모노돈(Penaeus monodon), 대하(Penaeus chinensis), 피나에우스 모르기엔시스(Penaeus morguiensis) 등을 포함하는 새우류 및 상해 게, 꽃게 등의 게류 등 인 것이 바람직하며, 흰다리 새우인 것이 더욱 바람직하며, 남미 흰다리 새우(Penaeus vannanei)인 것이 가장 바람직하나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.

특정 균주가 사료 첨가제로 사용되기 위해서는, 자체적으로 병원성이지 않아야 하며, 어류의 부화나 어류 및 갑각류의 사료로 사용되는 물벼룩(로티퍼)과 알테미아 새우의 생육에 영향을 미치지 않아야 한다. 본 발명의 신규 Bacillus sp. 균주는 넙치의 부화에 전혀 영향을 미치지 않을 뿐만 아니라, 로티퍼 및 알테미아의 활력에 전혀 영향을 미치지 아니하였다(표 1 내지 3 참조).

더 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 신규 Bacillus sp. 균주는 생체 실험 결과 현저한 프로바이오틱스 효과가 나타났다. 구체적으로 본 발명의 발명자들은 넙치 E. tarda를 넙치에 복강주사로 감염시킨 후, 신규 Bacillus sp. 균주를 사료에 섞어 급이한 후, 상기 Bacillus sp. 균주를 급이하지 않은 대조군에 비교하여 폐사 개체수를 조사한 결과, 대조군에 비하여 폐사 개체수가 유의하게 낮음을 확인하였다(도 8 참조).

따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 신규 Bacillus sp. 균주는 어류 및 갑각류의 양식을 위한 프로바이오틱스로서 유용하게 사용가능함을 알 수 있다. 이에, 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 신규 바실러스 균주를 포함하는 프로바이오틱스 제제가 제공된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 프로바이오틱스 제제에는 상기 유효성분 외에도 약학적, 식품학적 또는 사료용으로 허용되는 공지의 담체 또는 첨가제가 포함될 수 있다.

아울러, 본 발명의 다른 일 관점에 따르면 상기 Bacillus sp. 균주가 함유된 어류 및/또는 갑각류 양식용 사료를 제공한다. 본 발명의 일 실시예에 따른 신규 Bacillus sp. 균주는 포자형성이 가능한 그람양성균이므로, 포자 형태로 제형화되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에 따른 어류 및/또는 갑각류 양식용 사료는 상기 신규 Bacillus sp. 균주 외에 어분, 깻묵, 전분박, 대두박, 물벼룩과 같은 주사료와 배합되어 배합사료의 형태로 제공될 수 있다. 상기 사료의 제형 역시 특별히 한정되는 것은 아니고, 분말사료, 고형사료, 모이스트 펠릿사료, 드라이 펠릿사료, EP(Extruder Pellet) 사료, 날먹이 등 어떠한 사료라도 무방하다. 이 때, 상기 사료는 통상의 사료와 동일한 양 및 급이 간격으로 공급되는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에 따른 신규 Bacillus sp. 균주는 어류 병원균 외에도 화장품 표준균주인 Candida albicans, E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus는 물론 치아우식균인 Streptococcus mutans에 대한 광범위한 항균활성을 나타내었을 뿐만 아니라(도 6 참조), 상기 항균활성이 세균의 세포벽에 대한 용해활성에 기인하는 것인지 확인하기 위하여, E. tarda 세포벽 현탁액과 상기 Bacillus sp. SW 1-1 균주의 농축 배양상등액을 혼합하여 반응시킨 결과, 시간이 경과할수록 E. tarda 세포벽 현탁액이 상기 농축 배양상등액의 처리시 대조군과 달리 혼탁도가 낮아져서, Bacillus sp. SW 1-1 균주에서 분비되는 성분에 세균의 세포벽 용해활성을 갖는 성분이 있음을 확인하였다(도 9 참조). 따라서, 본 발명의 Bacillus sp. SW 1-1 균주의 파쇄액 또는 배양상등액은 항균 조성물은 물론 식품 또는 화장품의 보존제로도 활용이 가능하다.

따라서, 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 신규 Bacillus sp. 균주, 상기 Bacillus sp. 균주의 파쇄물 또는 상기 Bacillus sp. 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물이 제공된다. 상기 항균용 조성물은 그람음성균, 그람양성균은 물론 효모에 대한 포괄적인 항균 스펙트럼을 나타내며, 상기 그람음성균은 대장균(E. coli), Pseudomonas aeruginosa, Edwardsiella tarda, Vibrio harveyi, Vibrio anguillarum 또는 살모넬라균(Salmonella sp.)일 수 있고, 상기 그람양성균은 Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Streptococcus iniae 또는 Streptococcus parauberis일 수 있으며, 상기 효모는 Candida albicans일 수 있다.

아울러, 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 신규 Bacillus sp. 균주의 파쇄물 또는 배양상등액을 유효성분으로 함유하는 식품 첨가제가 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 신규 Bacillus sp. 균주의 파쇄물 또는 배양상등액을 유효성분으로 함유하는 화장품 보존제가 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 신규 Bacillus sp. 균주의 파쇄물 또는 배양상등액을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예를 통해 설명하기로 한다. 본 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로서 본 발명의 범위가 본 실시예로 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 균주의 분리 및 동정

본 발명자들은 프로바이오틱스로 사용가능한 신균주를 발굴하기 위해, 새우 양식장의 새우 내장으로부터 항균 활성이 우수한 균주를 선별하였다. 구체적으로, BHI(Brain Heart Infusion) 한천 배지 및 MRS(de Man, Rososa and Sharpe) 한천 배지 상에 새우 내장을 도말한 후 30℃에서 배양하여, 형태적으로 다른 300 균주를 1차 선별하였다. 이어, 이들 균주를 각각 BHI 한천 배지 및 MRS 한천 배지에서 48시간 배양 후 배양상등액을 10배 농축하였다. 항균활성 측정을 위하여 Vibrio harveyi 균을 BHI 한천 배지에 도말하고 0.8 cm Paper-disk에 상기 농축 배양상등액 50 μl를 분주한 후 저지대를 형성하여 항균활성을 보이는 10 균주를 2차 선별하였다. 그런 다음, 이들 균주 중 항균활성이 가장 강한 균주를 최종적으로 선별하였다. 상기와 같이 선별된 균주에 대한 16S rDNA에 대한 염기서열을 분석한 결과, 상기 균주는 그람 양성 간균으로서, 공시균주인 Bacillus amyloliquefaciens FZB42T 균주의 16S rDNA 염기서열과 99% 이상의 상동성을 가진 Bacillus sp. 신규 균주인 것으로 판정되어(도 1, 서열번호 1), 이를 Bacillus sp. SW 1-1 균주로 명명하였으며(도 2), 이를 2014년 2월 6일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여, 수탁번호 KCCM 11517P를 부여받았다.

실시예 2: 성장 곡선 및 항균활성 분선

본 발명자들은 상기 Bacillus sp. SW 1-1 균주의 특성을 확인하기 위해, 다양한 온도에서의 성장곡선 및 항균활성을 분석하였다.

우선, 본 발명의 Bacillus sp. SW 1-1 균주를 각각 25℃, 30℃, 35℃에서 BHI 배지에 1% 재접종 후 배양하면서 배양시간에 따른 성장 양상을 조사하였다(도 3). 그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이, 24시간까지는 상기 세 온도 조건 모두에서 잘 성장하였고, 온도가 높을수록 성장속도가 더 빨랐으나, 24시간 경과후 중간온도(30℃) 및 고온(37℃)에서는 세포 수가 시간이 지날수록 감소한 반면, 저온(25℃)에서는 성장속도가 다소 완만해지긴 하였으나, 지속적으로 성장세를 나타내 저온 선호도를 나타냈다.

이어 본 발명자들은 온도조건 및 시간의 경과에 따른 본 발명의 Bacillus sp. SW 1-1 균주의 항균활성을 조사하였다. 구체적으로, 대조군으로 V. harveyi만 배양하고 실험구로 V. harveyi와 본 발명의 Bacillus sp. SW 1-1 균주를 25℃, 30℃ 또는 37℃의 온도 조건에서 함께 배양하면서 시간대별로 배양액의 흡광도를 측정하여 600 nm에서 흡광도 0.01 감소값을 1 unit로 계산하였다(도 4). 그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이, 24시간까지는 세 가지 온도조건에서 항균활성이 증가하였으나, 고온에서의 항균활성이 제일 떨어졌고, 중온에서의 항균활성이 제일 높게 나타났다. 24시간이 경과한 후에는 세 온도 조건마다 다른 항균활성을 나타냈는데, 저온에서는 24시간을 정점으로 항균활성이 감소하여 48시간 경과시에는 항균활성이 사라졌고, 중온에서는 48시간까지 높은 항균활성을 나타내다가 48시간 경과후 항균활성의 급격한 감소가 나타냈으며, 중온에서는 24시간 경과 시점의 항균활성이 지속적으로 유지되었다. 이러한 특성은 상온에서 보관되는 식품이나 화장품의 부패방지에 본 발명의 균주가 적합할 수 있음을 시사하는 것이다.

실시예 3: 항균 스펙트럼 분석

3-1: 어류 병원성 미생물에 대한 항균활성 분석

본 발명자들은 본 발명의 Bacillus sp. SW 1-1 균주의 항균 범위가 어느 정도인지 확인하기 위해, 다양한 어류 병원성 미생물에 대한 항균 활성을 할로테스트를 통해 분석하였다. 구체적으로, 어류 병원성 미생물인 Edwardsiella tarda, Streptococcus iniae, Vibrio anguillarum, Vibrio harveyi 및 Streptococcus parauberis를 각각의 균의 생장에 적합한 배지에서 배양시킨 후, 상기 배지가 함유된 한천 배지위에 도말한 후, 0.8 cm 직경의 종이 디스크를 올린 다음, 본 발명의 Bacillus sp. SW 1-1 균주를 30℃에서 48시간 배양하여 균 농도가 1.0x10⁸ cfu/ml에 이르렀을 때, 원심분리하여 수득한 5배 농축 배양 상등액을 50 ㎕ 정도 떨어뜨린 후, 25-30℃에서 24-48시간 배양한 후, 형성된 투명환의 크기를 측정하였다(도 5). 그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, 본 발명의 Bacillus sp. SW 1-1 균주는 E. tarda, S. iniae, Vibrio harveyi 및 S. parauberis에 대하여는 강한 항균활성을 나타내었고, V. anquillarum에 대하여는 중간정도의 항균활성을 타나내었다. 상기 결과는 본 발명의 Bacillus sp. SW 1-1 균주가 어류 병원균의 조절을 위한 생균제(probiotics)로서의 사용 가능성을 시사하는 것이다.

3-2: 화장품 표준균주 및 치아우식균에 대한 항균활성 분석

이어, 본 발명자들은 본 발명의 Bcillus sp. SW 1-1 균주가 일반적인 항균제로 사용가능한지 여부를 확인하기 위해, 상기 실시예 3-1과 유사하게 화장품 표준균주인 효모 Candida albicans, 대장균(E. coli), 포도상 구균(Staphylococcus aeruginosa), 및 녹농균(Pseudomonas aeuroginosa) 그리고 치아우식균인 Streptococcus mutans에 대한 항균활성을 분석하였다(도 6). 그 결과 도 6에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 Bacillus sp. SW 1-1 균주는 대장균과 녹농균에 대하여는 매우 강한 항균활성을 나타냈고, Candida albicans, 포도상 구균 및 치아우식균에 대하여는 중간정도의 항균활성을 나타냈다.

실시예 4: 효소 분비능 분석

본 발명자들은 본 발명의 Bacillus sp. SW 1-1 균주가 유용한 효소를 분비하는 지 확인하기 위해, 다양한 기질에 대한 분해능을 조사하였다. 먼저, 단백질과 지방분해효소 활성을 조사하기 위해, 탈지분유(skim milk)가 도말된 배지 위에, 본 발명의 Bacillus sp. SW 1-1 균주를 도말하고, 30℃에서 24시간 동안 배양한 후, 균주의 도말 부위 주변에 투명환이 생성되는지 확인하였다(도 7). 그 결과 도 7의 a에서 나타난 바와 같이, 기질인 탈지분유의 분해를 의미하는 투명환이 생성됨을 확인하였다. 이어, 본 발명자들은 본 발명의 균주에 아밀라제, 자일라아제 및 카르복시메틸셀룰라제(CMCase) 활성이 있는지 확인하기 위해, 각각 수용성 녹말, 자일란 및 카르복시메틸셀룰로오스가 도포된 한천 평판배지 위에 종이디스크를 놓고 실시예 3에서 사용한 본 발명의 균주의 5배 농축 배양상등액을 50 ㎕ 떨어뜨린 후, 실온에서 16시간 정치시킨 후, 투명환의 생성여부를 관찰하였다. 그 결과, 도 7의 b 내지 d에서 나타난 바와 같이, 종이 디스크 주변에 투명환이 생성되어, 아밀라제, 자일라아제 및 CMCase 활성이 있음을 확인하였다. 이들 효소는 사료내에 포함된 다양한 바이오매스의 분해를 촉진시켜, 사육하는 개체로 하여금 사료의 효율적인 소화를 돕기 때문에, 이들 효소를 분비하는 비병원성 균은 사료첨가제로 활용가치가 높다. 따라서, 본 발명의 Bacillus sp. SW 1-1 균주는 사료의 소화 흡수 측면에서도 매우 유용한 균주임을 알 수 있다.

실시예 5: 프로바이오틱스 효과 분석

본 발명자들은 실제 본 발명의 균주를 사료에 첨가하여 어류에 공급하는 경우, 프로바이오틱스로서 작용을 하는지 알아보기 위해, 실제 본 발명의 Bacillus sp. SW 1-1 균주를 사료에 혼합하여 공급한 후, 대표적인 어류 병원균인 E. tarda를 넙치의 복강에 주사한 후, 폐사 개체수를 조사하였다.

구체적으로, 사료는 표 5와 같이 생균제 첨가사료는 본 발명의 균주 배양체 분말을 0.5%(w/w)로 혼합하고 대조구는 셀룰로오스를 첨가하려 동일하게 맞추어서 원료를 혼합 후 사용하였다. 생균제 효과검증을 위하여 공격실험시 넙치(각 그룹별 110마리)에 대조구와 생균제 첨가사료를 각각 한 달간 급이 후 E. tarda 균 5x10⁵ 세포를 복강주사하고 수온 20~22℃에서 15일간 사육하면서 누적폐사 개체수를 기록하였다(도 8). 그 결과, 도 8에서 보는 바와 같이, 대조군 그룹은 감염 12일 경과후 45마리가 폐사한 반면, 본 발명의 생균제 첨가 그룹에서는 32마리만 폐사하여, 본 발명의 Bacillus sp. SW 1-1 균주가 생균제로 효과적임을 알 수 있었다.

프로바이오틱스 효과검증을 위한 사료조성 표

대조구		생균제
원료명	%	원료명	%
Fishmeal	65.6	Fishmeal	65.6
Wheat meal	20.4	Wheat meal	20.4
Squid liver oil	5.5	Squid liver oil	5.5
Soybean meal	3.0	Soybean meal	3.0
Vitamine premix	1.0	Vitamine premix	1.0
Mineral premix	1.0	Mineral premix	1.0
CMC	3.0	CMC	3.0
cellulose	0.5	생균제(Bacillus sp. SW 1-1)	0.5
Total	100	Total	100

상기와 같은 결과는, 어류 전염병이 빈번하게 발생하는 여름철에도 본 발명의 균주가 어류의 집단폐사의 예방에 효과적임을 보여주는 것이다.

실시예 6: 어류 난 부화 실험

특정 박테리아가 어류의 사료 첨가제로 사용되기 위해서는 비병원성일 뿐만 아니라, 어류 알의 부화에 대한 영향이 없어야 한다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명의 균주의 존재하에서 넙치 알의 부화율을 측정하였다. 구체적으로, 수정된 후 12시간이 경과한 넙치 알 120개 정도를 세어 멸균 해수가 담긴 비이커에 넣고, 본 발명의 균주와 E. tarda를 표 2에 기재된 농도로 접종한 후, 1일 경과 후 부화율을 측정하였다. 그 결과, 표 2에서 보는 바와 같이, 본 발명의 균주는 넙치 알의 부화에 전혀 영향을 미치지 아니하였다. 반면, E. tarda의 경우에는 고농도로 처리할 경우, 폐사 두수가 증가하였으며, 이러한 양상은 본 발명의 균주를 첨가시 억제됨을 알 수 있었다.

어류 난 부화에 미치는 Bacillus sp. SW 1-1의 영향

실험구	E. tarda	폐사 마리수	생존 마리수	기타
1x10⁶ (Bacillus sp. SW 1-1 처리구)	no E. tarda	7	105
	1x10⁵ E. tarda	8	110
	1x10⁶ E. tarda	6	95
	1x10⁷ E. tarda	5	103
E. tarda만 처리구	no E. tarda	7	100
	1x10⁵ E. tarda	15	98
	1x10⁶ E. tarda	8	102
	1x10⁷ E. tarda	7	95

실시예 6: 물벼룩 및 알테미아의 활력에 미치는 영향 조사

박테리아가 어류 및 갑각류의 양식용 사료 첨가제로 사용되기 위해서는 이들에 대한 주 먹이인 물벼룩(로티퍼)와 알테미아의 생존 및 활력에 영향을 미쳐서는 안 된다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명의 균주가 로티퍼 및 알테미아 새우의 활력에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다. 구체적으로 동수의 로티퍼를 각각 일반 멸균 해수(대조군)와 본 발명의 균주를 10⁶ CFU/ml로 접종한 멸균 해수에 넣은 후 상온에서 24시간 방치 후, 살아 있는 로티퍼의 개체수를 측정하였다. 그 결과, 표 3에서 보는 바와 같이, 대조군과 비교할 때, 본 발명의 균주의 접종군에서의 로티퍼의 활력은 변화가 없었다. 이어, 본 발명자들은 다른 사료용 플라크톤인 알테미아의 활력에 대한 본 발명의 Bacillus sp. SW 1-1균주의 영향을 조사하였다. 구체적으로 동수의 알테미아를 일반 멸균 해수와 본 발명의 균주를 10⁶ CFU/ml로 접종한 멸균 해수에 넣고 상온에서 24시간 방치 후, 살아 있는 알테미아의 개체수를 측정하였다. 그 결과, 표 4에서 보는 바와 같이, 본 발명의 균주는 알테미아의 활력에 영향을 미치지 아니하였다.

로티퍼 활력에 미치는 Bacillus sp. SW 1-1의 영향

		로티퍼 균수 측정
		1회	2회	3회	4회	5회	6회	7회	8회	9회	10회	로티퍼 평균수
1회	대조구	7	7	6	6	6	6	5	6	5	7	6.1
1회	1x10⁶ (Bacillus sp. SW 1-1 처리구)	5	7	6	8	5	7	5	5	6	7	6.1
2회	대조구	12	8	8	12	13	9	10	10	10	9	10.1
2회	1x10⁶ (Bacillus sp. SW 1-1 처리구)	8	15	7	8	7	8	10	8	13	10	9.4

알테미아 활력에 미치는 Bacillus sp. SW 1-1의 영향

		알테미아 균수 측정
		1회	2회	3회	4회	5회	6회	7회	8회	9회	10회	알테미아 평균수
1회	대조구	6	4	5	6	6	6	6	7	4	4	5.4
1회	1x10⁶ (Bacillus sp. SW 1-1구)	6	5	5	4	5	6	6	4	5	5	5.1
2회	대조구	5	4	6	6	5	4	8	6	4	5	5.3
2회	1x10⁶ (Bacillus sp. SW 1-1 처리구)	5	5	4	4	5	7	5	7	6	5	5.3

실시예 8: 항균기전 연구

본 발명자들은 본 발명의 Bacillus sp. SW 1-1 균주의 항균활성이 어떤 기전에 기인하는 것인지 확인하기 위해, E. tarda 균의 세포벽 현탁액을 제조하여 본 발명의 Bacillus sp. SW 1-1 농축 배양상등액이 상기 E. tarda 균의 세포벽을 분해하는지 여부를 조사하였다. 구체적으로, E. tarda 세포벽 현탁액을 브로네케와 피들러방법 (Bronneke and Fiedler method, 1994) 으로 제조한 후, 상기 E. tarda 세포벽 현택액 1.7 ml과 상기 실시예 3-1에서 제조된 Bacillus sp. SW 1-1 농축 배양상등액 0.3 ml을 혼합한 후, 시간 경과에 따라, 600 nm에서의 흡광도(OD600)을 측정하였다(도 9). 그 결과, 도 9에서 나타난 바와 같이, 시간이 경과할수록, E. tarda 세포벽 현탁액의 흡광도가 감소하였으며, 이는 본 발명의 Bacillus sp. SW 1-1 농축 배양상등액이 E. tarda 세포벽을 분해했음을 의미하는 것으로, 본 발명의 Bacillus sp. SW 1-1 균주가 세균의 세포벽을 분해하는 물질을 분비함을 의미한다. 따라서, 본 발명의 Bacillus sp. SW 1-1 균주 자체뿐만 아니라, Bacillus sp. SW 1-1로부터 분비된 물질 역시 항균제로 사용 가능하고, 이는 본 발명의 균주가 식품 및 화장품의 보존을 위한 첨가제로도 활용이 가능함을 시사하는 것이다.

본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

한국미생물보존센터

KCCM11517P

20140206

<110> Republic of Korea represented by National Fisheries Research & Development Institute <120> A novel Bacillus sp. strain and use thereof <130> PD13-1141 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1513 <212> DNA <213> Bacillus sp. SW 1-1 <400> 1 agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60 ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120 cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga 180 accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240 cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300 ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360 gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420 cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt 480 gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540 gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600 gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660 gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720 agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780 aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840 tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900 aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960 ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag 1020 gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080 agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1140 tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200 atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg 1260 aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1320 tcgactgtgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt 1380 tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1440 gaggtaacct tttaggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta 1500 acaaggtaac tgt 1513

Claims

항균 및 프로바이오틱스 활성을 갖는 신규 바실러스 속(Bacillus sp.) SW 1-1(KCCM 11517P) 균주.
제1항의 균주를 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제.
제1항의 균주를 유효성분으로 포함하는 어류 및/또는 갑각류 양식용 사료 첨가제.
제3항의 사료 첨가제를 포함하는 어류 및/또는 갑각류 양식용 사료.
제1항의 신규 Bacillus sp. 균주, 상기 Bacillus sp. 균주의 파쇄물 또는 상기 Bacillus sp. 균주의 배양상등액을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물.
제1항의 신규 Bacillus sp. 균주의 파쇄물 또는 배양상등액을 유효성분으로 함유하는 식품 보존용 첨가제.
제1항의 신규 Bacillus sp. 균주의 파쇄물 또는 배양상등액을 유효성분으로 함유하는 화장품 보존용 첨가제.
제1항의 신규 Bacillus sp. 균주의 파쇄물 또는 배양상등액을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
제1항의 신규 Bacillus sp. 균주의 파쇄물 또는 배양상등액을 함유하는 치약 조성물.