KR20160143498A

KR20160143498A - 발효 미생물의 생물전환 공정에 의한 생리활성이 증진된 발효 사료 첨가제 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20160143498A
Application number: KR1020160038896A
Authority: KR
Inventors: 장인환; 허강칠; 송인근; 이상용; 박효정; 허회정; 김수기; 김삼철; 배인수; 조상범
Original assignee: 주식회사 빅바이오젠
Priority date: 2016-03-31
Filing date: 2016-03-31
Publication date: 2016-12-14

Abstract

본 발명은 발효 미생물의 생물전환 공정에 의한 생리활성이 증진된 사료 첨가제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로 발효 미생물의 생물전환 공정을 통해 생리활성물질 함량이 증진된 발효 사료 첨가제 조성물을 제공하고 이를 축산용 사료에 첨가하여 부작용이 없으면서도 가축의 생산기능성을 증진시키는 축산용 사료를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

발효 미생물의 생물전환 공정에 의한 생리활성이 증진된 발효 사료 첨가제 조성물 및 그 제조방법{A fermented feedstuff additive composition having enhanced active components by bioconversion using microorganisms and the method for preparing of the same}

본 발명은 발효 미생물의 생물전환 공정을 통한 생리활성이 증진된 발효 사료 첨가제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 발효 미생물의 발효공정을 개발하여 생리활성물질 중 조단백질, 저분자펩타이드, 총폴리페놀, 총플라보노이드, 항산화물질, Xylanase 및 Mannanase의 함량을 증진시킨 발효 사료 첨가제 조성물에 관한 것이다.

사료첨가제는 생산성 개선이나 육질 개선의 목적으로 사료에 소량 배합하는 비 영양소 보조물질로 정의할 수 있으며, 항생제, 생균제, 효소제, 유기산제, 향미제, 감미제, 항산화제, 각종 천연물질 및 기능성 물질 등이 사료첨가제로 분류될 수 있으며 FDA에 따르면, 농축사료 첨가제란 배합사료 및 일반사료 첨가제에 희석되어 사용되어야만 하며, 동물에게 직접 급여할 수 없는 고농도의 사료용 첨가제로 정의하고 있으며 즉, 농축 사료 첨가제는 1톤의 배합사료에 약 0.5-5.0kg 정도 첨가하여 사용하여야 한다고 알려져 있다(양윤모, 2014, 생물자원정보서비스 기능고도화 사업, 사료첨가제 특허분석 최종보고서, 한국특허정보원 특허정보진흥센터).

지난 수십년간 우리 축산업은 가축의 생산성 향상을 기하기 위하여 보편적으로 항생물질을 사용하여왔으나, 빈번하게 사용시 내성을 가지는 미생물이 증가하여 그 항생물질의 효능이 떨어지고 축산물 중에 잔류하게 되어 인체에 악영향을 초래할 수 있다는 점에서 한국에서는 2011년 7월 이후 사료첨가용 항생제 사용이 금지되었다.

상기 항생제 사용금지의 대안으로 가축의 장내에 유익한 미생물을 섭취시켜 병원성 미생물을 억제하는 생균제(probiotic)나 미생물을 이용한 발효제가 사료용 첨가제 조성물로 국내 축산농가에 보급되고 있다. 사료용 첨가제 조성물의 대표적인 발효미생물로는 유산균, 효모, 바실러스 등이 많이 이용되며, 이 미생물들은 각종의 분해효소, 아미노산, 비타민, 핵산 및 항균물질 등을 생산함으로써 가축장내 미생물균총의 안정, 내병성 증대에 기여한다고 알려져 있다(Fuller R, 1989, Probiotics in man and animals., J Appl Bacteriol. 66(5):365-78). 또한 건강한 동물의 소화기에는 혐기성 세균이 우점하고 있으며, 소화기상부에는 락토바실러스 애시도필러스, 중부에는 바실러스 서브틸리스, 하부에는 엔트로코크스 페시움(Enterococcus facium)이 정착하기 알맞기 때문에 이를 고려하여 혼합 생균제를 이용하면, 그 효과를 증진시킬 수 있다고 보고되었으며(백인기 1989 생균제(Probiotics)의 사용효과. 한국영양사료학회지 13:175-183), 이에 따라 최근 단일 발효미생물보다는 다양한 기능을 가진 균들을 혼합하여 발효미생물로 사용시 다양한 효과를 한번에 기대할 수 있어 이를 발효미생물로 사용하는 연구가 다양하게 진행되고 있다.

일반적으로 생균제나 발효제로 이용되는 미생물들은 유효미생물 숫자가 많을 것과 미생물 균주의 능력이 뛰어날 것이 요구된다. 특히 가축에 급여하는 생균제는 가축의 장에 살아서 도달하여야 하고, 장에 정착할 수 있는 능력이 있어야 제기능을 발휘하게 되고 또한 발효에 의해 생성되는 대사산물이 가축 체내에서 기능성을 보유할 것이 요구된다. 그러나 현재 발효미생물을 이용한 발효제의 경우 생리활성물질의 함량이 낮아 가축 체내에서 기능성을 보이기 위하여 항산화제같은 화학물질을 사료 첨가제 조성물에 같이 첨가하거나 여러 발효원료를 복합적으로 혼합하여 발효하는 방법으로 이를 보완하여왔다. 따라서 화학물질을 첨가하지 않고 미생물의 생물전환공정만으로 가축 체내에서 기능성을 보일수 있는 사료 첨가제 조성물이 필요한 실정이다.

본 발명의 선행기술로 천연물을 이용한 발효 사료 첨가제의 제조방법 및 이를 통해 얻은 닭고기와 오리고기가 대한민국 등록특허 제10-1255166호에 공지되어 있으나 이는 울금, 어성초, 매실, 복분자, 오디등을 발효원으로 사용하여 유산균(Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei)과 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 사용해 발효한 발효 사료 첨가제 제조방법에 관한 것이다. 또한, 유산균 및 효모를 이용한 축산용 발효사료 및 그 제조방법이 대한민국 등록특허 제10-0840145호에 공지되어 있으나 이는 유산균(Lactobacillus fermentum, Pichia kluyveri)과 효모(Saccharomyces cereviseae)를 느타리버섯 폐배지, 미강, 대두피, 깻묵을 혼합한 발효원료에 발효한 발효사료 제조방법에 관한 것이다.

한편, 본 발명자에 의해 병원성 미생물의 항균활성을 가진 신규한 유산균과 유기물분해 활성을 갖는 신규 유용 미생물을 유효성분으로 함유하는 가금류용 발효사료 첨가제 조성물이 대한민국 등록특허 제10-1431250호에 공지되어 있으나 이는 병원성 미생물의 향균활성을 가지는 신규한 유산균(Pediococcus acidilactici BBG L1)으로 발효한 발효사료 첨가제 조성물에 관한 것이고 또한 신규한 L. plantarum BBG L30 균주를 포함하는 Lactobacillus 속 유산균 보존제 및 그 제조방법이 대한민국 출원특허 제10-2014-0144727호에 공지되었으나 이는 인체병원성 균주에 대하여 항균활성을 보이는 L. plantarum BBG L30 균주와 그 배양액에 관한 것이다.

따라서, 상기 특허 문헌 어디에도 유산균과 효모와 바실러스를 발효미생물로 사용한 생물전환공정을 통해서 생리활성물질이 증진되고 가축내에서 기능성을 보이는 사료 첨가제 조성물에 대하여는 공지 된 바 없다.

따라서 본 발명의 목적은 발효 미생물의 생물전환 공정을 통해 생리활성물질 함량이 증진된 발효 사료 첨가제 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 발효 사료 첨가제 조성물을 축산사료에 첨가하여 가축의 생산성을 증진시키는 축산사료를 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 발효 미생물제제와 발효 원료를 선정하는 단계와; 상기에서 얻은 발효미생물제제와 발효원료의 최적 발효조건을 설정하고 발효하는 단계와; 상기에서 얻은 발효물을 건조하여 발효 사료 첨가제 조성물을 제조하는 단계;로 이루어지고, 상기 발효 사료 첨가제 조성물의 조단백질과 저분자 페타이드와 총 폴리페폴과 총 플라보노이드와 항산화물질과 Xylanase및 Mannanase 함량을 확인하는 단계와; 상기 발효 사료 첨가제 조성물을 축산사료에 첨가한 사료를 사용하여 사양시험을 통해 본 발명 발효 사료 첨가제 조성물의 가축의 생산 기능성을 평가하는 단계를 통하여 달성하였다.

본 발명은 발효 미생물의 생물전환 공정을 통해 생리활성물질 함량이 증진된 발효 사료 첨가제 조성물을 제공하는 효과가 있을 뿐 아니라, 상기 발효 사료 첨가제 조성물을 일반사료에 첨가하여 부작용이 없으면서도 가축의 생산기능성을 증진시키는 가축사료를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 본 발명 균주 BBG-Y6의 유전자 염기서열 분석결과를 바탕으로 BBG-Y6가 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiase)임을 나타내는 계통모식도이다.
도 2는 본 발명 균주 BBG-B20의 유전자 염기서열 분석결과를 바탕으로 BBG-B20이 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)임을 나타내는 계통모식도이다.
도 3은 본 발명의 발효공정을 모식도를 나타낸 그림이다.
도 4는 탈지대두박, 소맥피, 옥태말분을 혼합하여 발효원료로 사용시 유산균과 효모의 균체농도와 pH를 나타낸 그래프이다.
도 5는 탈지대두박, 소맥피, 옥태말분을 혼합하여 발효원료로 사용시 바실러스의 균체농도와 pH를 나타낸 그래프이다.
도 6은 발효시 당 첨가물에 따른 유산균과 효모의 균체농도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 발효시 당 첨가물에 따른 바실러스의 균체농도를 나타낸 그래프이다.
도 8은 발효시 당밀 첨가량에 따른 유산균과 효모의 균체농도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 발효시 당밀 첨가량에 따른 바실러스의 균체농도를 나타낸 그래프이다.
도 10은 발효시간에 따른 유산균과 효모의 균체농도를 나타낸 그래프이다.
도 11은 발효시간에 따른 바실러스의 균체농도를 나타낸 그래프이다.
도 12는 대량발효시 발효방법에 따른 유산균과 효모의 균체농도를 나타낸 그래프이다.
도 13은 대량발효시 발효방법에 따른 바실러스의 균체농도를 나타낸 그래프이다.
도 14는 트레이발효방법을 이용한 대량발효시 발효시간에 따른 유산균과 효모의 균체농도 및 pH를 나타낸 그래프이다.
도 15는 트레이발효방법을 이용한 대량발효시 발효시간에 따른 바실러스의 균체농도 및 pH를 나타낸 그래프이다.
도 16은 각 발효시간별 동결건조시킨 발효건조물의 총폴리페놀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 17은 각 발효시간별 동결건조시킨 발효건조물의 총 플라보노이드 함량을 나타낸 그래프이다
도 18은 각 발효시간별 동결건조시킨 발효건조물의 DPPH의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 19는 각 발효시간별 동결건조시킨 발효건조물의 ABTS의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 20은 각 발효시간별 동결건조시킨 발효건조물의 펩타이드의 분자량 변화를 나타낸 SDS-PAGE 사진이다.

본 발명은 페디오코크스 엘시딜락티시(Pediococcus acidilactic)BBG-L1 균주(KCTC 12504BP)와 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) BBG-L30 균주(KACC 91952P)를 혼합한 유산균혼합물에 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiase) BBG-Y6 효모균주(KACC93230P)를 혼합하여 발효 미생물제제를 제조하는 단계와; 상기에서 얻은 발효 미생물제제를 탈지대두박에 접종하고 수분함량 50%로 조절하여 혼합발효미생물배지를 제조하는 단계와; 상기 혼합발효미생물배지에 당밀을 첨가하고 35℃, 48~72시간, 통상혐기 조건에서 트레이발효방법으로 발효시키는 단계를 포함하여 이루어진다. 본 발명은 상기 발효물 제조방법에 있어서, 발효미생물제제의 제조단계에서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) BBG-B20균주(KACC92073P)를 대체사용하여 바실러스 발효물을 제조 할 수 있다.

본 발명에서 트레이발효방법이라함은 트레이 용기에서 발효원료와 발효미생물을 넣고 발효기에서 발효시키는 방법이다.

본 발명에서 발효 미생물제제는 통상적으로 사용되는 페디오코크스 엘시딜락티시(Pediococcus acidilactic)와 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)과 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiase)와 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)균주를 사용함에 있어 본 발명의 목적이 주는 효과를 손상시키지 않는 범위내에서 동일 속 균주의 사용은 제한되지 않지만 가장 바람직하게는, 본 발명자들에 의하여 분리한 페디오코크스 엘시딜락티시(Pediococcus acidilactic) BBG-L1균주(KCTC12504BP), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) BBG-L30균주(KACC91952P), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiase) BBG-Y6균주(KACC93230P) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) BBG-B20균주(KACC92073P)가 바람직하다.

본 발명 발효 사료 첨가제 조성물은 돼지, 소, 송아지, 젖소, 병아리, 닭등 가축의 사료에 첨가하여 급여가능하며 따라서 가축의 종류를 특별히 제한하지는 않지만 가장 바람직하게는 산란계용 사료로 적합하다. 또한 상기 가축의 사료에 상기 발효 사료 첨가제 조성물의 첨가량은 사육동물의 종류, 나이 및 배합사료 성분에 따라 변화하여 일정하게 정의하기는 어렵지만 가장 바람직하게는 대사에너지(ME) 2,780 kcal/kg), 조단백질 16.50%, 인 0.21%, 칼슘 3.86%로 배합된 산란계용 사료에 전체 사료 대비 0.1 중량%의 발효 사료 첨가제 조성물을 첨가하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예와 도면에 의거 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것에 불과하며 본 발명의 권리범위를 한정하는 것으로 의도되지는 않는다.

실험예 1. 발효 미생물의 유용균주 분리

본 발명에 사용할 발효 미생물을 개발하기 위해 산토양, 하우스토양, 돼지분변 등에서 각각 시료를 채취한 후 시료 1 g에 멸균된 생리식염수(0.85% NaCl) 9 mL에 현탁 시킨후 바실러스 속은 NB(Nutrient Broth) agar 배지, 유산균 속은 MRS agar 배지, 효모균 속은 PDB(Potato Dextrose Broth) agar 배지에 103 ~ 106 희석한 희석액 0.1 mL를 첨가하여 유리봉으로 도말하여 2일 배양한 후 항균활성 균주를 순수 분리하였다.

항진균활성 검정을 위하여 병원성미생물은 LB(Luria Bertani media broth) agar 배지에 35℃에서 계대배양하여 사용하였다. 상기 분리한 균주의 병원성미생물의 항균활성을 통한 균주 선발을 하였다. 상기 계대배양한 병원성미생물 Salmonella gallinarum, Salmonella pullorum, Salmonella typhimurium을 LB 배지에 전 배양하여, LB agar에 현탁액(1.0×106 cfu/ml) 10 μL를 퍼지지 않게 주입하고 도말한 후 직경 5 mm의 Cokr Borer를 이용하여 구멍을 내었다. 상기 구멍에 MRS 배지에서 1일 배양한 배양액을 시린지 필터(0.2 μL)로 여과하여 각각 200 μL를 주입하고 35℃에서 20시간 배양후에 clear zone의 지름을 측정하였다.

하기 표 1과 같이 유산균 속인 Pediococcus acidilactic BBG-L1과 Lactobacillus plantarum BBG-L30이 항진균 활성이 강하게 나타나는 것을 확인하였다.

선별 유산균의 항진균 스펙트럼 결과
BBG NO.	L1 (mm)	L30 (mm)
Bacillus cereus	10	0
Candida albicans	0	0
Clostridium perfrigens	18	14
Escherichia coli	13	13
Haemophillus parasuis	14	11
Haemophillus simmunus	14	16
Listeria monocytogens	18	15
Mammheimia haemolytica type A	14	11
Pseudomonas aeruginosa	0	14
Pasteurella multocida type A	13	14
Salmonella gallinarum	9	11
Salmonella pullorum	15	13
Salmonella typhimurium	12	13
Staphylococcus aereus	14	11

또한 Amylase 분해능이 높은 균주를 선발하기 위해 상기에서 분리한 균주들을 2.0% soluble starch 첨가한 Nutrient agar 배지에서 35℃, 24시간 배양하고 Gram's iodine을 균체를 배양한 녹말 한천 평판상에 한방울 씩 떨어뜨려 균체 주위에 투명환(Clear zone)이 큰 균주들을 선발하였다. Protease 분해능이 높은 균주를 선발하기 위해 상기에서 분리한 균주들을 1.0% skim milk 첨가한 Nutrient agar배지에서 35℃, 24시간 배양하고 균체 주위에 투명환(Clear zone)이 큰 균주들을 선발하였다. Cellulase 분해능이 높은 균주를 선발하기 위해 상기에서 분리한 균주들을 0.5% carboxymethyl cellulose를 함유한 Nutrient Broth agar에 접종하여 37℃에서 배양하였다. 배양된 균들의 replica plate를 만들고 24시간 배양한 후에 Gram's iodine을 균체를 배양한 녹말 한천 평판상에 한방울 씩 떨어뜨려 균체 주위에 투명환(Clear zone)이 큰 균주들을 선발하였다. Xylanase 분해능이 높은 균주 선발하기 위해 상기에서 분리한 균주들을 1.0% oat spelt xylan(sigma)를 함유한 Nutrient Broth agar에 접종하고 37℃, 24시간 배양한 후에 Gram's iodine을 균체를 배양한 녹말 한천 평판상에 한방울 씩 떨어뜨려 균체 주위에 투명환(Clear zone)이 큰 균주들을 선발하였다. Mannanase 분해능이 높은 균주 선발하기 위해 상기에서 분리한 균주들을 0.5% Mannan를 함유한 Nutrient Broth agar에 접종하고 37℃, 24시간 배양한 후에 Gram's iodine 균체를 배양한 녹말 한천 평판상에 한방울 씩 떨어뜨려 균체 주위에 투명환(clear zone)이 큰 균주들을 선발하였다.

그 결과 하기 표 2와 같이 효모 BBG-Y6균주가 Cellulase 분해능이 뛰어난 것을 확인하였다.

선별 효모의 소화효소 분비효과
BBG NO.	Protease(mm)	Cellulase (mm)
Y1	0	0
Y5	0	0
Y6	0	8

또한 하기 표 3과 같이 바실러스 BBG-B20균주가 Amylase, Protease, Cellulase, Xylanase, Mannanase 분해능이 뛰어난 것을 확인하였다.

선별 바실러스의 소화효소 분비효과
BBG NO.	Amylase(mm)	Protease(mm)	Cellulase (mm)	Xylanase (mm)	Mannanase (mm)
B1	1	3	5	16	14
B5	1	3	4	23	20
B20	4	15	13	14	14
B25	0	4	7	12	14

상기의 효모 BBG-Y6균주와 바실러스 BBG-B20균주를 Benzyl chlorise법을 변형한 방법을 이용하여 DNA를 추출하였다. 16S rDNA의 PCR 증폭산물은 PCR Product Purification Kit(Qiagen)를 사용하여 정제하였으며, PCR 정제산물은 Genetic analyer 310A(Applied Biosystems)을 사용하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 NCBI/Genebank와 Ribosomal Database Project II(RDP II)의 database에서 상동성 검색을 수행하였고 효모 BBG-Y6균주는 서열번호 1로 바실러스 BBG-B20균주는 서열번호 2로 표시하였다. CLUSTAL X 프로그램(Thompson et al., 1994) 및 PHYLIP 프로그램(Felsenstein, 1993)을 이용하여 계통학적 위치를 확인하였으며, 균주를 최종적으로 동정하였다(도1, 도2).

본 발명에 따른 상기 균주들은 각각 Pediococcus acidilactic BBG-L1(KCTC12504BP), Lactobacillus plantarum BBG-L30(KACC91952P), Saccharomyces cerevisiase BBG-Y6(KACC93230P) 및 Bacillus subtilis BBG-B20(KACC92073P)로 명명하여 기탁기관 한국생명공학연구원(2013. 10. 14), 농업생명공학연구원(2014. 06. 10), 농업생명공학연구원(2015. 05. 21), 농업생명공학연구원(2015. 05. 21)에 기탁하여 분양가능한 상태이다.

실시예 1. 발효 미생물 선정

상기 실험예 1 결과에 따라 본 발명의 발효미생물로 유산균은 항진균 활성이 강한 페디오코크스 엘시딜락티시 BBG-L1균주와 락토바실러스 플란타룸 BBG-L30균주를 효모는 Cellulase 분해능이 뛰어난 사카로마이세스 세레비지아에 BBG-Y6균주를 그리고 바실러스는 소화효소 분비효과가 높은 바실러스 서브틸리스 BBG-B20균주를 선정하였다.

상기 유산균은 페디오코크스 엘시딜락티시 BBG-L1 균주와 락토바실러스 플란타룸 BBG-L30균주를 중량비 1(w/w) : 1(w/w) 동량혼합하여 사용하였고 이를 '유산균혼합물'로 명명하고 본 발명의 공시재료로 사용하였다.

실시예 2. 발효공정

본 발명은 도 3에 도시한 바와 같이 발효공정을 수행하였다. 먼저, 발효미생물을 선정하고 발효미생물제제를 제조하는 단계와; 상기에서 얻은 발효미생물제제를 발효배지 전체중량의 1중량%(w/w)를 발효원료에 접종하고 수분함량을 50%로 조절하여 혼합발효미생물배지를 제조하는 단계와; 상기에서 얻은 혼합발효미생물배지를 발효방법중 발효기, 회전식 드럼발효기, 트레이, 비닐백 및 쌀포대 중 어느 하나를 선택하여 35℃, 통상혐기조건으로 발효하는 공정을 채택하였다.

실험예 2. 발효 미생물 혼합방법

상기 실시예 1에서 선정된 발효 미생물을 고농도의 발효미생물제제로 사용하기 위하여, 하기 표 3과 같이 유산균혼합물과 효모와 바실러스를 동량의 중량비(w/w)로 혼합한 발효미생물제제를 상기 실험예 2의 발효공정에서 발효원료는 탈지대두박으로 하고 발효방법은 발효기를 이용하여 균체농도 및 pH의 경시적 변화를 측정하였다.

표 4와 같이, 단일 발효미생물을 탈지대두박에서 발효시 유산균은 9.30 log CFU/g , 효모는 8.12 log CFU/g , 바실러스는 9.15 log CFU/g의 균체농도를 나타내었으며 발효미생물을 혼합하여 탈지대두박에서 발효시 유산균은 혼합되는 발효미생물종류에 관계없이 9.20-9.25 log CFU/g의 균체 농도를 나타내어 유산균을 단일 발효시와 큰 차이를 나타내지 않았다. 효모 또한 혼합되는 발효미생물의 종류에 관계없이 7.90-8.12 log CFU/g의 균체농도를 나타내어 효모로 단일 발효 시와 큰 차이를 나타내지 않았다. 그러나 바실러스의 경우에는 다른 발효미생물과 혼합하여 탈지대두박에서 발효시 6.10-6.12 log CFU/g의 균체농도를 나타내어 바실러스로 단일 발효할 때에 비하여 균체농도에서 현저한 차이를 나타내었다(표3).

발효 미생물 혼합 발효시 균체 농도			Log CFU /g
균주	유산균혼합물	효모	바실러스
유산균혼합물	9.30	-	-
효모	-	8.12	-
바실러스	-	-	9.15
효모+바실러스	-	7.90	6.10
유산균혼합물+바실러스	9.25	-	6.12
유산균혼합물+효모	9.25	8.15	-
유산균혼합물+효모+바실러스	9.20	8.13	6.20

실시예 3. 발효미생물제제 제조

상기 표 4 결과와 같이 유산균혼합물과 효모 및 바실러스를 고농도의 발효미생물제제로 사용하기 위해서는 하기 표 5와 같이 유산균혼합물과 효모의 경우 페디오코크스 엘시딜락티시 BBG-L1균주와 락토바실러스 플란타룸 BBG-L30균주와 사카로마이세스 세레비지아에 BBG-Y6균주의 중량비를 혼합발효미생물배지 전체 중량의 0.25%(w/w) : 0.25%(w/w) : 0.5%(w/w)로 혼합하여 제조된 혼합발효미생물을 발효미생물제제로 사용하고, 바실러스의 경우 바실러스 서브틸리스 BBG-B20균주를 단독으로 발효미생물제제로 사용하여 혼합발효미생물배지 전체 중량의 1%(w/w)를 접종하였다.

발효미생물제제	미생물명칭		발효원료 접종량 ( 전체혼합발효미생물배지 대비 %(w/w))
1.혼합	유산균 혼합물	Pediococcus acidilactic BBG-L1	0.25	1
	유산균 혼합물	Lactobacillus plantarum BBG-L30	0.25
	효모	Saccharomyces cerevisiase BBG-Y6	0.5
2.단일	바실러스	Bacillus subtilis BBG-B20	1	1

실험예 3. 발효 원료 선정

발효 원료 선정을 위해 소맥피, 탈지대두박 및 옥태말분을 하기 표 5와 같은 비율로 혼합하여 발효 원료로 사용하고 발효 미생물 접종 후 균체농도의 경시적 변화를 확인하였다.

하기 표 6와 같이 혼합한 원료에 동량의 유산균혼합물+효모를 혼합접종한 후 발효시, 도 4와 같이 탈지대두박을 단일원료로 사용한 조건1의 발효 72시간 후 균체농도가 유산균 10.30 log CFU/g, 효모 8.70 log CFU/g으로 가장 높았으며 옥태말분과 소맥피를 첨가한 혼합원료조건(조건2~10)보다 균체농도가 안정적으로 높아 발효미생물로 유산균혼합물+효모을 사용시 탈지대두박을 발효원료로 사용하였다.

또한 표 6와 같이 혼합한 원료에 바실러스를 단일접종한 후 발효시, 도 5과 같이 탈지대두박을 단일원료로 사용한 조건1의 발효 72시간 후 바실러스 균체농도가 9.30 log CFU/g으로 가장 높아 발효미생물로 바실러스를 사용시에도 탈지대두박을 발효원료로 사용하였다.

조건	중량%
조건	탈지대두박	소맥피	옥태말분
1	100	0	0
2	50	50	0
3	50	0	50
4	50	25	25
5	25	50	25
6	25	25	50
7	33	34	33

실험예 4. 당 첨가물 및 첨가량 선정

발효시 2 중량% 당 첨가(molasses, glucose, sucrose, sodium succinate, sodium malate, sodium acetate, corn starch)에 따른 발효양상을 점검하였다. 대조군은 당을 첨가하지 않고 발효하였다.

도 6와 같이 2중량% 당 첨가에 따른 유산균혼합물+효모 혼합배양시 발효 72시간 후 유산균의 균체농도는 당밀(molasses)처리구 9.75 log CFU/g, 옥수수전분(corn starch)처리구 9.63 log CFU/g, 대조군 9.43 log CFU/g로 나타났으며 가장 높은 균체농도를 보인 당밀처리구와 대조군(Inoculation)의 차이가 0.32 log CFU/g 였다. 효모의 균체농도는 당밀(molasses)처리구 8.21 log CFU/g, 유당(lactose)처리구 8.21 log CFU/g, 대조군 log CFU/g으로 나타나, 가장 높은 균체농도를 보인 당밀처리구 및 유당처리구는 대조군과 큰 차이를 나타내지 않았다. 따라서 유산균+효모 혼합배양시에는 유산균 증식에 효과가 있는 탄소원으로 당밀을 첨가하는 것으로 결정하였다.

또한 도 7와 같이 2중량% 당 첨가에 따른 바실러스 단일배양시 발효 72시간 후 바실러스의 균체농도는 당밀(molasses)처리구 10.28 log CFU/g, 옥수수전분(corn starch)처리구 10.17 log CFU/g, 유당(lactose)처리구 10.18 log CFU/g, 대조군 9.81 log CFU/g로 나타나 가장 높은 균체농도를 보인 당밀(molasses)처리구 10.28 log CFU/g와 대조군(Inoculation)의 균체농도 차이가 0.47 log CFU/g를 나타냈다. 따라서 바실러스 단일배양시에도 바실러스 증식에 효과가 있는 탄소원으로 당밀을 첨가하는 것으로 결정하였다.

다음으로 발효시 2, 4, 6, 8, 10중량%의 당밀 첨가량에 따른 발효 미생물 발효패턴을 점검하였다. 도 8과 같이 유산균혼합물+효모 혼합배양시 당밀첨가량에 따른 발효 72시간 후 유산균의 균체농도는 당밀 2중량%, 8중량% 첨가구 10.26 log CFU/g, 대조군(Inoculation) 9.74 log CFU/g로 나타나 균체농도가 가장 높게 나온 2중량%, 8중량% 첨가구와 대조군의 차이가 0.52 log CFU/g를 나타냈다. 효모의 균체농도는 당밀 2중량%, 10중량% 첨가구가 8.68 log CFU/g, 대조군이 8.39 log CFU/g로 나타나, 가장 높게 나온 2중량%, 10중량% 첨가구와 대조군의 차이가 0.29 log CFU/g으로 나타났다. 당밀 첨가량에 비례하여 유산균 및 효모의 증식은 일어나지 않았으나, 당밀 2중량% 첨가구가 대조군보다 균체농도가 높게 나타났다. 따라서 유산균+효모 혼합배양시에 유산균PL과 효모의 증식에 효과가 있는 당밀의 첨가량으로 배지 전체중량의 당밀 2중량% 첨가하는 것으로 결정하였다.

또한 도 9와 같이 바실러스 단일배양시 당밀첨가량에 따른 발효 72시간 후 바실러스의 균체농도는 당밀 2중량%, 4중량% 첨가구 9.14 log CFU/g, 대조군 8.35 log CFU/g로 나타나, 균체농도가 가장 높게 나온 당밀 2중량%, 4중량% 첨가구 9.14 log CFU/g와 대조군의 차이가 0.79 log CFU/g을 나타냈다. 당밀 첨가량에 비례하여 바실러스의 증식은 일어나지 않았으나, 당밀 2중량% 첨가구와 4중량% 첨가구가 같은 효과를 나타냈다 따라서 바실러스 단일배양 시에도 바실러스 증식에 효과가 있는 당밀의 첨가량으로 배지 전체중량의 당밀 2중량% 첨가하는 것으로 결정하였다.

실험예 5. 발효시간 설정

발효 시간에 따른 발효양상을 점검하였다. 도 10과 같이, 유산균혼합물+효모 혼합배양시 발효시간에 따른 유산균의 균체농도는 72시간> 96시간> 48시간> 24시간> 12시간 순으로 나타났다. 발효시간에 따른 효모의 균체농도는 72시간=48시간>96시간>24시간>12시간 순으로 나타나 최종적으로 유산균혼합물+효모의 혼합배양 시 적정발효시간은 72시간으로 설정하였다.

또한 도 11과 같이 바실러스 단일배양시 발효시간에 따른 바실러스의 균체농도는 72시간=96시간> 48시간> 24시간> 12시간 순으로 나타나 최종적으로 바실러스 단일배양시 발효시간은 72시간으로 설정하였다.

실험예 6. 대량발효방법 설정

대량 발효방법을 설정하고자 회전식 드럼발효기(200kg), 트레이(4.5kg×45개), 비닐백(10kg×20개), 쌀포대(20kg×10개)발효 방법들 중 가장 균체농도가 높게 발효되는 발효 방법을 확인하였다.

발효조건은 유산균혼합물+효모는 동량비(w/w)로 혼합하여 전체발효배지중량의 1 중량%(w/w)를 탈지대두박에 혼합접종하고, 바실러스는 전체발효배지중량의 1 중량%(w/w)를 탈지대두박에 단일접종하고 수분함량이 50%가 되게 조절후 35℃, 통상혐기 조건에서 72시간 발효하였다.

도 12와 같이 유산균혼합물+효모 혼합배양시 발효 72시간 후 유산균의 균체농도는 트레이발효(tray fermentaion)처리구 9.28 log CFU/g, 회전드럼발효기(rotary drum fermentor)처리구 8.68 log CFU/g, 쌀자루를 이용한 발효(rice bag)처리구 8.33 log CFU/g, 비닐백발효(plastic bag)처리구 7.40 log CFU/g 순으로 나타나 가장 높게 나온 트레이발효(tray fermentaion)처리구와 가장 낮게 나온 비닐백발효(plastic bag)처리구의 균체농도 차이가 1.88 log CFU/g를 나타냈다. 효모의 균체농도는 트레이발효(tray fermentaion)처리구 8.36 log CFU/g, 회전드럼발효기(rotary drum fermentor)처리구 7.68 log CFU/g, 쌀자루를 이용한 발효(rice bag)처리구 6.34 log CFU/g, 비닐백발효(plastic bag)처리구 6.17 log CFU/g 순으로 나타나, 가장 높게 나온 트레이발효(tray fermentaion)처리구와 가장 낮게 나온 비닐백발효(plastic bag)처리구의 균체농도 차이가 2.19 log CFU/g를 나타냈다. 유산균과 효모 모두 트레이발효(tray fermentaion)처리구의 균체농도가 가장 높게 나와 최종적으로 유산균PL+효모 혼합배양시 대량 발효방법으로 트레이발효(tray fermentaion)방법을 설정하였다.

도 13과 같이 바실러스 단일배양시 발효 72시간 후 바실러스의 균체농도는 트레이발효(tray fermentaion)처리구 9.17 log CFU/g, 쌀자루를 이용한 발효(rice bag)처리구 7.70 log CFU/g, 회전드럼발효기(rotary drum fermentor)처리구 6.14 log CFU/g, 비닐백발효(plastic bag)처리구 5.31 log CFU/g순으로 나타나 가장 높게 나온 트레이발효(tray fermentaion)처리구와 가장 낮게 나온 비닐백발효(plastic bag)처리구의 균체농도 차이가 4.04 log CFU/g를 나타냈다. 바실러스 발효 시 혐기조건보다 호기조건이 되어야 증식이 일어나는데 호기 조건상태인 트레이발효(tray fermentaion)방식이 다른 방법보다 균체농도가 높게 나타나 최종적으로 바실러스 단일배양시 대량 발효방법으로 트레이발효(tray fermentaion)방법을 설정하였다.

실험예 7. 트레이발효방법의 발효시간 설정

*상기 트레이(4.5kg×45개) 발효방법으로 발효시, 발효시간에 따른 발효패턴을 점검하였다.

도 14와 같이 트레이발효방법으로 유산균혼합물+효모 혼합배양시 유산균은 발효시간에 따라 증식하여 72시간에 log 10.25CFU/g로 균체농도가 최고치에 달했으며 96시간에는 감소하는 것으로 나타났다. 효모는 발효시간에 따라 증식하여 48시간에 log 8.22CFU/g로 균체농도가 최고치를 보여 최종적으로 유산균+효모 혼합배양시 트레이 발효방법을 사용한 발효시간은 48~72시간으로 설정하였다.

도 15와 같이 트레이발효방법으로 바실러스 단일배양시 바실러스는 발효시간에 따라 증식하여 48~72시간에서 균체농도가 최고치를 보여 최종적으로 바실러스 단일배양시 트레이 발효방법을 이용한 최적발효시간은 48~72시간으로 설정하였다.

실시예 3. 본 발명 최종 발효물 제조

상기 실험예 2 내지 실험예 5에 결과에 따라 발효 원료는 탈지대두박을 사용하고 발효미생물은 유산균혼합물과 효모의 경우 유산균혼합물과 효모를 동량 혼합하여 혼합발효배지 전체중량의 1중량%(W/W) 농도로 원료에 혼합접종하고 바실러스의 경우 혼합발효배지 전체중량의 1중량%(W/W) 농도로 원료에 단일접종한후 수분함량을 50%(W/W)로 조절하여 혼합발효배지를 준비한다. 상기 혼합발효배지에 배지 전체중량의 2중량%(W/W)의 당밀을 첨가하고 35℃, 통상혐기 조건에서 트레이 발효(4.5X45개)방법으로 48~72시간 발효하여 고농도의 균체농도를 보이는 유산균혼합물+효모 발효물과 바실러스 발효물을 제조하였다.

실험예 8. 본 발명 최종 발효물의 생리활성물질 측정

상기 발효물의 생리활성물질 중 총폴리페놀과 항산화물질과 Xylanase 및 Mannanase의 함량을 측정하기 위해서 발효물을 건조 시켜 얻은 건조물을 5g을 취하여, 각각 80 중량% 에탄올 95mL에 현탁시켰다. 상기에서 얻은 현탁액을 4시간 동안 추출한 다음 여과하여 남은 상등액을 감압농축(N-1000, Eyela, Tokyo, Japan)하고 분말화 된 시료를 각 실험에 사용하였다. 대조군(Control)은 발효원료인 탈지대두박을 사용하였고 비발효물로 표시하였다.

상기 폴리페놀은 과일과 야채에 풍부하게 함유되어 있는 강력한 항산화 물질로서 가축의 향균효과에 뛰어나고, Xylanase는 탄수화물 분해효소로 가축의 소화를 방해하는 헤미셀룰루스와 자일란등을 분해하여 사료의 흡수를 도우며 Mannanase는 가축의 사료 흡수시 아미노산 소화율을 높여 육류 생산시 근육부위 고기 생산을 높이고 산란율을 개선시킨다고 알려져 있다(I. Bayram et al..2008, Effects of bacterial xylanase on egg production in the laying quail (Coturnix coturnix japonica) diets based on corn and soybean meal, Archiva Zootechnica 11:3, 69-74).

(1) 총 폴리페놀 함량 변화

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 법으로 측정하였다(Zhou et al., 1980). 시료를 희석시킨 다음 희석액 1 mL에 Folin-Ciocalteu's reagent 1 mL을 가하고 3분간 정치시킨 후 10중량% Na2CO₃용액 1 mL을 가하여 혼합한 다음 실온에서 1시간 정치시킨 후 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid를 증류수로 녹여 농도가 0, 25, 50, 100, 200 및 400 μg/mL 용액이 되도록 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 검량선으로부터 시료추출물의 총 폴리페놀 함량을 산출하였다.

도 16과 같이 발효시간에 따른 총 폴리페놀 함량은 12시간 이상 발효한 모든 발효물에서 증가하였으며, 바실러스 발효물이 유산균혼합물+효모 발효물보다 높았다.

(2) 총 플라보노이드 함량 변화

총 플라보노이드 함량은 Zia 등의 방법을 변형하여 측정하였다(Zia et al., 1999). 농도별 추출물 150㎕을 가하고, 500㎕ 1M NaOH를 혼합한 후 2.5ml의 증류수를 첨가한 후 5분동안 37℃에서 방치한다. 표준물질로는 Catechin으로(Sigma, USA)을 사용하였다. 검량선을 작성한 후 시료의 총 플라보노이드 함량을 산출하였다.

도 17과 같이 발효시간에 따른 총 플라보노이드 함량은 12~24시간 발효한 모든 발효물에서 증가하였으며, 바실러스 발효물이 유산균혼합물+효모 발효물보다 높았다.

(3) 항산화활성(DPPH, ABTS)의 변화

DPPH 라디칼 소거능의 측정은 Biosis 등(1958)의 방법에 의해 측정하였다. 3.49 mg DPPH를 100 mL 메탄올(methanol)에 녹인 다음 1mg/mL, 2mg/mL, 4 mg/mL 농도의 시료 200 μL에 0.1 mM DPPH 2 mL를 넣고 희석시킨다. 그 다음 실온에서 30분 동안 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하여 하기 수학식1에 의해 저해율을 계산하였다.

DPPH 는 자체가 매우 안정한 free radical로서 517 nm에서 특징적인 광흡수를 나타내는 보라색 화합물이다. DPPH는 알코올 등의 유기용매에서 매우 안정적이며 항산화 기작 중 proton-radical scavenger에 의하여 탈색되어 항산화 활성을 육안으로 쉽게 관찰할 수 있는 장점이 있다.

도 18과 같이 DPPH 방법으로 측정한 항산화저해활성은 24시간 이상 발효한 모든 발효물에서 증가하였으며, 유산균혼합물+효모 발효물이 바실러스 발효물 보다 높았다.

ABTS 라디칼 소거능의 측정은 Re 등(1999)의 방법에 의해 측정하였다. 7 mM ABTS 600 μL와 7.35 mM K2S2O8300 μL을 혼합시킨 후 암소에서 14시간 동안 반응시킨 뒤 80 mL 증류수와 희석시킨 다음 734 nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.7 ± 0.02가 되도록 조절한 ABTS solution을사용하였다. 1 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL 농도의 시료 용액 20 μL와 ABTS solution 2 mL를 6분 동안 반응시킨 다음 734 nm에서 흡광도를 측정하여 하기 수학식2 의해 저해율을 계산하였다.

도 19 와 같이 ABTS 라디컬소거능 방법으로 측정한 항산화저해활성도 12시간 이상 발효한 모든 발효물에서 증가하였다.

(4) Xylanase 변화

Xylanase의 활성도는 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) 방법을 사용하여 oat spelt xylan으로부터 유리된 xylose 함량을 측정하여 분석하였다. 본 연구에 사용된 효소활성측정을 위한 표준 반응용액은 조효소액 500 μL와 1% oat spelt xylan용액 500 μL를 완전 혼합하여 50℃에서 30분간 반응시킨 후, DNS 용액 1 mL을 첨가한 뒤 끓는 물속에 시험관을 담궈 중탕시키면서 5분간 발색시킨 후 증류수 10 mL를 첨가하고 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 조효소액 500 μL와 증류수 500 μL를 혼합하여 시료와 동일하게 수행하였다. 효소활성 1 international unit (IU)는 1분간 1 μmol의 xylose에 상응하는 환원당을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.

표 6과 같이, 발효물의 xylanase의 효소 활성은 발효 24시간부터 72시간까지 나타났다.

(5) Mannanase 변화

Mannanase의 활성도는 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) 방법을 사용하여 Locust bean gum(sigma)으로부터 유리된 mannose 함량을 측정하여 분석하였다. 본 연구에 사용된 효소활성측정을 위한 표준 반응용액은 조효소액 500 μL와 1중량% locust bean gum용액 500 μL를 완전 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후, DNS 용액 1 mL을 첨가한 뒤 끓는 물속에 시험관을 담궈 중탕시키면서 5분간 발색시킨 후 증류수 10 mL를 첨가하고 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 조효소액 500 μL와 증류수 500 μL를 혼합하여 시료와 동일하게 수행하였다. 효소활성 1 international unit (IU)는 1분간 1 μmol의 xylose에 상응하는 환원당을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.

표 7과 같이 발효물의 Mannanase의 효소 활성도 발효 24시간부터 72시간까지 나타났다.

	Xylanase (unit/g)	Mannanase (unit/g)
B.S 12hr	290	2,700
B.S 24hr	570	4,800
B.S 48hr	455	1,200
B.S 72hr	515	850
B.S Dry	380	780
L+Y 12hr	0	330
L+Y 24hr	260	420
L+Y 48hr	215	350
L+Y 72hr	320	530
L+Y Dry	0	260

(6) 펩타이드의 분자량 변화

동결건조한 시료를 SDS 2%, 2-mercaptoethanol 5%용액으로 시료와의 비율을 1:10(w/v)으로 추출한 후 원심분리(10,000rpm, 10min) 했으며, Laemmli(Laemmli et al., 1980)의 방법에 따라 4% stacking gel, 15% separation gel에서 실시하고, 염색은 0.125%의 coomassie brilliant R로, 탈색은 acetic acid: ethanol: H2O = 8: 25: 65(v/v)으로 실시하여 분석하였다.

도 20과 같이 발효시간에 따라 유산균혼합물+효모 발효물은 12시간부터 20, 34kDa의 밴드의 농도가 진해지는 것으로 보아, 고분자의 펩타이드가 저분자로 분해되는 반응이 시작되는 것으로 판단되며, 바실러스 발효물 또한 12시간부터 20, 34, 43-55kDa의 밴드의 농도가 진해지는 것으로 보아, 고분자의 펩타이드가 저분자로 분해되는 반응이 시작되는 것으로 판단되며, 전반적으로 바실러스 발효물이 유산균혼합물+효모 발효물보다 11-72kDa 사이의 저분자 펩타이드로 분해되는 비율이 높은 것으로 나타났다.

실시예 4. 본 발명 발효 사료 첨가제 조성물 제조

상기 실시예3에서 제조한 유산균혼합물+효모 발효물과 이와 별도로 바실러스 발효물을 건조하여 얻은 건조물을 동량(W/W)으로 혼합하여 폴리페놀과 플라보노이드와 항산화물질과 Xylanase 및 Mannanase함량이 증진된 저분자의 펩타이드를 함유한 본 발명 발효 사료 첨가제 조성물을 제조하였다.

실험예 9. 본 발명 발효 사료 첨가제 조성물의 일반성분 및 아미노산 성분 검사

상기 실시예 4에서 제조한 본 발효 발명 사료 첨가제 조성물과 발효시키지 않은 탈지 대두박의 일반성분(조단백, 조지방, 조섬유, 조회분) 및 아미노산 성분을 비교하였다.

상기 일반성분(조지방, 조섬유, 조회분)을 AOAC법에 의하여 정량하였고, 조단백질은 semi-micro Kjeldahl 법으로 측정하였다. 아미노산 15종에 대한 성분 비교를 amino acid auto analyzer(Amino acid analyzer S-433, Germany)를 사용하여 진행하였다.

하기 표 8과 같이 본 발명 발효 사료 첨가제 조성물은 비발효물보다 조단백질 +4.47%, 조지방 +0.63%, 조섬유 +2.35%, 칼로리 +128cal 높게 나타났으며, 조회분은 -0.52% 적게 나타났다. 또한 15종의 아미노산 분석결과 하기 표 9와 같이 발효미생물에 의한 총 아미노산 함량은 발효물이 39.83%로 비발효물 36.84% 보다 2.99% 높게 나타났으며, 전체 아미노산함량은 발효물에서 증가되는 것으로 나타났다.

	조단백질 (%)	조지방 (%)	조회분(%)	조섬유(%)	열량(cal)
비발효물(탈지대두박)	42.70	2.52	6.99	5.80	3,929
발효 사료 첨가제	47.17	3.15	6.47	8.15	4,057

	비발효물 (%)	발효물 (%)
Alanine	1.873	1.996
Arginine	2.722	2.797
Aspartic acid	4.348	4.714
Glutamic acid	7.322	7.878
Glycine	1.689	1.851
Histidine	1.038	1.100
Isoleucine	1.530	1.700
Leucine	3.171	3.460
Lysine	2.349	2.593
Phenylalanine	1.894	2.080
Proline	2.277	2.572
Serine	2.081	2.168
Threonine	1.594	1.698
Tyrosine	1.309	1.430
Valine	1.639	1.815
Total	36.836	39.852

실험예 10. 본 발명 발효 사료 첨가제 조성물의 가축내 효과

생리활성물질 함량이 증진된 본 발명 발효사료 첨가제의 가축내에서 기능성을 확인하기 위하여 상기 발효 사료 첨가제를 산란계 사료에 첨가 한 후 급여하여 산란계의 산란율 및 계란의 신선도를 확인하였다.

실험에 사용된 산란계 사료는 서울사료에서 구입하였으며 옥수수-대두박 위주의 사료를 사용하였다. 실험사료는 NRC(1994)를 토대로 대사에너지(ME) 2,780 kcal/kg), 조단백질 16.50%, 인 0.21%, 칼슘 3.86%로 배합하였다(표 10).

Ingredients	Contents(중량%)
Yellow corn	60.27
Soybean meal	3.00
Hulled lupine	16.18
Corn gluten meal	2.00
Wheat bran	2.50
Canola meal	3.20
Tallow	1.60
Molasses	0.50
Limestone, coarse	9.40
Dicalcium phosphate	0.64
Salt	0.30
DL-Methionine	0.03
Choline-chloride(50%)	0.05
Mineral mix¹	0.15
Vitamin mix²	0.13
Natuphos	0.03
Chemical composition
Dry matter, %	89.12
Crude protein, %	16.50
Ether extract, %	4.45
Crude fiber, %	3.69
Ash, %	12.77
Available P, %	0.21
Ca, %	3.86
Kcal/kg	2,780

_[주] _{1) Mineral mixture는 1g 섭취시, Fe, 70mg; Se, 0.2mg; Co, 0.13;} _choline _{chloride, 175mg;} _Mn _{, 8mg;}

_Zn _{, 60mg; I, 1mg; Cu, 7.5mg을 제공한다.}

_{2) Vitamin-mineral mixture는 1g 섭취시, vitamin A, 10,000} _IU _{; vitamin} _D3 _{, 2,300} _IU _{, vitamin E, 20} _IU _, vitamin K3, 2mg; vitaminB12, 0.02mg; niacin, 22.5mg; thiamin, 5.0mg; folic acid, 0.70mg; pyridoxin,

_{1.3mg; riboflavin, 5mg} _pantothenic _{acid, 25mg을 제공한다.}

(1) 실험동물 및 실험설계

본 실험에서 사용된 실험동물은 47주령 Hyline brown 180수를 공시하여 사양시험을 실시하였다. 2014년 10월 30일부터 12월 11일까지 6주간 사양실험을 진행하였으며, 사료 적응기간을 1주간 거친 후 본 발명 사료 첨가제가 첨가된 발효사료 급여사양 시험을 시작하였다.

(2) 사양관리 및 폐사처리

사육공간은 90cm, 90cm, 90cm 크기의 2단 철제 케이지에서 케이지당 3수씩 사육하였다. 음용수는 산란계 3마리당 1개씩 설치한 자동급수 nipple을 통하여 자유 취수하게 하였으며, 음수용 nipple과 사료구유 숫자는 반복구별로 동일하게 설치하였다.

점등관리는 자동점등 조절기를 이용하여 16L:8D로 하였으며, 기타 사육관리 방법을 Hyline 사양관리지침에 근거하여 실시하였다. 폐사계의 폐사일자를 기준으로 처리구당 누계사육 마리 수를 사료섭취량, 난생산성에 적용하여 계산하였다.

본 실험은 건국대학교 실험동물 윤리위원회 규정에 따라 시행하였다.

(3) 난생산성

본 발명 발효 사료 첨가제를 첨가한 발효사료 급여가 산란계의 생산성에 미치는 영향을 분석하기 위하여 상기 첨가사료 섭취 후 사료 섭취량과 난생산성 변화를 조사하였다. 사료급여량은 매일 처리구별로 급여사료량을 합산하여 실제급여량으로 간주하고 실험 마감 시 실제 급여량에서 사료급이구 내의 잔량과 바닥에 떨어진 유실 사료량을 합산계량한 후 각 처리반복별 급여량을 계산하였으며 그 평균을 처리구별 사료 섭취량으로 활용하였다. 사료 섭취량 계산은 폐사계수를 공시 실험계의 총 마무리수에서 감하여서 실험결과에 나타내었다.

산란율은 사양 실험진행 기간 중 매일 14시에 확인하였으며, 처리구별 생산된 계란을 집란하여 정상란, 연란 및 파란 수를 합한 총 산란수에 처리구별 사육수수를 나눈 수치를 백분율(%)로 표시하였다. 평균 난중은 당일 집란한 각 처리구별 계란의 무게를 측정하였고 정상란의 총 무게에 정상란 수로 나눈 평균치를 결과에 표시하였다.

표 10과 같이 첨가사료 섭취에 따른 산란율(%)은, 1-3주 차에는 상기 사료 첨가제 0.1중량% 첨가구 90.07%, 0.3중량% 첨가구 87.32%, 0.5중량% 첨가구 86.54%로 나타나 모든 발효 사료 첨가제 처리구가 무첨가구보다 산란율이 높게 나타났으며 그 중에서 0.1중량% 첨가구가 90.07%로 무첨가구 84.36%보다 5.71% 높게 나타났다. 4-6주 차에는 상기 발효 사료 첨가제 0.1중량% 첨가구 85.86%, 0.3중량% 첨가구 83.46%, 0.5중량% 첨가구 83.27%로 나타나났으며, 0.1중량% 첨가구가 85.86%로 무첨가구 78.15% 보다 7.61% 높게 나타났다. 또한 발효 사료 첨가제 첨가량이 증가할수록 산란율은 감소하였으나, 모든 발효 사료 첨가제 처리구가 무첨가구보다 산란율이 높게 나타났다.

따라서 모든 발효 사료 첨가제 첨가구에서 무첨가구보다 산란율 증가효과를 보였으며 그 중에서 0.1중량% 첨가 시에 가장 높은 산란율을 보였다.

또한, 표 11과 같이 상기 발효 사료 첨가제 첨가량에 따른 난중(g)은, 1-3주 차에는 발효 사료 첨가제 0.1중량% 첨가구 61.21g, 0.3중량% 첨가구 64.17g, 0.5중량% 첨가구 65.36g으로 첨가량 증가에 따라 비례적으로 증가하였으며, 0.5중량% 첨가구가 65.36g으로 무첨가구 64.32g보다 1.04g 높게 나타났다. 4-6주 차에는 상기 발효 사료 첨가제 0.1중량%첨가구 64.11g, 0.3중량%첨가구 64.78g, 0.5중량%첨가구가 65.90g으로 첨가량 증가에 따라 비례적으로 증가하였으며 0.5중량% 첨가구가 65.90g으로 무첨가구 64.42g보다 1.48g 높게 나타났다. 따라서 발효 사료 첨가제 0.5중량% 첨가 시에 난중이 가장 높게 나타났으며 첨가량이 증가 할수록 난중이 비례적으로 증가하였다.

표 11과 같이 상기 발효 사료 첨가제 첨가량에 따른 일당 계란 생산량은(egg mass, g/day)은 1-3주 차에는 발효 사료 첨가제 0.1중량% 첨가구 56.95g/day, 0.3중량% 첨가구 56.03g/day, 0.5중량% 첨가구가 56.47g/day으로 나타났으며, 0.1중량% 첨가구 56.95g/day으로 무첨가구 54.26g/day보다 1.77g/day 높게 나타났다. 4-6주 차에는 상기 발효 사료 첨가제 0.1중량% 첨가구 55.07g/day, 0.3중량% 첨가구 54.09g/day, 0.5중량% 첨가구가 54.88g/day으로 나타났으며, 0.1중량% 첨가구가 55.07g/day으로 무첨가구 50.33g보다 4.74g 높게 나타났다. 따라서 사료 첨가제 0.1중량% 첨가 시에 일당 계란 생산양이 가장 높게 나타났으며 모든 발효 사료 첨가제 첨가구에서 무처리구 보다 일당 계란 생산양이 높게 나타났다.

	무첨가 (Control)	사료첨가제 0.1중량%	사료첨가제 0.3중량%	사료첨가제 0.5중량%
Egg production(%)
Week 1-3	84.36土3.20	90.07土0.55	87.32土4.10	86.54土2.22
Week 4-6	78.15土4.50	85.86土4.96	83.46土4.06	83.27土3.57
Egg weight(g)
Week 1-3	64.32土0.57	61.21土2.95	64.17土0.85	65.36土0.42
Week 4-6	64.42土1.00	64.11土1.04	64.78土0.96	65.90土0.44
Egg Mass(g/day)
Week 1-3	54.26土2.00	56.95土0.62	56.03土2.89	56.47土1.89
Week 4-6	50.33土2.59	55.07土3.91	54.09土3.35	54.88土2.71

(4) 난질 및 난각질

본 발명 발효 사료 첨가제 조성물이 첨가된 첨가사료 급여 후 난질에 미치는 영향을 알아보기 위하여 난각강도, 난각두께 및 난각질을 조사하였다. 난각 강도는 계란의 둔단부를 위로 하고 수직 압력을 가한 후 파각되는 순간압력을 난각 강도계(FHK, Fujihara Industry Co., Ltd., Japan)로 측정하였다. 난각 두께는 난각 강도 측정 후 계란 중앙부의 난각을 난각 후도계(FHK Peacock, Fujihara Industry Co., Ltd., Japan)로 측정한 15개의 평균 두께를 결과에 활용하였다. 계란의 Haugh unit 하기 수학식 3과 같이 난백 높이와 난중을 대비하여(FHK, Fujihara Industry Co., Ltd., Japan) 계산하였다.

^{H =} ^난백높이 ^{(mm), W = 난중(g)}

난황 색과 난각 색 비교는 모두 육안으로 색도계와 대조한 수치로 그 색도를 표시하였다. 난황색 비교 Roche egg yolk color fan(Roche, Switzer land)를 활용하여 비교하였고, 난각 색도는 난각 색도계(QCM+, Technical services and suplies, York Ltd., England)를 이용하여 측정하였다.

표 12과 같이, 본 발명 발효 사료 첨가제 첨가량에 따른 계란의 난각색은, 1-3주 차에는 상기 사료 첨가제 0.5중량% 첨가구가 12.40으로 무첨가구 11.60 보다 0.80 높게 나타났으며, 4-6주 차에는 상기 발효 사료 첨가제 0.5중량% 첨가구가 11.98으로 무첨가구 11.75 보다 0.23 높게 나타났다. 따라서 발효 사료 첨가제 0.5중량% 첨가 시에 난각색이 가장 높게 나타났으며, 0.5중량% 첨가구를 제외한 0.1, 0.3중량% 첨가구는 무첨가구보다 난각색이 낮게 나타났으나, 큰 차이를 보이지 않았다.

또한 표 12과 같이 상기 발효 사료 첨가제 첨가량에 따른 계란의 난황색은, 1-3주 차에는 상기 발효 사료 첨가제 0.5중량% 첨가구가 7.85으로 가장 높게 나타났으나, 무첨가구 7.93보다 0.08 낮게 나타났다. 4-6주 차에는 발효 사료 첨가제 0.5중량% 첨가구가 8.04으로 무첨가구 7.93보다 0.09 높게 나타났다. 따라서 사료 첨가제 0.5중량% 첨가 시에 난각색이 가장 높게 나타났으며, 0.5중량% 첨가구를 제외한 0.1%, 0.3% 첨가구는 무첨가구보다 난각색이 낮게 나타났으나, 큰 차이를 보이지 않았다.

또한 표 12과 같이 상기 발효 사료 첨가제 첨가량에 따른 하우유닛(haugh unit)은, 1-3주 차 상기 발효 사료 첨가제 0.1중량 %첨가구가 94.35으로 무첨가구 90.78보다 3.57 높게 나타났으며, 4-6주 차에는 상기 발효 사료 첨가제 0.5중량% 첨가구가 90.55으로 무첨가구 88.53보다 2.02 높게 나타났다. 따라서 발효 사료 첨가제 0.1, 0.5중량% 첨가 시에 하우유닛 높게 나타났으며, 0.3중량% 첨가구는 무첨가 보다 하우유닛이 낮게 나타났다.

또한 상기 발효 사료 첨가제 첨가량에 따른 계란의 난각두께(Eggshell thickness, mm/100)는, 1-3주 차에는 상기 발효 사료 첨가제 0.5중량% 첨가구가 42.79으로 무첨가구 41.72보다 1.07 높게 나타났으며, 4-6주 차에는 상기 발효 사료 첨가제 0.1중량% 첨가구가 40.43으로 가장 높게 나타났으나, 무첨가구 40.73보다 0.30 낮게 나타났다. 따라서 1-3주 차에는 발효 사료 첨가제 0.5중량% 첨가구가, 4-6주 차에는 0.1중량% 첨가구의 난각두께가 높게 나타났으나, 무첨가구와 큰 차이를 보이지 않았다(표12).

또한 상기 발효 사료 첨가제 첨가량에 따른 계란의 난각강도(Eggshell breaking strength, kg/cm2)는, 1-3주 차에는 상기 발효 사료 첨가제 0.3, 0.5중량% 첨가구가 2.92으로 무첨가구 2.81보다 0.11 높게 나타났으며, 4-6주 차에는 상기 발효 사료 첨가제 0.5중량% 첨가구가 2.83으로 가장 높게 나타났으나, 무첨가구 2.91보다 0.08 낮게 나타났다. 따라서 1-3주 차에는 발효 사료 첨가제 0.3, 0.5중량% 첨가구가, 4-6주 차에는 0.5중량% 첨가구의 난각강도가 높게 나타났으나, 무첨가구와 큰 차이를 보이지 않았다(표12).

	무첨가 Control	사료첨가제 0.1중량%	사료첨가제 0.3중량%	사료첨가제 0.5중량%
Week 1-3
Egg shell color(unit)	11.60土0.24	11.24土0.42	11.67土0.60	12.40土0.70
Egg yolk color(Rhochl color fan)	7.93土0.12	7.82土0.14	7.64土0.56	7.85土0.33
Haugh unit	90.78土3.46	94.35土2.99	90.27土3.62	93.39土1.74
Eggshell thickness(mm/₁₀₀)	41.72土1.01	40.71土4.06	40.63土5.43	42.79土6.49
Eggshell breaking strength(kg/cm²)	2.81土0.14	2.80土0.36	2.92土0.54	2.92土0.41
Week 4-6
Egg shell color(unit)	11.75土1.29	11.33土1.33	11.49土0.77	11.98土1.00
Egg yolk color(Rhochl color fan)	7.93土0.42	7.93土0.29	8.00土0.58	8.04土0.58
Haugh unit	88.53土3.88	89.83土5.39	89.29土1.90	90.55土3.88
Eggshell thickness(mm/₁₀₀)	40.73土1.10	40.43土1.21	39.10土1.19	39.16土2.45
Eggshell breaking strength(kg/cm²)	2.91土0.23	2.81土0.19	2.79土0.33	2.79土0.33

(5) 장기와 복강 지방

공시 가축의 장기의 상대적 중량을 알아보기 위하여 처리구별 8수씩 간장, 비장, 심장, 모래주머니, 공장, 회장, 맹장, 복강지방의 무게를 소수점 아래 두 자리 기준으로 측정하였다. 또한 공장과 회장의 길이와 pH를 측정하였으며, 5mm 이상의 여포 개수와 난소의 무게를 측정하여 산란율에 미치는 영향을 조사하였다.

산란계에 본 발명 발효 사료 첨가제 조성물의 0.1, 0.3, 0.5중량% 급여량의 차이에 따른 간장, 비장, 심장, 사낭(모래주머니), 공장, 회장, 맹장, 복강지방에 미치는 영향에 대해 조사하였다. 다른 장기의 경우 첨가량에 따른 변화가 나타나지 않았으나, 복가지방은 첨가량이 증가할수록 복강 지방이 증가하였고, 무첨가구에 비해, 전 첨가구의 복강지방이 감소하였다(표13).

장기 (g/ 100g BW)	무첨가 Control	사료첨가제 0.1중량%	사료첨가제 0.3중량%	사료첨가제 0.5중량%	p-value
간장	1.68土0.28	1.72土0.34	1.76土0.25	1.54土0.16	0.37
비장	0.10土0.02^a	0.07土0.03^b	0.10土0.01^a	0.08土0.01^ab	0.09
심장	0.43土0.08	0.42土0.07	0.46土0.05	0.42土0.05	0.57
사낭(모래주머니)	1.52土0.12	1.60土0.15	1.55土0.18	1.57土0.10	0.73
공장	0.71土0.13	0.68土0.14	0.64土0.17	0.66土0.09	0.76
회장	0.58土0.13	0.55土0.21	0.59土0.11	0.55土0.04	0.91
맹장	0.29土0.05	0.29土0.08	0.29土0.07	0.26土0.04	0.72
복강지방	4.63土1.26	3.49土0.83	3.69土1.13	4.27土0.99	0.15

또한 산란계에 본 발명 발효 사료 첨가제의 0.1, 0.3, 0.5중량% 급여량의 차이에 따른 공장과 회장의 길이와 pH, 여포의 개수와 난소관 길이에 미치는 영향에 대해 조사하였으나, 큰 차이는 나타나지 않았다(표 14).

장기 (g/ 100g BW)	무첨가 Control	사료첨가제 0.1중량%	사료첨가제 0.3중량%	사료첨가제 0.5중량%	p-value
공장 길이	1.68土0.28	1.72土0.34	1.76土0.25	1.54土0.16	0.37
공장 pH	0.10土0.02^a	0.07土0.03^b	0.10土0.01^a	0.08土0.01^ab	0.09
회장 길이	0.43土0.08	0.42土0.07	0.46土0.05	0.42土0.05	0.57
회장 pH	1.52土0.12	1.60土0.15	1.55土0.18	1.57土0.10	0.73
여포 개수	0.71土0.13	0.68土0.14	0.64土0.17	0.66土0.09	0.76
난소관 길이	0.58土0.13	0.55土0.21	0.59土0.11	0.55土0.04	0.91

(6) 저장기간의 경과에 의한 계란의 신선도에 미치는 영향

본 발명 발효 사료 첨가제 첨가급여 후 저장기간의 경과에 따라 계란의 신선도에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 18℃에서 보관하여, 하기 표 14와 같은 기간 별로 상기 수학식3으로 계산한 Haugh unit을 조사하였다.

표 15과 같이 Haugh unit은 4주 차에 상기 발효 사료 첨가제 0.1중량% 첨가구가 77.33으로 다른 첨가구보다 높았으며, 무첨가구 72.62보다 4.71 높게 나타나, 0.1중량% 첨가구가 계란의 저장기간에 따라 신선도에 좋은 영향을 미치는 것으로 나타났다.

주(Week)	무첨가 Control	사료첨가제 0.1중량%	사료첨가제 0.3중량%	사료첨가제 0.5중량%
1	84.43土6.16	86.97土8.99	89.41土8.94	85.75土8.14
2	77.51土11.75	75.78土9.41	74.48土10.45	76.15土8.97
3	76.61土12.95	78.15土6.90	79.16土8.25	79.90土8.67
4	72.62土9.35	77.33土10.27	70.47土10.84	72.57土6.42

따라서 상기 실험예 10 결과와 같이, 상기 실시예 4에서 제조한 사료 첨가제 0.1중량%를 사료에 첨가하는것이 산란율과 난의 신선도에 가장 바람직하였다.

본 발명은 화학물의 첨가가 아닌 발효미생물의 생물전환공정을 통하여 생리활성물질의 함량을 증진시킨 발효 사료 첨가제를 제공할 뿐만 아니라 이를 통해 축산용 사료에 첨가시 가축의 생산성을 높임으로써 축산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

[수탁번호]

기탁기관명 : 농업생명공학연구원

수탁번호 : KACC91952P

수탁일자 : 20140528

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수탁번호 : KCTC12504BP

수탁일자 : 20131014

기탁기관명 : 농업생명공학연구원

수탁번호 : KACC93230P

수탁일자 : 20150521

기탁기관명 : 농업생명공학연구원

수탁번호 : KACC92073P

수탁일자 : 20150521

<110> BIGBIOGEN CO.,LTD <120> A fermented feedstuff additive composition having enhanced active components by bioconversion using microorganisms and the method for preparing of the same <130> P5650 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 843 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta aagaaattta ataattttga aaatggattt 60 ttttgttttg gcaagagcat gagagctttt actgggcaag aagacaagag atggagagtc 120 cagccgggcc tgcgcttaag tgcgcggtct tgctaggctt gtaagtttct ttcttgctat 180 tccaaacggt gagagatttc tgtgcttttg ttataggaca attaaaaccg tttcaataca 240 acacactgtg gagttttcat atctttgcaa ctttttcttt gggcattcga gcaatcgggg 300 cccagaggta acaaacacaa acaattttat ctattcatta aatttttgtc aaaaacaaga 360 attttcgtaa ctggaaattt taaaatatta aaaactttca acaacggatc tcttggttct 420 cgcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga tacgtaatgt gaattgcaga attccgtgaa 480 tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc cttggtattc cagggggcat gcctgtttga 540 gcgtcatttc cttctcaaac attctgtttg gtagtgagtg atactctttg gagttaactt 600 gaaattgctg gccttttcat tggatgtttt ttttccaaag agaggtttct ctgcgtgctt 660 gaggtataat gcaagtacgg tcgttttagg ttttaccaac tgcggctaat ctttttttat 720 actgagcgta ttggaacgtt atcgataaga agagagcgtc taggcgaaca atgttcttaa 780 agtttgacct caaatcaggt aggagtaccc gctgaactta agcatatcaa taagcggagg 840 aaa 843 <210> 2 <211> 1450 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 2 gctgtcggcg tgctataatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta 60 gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120 aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcaaacataa aaggtggctt 180 cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac 240 caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg 300 gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg 360 gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga 420 acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa 480 ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg 540 taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag 600 ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg 660 gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac 720 tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780 cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca 840 ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900 cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 960 cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt 1020 ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080 aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa 1140 accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200 gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat 1260 ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa 1320 tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380 ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttaggagcc agccgccgaa 1440 ggtgacaggg 1450

Claims

서열번호 1로 표시되는 유전자 염기서열로 이루어진 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiase) BBG-Y6 균주(KACC 93230P)
유산균주 페디오코크스 엘시딜락티시(Pediococcus acidilactic) BBG-L1균주(KCTC 12504BP)와 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) BBG-L30균주(KACC 91952P)와 서열번호1로 표시되는 유전자염기서열로 이루어진 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiase) BBG-Y6균주(KACC 93230P) 3종의 혼합발효미생물배지 전체 중량의 0.25(w/w) : 0.25(w/w) : 0.5(w/w) 배합비로 혼합하여 제조된 발효사료용 미생물제제
제2항의 미생물제제를 탈지대두박에 접종하고 수분함량을 50%로 조절하여 혼합발효미생물배지를 제조하는 단계와; 상기 배지에 당밀을 첨가하고 35℃에서 통상 혐기조건으로 48~72시간 트레이 발효법으로 발효시키는 단계를 포함한 미생물 발효사료 첨가제 제조방법
제 3항에 있어서, 상기 당밀의 첨가량은 혼합발효미생물배지 전체 중량의 2중량%(w/w)를 첨가하는 것이 특징인 방법
제 3항 또는 제4항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 미생물 발효 사료 첨가제
제 5항의 미생물 발효사료 첨가제가 함유된 가축 사료