KR20200072694A - 베타-글루쿠로니다제 분비 활성을 가진 락토바실러스 파라카제이 균주, 이를 이용한 황금 발효물 및 사료 첨가제 - Google Patents

베타-글루쿠로니다제 분비 활성을 가진 락토바실러스 파라카제이 균주, 이를 이용한 황금 발효물 및 사료 첨가제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 베타-글루쿠로니다제 분비 활성, 비배당체 전환율, 항균활성 및 생균제 효과가 증진된 락토바실러스 파라카제이 균주, 이를 이용한 황금 발효물 및 사료 첨가제에 관한 것이다.
본 발명은 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 분비활성이 높고 황금 비배당체 전환율이 높은 신규한 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK77 균주(수탁번호 : KCTC18571P)를 제공할 수 있다.
본 발명은 항균물질 분비에 뛰어난 신규한 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK77 균주(수탁번호 : KCTC18571P)의 생물전환 공정을 통해, 생리활성물질이 증진된 발효물을 제공할 수 있다.
본 발명은 상기 발효물을 사료첨가제로 첨가하여 가축의 생산기능성을 증진시킬 수 있다.

Description

베타-글루쿠로니다제 분비 활성을 가진 락토바실러스 파라카제이 균주, 이를 이용한 황금 발효물 및 사료 첨가제{Lactobacillus paracasei strain with secretion activation of β-glucuronidase and Fermentative Scutellaria baicalensis and Feed supplement using the same}
본 발명은 베타-글루쿠로니다제 분비 활성을 가진 락토바실러스 파라카제이 균주, 이를 이용한 황금 발효물 및 사료 첨가제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 베타-글루쿠로니다제 분비 활성, 비배당체 전환율, 항균활성 및 생균제 효과가 증진된 락토바실러스 파라카제이 균주, 이를 이용한 황금 발효물 및 사료 첨가제에 관한 것이다.
사료첨가용 항생제 사용이 2011년 7월 금지된 이후, 항생제를 대체하여 생체면역을 종합적으로 개선시킴으로써 백신 접종 효과를 극대화 하거나, 외부에서 침입하는 병원체에 대한 방어 기능을 강화하는 비특이적 면역기능성 물질의 개발에 많은 관심이 모아지고 있다(Sohn 등, 2000).
이러한 대안으로 생균제, 효소제, 호르몬제, 광물질제, 유기산제 등을 중심으로 성장촉진, 사료요구율의 개선 및 생리활성의 증진을 위한 연구가 수행되어 왔으나, 구제역, 조류인플루엔자(AI), 아프리카 돼지열병 등 국가적인 큰 피해가 계속 발생하고 있다. 따라서 또 다른 대안으로 식물의 파이토케미컬(Phytochemical)을 적용하여 면역증강, 성장촉진, 사료요구율의 개선 및 생리활성의 증진을 위한 활발한 연구가 진행되고 있으며, 이런 식물추출물을 적용한 제품군 개발의 시장욕구가 계속해서 증가하고 있는 실정이다.
이러한 시장 트렌드에 적합한 소재로 항균, 항바이러스, 항염증, 항산화, 간보호, 뼈 건강 등의 많은 효과가 입증되어 있으며, 이러한 효과가 전통적으로 한약, 민간요법 및 건강기능 식품으로 사용하여 안정성이 확증된 원료가 황금이다. 또한 2018년에 농림축산식품부에서 사료관련 법령에 황금추출물을 보조사료(사료첨가제) 품목기준에 처음으로 등재되었다.
황금(Scutellaria baicalensis George)은 꿀풀과에 속하는 다년생 초본으로서 동아시아 대륙이 원산지이고 한국, 중국, 시베리아 등지에 주로 분포한다. 황금은 한방에서는 뿌리를 해열, 이뇨, 지사, 이담 및 소염제로 이용하고 있는데, 주요 활성 성분으로는 플라보노이드(flavonoid) 계열의 배당체인 바이칼린(baicalin), 우고노사이드(wogonoside)이 있고, 비배당체인 바이칼레인(baicalein)과 우고닌(wogonin)은 미량 존재하는 것으로 알려져 있다. 그런데, 배당체에 비하여 비배당체 형태가 생리 활성이 높은 것으로 알려져 있다.
한편, 배당체인 바이칼린(Baicalin)은 흡수가 상당히 느리고 적용범위도 좁기 때문에 일반적으로 비배당체인 바이칼레인(baicalein)이 더 효과적이라고 알려져 있다. 하지만, 바이칼레인(baicalein)이 황금 중 극미량(약 0.2~0.5% 함유) 존재하기 때문에 직접 획득하기는 어렵다.
한국등록특허 10-1163101호에는 유산균인 락토바실러스 데브루엑키로 황금을 발효시킨 알레르기 저감용 식품 조성물이 개시되어 있다. 다만, 상기 한국등록특허는 인체의 알레르기 저감 효능이 있는 유산균을 이용한 것에 한정되어 있으므로, 사료 첨가제로 사용되어 가축의 생산성을 높이는 새로운 유산균과 이를 이용한 발효물 제조방법이 요구된다.
본 발명은 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 분비 효과가 뛰어난 신규한 유산균을 제공하는 것이다.
본 발명은 황금에서 비배당체를 좀 더 많이 획득할 수 있는 신규한 유산균을 제공하는 것이다.
본 발명은 사료 첨가제로 사용되어 가축의 생산성을 높일 수 있는 유산균과 이를 이용한 발효물과 사료 첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 양상은 베타-글루쿠로니다제 분비 활성을 가진 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK77 균주(수탁번호 : KCTC18571P)에 관련된다.
본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 상기 균주나 이의 배양물로 황금을 발효시킨 황금발효물에 관한 것이다.
본 발명은 탄소원 또는 질소원 및 황금 분말이 혼합된 배지에 상기 균주나 이의 배양물을 접종하는 단계, 상기 배지를 24시간 ~ 72시간 동안 발효시키는 단계를 포함하는 황금 발효물의 제조방법에 관련된다.
본 발명은 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 분비활성이 높고 황금 비배당체 전환율이 높은 신규한 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK77 균주(수탁번호 : KCTC18571P)를 제공할 수 있다.
본 발명은 항균물질 분비에 뛰어난 신규한 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK77 균주(수탁번호 : KCTC18571P)의 생물전환 공정을 통해, 생리활성물질이 증진된 발효물을 제공할 수 있다.
본 발명은 상기 발효물을 사료첨가제로 첨가하여 가축의 생산기능성을 증진시킬 수 있다.
도 1은 황금 생리활성 성분 표준물의 HPLC 분석결과이다.
도 2는 선별된 10종의 유산균의 생물전환 효율 평가를 위해, HPLC 분석으로 측정된 각 배지에서의 바이칼레인과 우고닌 함량을 보여준다.
도 3은 1차 선발된 미생물과 락토바실러스 파라카제이 MK77의 HPLC 검사결과를 보여준다.
도 4는 황금 분말 첨가함량에 따라 생균수 변화를 나타낸다.
도 5는 처리 전 원료와 최적화된 조건으로 발효 시, HPLC결과를 보여준다.
도 6은 락토바실러스 파라카제이 MK77의 발효시간에 따른 생균수 변화를 나타낸다.
도 7은 락토바실러스 파라카제이 MK77의 발효시간에 따른 병원성세균에 대한 항균활성 변화를 나타낸다,
도 8은 락토바실러스 파라카제이 MK77의 발효시간에 따른 비배당체 함량 을 보여준다.
도 9는 대조군과 처리군의 일당증체량을 나타낸다
도 10은 대조군과 처리군의 일당사료섭취량에 대한 효과를 보여준다.
도 11은 대조군과 처리군의 사료전환율에 대한 효과를 보여준다.
도 12는 장내 대장균에 대한 효과를 보여준다.
도 13과 도 14는 각각 장내 유산균과 장내 총 세균 함량을 보여준다.
도 15는 암모니아 가스 농도를 보여준다.
본 발명자들은 누룩, 된장, 발효 매실액 등의 전통 발효식품, 산토양, 하우스토양, 돼지분변으로부터 베타글루코시다아제 활성이 우수한 균주를 조사하였다. 후보 균주들을 선발한 후에 황금을 포함하는 배지에서 발효과정을 진행시키고, 황금 배당체에서 비배당체로 생물전환되는 전환 효율을 평가하여 전환효율이 우수한 유산균을 최종적으로 선발하여 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK77 균주(수탁번호 : KCTC18571P)로 동정 및 명명하였다.
본 발명은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK77 균주(수탁번호 : KCTC18571P)의 배양물일 수 있다.
본 발명은 상기 균주나 이의 배양물을 이용하여 황금 분말이나 추출물을 발효시킴으로써 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 분비활성이 높고 황금 비배당체 전환율이 높은 황금 발효물을 제공할 수 있다.
상기 MK77 유산균주는 황금 분말이나 추출물 중량 대비 0.001~5중량%, 바람직하게는 0.01~2중량%, 더욱 바람직하게는 0.1~1중량%의 양으로 접종될 수 있다.
황금 추출물은 일반적으로 천연물 추출에 사용되는 다양한 용매를 이용한 추출에 의하여 형성될 수 있으며, 예를 들어, 열수추출, 메탄올 추출 및 주정 추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상의 방법에 의하여 형성될 수 있다.
황금 추출물의 농도는 30~100 중량%, 바람직하게는 50~100 중량% 일 수 있다. 일예로서, 황금 추출물은 황금 원액에 물이 첨가된 것일 수 있고, 발효물은 황금 추출물이 발효된 후의 생성물이다.
일 실시예에서, 황금 추출물은 하나 이상의 탄소원이나 하나 이상의 질소원을 추가로 포함할 수 있다.
상기 탄소원 또는 질소원은 각각 황금 추출물 중량에 대하여 1~10 중량%, 바람직하게는 1~5 중량%가 포함될 수 있다.
탄소원은 글루코오스, 말토오스, 수크로오스, 프락토오스, 만노오스, 락토오스, 크실로스, 갈락토오스, 옥수수 전분 및 가용성 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 수크로오스(설탕)일 수 있다.
질소원은 트립톤, 펩톤, 소이펩톤, 이스트추출물, 카제인, 질산칼륨, 황산암모늄, 염화암모늄 및 질산암모늄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 트립톤일 수 있다.
상기 황금 발효물 제조방법은 황금 분말이나 황금 추출물이 담겨진 배지에 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK77 균주나 이의 배양물을 접종하는 단계와 상기 배지를 24시간 ~ 72시간 동안 발효시키는 단계를 포함한다.
상기 황금 추출물에는 하나 이상의 탄소원이나 하나 이상의 질소원이 포함될 수 있다.
예를 들면, 상기 접종 단계는 황금 분말 1~30중량%, 바람직하게는 1~20중량%, 설탕 1~10중량%, 바람직하게는 1~2중량%, 트립톤 1~5중량%, 바람직하게는 1~2중량% 및 MK77 균주 0.01~5중량%, 바람직하게는 0.1~1중량%가 사용될 수 있다.
상기 발효단계는 온도를 35~40℃ 범위로 유지할 수 있다. 상기 발효시간은 24시간 ~ 72시간, 바람직하게는 36시간~60시간일 수 있다.
상기 황금 발효물은 사료 조성물에 첨가될 수 있다. 사료 조성물 중의 황금 발효물의 함량은 급여 가축의 종, 주령, 체중, 및 사육 조건 등에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 사료 전체 중량에 대하여 0.01~10 중량%., 바람직하게는 0.1~1중량%일 수 있다.
상기 사료 조성물은 시판되는 사료(예를 들면, 초이사료, 육계전기 사료, 육계후기 사료 등)에 상기 황금 발효물이 포함된 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 항균활성이 우수한 유산균의 선발
(1) 실험방법
1) 시료의 수집
발효 미생물을 선발하기 위해 누룩, 된장, 발효 매실액 등의 전통 발효식품, 산토양, 하우스토양, 돼지분변을 분리원으로 사용하였다.
2) 유산균의 분리
각각 시료를 채취한 후 시료 1g에 멸균된 생리식염수(0.85% NaCl) 9mL에 현탁 시킨 후, 유산균 속은 MRS agar 배지, 104 ~ 107 희석한 희석액 0.1mL를 첨가하여 유리봉으로 도말하였으며, 2 차례의 계대 배양하여 순수 분리하였다.
3) 항균활성
항균활성 검정을 위하여, 병원성미생물을 LB(Luria Bertani media broth) agar 배지에 35℃에서 계대 배양하여 실험에 사용하였다. 상기 계대배양한 병원성미생물 Listeria monocytogens, E. Coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, S. gallinarum, S. pullorum, S. typhimurium을 LB 배지에 전 배양하였으며, LB agar에 현탁액(1.0×106cfu/ml) 10μL를 퍼지지 않게 주입하고, 도말한 후 직경 8mm의 Cokr Borer를 이용하여 구멍을 내었다. 상기 구멍에 MRS 액상 배지에서 1일 배양한, 배양액을 시린지 필터(0.2μL)로 여과하여, 여과한 액을 각각 200μL를 주입하고 35℃에서 20시간 배양 후에 clear zone의 지름을 측정하였다.
(2) 항균활성이 우수한 균주선별 결과
그 결과, MRS 배지에서 분리한 200종의 유산균 콜로니 중, 40종이 6종의 병원성 미생물에 항균 활성이 강하게 나타나는 것을 1차 확인하였다. 따라서 상기 분리된 40종의 유산균을 베타글루코시다아제 활성 균주의 선발에 적용하였다.
실시예 2. 베타글루쿠로니다제 분비가 우수한 균주의 선발
(1) 실험방법
1) 베타글루쿠로니다제 활성 균주의 선발
베타글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 활성 균주는 4-Nitrophenyl
Figure pat00001
-D-glucuronide를 기질로 하여 형광색을 나타내는 균주 집락을 선별하는 방법을 사용하였다(World Journal of Microbiology and Biotechnology 2004,, 20:633-637).
2) 선발균주의 베타글루쿠로니다제 효소 활성 평가
실험방법: 선발된 균주들은 다시 MRS 액상 배지에서 24시간 동안 배양한 후에, 배양액 내에 분비된 효소활성으로 평가하였다. 베타글루쿠로니다제(
Figure pat00002
-glucuronidase) 효소활성 분석은 다음과 같다. 효소에 1ml에 50mM 초산완충액(pH 5.0)에 용해시킨 5mM 4-Nitrophenyl
Figure pat00003
-D-glucuronide(Sigma, 73677) 1ml 넣고, 30℃ water bath에서 10분간 반응시켰으며, 반응이 완료되면 1M sodium carbonate을 넣어 반응을 종결시킨 다음 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
실험결과 : 유산균 40종 중, 10종이 베타글루코시다아제 활성이 높게 나타났다. 따라서 상기 분리된 10종의 유산균의 베타글루코시다아제 분비에 의한, 황금 내에 함유되어 있는 배당체(바이칼린, 우고닌사이드)를 비배당체로 전환하는 효과가 뛰어난 균주를 최종 선발하기 위한 실험에 적용하였다.
3) 선발균주의 배당체에서 비배당체로 생물전환되는 전환 효율 평가
선발된 10종의 유산균이 황금 내에 함유되어 있는 배당체를 비배당체로 생물전환 시키는 효율을 점검하기 위해여, 건조된 황금을 분쇄한 후에 MRS 액상 배지에 10%(w/v) 함유되도록 준비하고, 121℃에서 20분간 멸균하여 황금 분말 함유 배지를 제조하였다. MRS 배지에 선발된 10종의 후보 균주를 1% 함량으로 각각 접종하였으며, 35℃, 100rpm 조건에서 2일간 발효 시켜, HPLC 분석에 사용하였다.
4) 황금배당체와 비배당체의 추출
발효과정을 거쳐 생물전환 된, 황금 발효액을 스테인레스 제질의 사각트레이에 옮기고, 대두박에 1:1의 비율이 되도록 흡착하여 저온(40℃)에서 24시간 동안 건조하였다. 이렇게 건조된 분석 샘플을 70% 메탄올을 이용해, water bath에서 80℃에서 1시간 동안 추출하여 분석시료로 사용하였다.
5) 황금배당체와 비배당체의 HPLC분석
실험방법: 황금배당체(바이칼린, 우고닌사이드)와 비배당체(바이칼레인, 우고닌) 분석은 HPLC 기기를 사용하였고, HPLC는 DAD가 장착된 Agilent 1100 시리즈 기기를 사용하였다. 분석 조건은 다음과 같다(표 1).
실험결과: 표준물질 분석결과는 배당체 계열에 속하는 바이칼린과 우고닌사이드를 분석한 결과 각각 3.9분과 7.5분으로 나타났으며, 비배당체에 속하는 바이칼레인, 우고닌은 각각 13.1분과 22.2로 나타났다(도 1).
항 목 분 석 조 건
검출기 UV 275 nm
컬럼 C 18 (4.6×50 mm, 5um)
컬럼온도 30℃
유속 0.8ml/min
용매 A: 0.1% acetic acid/Water
B: 0.1% acetic acid/ACN
조건: A-> B 50%, 30 min
도 2는 선별된 10종의 유산균의 생물전환 효율 평가를 위해, HPLC 분석으로 측정된 각 배지에서의 바이칼레인과 우고닌 함량을 보여준다. 균주 77(MK77)이 가장 높은 바이칼레인과 우고닌 함량을 보여주었다. 도 3은 1차 선발된 미생물과 락토바실러스 파라카제이 MK77의 HPLC 검사결과를 보여준다.
6) 선발균주의 동정
실험방법: 선발균주의 동정은 MK77의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하여 수행하였다. 유전자 염기서열을 분석한 후에 표준균주(type strain)와 유전자 염기서열 비교를 수행하였고, 가장 유사성이 높은 균주를 기준으로 명명하였다.
16S rRNA 동정결과 MK77은 락토바실러스 파라카제이로 동정되어, 락토바실러스 파라카제이 MK77(Lactobacillus paracasei MK77)로 명명하였다. 하기 표 2는 MK77의 16S rRNA 염기 서열임.
Figure pat00004
실시예 3. 생물전환 조건 최적화
1) 생물전환 조건 최적화
㉠ 황금 분말의 첨가량 설정
실험방법: 건조된 황금을 분쇄한 후에 MRS 액상 배지에 0, 5, 10, 15, 20, 25 30%(w/v) 함유되도록 첨가하였고, 121℃에서 20분간 멸균하여 황금 뿌리 함유 배지를 제조하였다. 제조된 배지에 전 배양된 락토바실러스 파라카제이 MK77을 1% 농도가 되게 접종하였으며, 35℃에서 1일간 배양하였다. 검정항목으로는 생균수를 지표로 결정하였는데, 그 이유는 미생물이 생장이 가능해야 베타글루쿠로니다제를 분비하여 배당체를 비배당체로 전환이 가능하기 때문에, 생균수를 검정 지표로 측정하였다.
실험결과: 황금 분말의 첨가량에 따른, 락토바실러스 파라카제이 MK77의 생장에 미치는 영향을 점검하였다. 도 4는 황금 분말 첨가함량에 따라 생균수 변화를 나타낸다. 도 4를 참고하면, 0~20% 황금 분말 첨가시 샹균 농도가 Log 8.7-8.8 CFU/g으로 나타났으며, 황금 분말의 첨가량이 25% 이상 증가되면 생장 억제효과가 발생하여, 최종 첨가함량을 20%로 결정하였다.
또한, 발효물을 저온(40℃)에서 건조하였을 때, 생균수는 Log 8.7 CFU/g으로 나타나, 건조 전후의 차이가 나타나지 않았다. 따라서 생물전환이 완료된 황금을 저온 건조하여 조성물을 제조하였을 때, 생균제의 영향(장 건강, 면역증강, 항생제 복용 후 발생하는 설사감소, 호습기 감염이 위험감소)으로 전체 조성물의 효과가 증진 될 것으로 판단된다.
㉡ 생물전환 조건의 최적화
실험방법: 다양한 탄소원이 생물전환에 미치는 최적의 발효조건을 알아보기 위하여 다음과 같이 진행하였다. 글루코오스, 말토오스, 수크로오스, 프락토오스, 만노오스, 락토오스, 크실로스, 갈락토오스, 옥수수 전분을 탄소원으로 하여 각각의 탄소원을 농도별로 첨가하였다. 각각의 탄소원이 2% 첨가된 액상 배지에 건조된, 황금 뿌리를 분쇄한 후에, 20%(w/v) 함유되도록 첨가하였고, 유산균 배양액을 0.1% 접종하여 35℃에서 48시간 발효를 실시하였다.
또한 다양한 질소원이 발효에 미치는 최적의 발효조건을 알아보았다. 트립톤, 펩톤, 소이펩톤, 이스트추출물, 카제인을 질소원으로 하여 각각의 질소원을 농도별로 첨가하였다. 1차 탄소원의 실험결과 가장 생물전환 효율이 뛰어난, 수크로오스(설탕) 2%와 각각의 질소원 2% 첨가한 액상 배지에 건조된 황금 뿌리를 분쇄한 후에 20%(w/v) 함유되도록 첨가하였고, 유산균 배양액을 1% 접종하여 35℃에서 48시간 발효를 실시하였다.
검정 항목으로는, 황금 배당체와 비당체의 변환 패턴을 HPLC 분석하였으며, 탄소원 및 질소원의 종류에 따라 생물전환에 미치는 효과를 황금의 비배당체(바이칼레인, 우고닌) 함량으로 나타내었다(하기 표 3, 4).
실험결과: 탄소원 첨가 성분 중, 설탕(수크로오스)이 배당체를 비배당체인 바이칼레인과 우고닌으로 생물전환 시키는 효과가 가장 크게 나타났으며(표 3), 결과 값은 바이칼레인 경우 대조구가 1,085ppm 일 때, 설탕(수크로오스)이 4,088ppm으로 나타나 380%이상 전환효율이 증가하였으며, 우고닌의 경우 대조구가 413ppm일 때, 설탕(수크로오스)이 1,237ppm 300%이상 전환효율이 증가하였다.
원 료 비배당체 (단위: ppm)
바이칼레인 우고닌 합계
무처리구 1,085 413 1,498
글루코오스 4,032 1,135 5,167
말토오스 2,714 1,081 3,795
수크로오스 4,088 1,237 5,325
프락토오스 3,920 1,011 4,931
만노오스 3,346 788 4,134
락토오스 3,811 955 4,766
크실로스 3,025 678 3,703
갈락토오스 3,822 850 4,672
옥수수전분 3,723 872 4,595
질소원 첨가 성분 중, 트립톤이 배당체를 비배당체인 바이칼레인과 우고닌으로 생물전환 시키는 효과가 가장 크게 나타났으며(표 3), 결과 값은 바이칼레인 경우 대조구가 1,085ppm 일 때, 트립톤이 6,713ppm으로 나타나 620%이상 전환효율이 증가하였으며, 우고닌의 경우 대조구가 413ppm일 때, 트립톤이 2,074ppm 500%이상 전환효율이 증가하였다.
원 료 비배당체 (단위: ppm)
바이칼레인 우고닌 합계
무처리구 1,085 413 1,498
트립톤 6,713 2,074 8,787
펩톤 5,438 1,725 7,163
소이펩톤 5,611 1,807 7,418
이스트추출물 4,932 1,582 6,514
카제인 5,322 1,754 7,076
이렇게 배당체성분이 비배당체 성분으로 생물전환이 되면 항균활성, 면역활성, 항암효과 등의 생리활성이 크게 증가하게 된다. 따라서 락토바실러스 파라카제이 MK77의 최적 발효조건은 설탕 2%, 트립톤 2%, 황금 분말 20%인 것으로 결정되었다.
도 5는 처리 전 원료와 최적화된 조건(설탕 2중량%, 트립톤 2중량%, 황금 분말 20중량%, MK77 0.1중량%)으로 발효 시, HPLC결과를 보여준다. 도 5를 참고하면, 배당체인 바이칼린과 우고닌사이드가 각각 95%이상 생물전환에 이용되어, 비당체인 바이칼레인과 우고닌으로 전환되었음을 확인할 수 있다.
㉢ 발효시간의 최적화
실험방법: 상기 방법으로 최적화된 액상배지에 121℃에서 20분간 멸균, 1% 접종하여 35℃에서 0, 24, 48, 72시간 발효를 실시하였으며. 40℃에서 저온 건조하여 분석샘플로 이용하였다. 검정항목으로는 생균수, 항균활성 및 황금 비배당체 함량을 검정하였다.
실험결과: 락토바실러스 파라카제이 MK77에 성장에 의한 항균활성 물질분비와, 배당체에서 비배당체로 생물전환 되면서 항균활성이 증가되는 패턴을 확인하기 위하여, 상기의 최적화된 조성으로 실험을 진행하였다.
도 6은 락토바실러스 파라카제이 MK77의 발효시간에 따른 생균수 변화를 나타낸다. 도 6을 참고하면, 락토바실러스 파라카제이 MK77은 처음(0일)에 생균수가 Log 5.2이었으나, 1일 Log 8.7, 2일 Log 8.8 및 3일 Log 8.7 CFU/g으로 증가하였다. 생균수 함량으로만 고려하면, 24시간이 가장 적합한 발효시간으로 나타났다.
도 7은 락토바실러스 파라카제이 MK77의 발효시간에 따른 병원성세균에 대한 항균활성 변화를 나타낸다. 도 7을 참고하면, MK77의 병원성세균에 대한 항균활성은 MK77의 자체 항균물질 분비와, 배당체를 비배당체로 생물전환 되는 과정에서 항균활성이 향상되므로 24시간 이후에도 향균 활성이 증가함을 알 수 있다.
그 결과, E.coli(대장균)의 항균활성은 대조구가 10mm일 때, 24시간 15mm, 48시간 18mm, 및 72시간 18mm으로 나타났으며, 48시간 발효 시 적합한 것으로 나타났다. Listeria monocytogens의 항균활성 경우 대조구가 12mm일 때, 24시간 16mm, 48시간 20mm, 및 72시간 19mm으로 나타났으며, 48시간 발효 시 적합한 것으로 나타났다.
Pseudomanas aeruginosa의 항균활성 경우 대조구가 10mm일 때, 24시간 15mm, 48시간 18mm, 및 72시간 19mm으로 나타났으며, 48시간 발효 시 적합한 것으로 나타났다.
Staphylococcus aereus의 항균활성 경우 대조구가 10mm일 때, 24시간 14mm, 48시간 19mm, 및 72시간 19mm으로 나타났으며, 48시간 발효 시 적합한 것으로 나타났다.
Salmonella gallinarum의 항균활성 경우 대조구가 10mm 일 때, 24시간 15mm, 48시간 18mm, 및 72시간 19mm으로 나타났으며, 48시간 발효 시 적합한 것으로 나타났다. 또한 Salmonella gallinarum의 항균활성 경우 대조구가 10mm일 때, 24시간 13mm, 48시간 17mm, 및 72시간 16mm으로 나타났으며, 48시간 발효 시 적합한 것으로 나타났다. 이와 같이 6종의 병원성 미생물에 대하여 항균활성을 점검 하였으며, 그 결과 48시간이 가장 효율적인 시간으로 나타났다.
도 8은 락토바실러스 파라카제이 MK77의 발효시간에 따른 비배당체 함량 을 보여준다.
도 8을 참고하면, 대조구가 1,108ppm일 때, 바이칼레인의 함량이 24시간 4,985ppm, 48시간 6,737ppm, 및 72시간 6,738ppm으로 나타났다. 48시간 이상 발효 시, 바이칼레인의 함량이 600% 이상 증가하였다.
우고닌의 경우 대조구가 427ppm일 때, 24시간 1,408ppm, 48시간 2,103ppm, 및 72시간 2,105ppm으로 나타났으며, 48시간 이상 발효 시, 500%이상 함량이 증가하였다.
또한 비배당체 총 함량으로 보았을 때, 대조구가 1,535ppm일 때, 24시간 6,393ppm, 48시간 8,842ppm 및 72시간 8,843ppm으로 나타났으며, 48시간 이상 발효 시, 550%이상 함량이 증가하였다.
이와 같이 황금 내, 생리활성 성분인 배당체를 비배당체로 생물전환 시키는 효율로, 판단하였을 때는 48시간이 가장 효율적인 시간으로 나타났다.
실시예 4. 황금조성물 준비 및 사양시험
(1) 실험방법
1) 발효황금 조성물
황금 조성물은 락토바실러스 파라카제이 MK77 균주에 의한 발효 과정을 거쳐 생물전환 된, 황금 발효액을, 스테인레스 제질의 사각트레이에 옮겼다. 대두박에 1:1의 비율이 되도록 흡착하여, 생균제의 효과도 적용하여 조성물의 효과를 증진시키기 위해, 저온(40℃)에서 24시간 동안 건조하였다.
2) 사양실험 설계
사양실험에 적용될 실험 샘플은, 상기 실시예 4-1)방법으로 제조된 발효황금 조성물을 준비하였다. 생물전환으로 생리활성이 증진된 황금조성물을 0.1%(w/w, PT1)와 0.3%(w/w, PT2)가 되도록 하였고, 비교를 위하여 발효하지 않은 황금 분말을 사료 내, 0.1%(w/w, NT1)와 0.3%(w/w, NT2) 첨가하여 비교군을 설정하였다. 대조군으로는 항생제(Avilamycin 10 ppm, PC)를 첨가한 PC(positive control)와 아무런 항생제도 포함시키지 않은 NC (negative control)을 설정하였다.
2) 시험동물의 사양관리
부화 1일령의 무감별 육계병아리 Hubbard 품종 900수를 처리구 당 5반복, 반복당 30수씩 총 6처리구로 공시하여 사양실험을 실시하였다. 시험동물은 9.05m2(가로 1.90×세로 0.95m)면적의 구획에 할당되었으며, 각 구획은 완전임의 배치법에 의하여 배열하였다. 실험동물은 32일간 사육되었다. 실험계사는 콘크리트 바닥이 설치된 반무창 계사이며, 깔집은 왕겨를 5cm 두께로 깔아주었다. 온도는 처음 1주간은 33℃로 한뒤 매주 2℃씩 감소시켜 시험 마지막 주에는 24℃가 유지 되도록 하였으며, 습도는 입추 시 70%로 하였고, 이후에는 50%로 사육환경을 유지하였다. 또한 신선한 산소 공급을 위하여 적정한 환기 상태를 유지하였다. 점등은 전 기간 24시간 점등하였다.
시험사료는 표 5와 같은 배합비를 가진 시판중인 옥수수와 대두박 위주의 크럼블 형태인 초이사료(ME 3,096 kcal/kg, CP 23%, Ca 1%), 펠렛 형태의 육계 전기사료(ME 3,135 kcal/kg, CP 20.5%, Ca 0.95%)와 육계 후기 사료(ME 3,164 kcal/kg, CP 23%, Ca 1%)를 각각 1주, 1주, 3주간 급여하였다.
Items Starter
(0∼1wk)		 Earlier
(2∼3wk)		 Finisher
(4∼5wk)
Corn 40.02 40.05 40.50
Wheat grain 8.00 15.00 18.00
Cellmass 1.00 1.50 1.50
Soybean meal 30.30 24.55 21.65
Corn gluten meal 6.00 4.00 4.00
Cddgs 3.00 5.00 5.00
Soybean oil 1.00 0.50 0.50
Animal fat 4.25 4.20 4.05
Prosol . 0.05 0.05
Salt dehydrated 0.20 0.15 .
MDCP(23/22.3/97%) 1.35 1.25 1.25
Limestone 1.65 1.65 1.55
Sodium bicarbonate 0.13 0.20 .
Salinomycin . . 0.05
Declazulil 0.05 0.05 .
Liq-methionine 0.38 0.28 0.23
Threonine 0.11 0.03 0.01
Liq-lysine-hcl 1.30 0.72 0.55
Liq-cholin chloride 50% 0.10 0.08 0.07
Vitamin premix 0.18 0.15 0.18
Mineral premix 0.15 0.15 0.15
others 0.83 0.45 0.72
Total 100 100 100
Chemical composition
Crude protein(%) 23.00 20.50 19.50
Crude fat(%) 7.61 7.15 7.02
Crude ash(%) 6.17 5.81 5.43
Calcium(%) 1.00 0.95 0.90
Natrium(%)(%) 0.13 0.13 0.02
ME(kcal/kg) 3,096 3,135 3,164
Lysine(%) 14.50 12.10 11.00
Methionine(%) 7.20 5.99 5.46
Cystine(%) 3.74 3.42 3.31
3) 분석항목
㉠ 사양성적
사양성적은 일당증체량, 일당사료섭취량 및 사료전환효율(FCR, Feed conversion rate)을 측정하여 평가하였다. 일당증체량은 사료가 전환되는 시기에 따라 총 3개의 기간을 구분하고 각 기간의 마지막 날 체중을 측정하여 사양기간으로 나누었다. 체중은 한 시험구획에 포함된 시험동물 전체의 무게를 측정하고, 시험구획에 포함된 마리 수로 나누어 개체 체중을 측정하였다. 일당 사료섭취량은 정량의 사료의 무게를 측정한 사료통에 담고, 일정 기간 후에 잔량을 측정하여 섭취된 사료량을 측정하였다. 사료섭취량 또한 체중과 같이 시험구획 전체에서 섭취된 사료량을 측정하고 다시 시험구획에 포함된 개체수로 나누어 개체 당 사료섭취량을 산출하였다. 사료전환율은 사료섭취량을 증체량으로 나누어 측정하였다.
㉡ 장내 미생물
사양 시험 종류 직후, 도축된 닭의 ileum-cecal junction의 상부 10cm 씩 일정하게 절개하여 그 안에 있는 내용물을 멸균된 용기에 담아 분석에 사용하였다. 대장균은 McConkey agar(Difco, USA), 총 세균은 LB agar(Difco, USA), 유산균은 MRS agar(Difco, USA) 배지를 사용하여 분석하였다.
㉢ 악취저감 효과
가축 분뇨로는 육계의 깔집을 사용하였다. 32일간의 사양이 종료된 후에 계사 바닥 깔집을 바로 채취하여 사용하였다. 채취된 시료들은 다시 뚜껑에 고무가 장착되어 밀봉할 수 있는 1 kg 용량의 플라스틱 용기에 담아 시험에 사용하였다. 용기 내 암모니아 가스 농도는 실온에서 1일 후, 가스텍을 이용하여 측정하였다.
(2) 사양실험 결과
㉠ 일당 증체량, 일당 사료섭취량에 대한 효과
본 연구에서 상기의 방법으로 제조된 생물전환 황금조성물을 혼합하여 육계에게 급여한 결과는 다음과 같다(도 9는 대조군과 처리군의 일당증체량을 나타낸다). 도 9를 참고하면, 일당증체량의 경우 생물전환 황금조성물 처리군이, 생물전환 되지 않은 처리군보다 높게 나타났으며, 생물전환 황금조성물 0.3% 처리군(PT2)이 55.36g 으로 가장 높게 나타났다. 또한 항생제 처리구(PC)의 일당증체량이 54.25g 일 때, 생물전환 황금조성물 0.1(PT1) 54.35g으로 나타나, 생물전환 황금조성물은 일당증체량에 0.1% 이상 첨가 시 효과를 나타내었다.
도 10은 대조군과 처리군의 일당사료섭취량에 대한 효과를 보여준다. 도 10을 참고하면, 일당 사료섭취량의 경우 생물전환 황금조성물 처리군과 생물전환 되지 않은 처리군의 유의적인 차이는 나타나지 않았으나, 모두 대조구보다 높게 나타났다.
㉡ 사료전환율
본 연구에서 상기의 방법으로 제조된 발효황금 사료첨가제를 혼합하여 육계에게 급여한 결과는, 다음과 같다. 도 11은 대조군과 처리군의 사료전환율에 대한 효과를 보여준다. 도 11을 참고하면, 사료전환율의 경우 대조군보다 생물전환 황금조성물 처리군의 경우 평균 4.1%, 생물전환 되지 않은 처리군의 경우 평균 1.7% 개선되었다. 또한 생물전환 황금조성물의 사료전환율이, 생물전환 시키지 않은 황금에 비해 2.4%로 높게 나타났다.
㉢ 장내 미생물
도 12는 장내 대장균에 대한 효과를 보여준다. 본 발명에서 상기의 방법으로 제조된 황금 사료첨가제를 혼합하여 육계에게 급여한 결과, 도 12와 같이, 장내 유해균인 대장균은 모든 처리구가, 대조구에 비해 대장균 저해효과가 높게 나타났으며, 생물전환 황금조성물 처리군(PT1, PT2)이 생물전환되지 않은 처리군(NT1, NT2)보다 저해효과가 높게 나타났다. 따라서 이와 같은 대장균의 저해 효과는, 발효 황금조성물 내 함유된 항균활성 효능이 있는 비배당체 성분인 바이칼레인과 우고닌 성분뿐만 아니라, 락토바실러스 파라카제이 MK77이 유산균의 시너지 효과에 의해 나타난 것으로 판단되었다.
도 13은 장내 유산균 도 14는 장내 총 세균 함량을 보여준다. 도 13과 같이 장내 유익균인 유산균의 함량은, 대조구가 Log 7.2 CFU/g 일 때, 생물전환 황금조성물 처리구(PT1, PT2)만 7.7과 7.8 Log CFU/g로 높게 나타나, 발효 황금조성물 내 함유된 락토바실러스 파라카제이 MK77이 유산균 함량을 증가시킨 것으로 판단되었다.
도 14를 참고하면, 장내 총 세균은 처리구에 따른 차이가 나타나지 않았다.
㉣ 악취저감 효과
도 15는 암모니아 가스 농도를 보여준다. 본 발명에서 상기의 방법으로 제조된 발효황금 조성물을 혼합하여 육계에게 급여한 결과, 악취저감 주요성분 중 암모니아 가스 함량은 모두 대조구에 비해 감소효과가 높게 나타났다. 또한 생물전환 황금조성물 처리군(PT1, PT2)이 생물전환 되지 않은 처리군(NT1, NT2)보다 감소효과가 높게 나타났다. 이는 장내의 유산균수가 증가할수록, 대장균수가 적을수록 악취저감 효과가 증가되는 것으로 판단된다.
본 발명은 화학제 및 항생제의 첨가가 아닌 항균활성과 베타글루쿠로니다제 분비활성을 가진 미생물에 의해, 생물전환 공정을 통한 생리활성 물질의 함량을 증진시킨 발효황금 조성물을 제공할 뿐만 아니라, 이를 통해 가축사료에 사료첨가제로 사용 시 가축의 생산성을 향상 시키며, 축산업에 많은 기여를 할 것으로 판단된다.
본 명세서와 도면에 개시된 본 발명의 실시 예들은 본 발명의 기술 내용을 쉽게 설명하고 본 발명의 이해를 돕기 위해 특정 예를 제시한 것뿐이며, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 여기에 개시된 실시예들 이외에도 본 발명의 기술적 사상에 바탕을 둔 다른 변형 예들이 실시 가능하다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것이다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원 생물자원센터장
수탁번호 : KCTC18751P
수탁일자 : 2018. 11. 30
<110> SHIN, Youngkeun <120> Lactobacillus paracasei strain with secretion activation of beta-glucuronidase and Fermentative Scutellaria baicalensis and Feed supplement using the same <130> 18-MK-01 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1436 <212> RNA <213> Lactobacillus paracasei <400> 1 gcagtcgaac gagttctcgt tgatgatcgg tgcttgcacc gagattcaac atggaacgag 60 tggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcccttaa gtgggggata acatttggaa 120 acagatgcta ataccgcata gatccaagaa ccgcatggtt cttggctgaa agatggcgta 180 agctatcgct tttggatgga cccgcggcgt attagctagt tggtgaggta atggctcacc 240 aaggcgatga tacgtagccg aactgagagg ttgatcggcc acattgggac tgagacacgg 300 cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatggacgca agtctgatgg 360 agcaacgccg cgtgagtgaa gaaggctttc gggtcgtaaa actctgttgt tggagaagaa 420 tggtcggcag agtaactgtt gtcggcgtga cggtatccaa ccagaaagcc acggctaact 480 acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt atccggattt attgggcgta 540 aagcgagcgc aggcggtttt ttaagtctga tgtgaaagcc ctcggcttaa ccgaggaagc 600 gcatcggaaa ctgggaaact tgagtgcaga agaggacagt ggaactccat gtgtagcggt 660 gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc ggctgtctgg tctgtaactg 720 acgctgaggc tcgaaagcat gggtagcgaa caggattaga taccctggta gtccatgccg 780 taaacgatga atgctaggtg ttggagggtt tccgcccttc agtgccgcag ctaacgcatt 840 aagcattccg cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacgggggcc 900 cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct 960 tgacatcttt tgatcacctg agagatcagg tttccccttc gggggcaaaa tgacaggtgg 1020 tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1080 cccttatgac tagttgccag catttagttg ggcactctag taagactgcc ggtgacaaac 1140 cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt 1200 gctacaatgg atggtacaac gagttgcgag accgcgaggt caagctaatc tcttaaagcc 1260 attctcagtt cggactgtag gctgcaactc gcctacacga agtcggaatc gctagtaatc 1320 gcggatcagc acgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1380 atgagagttt gtaacacccg aagccggtgg tcgtaaccct tttagggagc gagccg 1436

Claims (8)

  1. 베타-글루쿠로니다제 분비 활성을 가진 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK77 균주(수탁번호 : KCTC18571P).
  2. 제 1항에 있어서, 상기 균주는 황금 내에 함유된 배당체를 비배당체로 전환시키는 생물전환능을 향상시킨 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK77 균주 (수탁번호 : KCTC18571P).
  3. 제 1항 또는 제 2항 균주의 배양물.
  4. 제 1항 또는 제 2항 균주나 이의 배양물로 황금분말이나 황금 추출물을 발효시킨 황금발효물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 황금 추출물은 하나 이상의 탄소원 또는 하나 이상의 질소원을 포함하는 것을 특징으로 하는 황금발효물.
  6. 황금 분말이나 황금 추출물이 담겨진 배지에 제 1항 또는 제 2항 균주나 이의 배양물을 접종하는 단계 ; 및
    상기 균주를 24시간 ~ 72시간 동안 발효시키는 단계를 포함하는 황금 발효물의 제조방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 황금 추출물은 하나 이상의 탄소원 또는 하나 이상의 질소원을 포함하고, 상기 탄소원은 설탕이고, 상기 질소원은 트립톤인 것을 특징으로 하는 황금 발효물의 제조방법.
  8. 제 4항의 황금 발효물을 포함하는 사료조성물.


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