KR20100001908A - 신규한 미생물인 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓＲ０１（ＫＦＣ Ｃ １１４２４Ｐ）및 이에서 유도된 베타글루쿠로니다제를 이용하여 황금의 바이칼린과우고노사이드에서 비당체인 바이칼레인과 우고닌을제조하는 방법 - Google Patents

신규한 미생물인 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓＲ０１（ＫＦＣ Ｃ １１４２４Ｐ）및 이에서 유도된 베타글루쿠로니다제를 이용하여 황금의 바이칼린과우고노사이드에서 비당체인 바이칼레인과 우고닌을제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 플라보노이드 계열 배당체인 바이칼린과 우고노사이드의 생물전환에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 신규한 미생물인 Lactobacillus brevis RO1(KFCC 11424P) 및 이 미생물에서 유도되고 그리고 대장균에서 발현시킨 베타 글루쿠로니다제를 이용하여 황금에 대량으로 존재하는 배당체인 바이칼린과 우고노사이드를 가수분해하여 비당체인 바이칼레인과 우고닌을 형성하는 방법에 관한 것이다.
이를 위하여 본 발명은 신규한 미생물인 Lactobacillus brevis RO1(KFCC 11424P)균주에서 초음파 파쇄 방법으로 조효소를 얻는 단계, 대장균에서 Lactobacillus brevis 속의 베타 글루쿠로니다제를 대량 발현시키는 단계, 상기 효소들을 이용하여 실제 기질인 바이칼린과 우고노사이드를 생물전환 하여 바이칼레인과 우고닌을 수득하는 단계, 고속액체크로마토그래피로 물질 전환과정을 측정하는 단계로 이루어졌다.
베타 글루쿠로니다제, 바이칼린, 우고노사이드, 바이칼레인, 우고닌, Lactobacillus brevis, 대장균, 생물전환

Description

신규한 미생물인 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ Ｒ０１（ＫＦＣ Ｃ １１４２４Ｐ）및 이에서 유도된 베타 글루쿠로니다제를 이용하여 황금의 바이칼린과 우고노사이드에서 비당체인 바이칼레인과 우고닌을 제조하는 방법{novel microbe, Lactobacillus brevis RO1 and method for preparing for baicalein and wogonin from baicalin and wogonoside in Scutellaria baicalensis using β-glucuronidase therefrom}
본 발명은 플라보노이드 계열 배당체인 바이칼린과 우고노사이드의 생물전환에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 신규한 미생물인 Lactobacillus brevis RO1(KFCC 11424P)에서 유도한, 그리고 대장균에서 발현시킨 베타 글루쿠로니다제를 이용하여 황금에 대량으로 존재하는 배당체인 바이칼린과 우고노사이드를 가수분해 하여 비당체인 바이칼레인과 우고닌을 형성하는 방법에 관한 것이다.
황금은 (Scutellaria baicalensis)은 꿀풀과에 속하는 속썩은풀이라고도 하며 다년생 초본으로서 예로부터 약용으로 하였을 뿐만 아니라 현재에도 많이 쓰이는 한방약 중 하나이다. 황금은 각종 약리작용을 가지고 있어 해열작용, 소염작용, 이뇨작용, 위액분비억제작용 등 다양한 질병의 억제에 효과를 보이고 있는 것으로 보고되고 있다.
황금의 뿌리는 바이칼린(baicalin) 및 우고노시드(wogonoside)를 함유
하며, 다시 안식향산, β-시토스테롤(sitosterol) 등을 포함한다. 경엽(莖葉)속에는 스쿠텔라레인(scutellarein)이 함유되어 있다.
황금의 생리활성 및 약리작용으로 해열, 소염, 항알레르기 작용을 나타내며, 혈관을 확장시키고 더욱이 혈압을 강하시키는 작용을 하며 죽상 동맥경화를 억제한다. 황금에 함유된 바이칼린은 진정작용을 하며 모세혈관의 투과성을 저하시키므로 지혈(止血)하게 된다. 또한, 비만 세포막을 강화하여 화학 전달 물질의 유리를 억 제하여 항알러지 작용을하며, 특히 알러지로 인한 간염을 개선하고 혈관투과성 항진을 억제하며 소염작용이 강하여 혈관의 염증성 출혈, 울혈을 완화하는 작용을 한다.
바이칼린은 가수분해되서 바이칼레인 및 글루쿠로닉 산(glucuronic acid)이 되고 이 바이칼레인은 이뇨작용을, 글루쿠로닉 산은 해독작용을 한다(한국의 약용식물, 교학사, 2000, p864-865, 배기환저).
이와 관련된 특허로, 한국공개특허 제1996-0003725호에서는 황금의 후라보노이드 성분으로 된 백내장 치료제에 대해 개시하고 있고, 한국공개특허 제1996-0040370호에서는 황금추출물을 비롯한 후라본 배당체들을 함유함을 특징으로 하는 알콜장애 예방 및 치료제 조성물에 관해 개시하고 있으며, 한국공개특허 제2002-0031608호에서는 항균효과가 우수한 황금 추출물, 그의 제조방법 및 그를 포함하는 약학적 조성물에 관해 개시하고 있다.
황금의 주요 활성성분으로서 플라보노이드 계열의 배당체인 바이칼린, 우고노사이드이고 비배당체인 바이칼레인, 우고닌은 미량으로 존재한다.(도 1) 현존 연구에서 배당체에 비하여 비배당체 형태가 생리 활성이 높은 것으로 알려져 있다.
생리활성이 높은 바이칼레인, 우고닌은 현재까지 대부분 직접 황금에서 분리하는 방법으로 획득하였다. 미량으로 존재하는 물질을 분리하는 과정은 경제적, 시간적 측면에서 모두 효율적이지 않다.
베타 글루쿠로니다제는 황금에 함유되어 있는 배당체인 바이칼린과 우고노사이드를 가수분해하여 베타 글루쿠론산과 비배당체인 바이칼레인과 우고닌으로 분해되는데 이러한 과정은 효소를 분비하거나 함유하는 미생물에 의해 장내에서도 진행된다. 그러나 사람에 따라 장내에 존재하는 균 총의 차이가 있으므로 전환되는 비율이 사람마다 각각 다를 것이며 흡수 가능한 바이칼레인과 우고닌의 비율도 다를 것이다.
본 발명에서는 신규한 미생물인 Lactobacillus brevis RO1(KFCC 11424P)를 이용하여 식품 안전성이 보장되는 베타 글루쿠로니다제를 개발하여 효율적으로 황금에서 대량으로 존재하는 배당체인 바이칼린과 우고노사이드를 비당체인 바이칼레인과 우고닌으로 전환시켜 생리활성을 보다 높이는 방법은 큰 의미를 가질 것이다.
본 발명은 신규한 미생물인 Lactobacillus brevis RO1(KFCC 11424P)에서 유도되고 대장균에서 발현시킨 베타 글루쿠로니다제를 이용하여 황금에 대량으로 존재하는 배당체인 바이칼린과 우고노사이드를 가수분해 함으러써미량으로 존재하는 생리활성이 높은 비당체인 바이칼레인과 우고닌을 대량 획득하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 하기의 단계로 구성된다.:
기존에 효소 활성도가 높은 것으로 동정된 신규한 미생물인 Lactobacillus brevis RO1(KFCC 11424P) 균주에서 초음파 파쇄 방법으로 베타 글루쿠로니다제 조효소를 얻는 단계;
대장균에서 Lactobacillus brevis 속의 베타 글루쿠로니다제를 유전공학적 방법을 통해 대량 발현시키는 단계;
수득된 베타 글루쿠로니다제를 이용하여 실제 기질인 바이칼린과 우고노사이드를 생물전환 하여 바이칼레인과 우고닌을 수득하는 단계; 및
고속액체크로마토그래피로 물질 전환효과를 측정하는 단계.
본 발명의 신규한 미생물 Lactobacillus brevis RO1(KFCC 11424P)는 한국미생물보존센터에 2008년 6월 6일 수탁되었고 기탁번호는 KFCC 11424P 이다.
본 발명은 신규한 Lactobacillus brevis RO1(KFCC 11424P) 균주에서 초음파 파쇄 방법으로 베타 글루쿠로니다제 조효소를 얻고 대장균에서 Lactobacillus brevis RO1(KFCC 11424P) 속의 베타 글루쿠로니다제를 대량 발현시키는 등의 방법으로 수득한 베타 글루쿠로니다제로 황금에 대량 존재하는 배당체인 바이칼린과 우고노사이드를 바이칼레인과 우고닌으로 전환하였다.
1. 효소 수득
1) Lactobacillus brevis RO1(KFCC 11424P)의 베타 글루쿠로니다제 수득
본 균주의 배양은 통상의 미생물이 사용할 수 있는 MRS배지에서 배양한다. 베타 글루쿠로니다제의 생성을 촉진시키기 위하여 0.3% 베타 클루쿠론산을 첨가하였고 37도에서 18시간 혐기성배양을 하였다. 배양액을 2 배로 농축하고 초음파로 세포벽을 파쇄하고 나서 상등액을 조효소로 사용하였다.
이러한 배양 조건에서 생성되는 베타 글루쿠로니다제의 최적 pH와 최적 온도를 측정하였다. 37도에서 pH 4부터 8까지에서 30분간 pNP기질과 반응시키고 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 실험결과 pH 5에서 가장 높은 효소활성을 나타내었다. pH 5에서 20도에서 50도까지 5도 간격으로 pNP기질과 반응시키고 405 nm에서의 흡광도를 측정한 결과 35도에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 이상의 실험 결과로부터 최적 pH는 5이고 최적 온도는 35도라는 결론을 얻었다.
3) Lactobacillus brevis RO1(KFCC 11424P) 베타 글루쿠로니다제의 유전자 클로닝, 발현 및 수득
베타 글루쿠로니다제는 Lactobacillus brevis RO1 로부터 추출한 염색체를 주형으로 하고 primer (forward/SacⅠ: AAAGAGCTCATGTTATATCCAATGGAAACAG; reverse/XhoⅠ: GGGTCTAGACTATTTTTTATAATTAAAGTCCGGAATATTC)첨가 후 PCR (annealing Temp 48℃, 35 cycle)을 수행하여 증폭하였다.
발현벡터로 pBADNH선정 (N ?terminal His tag 부착, arabinose induction system, Amp maker, 서울대학교 유전공학연구소 홍주봉교수)하여 이를 각각 Sac1/Xho1로 절단한 후 처리 후 gel elution을 통해 enzyme을 제거하였다.
T4 ligase를 사용하여 16℃에서 over-night으로 ligation하여 DH5a(RecA-)를 숙주로 이용하여 heat shock transformation(heat shock 42℃ 20min, regeneration 37℃ 30 min)후 ampicillin을 첨가한 LB배지에 도말한 후 37℃에서 하룻밤 배양 하였다(도 2).
여기서 형성된 집락을 ampicillin을 첨가한 LB배지에 37℃, 12시간 배양한 후 plasmid DNA를 수득하여 제한효소를 처리하여 (size확인: vector 4.6kb, insert 약 1800bp)하여 sequence를 확인하고 pBADNH-GUS로 명명하였다 (도 3).
E. coli DH5a에서 얻은 재조합 플라스미드 pBADNH-GUS를 E. coli GMS407 (gusA gene negative)로 형질전환하고 여기서 얻은 형질전환체를 LB배지에서 37℃, 2시간 배양 후 아라비노오즈 (0.2% w/v)으로 발현을 유도한 후 6-8h동안 37℃에서 배양하여 세포를 수득한 후 초음파 분쇄하여 효소를 획득하고 효소의 발현을 확인하였다 (Negative control: pBAD18 transformed GMS407). (도 4).
이 sample을 protein assay 후 10 μg에 대한 western blot를 베타 글루쿠로니다제의 발현을 약 72KDa에서 확인하였다 (primary: His antibody, secondary: Mouse antibody) (도 5).
2. 효소에 의한 baicalin의 전환
Baicalin을 pH 5(베타 글루쿠로니디아제의 최적 pH)인 buffer에 200 ppm의 농도로 용해 한후 세가지 유래가 다른 효소와 1대 1로 혼합하여 반응을 시킨다. 이때 사용하는 효소는 일정한 정도로 희석을 진행한다. 반응시간은 0~10h까지 일정한 간격으로 설정하고 최적온도 (35도 혹은 50도)에서 shaking하면서 반응 시킨다. 시간별로 반응액을 취하여 17900 ×g에서 15분간 원심분리하여 얻은 상등액을 물층으로 설정하고 침전물질에 동량의 메탄올을 첨가하여 suspension 한후 다시 17900 ×g에서 15분간 원심분리하여 얻은 상등액을 메탄올 층으로 한다.
3. 고속액체 크로마토그래픽
얻은 반응액을 고속액체 크로마토그래픽으로 baicalin과 baicalein의 양을 정량한다. 검출 가능한 용매조건으로 (도 6) standard를 먼저 측정한 결과 baicalin의 retention time은 20 분이고 baicalein의 retention time은 35 분n이 다. 결과를 보면 반응 1 시간만에 대부분 baicalin은 전환이 된다. 하지만 모든 효소가 정량적으로 baicalein을 생성하지는 않는다. Lactobacillus brevis RO1 (도 7)의 조효소에 의하여 생산된 baicalein은 시간이 경과함에 따라 점차 소실된 sruf과를 보인데 비하여 대장균에서 발현시킨 효소에 의하여 생산된 baicalein은 소실되지 않았다 (도 8).
도 1은 바이칼린, 바이칼레인, 우고노사이드 및 우고닌의 구조식을 나타낸 도면이다.
도 2는 발현벡터 pBADNH를 이용하여 베타글루쿠로니다제를 제조하는 공정을 나타낸 도면이다.
도 3은 제한 효소처리 후 벡터 insert 크기를 확인하는 도면이다.
도 4는 세포파쇄액으로 pNP assay 효소활성을 측정한 표이다.
도 5는 western blott을 이용하여 효소 발현을 확인한 도면이다.
도 6은 고속 액체크로마토그래피로 바이칼린 및 바이칼레인의 양을 측정하기 위하여 검출가능한 용매의 조건을 나타낸 도면이다.
도 7은 Lactobacillus brevis RO1(KFCC 11424P)의 조효소에서 생성된 바이칼레인의 고속 액체 크로마토그래피의 결과이다.
도 8은 대장균에서 발현된 효소에 의해 생성된 바이칼레인의 액체 크로마토그래피의 결과이다.

Claims (4)

  1. 베타 글루쿠로니다제 효소를 생산하는 신규 미생물 Lactobacillus brevis RO1(KFCC 11424P).
  2. 제 1항의 신규 미생물 Lactobacillus brevis RO1(KFCC 11424P)에서 생성된 베타 글루쿠로니다제 효소를 이용하여 황금의 바이칼린과 우고노사이드를 가수분해하여 바이칼레인 및 우고닌을 생산하는 방법
  3. 제 2항에 있어서, 하기의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 바이칼레인 및 우고닌을 생산하는 방법:
    신규한 미생물인 Lactobacillus brevis RO1(KFCC 11424P) 균주에서 초음파 파쇄 방법으로 베타 글루쿠로니다제 효소를 얻는 단계;
    대장균에서 Lactobacillus brevis 속의 베타 글루쿠로니다제를 유전공학적 방법을 통해 대량 발현시키켜 는 단계;
    수득된 베타 글루쿠로니다제를 이용하여 실제 기질인 바이칼린과 우고노사이드를 생물전환 하여 바이칼레인과 우고닌을 수득하는 단계; 및
    고속액체크로마토그래피로 물질 전환효과를 측정하는 단계.
  4. 제 3항에 있어서, 신규한 미생물인 Lactobacillus brevis RO1(KFCC 11424P) 균주에서 초음파 파쇄 방법으로 베타 글루쿠로니다제 조효소를 얻는 단계에 있어서, pH는 5 이고, 온도는 35℃ 인 것을 특징으로 하는 바이칼레인 및 우고닌을 생산하는 방법.
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