CN109651464A - 应用pH区带精制逆流色谱分离黄芩中的黄芩苷和汉黄芩苷的方法 - Google Patents

应用pH区带精制逆流色谱分离黄芩中的黄芩苷和汉黄芩苷的方法 Download PDF

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童胜强
王超越
颜继忠
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification

Abstract

本发明提供了一种应用pH区带精制逆流色谱分离黄芩中的黄芩苷和汉黄芩苷的方法，本发明通过pH区带精制逆流色谱分离黄芩苷和汉黄芩苷，工艺简单，回收率高，分离得到的黄芩苷和汉黄芩苷纯度高，对黄芩药材的充分利用有重要作用。

Description

应用pH区带精制逆流色谱分离黄芩中的黄芩苷和汉黄芩苷的 方法
(一)技术领域
本发明涉及一种应用pH区带精制逆流色谱分离黄芩中的黄芩苷和汉黄芩苷的方法。
(二)背景技术
黄芩为唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根，是一种名贵的中药材，首载于古代第一部本草著作《神农本草经》，其药用历史悠久，是我国广泛应用的传统中药材之一，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎的功效。黄芩苷(Baicalin)是从黄芩中提取分离出来的一种黄酮类化合物，常温下为淡黄色粉末，味苦。具有显著的生物活性，具有抑菌、利尿、抗炎、降胆固醇、抗血栓形成、缓解哮喘、泻火解毒、止血、安胎、抗变态反应及解痉作用，也为哺乳动物肝脏涎酶的特异性抑制剂，具有调节某些疾病的作用，也具有较强的抗癌反应生理效能。汉黄芩苷(Wogonoside)也是从黄芩中提取分离出来的一种黄酮类化合物，具有镇静、保肝、利胆、抗菌、消炎等作用，已有研究表明，汉黄芩苷对流感病毒、单纯胞疹病毒、柯萨奇病毒、呼吸道合胞病毒、丙型肝炎病毒等有抑制作用。汉黄芩苷具有一定的抗肿瘤活性。
目前，黄芩苷和汉黄芩苷的提取主要通过硅胶柱层析洗脱，此方法操作繁琐，步骤较多，过程缓慢增加生产周期。而普通的逆流色谱分离方法，进样量小，得到目标物黄芩苷和汉黄芩苷耗时长，成本高，难以得到广泛应用。pH区带精制逆流色谱(pH-zone-refiningcountercurrent chromatography)是由普通逆流色谱发展而来的一种特殊分离技术，具有进样量大(达到克级)、分离纯度高、分离时间短等优点。其突出的特点是在固定相中加入了保留酸或碱，在流动相中加入了洗脱碱或酸，根据分离物质的解离常数(pKa)及疏水性的差异而实现分离，目标组分以矩形峰被洗脱出来，而杂质则被富集在矩形峰边缘，并且不同组分被洗脱出来伴随着pH值的变化。其分离物质包括有机酸碱衍生物、多肽类、有机染料、生物碱、同分异构体、游离肽等。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种快速地将黄芩苷和汉黄芩苷从黄芩中分离出来的方法，本发明方法工艺简单，具有更强的目的性，快捷高效。
本发明的技术方案如下：
一种应用pH区带精制逆流色谱分离黄芩中的黄芩苷和汉黄芩苷的方法，所述方法为：
(1)在分液漏斗中加入甲基叔丁醚、正丁醇、四氢呋喃与水体积比为2～6：0～4：1～5：5(优选2：2：1：5)的混合溶剂体系，充分振摇后静置分层，取上相加入终浓度为5～20mM(优选10mM)的酸性物质作为固定相，下相加入终浓度为5～20mM(优选10mM)的碱性物质作为流动相；
所述酸性物质为三氟乙酸或醋酸，优选三氟乙酸；
所述碱性物质为氨水(28％NH3)或三乙胺，优选氨水(28％NH3)；
(2)取黄芩的乙醇粗提物用步骤(1)所述固定相和下相的混合液溶解，制得样品溶液；
所述固定相和下相的体积比为1：1；
所述固定相和下相的混合液的体积用量以黄芩的乙醇粗提物的质量计为0.05～0.1mL/mg；
所述黄芩的乙醇粗提物按如下方法制得：将黄芩干燥根粉碎，过60目筛，得到黄芩细粉，将所得黄芩细粉与乙醇按料液比1：10(g：mL)混合，超声1h，过滤，收集滤液，完成一次提取过程，滤渣重复提取2次，合并滤液，用1mol/L的盐酸水溶液调节pH值为2.0，再于80℃水浴中保温30min至不再析出沉淀，过滤，弃去沉淀，滤液用旋转蒸发仪回收溶剂，得到乙醇粗提物；
(3)取步骤(1)制备的固定相注满逆流色谱仪的分离柱，随后注入步骤(2)所得样品溶液，待进样完成后，开启速度控制器，使分离柱正转，在550～850r/min(优选600r/min)转速下，以1～2mL/min(优选1.5mL/min)的流速持续注入步骤(1)制备的流动相，以波长250～400nm的紫外检测器检测，用自动部分收集器收集洗脱液，薄层层析跟踪检测至洗脱液中无样品组分，停止收集；
所述样品溶液的进样体积通常小于分离柱柱体积的30％，优选5％～10％；
所述样品溶液可以通过进样圈注入或通过泵泵入；
所述薄层层析的展开剂为醋酸乙酯、丙酮、甲酸和水体积比26：7：1.5：3的混合溶剂；
(4)将步骤(3)收集的洗脱液通过薄层层析和高效液相色谱进行检测，分别合并与黄芩苷和汉黄芩苷标准品Rf值及保留时间相同且纯度大于90％的黄芩苷和汉黄芩苷洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到黄芩苷和汉黄芩苷；
所述薄层层析的展开剂为醋酸乙酯、丙酮、甲酸和水体积比26：7：1.5：3的混合溶剂；
所述高效液相色谱的检测条件为：Agilent SB-C18(4.6×250mm，5μm)；柱温25℃；流动相：乙腈-1％磷酸水溶液(75：22，v/v)，等度洗脱；流速：0.8ml/min；检测波长：274nm；进样量：20μl。
本发明的有益效果在于：通过pH区带精制逆流色谱分离黄芩苷和汉黄芩苷，工艺简单，回收率高，分离得到的黄芩苷和汉黄芩苷纯度高，对黄芩药材的充分利用有重要作用。
(四)附图说明
图1实施例1的高速逆流色谱(HSCCC)图；
图2实施例2的高速逆流色谱(HSCCC)图；
图3实施例3的高速逆流色谱(HSCCC)图；
图4实施例4的高速逆流色谱(HSCCC)图；
图5实施例5的高速逆流色谱(HSCCC)图；
图1～图5中，化合物1代表黄芩苷，化合物2代表汉黄芩苷。
(五)具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
以下实施例中采用半制备型逆流色谱仪(TBE-200A,上海同田生物与技术股份有限公司)，逆流色谱仪由恒流泵(MP0106，上海三为科学仪器有限公司)、紫外检测器(21C-B蛋白核酸检测仪，上海康华生化仪器制造厂)、记录仪(SEPU3010工作站，杭州惠普科技)、馏分收集器(SBC-100，上海泸西分析仪器厂有限公司)等组成。
黄芩的乙醇粗提物按如下方法制得：将黄芩干燥根粉碎，过60目筛，称取30g的黄芩细粉，加300ml乙醇，超声处理1h，过滤，残渣重复提取2次，合并滤液，滤液用稀盐酸(1mol/L)调节pH值到2.0，将溶液放置在80℃的水浴中保温30min左右，当不再析出沉淀时，过滤，弃去沉淀，滤液用旋转蒸发仪回收溶剂，得到乙醇粗提物6.550g。
实施例1：
将甲基叔丁醚、正丁醇、四氢呋喃和水按照体积比2:2:1:5配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，上相加入三氟乙酸，使三氟乙酸的终浓度为10mM作为固定相，下相加入氨水(28％NH3),使氨水的终浓度为10mM作为流动相；称取黄芩的乙醇粗提物98mg，用5ml固定相和5ml未碱化的下相溶解，得到样品溶液。
采用半制备型逆流色谱仪对黄芩粗提物进行分离，分离柱的柱体积为150ml。首先将固定相以10ml/min的流速注满分离柱，然后将上述样品溶液通过进样圈注入分离柱，待进样完成后，开启速度控制器，使分离柱正转，节转速为600r/min，设置流动相的流速为1.5ml/min，开始泵入流动相，以波长280nm的紫外检测器检测，通过色谱工作站记录色谱图并用自动部分收集器按4分钟每试管的速度接收洗脱液，用薄层层析(展开剂为醋酸乙酯：丙酮：甲酸：水＝26：7：1.5：3)，跟踪检测至洗脱液中无黄芩苷和汉黄芩苷组分，停止收集。
收集得到的洗脱液通过薄层层析(展开剂为醋酸乙酯：丙酮：甲酸：水＝26：7：1.5：3)和高效液相进行检测，合并与黄芩苷标准品Rf值(Rf＝0.5)及保留时间(11.7min)相同且黄芩苷纯度大于90％的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到黄芩苷47mg，纯度为98.9％。同时合并与汉黄芩苷标准品Rf值(Rf＝0.7)及保留时间(27.1min)相同且汉黄芩苷纯度大于90％的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂,得到汉黄芩苷8mg，纯度为97.8％。
高效液相色谱的检测条件为：Agilent SB-C18(4.6×250mm,5μm)；柱温25℃；流动相：乙睛-1％磷酸水溶液(75：22，v/v)，等度洗脱；流速：0.8ml/min；检测波长：274nm；进样量：20μl。
实施例2：
将甲基叔丁醚、正丁醇、四氢呋喃和水按照体积比2:2:1:5配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，上相加入冰乙酸，使冰乙酸的终浓度为10mM作为固定相，下相加入氨水(28％NH3),使氨水的终浓度为10mM作为流动相；称取黄芩的乙醇粗提物96mg，用5ml固定相和5ml未碱化的下相溶解，得到样品溶液。
采用半制备型逆流色谱仪对黄芩粗提物进行分离,分离柱的柱体积为150ml。首先将固定相以10ml/min的流速注满分离柱，然后将上述样品溶液通过进样圈注入分离柱，待进样完成后，开启速度控制器，使分离柱正转，调节转速为600r/min，设置流动相的流速为1.5ml/min，开始泵入流动相,以波长280nm的紫外检测器检测，通过色谱工作站记录色谱图并用自动部分收集器按4分钟每试管的速度接收洗脱液，用薄层层析(展开剂为醋酸乙酯：丙酮：甲酸：水＝26：7：1.5：3)，跟踪检测至洗脱液中无黄芩苷和汉黄芩苷组分，停止收集。
收集得到的洗脱液通过薄层层析(展开剂为醋酸乙酯：丙酮：甲酸：水＝26：7：1.5：3)和高效液相进行检测，合并与黄芩苷标准品Rf值(Rf＝0.5)及保留时间(11.7min)相同且黄芩苷纯度大于90％的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到黄芩苷23mg，纯度为99.3％。同时合并与汉黄芩苷标准品Rf值(Rf＝0.7)及保留时间(27.1min)相同且汉黄芩苷纯度大于90％的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到汉黄芩苷4mg，纯度为98.1％。
高效液相色谱的检测条件为：Agilent SB-C18(4.6×250mm,5μm)；柱温25℃；流动相：乙睛-1％磷酸水溶液(75：22，v/v)，等度洗脱；流速：0.8ml/min；检测波长：274nm；进样量：20μl。
实施例3：
将甲基叔丁醚、正丁醇、四氢呋喃和水按照体积比2:2:1:5配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，上相加入三氟乙酸，使三氟乙酸的终浓度为10mM作为固定相，下相加入氨水(28％NH3)，使氨水的终浓度为5mM作为流动相；称取黄芩的乙醇粗提物104mg，用5ml固定相和5ml未碱化的下相溶解，得到样品溶液。
采用半制备型逆流色谱仪对黄芩粗提物进行分离，分离柱的柱体积为150ml。首先将固定相以10ml/min的流速注满分离柱，然后将上述样品溶液通过进样圈注入分离柱，待进样完成后，开启速度控制器，使分离柱正转，调节转速为600r/min，设置流动相的流速为1.5ml/min，开始泵入流动相，以波长280nm的紫外检测器检测，通过色谱工作站记录色谱图并用自动部分收集器按4分钟每试管的速度接收洗脱液，用薄层层析(展开剂为醋酸乙酯：丙酮：甲酸：水＝26：7：1.5：3)，跟踪检测至洗脱液中无黄芩苷和汉黄芩苷组分，停止收集。
收集得到的洗脱液通过薄层层析(展开剂为醋酸乙酯：丙酮：甲酸：水＝26：7：1.5：3)和高效液相进行检测,合并与黄芩苷标准品Rf值(Rf＝0.5)及保留时间(11.7min)相同且黄芩苷纯度大于的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到黄芩苷45mg，纯度为95.3％。同时合并与汉黄芩苷标准品Rf值(Rf＝0.7)及保留时间(27.1min)相同且汉黄芩苷纯度大于90％的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂,得到汉黄芩苷6mg，纯度为98.0％。
高效液相色谱的检测条件为：Agilent SB-C18(4.6×250mm,5μm)；柱温25℃；流动相：乙睛-1％磷酸水溶液(75：22，v/v)，等度洗脱；流速：0.8ml/min；检测波长：274nm；进样量：20μl。
实施例4：
将甲基叔丁醚、正丁醇、四氢呋喃和水按照体积比6:4:5:5配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，上相加入三氟乙酸，使三氟乙酸的终浓度为10mM作为固定相，下相加入氨水(28％NH3),使氨水的终浓度为10mM作为流动相；称取黄芩的乙醇粗提物100mg，用5ml固定相和5ml未碱化的下相溶，得到样品溶液。
采用半制备型逆流色谱仪对黄芩粗提物进行分离，分离柱的柱体积为150ml。首先将固定相以10ml/min的流速注满分离柱，然后将上述样品溶液通过进样圈注入分离柱，待进样完成后,开启速度控制器,使分离柱正转，调节转速为600r/min，设置流动相的流速为1.5ml/min，开始泵入流动相，以波长280nm的紫外检测器检测，通过色谱工作站记录色谱图并用自动部分收集器按4分钟每试管的速度接收洗脱液，用薄层层析(展开剂为醋酸乙酯：丙酮：甲酸：水＝26：7：1.5：3)，跟踪检测至洗脱液中无黄芩苷和汉黄芩苷组分，停止收集。
收集得到的洗脱液通过薄层层析(展开剂为醋酸乙酯：丙酮：甲酸：水＝26：7：1.5：3)和高效液相进行检测，合并与黄芩苷标准品Rf值(Rf＝0.5)及保留时间(11.7min)相同且黄芩苷纯度大于的洗脱液,用旋转蒸发仪回收溶剂，得到黄芩苷38mg，纯度为96.7％。同时合并与汉黄芩苷标准品Rf值(Rf＝0.7)及保留时间(27.1min)相同且汉黄芩苷纯度大于90％的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂,得到汉黄芩苷6mg，纯度为98％。
高效液相色谱的检测条件为：Agilent SB-C18(4.6×250mm,5μm)；柱温25℃；流动相：乙睛-1％磷酸水溶液(75：22，v/v)，等度洗脱；流速：0.8ml/min；检测波长：274nm；进样量：20μl。
实施例5：
将甲基叔丁醚、正丁醇、四氢呋喃和水按照体积比2:2:1:5配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层,上相加入三氟乙酸，使三氟乙酸的终浓度为10mM作为固定相，下相加入氨水(28％NH3),使氨水的终浓度为10mM作为流动相；称取黄芩的乙醇粗提物300mg，用10ml固定相和10ml未碱化的下相溶解，得到样品溶液。
采用半制备型逆流色谱仪对黄芩粗提物进行分离,分离柱的柱体积为250ml。首先将固定相以30ml/min的流速注满分离柱，然后将上述样品溶液通过进样圈注入分离柱，待进样完成后，开启速度控制器，使分离柱正转，调节转速为800r/min，设置流动相的流速为1.5ml/min，开始泵入流动相，以波长280nm的紫外检测器检测，通过色谱工作站记录色谱图并用自动部分收集器按4分钟每试管的速度接收洗脱液，用薄层层析(展开剂为醋酸乙酯：丙酮：甲酸：水＝26：7：1.5：3)，跟踪检测至洗脱液中无黄芩苷和汉黄芩苷组分，停止收集。
收集得到的洗脱液通过薄层层析(展开剂为醋酸乙酯：丙酮：甲酸：水＝26：7：1.5：3)和高效液相进行检测,合并与黄芩苷标准品Rf值(Rf＝0.5)及保留时间(11.7min)相同且黄芩苷纯度大于的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到黄芩苷112mg，纯度为95.8％。同时合并与汉黄芩苷标准品Rf值(Rf＝0.7)及保留时间(27.1min)相同且汉黄芩苷纯度大于90％的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂,得到汉黄芩苷11mg,纯度为98.0％。
高效液相色谱的检测条件为：Agilent SB-C18(4.6×250mm,5μm；柱温25℃；流动相：乙睛-1％磷酸水溶液(75：22，v/v)，等度洗脱；流速：0.8ml/min；检测波长：274nm；进样量：20μl。
对比例
宣寒(宣寒,陈钧,杜丰玉,等.大孔吸附树脂分离纯化黄芩中黄芩苷的工艺研究[J].时珍国医国药,2006,17(10):1992-1994.)等人利用AB-8大孔吸附树脂纯化黄芩中黄芩苷，当优化条件使吸附效果最好时(上样浓度为50mg/ml，上样液pH值为4，吸附流速为4BV/h，上样体积为6BV，洗脱剂为5倍量树脂柱体积，乙醇且洗脱剂的pH值为8)，饱和吸附量仅为78.44mg/g(湿重)，样品纯度也仅在90％左右，而且回收率低，大孔树脂会对样品产生不可逆吸附，成本较高，生产周期延长，不适合大规模的生产。

Claims (7)

1.一种应用pH区带精制逆流色谱分离黄芩中的黄芩苷和汉黄芩苷的方法，其特征在于，所述方法为：
(1)在分液漏斗中加入甲基叔丁醚、正丁醇、四氢呋喃与水体积比为2～6：0～4：1～5：5的混合溶剂体系，充分振摇后静置分层，取上相加入终浓度为5～20mM的酸性物质作为固定相，下相加入终浓度为5～20mM的碱性物质作为流动相；
所述酸性物质为三氟乙酸或醋酸；
所述碱性物质为氨水或三乙胺；
(2)取黄芩的乙醇粗提物用步骤(1)所述固定相和下相的混合液溶解，制得样品溶液；
所述固定相和下相的体积比为1：1；
所述固定相和下相的混合液的体积用量以黄芩的乙醇粗提物的质量计为0.05～0.1mL/mg；
(3)取步骤(1)制备的固定相注满逆流色谱仪的分离柱，随后注入步骤(2)所得样品溶液，待进样完成后，开启速度控制器，使分离柱正转，在550～850r/min转速下，以1～2mL/min的流速持续注入步骤(1)制备的流动相，以波长250～400nm的紫外检测器检测，用自动部分收集器收集洗脱液，薄层层析跟踪检测至洗脱液中无样品组分，停止收集；
所述样品溶液的进样体积小于分离柱柱体积的30％；
(4)将步骤(3)收集的洗脱液通过薄层层析和高效液相色谱进行检测，分别合并与黄芩苷和汉黄芩苷标准品Rf值及保留时间相同且纯度大于90％的黄芩苷和汉黄芩苷洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到黄芩苷和汉黄芩苷。
2.如权利要求1所述的应用pH区带精制逆流色谱分离黄芩中的黄芩苷和汉黄芩苷的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述甲基叔丁醚、正丁醇、四氢呋喃与水体积比为2：2：1：5。
3.如权利要求1所述的应用pH区带精制逆流色谱分离黄芩中的黄芩苷和汉黄芩苷的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述黄芩的乙醇粗提物按如下方法制得：将黄芩干燥根粉碎，过60目筛，得到黄芩细粉，将所得黄芩细粉与乙醇按料液比1：10混合，超声1h，过滤，收集滤液，完成一次提取过程，滤渣重复提取2次，合并滤液，用1mol/L盐酸水溶液调节pH值为2.0，再于80℃水浴中保温30min至不再析出沉淀，过滤，弃去沉淀，滤液用旋转蒸发仪回收溶剂，得到乙醇粗提物。
4.如权利要求1所述的应用pH区带精制逆流色谱分离黄芩中的黄芩苷和汉黄芩苷的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述样品溶液的进样体积为分离柱柱体积的5％～10％。
5.如权利要求1所述的应用pH区带精制逆流色谱分离黄芩中的黄芩苷和汉黄芩苷的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述样品溶液通过进样圈注入或通过泵泵入逆流色谱仪。
6.如权利要求1所述的应用pH区带精制逆流色谱分离黄芩中的黄芩苷和汉黄芩苷的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述高效液相色谱的检测条件为：Agilent SB-C18，4.6×250mm，5μm；柱温25℃；流动相：体积比75：22乙腈-1％磷酸水溶液，等度洗脱；流速：0.8ml/min；检测波长：274nm；进样量：20μl。
7.如权利要求1所述的应用pH区带精制逆流色谱分离黄芩中的黄芩苷和汉黄芩苷的方法，其特征在于，步骤(3)或(4)中，所述薄层层析的展开剂为醋酸乙酯、丙酮、甲酸和水体积比26：7：1.5：3的混合溶剂。
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