CN111170861B - 一种从款冬花中提取二咖啡酰奎宁酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药有效成分制备技术领域，提供了一种从款冬花中提取二咖啡酰奎宁酸的方法。款冬花经70%乙醇回流提取后得提取液，提取液经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行系统溶剂萃取收集正丁醇部位；正丁醇部位通过HP‑20大孔树脂，依次采用水和10%乙醇的溶液进行洗脱，收集10%乙醇馏分，浓缩得到款冬花二咖啡酰奎宁酸提取物。制备方法步骤简单、成本低，易于工业化生产，二咖啡酰奎宁酸的含量可以达到89%以上。

Description

一种从款冬花中提取二咖啡酰奎宁酸的方法

技术领域

本发明属于中药有效成分制备技术领域，具体涉及一种从款冬花中提取二咖啡酰奎宁酸的方法。

背景技术

款冬花为我国传统中药材，具有润肺下气，止咳化痰的功效，含有苯丙素类、萜类、黄酮类、甾体类、生物碱、挥发油等成分，其中咖啡酰奎宁酸类成分含量较高，广泛存在于很多植物中，据研究该类成分具有抗氧化、抗炎、细胞保护、免疫调节、抗高血糖高血脂和抗癌等药理活性，具有广阔的开发前景。

咖啡酰奎宁酸类化合物是以奎宁酸为母核，根据其缩合的咖啡酸的数目分为单咖啡酰奎宁酸、二咖啡酰奎宁酸、三咖啡酰奎宁酸和多咖啡酰奎宁酸。其中以单咖啡酰奎宁酸和二咖啡酰奎宁酸较为常见。二咖啡酰奎宁酸在抗炎（Inhibition of Xanthine Oxidaseby Phenolic Conjugates of Methylated Quinic Acid[J]. Planta Medica, 2003, 69(5): 396-401.）、降糖（Simple High-yield Purification of 3,4,5-Tri-O-caffeoylquinic Acid from Sweetpotato (Ipomoea batatas L.) Leaf and ItsInhibitory Effects on Aldose Reductase[J]. Food Sci. Technol. Res. 2011, 17(2): 87-92.）和神经细胞保护（Protective Effects of Quinic Acid Derivatives onTetrahydropapaveroline-Induced Cell Death in C6 Glioma Cells[J]. Biological &Pharmaceutical Bulletin, 2003, 26(6): 803-807.）方面活性优于单咖啡酰奎宁酸。文献报道显示，款冬花中3种主要的二咖啡酰奎宁酸化合物，分别是异绿原酸A、B和C（基于UPLC多指标测定比较不同来源款冬花药材的质量[J]. 中草药, 2015, 46(15): 2296-2302.）。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供了一种从款冬花中提取二咖啡酰奎宁酸的方法。

本发明由如下技术方案实现的：一种从款冬花中提取二咖啡酰奎宁酸的方法，具体步骤如下：

（1）款冬花经70%乙醇按照料液比为1:10回流提取2次，每次1h，纱布过滤后合并上清液，减压浓缩至无醇味即得提取溶液；

（2）提取溶液用用等体积的石油醚萃取2次，用等体积的乙酸乙酯萃取2次，弃去石油醚和乙酸乙酯萃取部位，水相用等体积正丁醇继续萃取2次，合并2次正丁醇部位，50℃水浴蒸干；

（3）萃取得到的正丁醇部位通过HP-20大孔树脂以水和10%乙醇的溶液进行洗脱，收集10%乙醇洗脱液，浓缩干燥后得到款冬花二咖啡酰奎宁酸提取物。

步骤（2）中石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每次萃取时间为1h。

步骤（3）中HP-20大孔树脂先用95%乙醇浸泡过夜后装柱，柱体积为50ml，用蒸馏水冲至无醇味，取步骤（2）所得到的正丁醇部位200mg用1ml水溶解后进行上样，分别用100ml的水和10%乙醇进行洗脱，收集10%乙醇洗脱液浓缩干燥后得到款冬花二咖啡酰奎宁酸提取物。

本发明所提供的一种款冬花二咖啡酰奎宁酸提取物的制备方法步骤简单、成本低，易于工业化生产，二咖啡酰奎宁酸的含量可以达到89%以上。

附图说明

图1为款冬花正丁醇部位过HP-20大孔树脂柱后10%乙醇洗脱液色谱图（峰1为异绿原酸B，峰2为异绿原酸A，峰3为异绿原酸C）；

图2为对比例1得到的洗脱液的色谱图；

图3为对比例2得到的洗脱液的色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整的说明。

各实施例中使用到的试剂和器材如下：

仪器：Agilent 1260 高效液相色谱仪（Agilent 公司），G1311C四元梯度泵，G1329B自动进样器，G1316A柱温箱，G1314F紫外检测器，超声波清洗器（KQ5200E，昆山市超声仪器有限公司），色谱柱Venusil MP C₁₈(250 mm×4.6 mm，5 µm)。

试剂：乙腈（色谱纯，Fisher公司），甲醇（色谱纯，Fisher公司），超纯水，磷酸（色谱纯，Fisher公司），其余试剂均为分析纯。HP-20大孔树脂（日本三菱公司）。

实施例1：款冬花经提取、萃取、分离得二咖啡酰奎宁酸提取物，具体方法如下：

1、称取100 g款冬花，加入70%乙醇1000 ml，回流提取2次，每次1小时，用纱布过滤后合并上清液，减压浓缩至无醇味。

2、款冬花浓缩液中加入等体积石油醚萃取两次，再加入等体积乙酸乙酯萃取两次，弃去石油醚和乙酸乙酯萃取部位，然后加入等体积正丁醇萃取两次，合并两次的正丁醇部位，50℃水浴蒸干。

3、将HP-20大孔树脂用95%乙醇浸泡过夜后装柱，柱体积为50ml，用蒸馏水冲至无醇味，取上述正丁醇部位200mg用1ml水溶解后进行上样，分别用100ml的水和10%乙醇进行洗脱，收集10%乙醇洗脱液浓缩干燥后得到款冬花二咖啡酰奎宁酸提取物。通过高效液相色谱法检测（图1），通过标准品对照，确定峰1为异绿原酸B，峰2为异绿原酸A，峰3为异绿原酸C，根据峰面积归一化法计算得到3种二咖啡酰奎宁酸的纯度大于89%。

对比例1：款冬花正丁醇部位通过HP-20大孔树脂，以10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇洗脱：

将HP-20大孔树脂用95%乙醇浸泡过夜后装柱，柱体积为50ml，用蒸馏水冲至无醇味，取上述正丁醇部位200mg用1ml水溶解后进行上样，分别用150ml的10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇进行洗脱，收集10%乙醇洗脱液，干燥后通过高效液相色谱法检测。通过标准品对照的方式对色谱峰进行鉴定，结果可见，所得提取物中，除了具有异绿原酸A、B和C这3种二咖啡酰奎宁酸化合物，在保留时间7-14min之间还包含绿原酸等单咖啡酰奎宁酸类。（图2）

对比例2：款冬花正丁醇部位通过HP-20大孔树脂，以水、20%乙醇洗脱：

将HP-20大孔树脂用95%乙醇浸泡过夜后装柱，柱体积为50ml，用蒸馏水冲至无醇味，取上述正丁醇部位200mg用1ml水溶解后进行上样，分别用200ml的水、20%乙醇进行洗脱，收集20%乙醇洗脱液，干燥后通过高效液相色谱法检测。通过标准品对照的方式对色谱峰进行鉴定，结果可见，所得提取物中，除了具有异绿原酸A、B和C这3种二咖啡酰奎宁酸化合物，在保留时间21min还具有芦丁的信号。（图3）

通过对比实施例和对比例1和2，本发明提供的方法所制备的提取物中，异绿原酸A、B和C二咖啡酰奎宁酸的含量可以达到89%以上；而如果采用对比例1的洗脱条件，单咖啡酰奎宁酸类成分和二咖啡酰奎宁酸类成分无法分离；如果采用对比例2的洗脱条件，无法将异绿原酸A、B和C这3种二咖啡酰奎宁酸化合物和芦丁分离。因此，对比例1和2均无法达到制备高纯度二咖啡酰奎宁酸类成分的目的。

本发明提供的从款冬花二咖啡酰奎宁酸提取物的制备方法步骤简单、成本低，易于工业化生产，二咖啡酰奎宁酸的含量可以达到89%以上，所制备的二咖啡酰奎宁酸提取物可以用于进一步的中药新药研发。

Claims (1)

1.一种从款冬花中提取二咖啡酰奎宁酸的方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）款冬花经70%乙醇按照料液比为1:10回流提取2次，每次1h，纱布过滤后合并上清液，减压浓缩至无醇味即得提取溶液；

（2）提取溶液用用等体积的石油醚萃取2次，用等体积的乙酸乙酯萃取2次，弃去石油醚和乙酸乙酯萃取部位，水相用等体积正丁醇继续萃取2次，合并2次正丁醇部位，50℃水浴蒸干；

（3）萃取得到的正丁醇部位通过HP-20大孔树脂以水和10%乙醇的溶液进行洗脱，收集10%乙醇洗脱液，浓缩干燥后得到款冬花二咖啡酰奎宁酸提取物；

步骤（2）中石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每次萃取时间为1h；

步骤（3）中HP-20大孔树脂先用95%乙醇浸泡过夜后装柱，柱体积为50ml，用蒸馏水冲至无醇味，取步骤（2）所得到的正丁醇部位200mg用1ml水溶解后进行上样，分别用100ml的水和10%乙醇进行洗脱，收集10%乙醇洗脱液浓缩干燥后得到款冬花二咖啡酰奎宁酸提取物。

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