CN109232674B

CN109232674B - 从南山茶中提取白杨素-8-C-β-D-葡萄糖苷的方法

Info

Publication number: CN109232674B
Application number: CN201811457251.7A
Authority: CN
Inventors: 王元清; 袁虎; 严建业; 张晓帆; 曹清明
Original assignee: Central South University of Forestry and Technology
Current assignee: Central South University of Forestry and Technology
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2038-11-30
Also published as: CN109232674A

Abstract

本发明提供了一种从南山茶中提取白杨素‑8‑C‑β‑D‑葡萄糖苷的方法。所述方法:将南山茶饼经过浸提上样至大孔树脂层析柱，梯度洗脱后收集15％乙醇水溶液洗脱的洗脱液，经后处理得粗组分液；上样至聚酰胺树脂层析柱，梯度洗脱收集含有目标化合物的洗脱液，浓缩冻干得到粗提取物；使用高效液相色谱仪、C18HCE色谱柱进行DAC制备，得到粗分离物；使用高效液相色谱仪、C18ME色谱柱、用体积分数为19％的乙腈水溶液作为流动相，进行等度洗脱，收集含有目标化合物的流份段，浓缩冻干得到目标化合物；本申请提供的方法，首次从山茶属植物中有效分离出目标化合物，提取纯度高。

Description

从南山茶中提取白杨素-8-C-β-D-葡萄糖苷的方法

技术领域

本发明涉及化合物提取领域，具体而言，涉及一种从南山茶中提取白杨素-8-C-β-D-葡萄糖苷的方法。

背景技术

南山茶又名广宁红花油茶(Camellia semiserrata Chi.)，属于山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia L.)植物，多年生乔木或灌木。南山茶主要分布在我国的广西东南部以及广东西部。它是油茶的一种重要栽培物种。经研究比较发现，在各类油茶中，广宁红花油茶中的化学成分相对比较丰富。

南山茶及其饼粕尤其富含具有多种生物活性的黄酮类和皂苷等化合物。目前，对油茶饼粕的研究主要集中在以总黄酮或皂苷为指标进行的各种提取工艺的优化，还有一些着重于对得到的粗提物或初步纯化物进行抗氧化以及抑菌等活性方面的研究。但是，对提取物中具体成分的研究不够。

白杨素是一种具有广泛药理活性的黄酮类化合物，它具有抗氧化、抗肿瘤、抗癌、抗病毒、抗高血压、抗糖尿病、抗菌、抗过敏等广泛的药理生理活性，是新药开发研究中一个非常重要的资源。

分析南山茶中的有效活性物质，将其活性成分从复杂多样的成分中分离提取出来，得到纯度较高的产品，对于南山茶的深度开发具有重要的作用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从南山茶中提取白杨素-8-C-β-D-葡萄糖苷的方法，所述方法首次从南山茶中提取出目标化合物，而且快速有效、纯度很高。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种从南山茶中提取白杨素-8-C-β-D-葡萄糖苷的方法，所述方法包括以下步骤:

A.将南山茶饼经过浸提处理得到样品液；

B.将所述样品液湿法上样至大孔树脂层析柱，依次用体积分数为5％、15％、50％、95％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集用所述15％乙醇水溶液洗脱的洗脱液，经后处理得粗组分液；

C.将所述粗组分液湿法上样至聚酰胺树脂层析柱，依次用蒸馏水、体积分数为20％、40％、90％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，经色谱检测，收集含有目标化合物的洗脱液，浓缩冻干得到粗提取物；

D.将所述粗提取物用第一溶剂溶解后进样，使用高效液相色谱仪、C18HCE色谱柱进行DAC制备，用甲醇水溶液作为流动相进行等度洗脱，收集含有所述目标化合物的流份段，浓缩冻干得到粗分离物；

E.将所述预分离物用第二溶剂溶解后进样，使用高效液相色谱仪、第一C18ME色谱柱进行半制备，用体积分数为19％的乙腈水溶液作为流动相，进行等度洗脱，收集含有所述目标化合物的流份段，浓缩冻干得到所述目标化合物；所述目标化合物的结构式为：

根据南山茶浸提液中的主要成分及目标化合物的性质，采用浸提-萃取-大孔树脂柱层析-C18ME色谱柱洗脱后处理-聚酰胺树脂柱层析-DAC(动态轴向压缩)制备-C18ME色谱柱高效液相色谱制备的方法，有效将目标化合物从南山茶的复杂成分中分离出来。

优选地，所述步骤B中，所述大孔树脂层析柱的制备方法为：先用乙醇浸泡D101大孔树脂，然后装柱，依次用乙醇、水冲洗至无乙醇味。

大孔树脂进行处理制备成层析柱，目的是为了充分的释放大孔树脂的吸附能力，防止杂质对提取过程产生不良影响，保证最大的柱层析效率。

进一步优选地，所述大孔树脂层析柱的柱体积BV₁为10L，所述5％乙醇的用量为6倍BV₁、所述15％乙醇的用量为8倍BV₁、所述50％乙醇的用量为8倍BV₁、所述95％乙醇的用量为4倍BV₁。

合适的洗脱液体系，是基于对浸提液中有效成分及目标化合物之间的差异的认知而做出的。合适的洗脱用量，一方面是为了保证能够尽量将目标化合物和其他组分分离开，减少分离的次数；另一方面是为了保证提取效率，尽可能的提高提取得率。

更加优选地，所述后处理为：将洗脱液减压蒸馏除去乙醇，然后用第二C18ME色谱柱、以甲醇作为流动相进行洗脱做DAC富集，接收流出液减压浓缩直至无液体旋出，用体积比为1:1的甲醇和丙酮溶解得所述粗组分液；所述第二C18ME色谱柱规格为：100A，50mm×250mm，10μm。

用色谱柱处理洗脱液的主要目的是将水分离掉。而使用甲醇和丙酮溶解后，有利于下一步分离的进行。

优选地，所述步骤C中，所述聚酰胺树脂层析柱的柱体积BV₂为1L；所述蒸馏水、所述体积分数为20％乙醇、所述40％乙醇的用量均为5倍BV₂、所述90％乙醇的用量为2倍BV₂。

更加优选地，所述梯度洗脱过程中，每500mL为一个收集单位，并顺次编号，收集第5-18号洗脱液。

聚氨酯树脂柱层析的洗脱体系、柱体积以及洗脱液用量，是基于被分离物、洗脱液和聚氨酯层析柱的性质来确定的。设定收集单位，是为了更好地获得含有目标化合物的流份段。

优选地，所述步骤D中，所述C18HCE色谱柱规格为：100A，50mm×250mm，10μm；所述甲醇水溶液的体积分数为50％。

更加优选地，所述第一溶剂为体积比1:1的甲醇和二甲基亚砜。

溶剂、色谱柱规格、洗脱体系等的选择，是基于被分离物的极性来确定的。

优选地，所述步骤E中，所述第一C18ME色谱柱规格为：100A，20×250mm，10μm；所述第二溶剂为体积分数19％的乙腈水溶液。

可选地，所述步骤A中，所述浸提处理的方法为：用体积分数为50-60％的乙醇水溶液浸提，料液比为1kg所述南山茶饼对应2-4L所述乙醇水溶液，在60-70℃加热回流浸提2-4次，过滤、合并得到提取液；然后减压浓缩，再用正丁醇萃取得到萃取液，加水稀释18-22倍得到所述样品液。

乙醇水溶液可以很好的把南山茶中的成分浸提出来，但由于成分的性质不同，需要采用合适的温度和浸提时间；萃取剂的选择取决于目标化合物的性质；高浓度的提取液直接用大孔树脂进行柱层析时，分离效果比较差，因此需要稀释后使用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)首次从山茶属植物中分离出了目标化合物；

(2)本申请提供的提取方法简单、有效；

(3)目标化合物提取纯度高；

(4)该提取方法适合于推广应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1进行DAC制备的谱图；

图2为实施例1进行高效液相色谱制备的谱图；

图3为实施例1制备得到的目标化合物的纯度测定图；

图4为本申请制备得到的第二目标化合物的质谱图；

图5为本申请制备得到的第二目标化合物的H谱图；

图6为本申请制备得到的第二目标化合物的C谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

将南山茶的茶果晾晒，去壳，以物理压榨法脱去油脂后产生的饼晾干，并适当粉碎，即得到南山茶饼。以体积分数为50％的乙醇水溶液于60℃条件下超声浸提3次，每次2h，料液比为1:4(m/v)，然后进行过滤、合并，得到提取液。然后将提取液浓缩、用等体积的正丁醇萃取得到萃取液，再用水稀释20倍得到样品液。

去壳、脱去油脂，是为了最大程度的保证提取得率，减少分离过程中的干扰。合适的原料处理方法还有利于避免目标化合物的流失。

选取大孔树脂的型号为D101型，先用乙醇浸泡D101大孔树脂，然后装柱(柱体积BV₁为10L)，依次用乙醇、水冲洗至无乙醇味，可以用酒精计检测，读数小于5即可。将样品液缓慢的加入到大孔树脂层析柱中，然后依次用6倍BV₁的体积分数为5％乙醇、8倍BV₁的体积分数为15％乙醇、8倍BV₁的体积分数为50％乙醇、4倍BV₁的体积分数为95％乙醇洗脱，经色谱检测，收集用15％乙醇进行洗脱的洗脱液，减压蒸馏除去乙醇，然后用C18ME色谱柱(100A，50mm×250mm，10μm)、以甲醇作为流动相进行洗脱(DAC富集)，流速为80mL/min，洗脱10min，接收流出液减压浓缩直至无液体旋出，用甲醇和丙酮(体积比1:1)溶解，得粗组分液。

先将聚酰胺树脂层析柱用纯水冲洗至流出液无色，然后将粗组分液湿法上样至聚酰胺树脂层析柱(BV₂为1L)，依次用蒸馏水、体积分数为20％乙醇、40％乙醇、90％乙醇进行梯度洗脱，各洗脱液用量均为5倍BV₂，经色谱检测，每500mL为一个收集单位，并顺次编号，收集第5-18号洗脱液，浓缩冻干得到粗提取物。

使用C18HCE色谱柱(100A，50mm×250mm，10μm)、用体积分数为50％的甲醇水溶液作为流动相进行DAC制备，将粗提取物用体积比为1:1的甲醇和二甲基亚砜溶解后进样，控制流速70mL/min，进样量16mL，进行等度洗脱，收集含有目标化合物的流份段(见图1中，4号峰)，浓缩冻干得到粗分离物。

使用C18ME色谱柱(100A，20×250mm，10μm)、用体积分数为19％的乙腈水溶液作为流动相，将粗分离物用19％的乙腈水溶液溶解后进样，控制流速20mL/min，进样量2mL，进行等度洗脱，收集含有目标化合物的流份段，浓缩冻干得到目标化合物(见图2，3号峰)。

对目标化合物进行纯度测定：以乙腈-0.1％甲酸水溶液(体积比20：80)作为流动相，用LC3000型高效液相色谱仪，C18ME色谱柱(4.6×250mm，10μm)，检测器：UV254nm，控制流速1mL/min。测得目标化合物的纯度为95.92％(见图3)，提取得率为72mg/kg。

实施例2

将南山茶的茶果晾晒，去壳，以物理压榨法脱去油脂后产生的饼晾干，并适当粉碎，即得到南山茶饼。以体积分数为60％的乙醇水溶液于70℃条件下超声浸提2次，每次2h，料液比为1:2(m/v)，然后进行过滤、合并，得到提取液。然后将提取液浓缩、用等体积的正丁醇萃取得到萃取液，再用水稀释22倍得到样品液。

使用C18HCE色谱柱(100A，50mm×250mm，10μm)、用体积分数为50％的甲醇水溶液作为流动相进行DAC制备，将粗提取物用体积比为1:1的甲醇和二甲基亚砜溶解后进样，控制流速70mL/min，进样量16mL，进行等度洗脱，收集含有目标化合物的流份段，浓缩冻干得到粗分离物。

使用C18ME色谱柱(100A，20×250mm，10μm)、用体积分数为19％的乙腈水溶液作为流动相，将粗分离物用19％的乙腈水溶液溶解后进样，控制流速20mL/min，进样量2mL，进行等度洗脱，收集含有目标化合物的流份段，浓缩冻干得到目标化合物。

实施例3

将南山茶的茶果晾晒，去壳，以物理压榨法脱去油脂后产生的饼晾干，并适当粉碎，即得到南山茶饼。以体积分数为55％的乙醇水溶液于65℃条件下超声浸提4次，每次2h，料液比为1:4(m/v)，然后进行过滤、合并，得到提取液。然后将提取液浓缩、用等体积的正丁醇萃取得到萃取液，再用水稀释18倍得到样品液。

对实施例1-3得到的化合物单体均进行LC-MS测定和核磁共振检测。

如图4所示，质谱数据m/z417.1135[M+H]⁺。推测其分子式为C₂₁H₂₀O₉。¹H-NMR(图5)中，δ6.31(H,s)与6.99(H,s)符合苯环或烯烃上质子信号特征，δ8.19(2H,d,J＝7.5Hz)、7.55(2H,t,J＝7.5Hz)与7.63(H,t,J＝7.3Hz)，其积分面积、化学位移、裂分及耦合常数符合1位取代苯环上质子信号特征，因此推断化合物中包含有一个1取代苯。δ4.71(H,d,J＝9.8Hz)符合葡萄糖端基质子信号特征，通过其耦合常数(J＝9.8Hz＞7.0Hz)可以判断，该葡萄糖苷键为β构型。

¹³C-NMR(图6)中，81.89，70.82，73.37，70.53，78.64，61.30符合一组葡萄糖苷碳谱信号，其余信号与白杨素特征信号一致。

对H谱和C谱的峰进行归属如下：

¹³C-NMR:163.04(C-2),104.79(C-3),182.22(C-4),160.42(C-5),98.38(C-6),163.35(C-7),104.73(C-8),156.16(C-9),104.27(C-10),131.06(C-1’),126.89(C-2’,6’),129.04(C-3’,5’),132.02(C-4’),81.89(C-1”),70.82(C-2”),73.37(C-3”),70.53(C-4”),78.64(C-5”),61.30(C-6”)。

¹H-NMR:8.19(2H,d,J＝7.5Hz,H-2’,6’),7.63(H,t,J＝7.3Hz,H-4’),7.55(2H,t,J＝7.5Hz,H-3’,5’),6.99(H,s,H-6),6.31(H,s,H-3),4.71(H,d,J＝9.8Hz,H-1”)。

综合所有核磁谱图及质谱结果，鉴定该化合物为白杨素-8-C-β-D-葡萄糖苷。

结构式为：

本申请提供的从南山茶中提取白杨素-8-C-β-D-葡萄糖苷的方法，首次从山茶属植物中分离提取出了目标化合物，方法简单实用，适宜于规模化应用，产品纯度高，对于南山茶的深度开发利用有着积极意义。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims

1.一种从南山茶中提取白杨素-8-C-β-D-葡萄糖苷的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:

A.将南山茶饼经过浸提处理得到样品液；所述浸提处理的方法为：用体积分数为50-60％的乙醇水溶液浸提，料液比为1kg所述南山茶饼对应2-4L所述乙醇水溶液，在60-70℃加热回流浸提2-4次，过滤、合并得到提取液；然后减压浓缩，再用正丁醇萃取得到萃取液，加水稀释18-22倍得到所述样品液；

B.将所述样品液湿法上样至大孔树脂层析柱，依次用体积分数为5％、15％、50％、95％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集用所述15％乙醇水溶液洗脱的洗脱液，经后处理得粗组分液；所述大孔树脂层析柱的柱体积BV₁为10L，所述5％乙醇的用量为6倍BV₁、所述15％乙醇的用量为8倍BV₁、所述50％乙醇的用量为8倍BV₁、所述95％乙醇的用量为4倍BV₁；所述后处理为：将洗脱液减压蒸馏除去乙醇，然后用第二C18ME色谱柱、以甲醇作为流动相进行洗脱做DAC富集，接收流出液减压浓缩直至无液体旋出，用体积比为1:1的甲醇和丙酮溶解得所述粗组分液；所述第二C18ME色谱柱规格为：100A，50mm×250mm，10μm；

C.将所述粗组分液湿法上样至聚酰胺树脂层析柱，依次用蒸馏水、体积分数为20％、40％、90％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，经色谱检测，收集含有目标化合物的洗脱液，浓缩冻干得到粗提取物；所述聚酰胺树脂层析柱的柱体积BV₂为1L；所述蒸馏水、所述体积分数为20％乙醇、所述40％乙醇的用量均为5倍BV₂、所述90％乙醇的用量为2倍BV₂；所述梯度洗脱过程中，每500mL为一个收集单位，并顺次编号，收集第5-18号洗脱液；

D.将所述粗提取物用第一溶剂溶解后进样，使用高效液相色谱仪、C18HCE色谱柱进行DAC制备，用甲醇水溶液作为流动相进行等度洗脱，收集含有所述目标化合物的流份段，浓缩冻干得到粗分离物；所述C18HCE色谱柱规格为：100A，50mm×250mm，10μm；所述甲醇水溶液的体积分数为50％；所述第一溶剂为体积比1:1的甲醇和二甲基亚砜；

E.将所述预分离物用第二溶剂溶解后进样，使用高效液相色谱仪、第一C18ME色谱柱进行半制备，用体积分数为19％的乙腈水溶液作为流动相，进行等度洗脱，收集含有所述目标化合物的流份段，浓缩冻干得到所述目标化合物；所述第一C18ME色谱柱规格为：100A，20×250mm，10μm；所述第二溶剂为体积分数19％的乙腈水溶液；所述目标化合物的结构式为：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B中，所述大孔树脂层析柱的制备方法为：先用乙醇浸泡D101大孔树脂，然后装柱，依次用乙醇、水冲洗至无乙醇味。