CN108440612A - 一种玄参中三种环烯醚萜类成分的分离纯化方法 - Google Patents

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms

Abstract

本发明属于玄参环烯醚萜类化合物分离纯化技术领域，公开了一种玄参中三种环烯醚萜类成分的分离纯化方法，包括：称取玄参药材10kg，加入15倍量纯化水，调节pH值3.5；粗分离，在温度60℃回流提取2h，过滤收集滤液，滤渣按照以上方法同法提取滤液，合并两次收集的滤液，旋转蒸发仪上蒸发得浸膏，浸膏得率约为31.5％；高速逆流色谱纯化。本发明具有分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂等特点，已经广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。

Description

一种玄参中三种环烯醚萜类成分的分离纯化方法
技术领域
本发明属于玄参环烯醚萜类化合物分离纯化技术领域，尤其涉及一种玄参中三种环烯醚萜类成分的分离纯化方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：玄参为玄参科植物玄参的干燥根，中医认为玄参味甘、苦、咸，其性微寒，具有滋阴凉血、泻火解毒等功效，一般用于热病烦躁，发斑、夜寐不宁，自汗盗汗，喉咙肿痛等症，为临床常用中药。现代医学表明，玄参中含有苷类、生物碱等成份，具有抗炎、抗肿瘤、保肝作用。现有技术一般采用普通色谱柱法、重结晶等传统的分离方法分离植物中的有效单体，不仅费时费力、污染环境，且所用固定相对样品有不可逆性吸附作用。
综上所述，现有技术存在的问题是：普通色谱柱法、重结晶等传统的分离方法分离植物中的有效单体，不仅费时费力、污染环境，且所用固定相对样品有不可逆性吸附作用。
解决上述技术问题的难度和意义：样品经过大孔吸附树脂粗分离后，样品中的大部分杂质被除去，样品纯度得到提高，紧接着再经过硅胶柱层析后，样品中的其它成分基本上被去除，只有极少数成分没有被分离，最后经过高速逆流色谱仪分离纯化后，样品纯度达到98％以上。在高速逆流色谱仪分离纯化前先经过大孔吸附树脂和硅胶柱层析去除大部分杂质，提高样品经过高速逆流色谱仪纯化后的纯度，同时高速逆流色谱仪分离成份分离峰较窄，利于收集样品。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种玄参中三种环烯醚萜类成分的分离纯化方法。
本发明是这样实现的，一种玄参中三种环烯醚萜类成分的分离纯化方法，包括以下步骤：
步骤一，称取玄参药材10kg，加入15倍量纯化水，调节pH值3.5；
步骤二，粗分离，在温度60℃回流提取2h，过滤收集滤液，滤渣按照以上方法同法提取滤液，合并两次收集的滤液，旋转蒸发仪上蒸发得浸膏，浸膏得率约为31.5％；
步骤三，大孔吸附树脂层析，取玄参的提取浸膏1.8kg，以流速为5-10mL/min湿法上样已处理的大孔树脂上，水洗液后、5倍大孔吸附树脂的30％乙醇、4倍大孔吸附树脂的60％乙醇洗脱，得30％乙醇浸膏为380g、60％乙醇浸膏为173g；
步骤四，硅胶柱层析，30％乙醇洗脱浸膏，以乙酸乙酯-甲醇50:1-2:1梯度洗脱；60％乙醇洗脱浸膏，氯仿-甲醇25:1-10:1梯度洗脱；
步骤五，高速逆流色谱纯化。
进一步，所述高速逆流色谱纯化中得到哈巴俄苷的方法为：氯仿-正丁醇-甲醇-水(4:1:3:2)按比例混合后静置过夜，分层，取上层作为高速逆流色谱仪的固定相注入高速逆流色谱仪，待固定相充满高速逆流色谱仪的线圈后，再将下层作为流动相注入高速逆流色谱仪，待流动相从管柱出口流出，达到平衡时，将10mL硅胶柱层析得到的哈巴俄苷样品溶液(200mg/mL)注入高速逆流色谱仪，流速为2mL/min，检测波长为278nm，洗脱液每隔2分钟收集到试管中，进样分离样品后，停止主机转动，用氮气将固定相推出，测固定相的保留率(SR)通过HPLC对各个组分进行分析，得到哈巴俄苷139mg，纯度可达99.1％。
进一步，所述高速逆流色谱纯化中得到桃叶珊瑚苷的方法为：氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(4:2:2.5:2)按比例混合后静置过夜，分层，取上层作为高速逆流色谱仪的固定相注入高速逆流色谱仪，待固定相充满高速逆流色谱仪的线圈后，再将下层作为流动相注入高速逆流色谱仪，待流动相从管柱出口流出，达到平衡时，将10mL硅胶柱层析得到桃叶珊瑚苷溶液(200mg/mL)注入高速逆流色谱仪，流速为2mL/min，检测波长为210nm，洗脱液每隔2分钟收集到试管中，进样分离样品后，停止主机转动，用氮气将固定相推出，测固定相的保留率(SR)通过HPLC对各个组分进行分析，得到桃叶珊瑚苷132mg，纯度可达98.7％。
进一步，所述高速逆流色谱纯化中得到哈巴苷的方法为：氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(4:1:2:2)按比例混合后静置过夜，分层，取上层作为高速逆流色谱仪的固定相注入高速逆流色谱仪，待固定相充满高速逆流色谱仪的线圈后，再将下层作为流动相注入高速逆流色谱仪，待流动相从管柱出口流出，达到平衡时，将10mL硅胶柱层析得到哈巴苷溶液(200mg/mL)注入高速逆流色谱仪，流速为2mL/min，检测波长为210nm，洗脱液每隔2分钟收集到试管中，进样分离样品后，停止主机转动，用氮气将固定相推出，测固定相的保留率(SR)通过HPLC对各个组分进行分析,得到哈巴苷128mg，纯度可达98.1％。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：现有高速逆流色谱高速逆流色谱是一种连续的无需固体支撑物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，具有分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂等特点，已经广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：将玄参药材中主要成分哈巴俄苷、桃叶珊瑚苷和哈巴苷分离纯化出来，得到纯度非常高的纯化样品；酶解提取液先经过大孔树脂富集分离得到粗品，再经过硅胶柱层析得到纯度较高的样品，最后经过高速逆流色谱分离得到纯度非常高的样品，与现有报道的玄参药材粉碎、乙醇提取液经大孔吸附树脂富集得到样品粗提物，粗提物再进行高速逆流色谱分离得到不同的粗品，各个粗品再分别通过中低压制备色谱或结合制备液相色谱制得纯度较高的样品，具有分离纯化制备量大，节约溶剂，降低成本(因为硅胶柱层析纯化成本远低于高效液相色谱纯化的成本，且制备量远大于高效液相色谱)。
附图说明
图1是本发明实施例提供的玄参中三种环烯醚萜类成分的分离纯化方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
S101:称取玄参药材10kg，加入15倍量纯化水，调节pH值3.5；
S102:粗分离，在温度60℃回流提取2h，过滤收集滤液，滤渣按照以上方法同法提取滤液，合并两次收集的滤液，旋转蒸发仪上蒸发得浸膏，浸膏得率约为31.5％；
S103，大孔吸附树脂层析，取玄参的提取浸膏1.8kg，以流速为5-10mL/min湿法上样的大孔树脂上，水洗液后、5倍大孔吸附树脂的30％乙醇、4倍大孔吸附树脂的60％乙醇洗脱，得30％乙醇浸膏为380g、60％乙醇浸膏为173g；
S104，硅胶柱层析，30％乙醇洗脱浸膏，以乙酸乙酯-甲醇(50：1-2:1)梯度洗脱；60％乙醇洗脱浸膏，氯仿-甲醇(25：1-10:1)梯度洗脱；
S105:高速逆流色谱纯化。
本发明实施例提供的高速逆流色谱纯化中得到哈巴俄苷的方法为：氯仿-正丁醇-甲醇-水(4:1:3:2)按比例混合后静置过夜，分层，取上层作为高速逆流色谱仪的固定相注入高速逆流色谱仪，待固定相充满高速逆流色谱仪的线圈后，再将下层作为流动相注入高速逆流色谱仪，待流动相从管柱出口流出，达到平衡时，将10mL硅胶柱层析得到的哈巴俄苷样品溶液(200mg/mL)注入高速逆流色谱仪，流速为2mL/min，检测波长为278nm，洗脱液每隔2分钟收集到试管中，进样分离样品后，停止主机转动，用氮气将固定相推出，测固定相的保留率(SR)通过HPLC对各个组分进行分析，得到哈巴俄苷139mg，纯度可达99.1％。
本发明实施例提供的高速逆流色谱纯化中得到桃叶珊瑚苷的方法为：氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(4:2:2.5:2)按比例混合后静置过夜，分层，取上层作为高速逆流色谱仪的固定相注入高速逆流色谱仪，待固定相充满高速逆流色谱仪的线圈后，再将下层作为流动相注入高速逆流色谱仪，待流动相从管柱出口流出，达到平衡时，将10mL硅胶柱层析得到桃叶珊瑚苷溶液(200mg/mL)注入高速逆流色谱仪，流速为2mL/min，检测波长为210nm，洗脱液每隔2分钟收集到试管中，进样分离样品后，停止主机转动，用氮气将固定相推出，测固定相的保留率(SR)通过HPLC对各个组分进行分析，得到桃叶珊瑚苷132mg，纯度可达98.7％。
本发明实施例提供的高速逆流色谱纯化中得到哈巴苷的方法为：氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(4:1:2:2)按比例混合后静置过夜，分层，取上层作为高速逆流色谱仪的固定相注入高速逆流色谱仪，待固定相充满高速逆流色谱仪的线圈后，再将下层作为流动相注入高速逆流色谱仪，待流动相从管柱出口流出，达到平衡时，将10mL硅胶柱层析得到哈巴苷溶液(200mg/mL)注入高速逆流色谱仪，流速为2mL/min，检测波长为210nm，洗脱液每隔2分钟收集到试管中，进样分离样品后，停止主机转动，用氮气将固定相推出，测固定相的保留率(SR)通过HPLC对各个组分进行分析,得到哈巴苷128mg，纯度可达98.1％。
下面结合实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
实施例1
料液比：分别为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30；实验结果表明，随着料液比的增大，环烯醚萜类成分的提取率也逐渐增加，当料液比达到1:20时，提取率达到最高值，料液比继续增加，提取率呈现下降趋势。可能是因为，随着料液比的增加，溶液与玄参粉末的接触面积变大，这有利于酶解反应的进行；但是当料液比过大时，会降低反应体系中纤维素酶的浓度，以及纤维素酶的催化活性[9]，从而使环烯醚萜类成分的提取率降低。因此将料液比1:20作为中心水平，进行后续的正交试验优化。
实施例2
溶液pH：分别为3、3.5、4、4.5、5。实验结果表明，pH 3～3.5之间时，环烯醚萜类成分的提取率逐渐增加，并在pH 3.5时达到最大值；当pH超过3.5的时候，提取率明显下降。这是因为pH是影响酶解效率的一个重要因素，当纤维素酶处于适宜的pH时，酶活力最高，酶解反应的效率最高，当pH超过3.5的时候，酶活力减小，酶解效率也逐渐降低。因此将溶剂pH3.5作为中心水平，进行后续的正交试验优化。
实施例3
提取时间：选择提取时间分别为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h。实验结果表明，提取时间在0.5～2h内，环烯醚萜类成分的提取率处于逐渐上升的趋势，这是因为提取的初始阶段，酶浓度较高，酶活力较大，能够快速的使玄参的细胞壁酶解，环烯醚萜类成分溶出，从而使提取率逐渐增加；但是当提取时间大于2h时，环烯醚萜类成分的提取率开始逐步下降。因此将提取时间2h作为中心水平，进行后续的正交试验优化。
实施例4
提取温度：分别为45℃、50℃、55℃、60℃、65℃。实验结果表明，当提取温度小于60℃时，环烯醚萜类成分的提取率随着提取温度的升高而增加，并在60℃时达到最大值，当提取温度小于60℃时，提取率随着提取温度的升高而减少。这是因为在酶解反应中，温度对于酶解效率的影响在于酶反应速率和酶活力两方面。在60℃以下，随着温度的升高，酶反应速率加快，酶活力增强，提取率逐渐增加；当温度高于60℃时，酶反应速率减慢，酶活力减弱，导致提取率逐渐降低。因此将提取温度60℃作为中心水平，进行后续的正交试验优化。
根据以上结果，最终将纤维素酶酶解法提取玄参中环烯醚萜类成分的提取条件确定为料液比1:15，溶剂pH 3.5，提取时间2h，提取温度60℃
实施例5
大孔树脂经活化处理后，取6kg大孔树脂于玻璃分离柱(15cm X 150cm)中，待用。取玄参的浸膏1.8kg，溶于水中(上样药液比≤5％，分10次上样(湿法上样)，以流速为5-10mL/min上样于已处理大孔树脂上，收集2倍量大孔吸附树脂量的水洗液后，再依次用5倍大孔吸附树脂的30％乙醇洗脱，4倍大孔吸附树脂的60％乙醇洗脱，分别收集不同浓度乙醇洗脱液，减压浓缩洗脱液，回收乙醇，得30％乙醇浸膏为380g、60％乙醇浸膏为173g。
实施例6
纯化
柱层析
用柱层析硅胶(100-200)目装柱，取30％乙醇浸膏173g按试样-吸附剂(1：50)上样，以乙酸乙酯-甲醇(50：1-10：1)梯度洗脱，配合薄层检测(乙酸乙醋：无水乙醇：水(4：1：0.8)作为展开剂，展开后，瞭干，喷香草酸浓硫酸试剂显色剂，于105℃加热显色5min，收集相同流分，合并组分。组分经反复硅胶柱层析，显示有桃叶珊瑚苷和哈巴苷标准品相近似Rf值的组分先以乙酸乙酯-甲醇(25:1)洗脱，再以乙酸乙酯-甲醇(15:1)洗脱，以乙酸乙酸-甲醇(5:1)洗脱，每一流分为300mL，收集其中薄层检测值具有与桃叶珊瑚苷相同Rf值的单一斑点流分，浓缩，放冷即析出无色针状结晶，得到化合物桃叶珊瑚苷，纯度可达92.7％。组分最后以乙酸乙酯-甲醇(3:1-2:1洗脱，每一流分为300mL，收集其中薄层检测值与哈巴苷相同Rf值的单一斑点流分，Sephadex LH-20柱纯化，以甲醇水系统洗脱，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用甲醇冲柱，回收溶剂至干，适量甲醇溶解过滤，放置后得淡黄色粉末，即得到化合物哈巴苷，纯度可达93.2％。
用柱层析硅胶(100-200目)装柱，取60％乙醇浸膏按试样-吸附剂上样，以氯仿-甲醇(25:1-10:1)梯度洗脱，配合薄层检测(乙酸乙酯：无水乙醇：水(4:1:0.4)作为展开剂，展开后，晾干，喷的香草醛浓硫酸试剂的显色剂，于105℃加热显色，收集相同流分，合并组分。组分以乙酸乙酯-甲醇(25:1)洗脱，再以乙酸乙酯-甲醇(10:1)洗脱，每一流分为300mL，收集其中薄层检测值与哈巴俄苷相同的单一斑点流分，回收溶剂至干，适量甲醇溶解过滤，放置后得哈巴俄苷，纯度可达89.2％。
高速逆流色谱纯化
氯仿-正丁醇-甲醇-水(4:1:3:2)按比例混合后静置过夜，分层，取上层作为高速逆流色谱仪的固定相注入高速逆流色谱仪，待固定相充满高速逆流色谱仪的线圈后，再将下层作为流动相注入高速逆流色谱仪，待流动相从管柱出口流出，达到平衡时，将10mL硅胶柱层析得到的哈巴俄苷样品溶液(200mg/mL)注入高速逆流色谱仪，流速为2mL/min，检测波长为278nm，洗脱液每隔2分钟收集到试管中，进样分离样品后，停止主机转动，用氮气将固定相推出，测固定相的保留率(SR)通过HPLC对各个组分进行分析。得到哈巴俄苷139mg，纯度可达99.1％。
氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(4:2:2.5:2)按比例混合后静置过夜，分层，取上层作为高速逆流色谱仪的固定相注入高速逆流色谱仪，待固定相充满高速逆流色谱仪的线圈后，再将下层作为流动相注入高速逆流色谱仪，待流动相从管柱出口流出，达到平衡时，将10mL硅胶柱层析得到桃叶珊瑚苷溶液(200mg/mL)注入高速逆流色谱仪，流速为2mL/min，检测波长为210nm，洗脱液每隔2分钟收集到试管中，进样分离样品后，停止主机转动，用氮气将固定相推出，测固定相的保留率(SR)通过HPLC对各个组分进行分析。得到桃叶珊瑚苷132mg，纯度可达97.7(改为98.7)％。
氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(4:1:2:2)按比例混合后静置过夜，分层，取上层作为高速逆流色谱仪的固定相注入高速逆流色谱仪，待固定相充满高速逆流色谱仪的线圈后，再将下层作为流动相注入高速逆流色谱仪，待流动相从管柱出口流出，达到平衡时，将10mL硅胶柱层析得到哈巴苷溶液(200mg/mL)注入高速逆流色谱仪，流速为2mL/min，检测波长为210nm，洗脱液每隔2分钟收集到试管中，进样分离样品后，停止主机转动，用氮气将固定相推出，测固定相的保留率(SR)通过HPLC对各个组分进行分析。得到哈巴苷128mg，纯度可达95.1(改为98.1)％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种玄参中三种环烯醚萜类成分的分离纯化方法，其特征在于，所述的玄参中三种环烯醚萜类成分的分离纯化方法包括以下步骤：
步骤一，称取玄参药材10kg，加入15倍量纯化水，调节pH值3.5；
步骤二，粗分离，在温度60℃回流提取2h，过滤收集滤液，滤渣按照以上方法同法提取滤液，合并两次收集的滤液，旋转蒸发仪上蒸发得浸膏，浸膏得率约为31.5％；
步骤三，大孔吸附树脂层析，取玄参的提取浸膏1.8kg，以流速为5-10mL/min湿法上样已处理的大孔树脂上，水洗液后、5倍大孔吸附树脂的30％乙醇、4倍大孔吸附树脂的60％乙醇洗脱，得30％乙醇浸膏为380g、60％乙醇浸膏为173g；
步骤四，硅胶柱层析，30％乙醇洗脱浸膏，以乙酸乙酯-甲醇50：1-2:1梯度洗脱；60％乙醇洗脱浸膏，氯仿-甲醇25：1-10:1梯度洗脱；
步骤五，高速逆流色谱纯化。
2.一种由权利要求1所述玄参中三种环烯醚萜类成分的分离纯化方法分离的哈巴俄苷、桃叶珊瑚苷、哈巴苷。
3.一种如权利要求2所述玄参中哈巴俄苷的分离纯化方法，其特征在于，所述玄参中哈巴俄苷的分离纯化方法包括：
步骤一，称取玄参药材10kg，加入15倍量纯化水，调节pH值3.5；
步骤二，粗分离，在温度60℃回流提取2h，过滤收集滤液，滤渣按照以上方法同法提取滤液，合并两次收集的滤液，旋转蒸发仪上蒸发得浸膏，浸膏得率约为31.5％；
步骤三，大孔吸附树脂层析，取玄参的提取浸膏1.8kg，以流速为5-10mL/min湿法上样已处理的大孔树脂上，水洗液后、5倍大孔吸附树脂的30％乙醇、4倍大孔吸附树脂的60％乙醇洗脱，得30％乙醇浸膏为380g、60％乙醇浸膏为173g；
步骤四，硅胶柱层析，30％乙醇洗脱浸膏，以乙酸乙酯-甲醇50：1-2:1梯度洗脱；60％乙醇洗脱浸膏，氯仿-甲醇25：1-10:1梯度洗脱；
步骤五，高速逆流色谱纯化；氯仿-正丁醇-甲醇-水＝4:1:3:2按比例混合后静置过夜，分层，取上层作为高速逆流色谱仪的固定相注入高速逆流色谱仪，待固定相充满高速逆流色谱仪的线圈后，再将下层作为流动相注入高速逆流色谱仪，待流动相从管柱出口流出，达到平衡时，将10mL硅胶柱层析得到的哈巴俄苷样品溶液200mg/mL注入高速逆流色谱仪，流速为2mL/min，检测波长为278nm，洗脱液每隔2分钟收集到试管中，进样分离样品后，停止主机转动，用氮气将固定相推出，测固定相的保留率通过HPLC对各个组分进行分析。
4.一种如权利要求2所述玄参中桃叶珊瑚苷的分离纯化方法，其特征在于，所述玄参中桃叶珊瑚苷的分离纯化方法包括：
步骤一，称取玄参药材10kg，加入15倍量纯化水，调节pH值3.5；
步骤二，粗分离，在温度60℃回流提取2h，过滤收集滤液，滤渣按照以上方法同法提取滤液，合并两次收集的滤液，旋转蒸发仪上蒸发得浸膏，浸膏得率约为31.5％；
步骤三，大孔吸附树脂层析，取玄参的提取浸膏1.8kg，以流速为5-10mL/min湿法上样已处理的大孔树脂上，水洗液后、5倍大孔吸附树脂的30％乙醇、4倍大孔吸附树脂的60％乙醇洗脱，得30％乙醇浸膏为380g、60％乙醇浸膏为173g；
步骤四，硅胶柱层析，30％乙醇洗脱浸膏，以乙酸乙酯-甲醇50：1-2:1梯度洗脱；60％乙醇洗脱浸膏，氯仿-甲醇25：1-10:1梯度洗脱；
步骤五，高速逆流色谱纯化；氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水＝4:2:2.5:2按比例混合后静置过夜，分层，取上层作为高速逆流色谱仪的固定相注入高速逆流色谱仪，待固定相充满高速逆流色谱仪的线圈后，再将下层作为流动相注入高速逆流色谱仪，待流动相从管柱出口流出，达到平衡时，将10mL硅胶柱层析得到桃叶珊瑚苷溶液200mg/mL注入高速逆流色谱仪，流速为2mL/min，检测波长为210nm，洗脱液每隔2分钟收集到试管中，进样分离样品后，停止主机转动，用氮气将固定相推出，测固定相的保留率通过HPLC对各个组分进行分析。
5.一种如权利要求2所述玄参中哈巴苷的分离纯化方法，其特征在于，所述玄参中哈巴苷的分离纯化方法包括：
步骤一，称取玄参药材10kg，加入15倍量纯化水，调节pH值3.5；
步骤二，粗分离，在温度60℃回流提取2h，过滤收集滤液，滤渣按照以上方法同法提取滤液，合并两次收集的滤液，旋转蒸发仪上蒸发得浸膏，浸膏得率约为31.5％；
步骤三，大孔吸附树脂层析，取玄参的提取浸膏1.8kg，以流速为5-10mL/min湿法上样已处理的大孔树脂上，水洗液后、5倍大孔吸附树脂的30％乙醇、4倍大孔吸附树脂的60％乙醇洗脱，得30％乙醇浸膏为380g、60％乙醇浸膏为173g；
步骤四，硅胶柱层析，30％乙醇洗脱浸膏，以乙酸乙酯-甲醇50：1-2:1梯度洗脱；60％乙醇洗脱浸膏，氯仿-甲醇25：1-10:1梯度洗脱；
步骤五，高速逆流色谱纯化；氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水＝4:1:2:2按比例混合后静置过夜，分层，取上层作为高速逆流色谱仪的固定相注入高速逆流色谱仪，待固定相充满高速逆流色谱仪的线圈后，再将下层作为流动相注入高速逆流色谱仪，待流动相从管柱出口流出，达到平衡时，将10mL硅胶柱层析得到哈巴苷溶液200mg/mL注入高速逆流色谱仪，流速为2mL/min，检测波长为210nm，洗脱液每隔2分钟收集到试管中，进样分离样品后，停止主机转动，用氮气将固定相推出，测固定相的保留率通过HPLC对各个组分进行分析。
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