CN105820213B - 高效分离纯化纽莫康定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为高效分离纯化纽莫康定（Pnemocandin）的方法，解决已有分离纯化纽莫康定的方法回收率较低，难以回收利用洗脱溶剂，不能同时分离多种近似杂质,分离过程中产品的稳定性差的问题。其步骤为将经大孔吸附树脂洗脱分离得到包含纽莫康定A0、B0和C0三种组分的粗品用乙醇溶解，硅胶作为填料进行柱层析分离，洗脱剂选用低沸点中等极性溶剂、高沸点醇和水组成的三元溶剂体系，洗脱液经浓缩、重结晶而得到高纯度纽莫康定B0。由本发明方法制备的纽莫康定B0纯度极高、更高效地一步分离A0、B0和C0组分，方法操作简单、洗脱剂易回收，利于工业化应用。
Description
技术领域：
本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种高效分离纯化纽莫康定的方法。
背景技术：
纽莫康定是由Glarea lozoyensis产生的次级代谢产物，Glarea lozoyensis在发酵时除了会产生纽莫康定B0以外还会产生结构类似物A0以及同分异构体C0。
中国发明专利 200910133118.0公开了制备纽莫康定 B0的方法，首先过酸性氧化铝柱，然后上HP20吸附树脂，接下来用反相树脂 YPR-Ⅱ洗脱得到纽莫康定B0纯度大于90%，最后重结晶得到纯度可达到96%的成品。该方法没有对同分异构体C0进行检测和纯度控制，而一般发酵液中的C0杂质含量在10%左右，该方法得到的是B0和C0的混合物，在下一步的合成反应中将严重影响卡泊芬净的质量。
中国专利 201410051009.5公开了一种高效制备纽莫康定B0的方法，将含有纽莫康定B0的发酵液酸化过滤，浸提；浸提液浓缩后加入硅藻土裹晶；离心固体用乙醇溶解，加入活性炭脱色过滤；滤液浓缩，加入氯仿过硅胶柱，收集纽莫康定B0的过柱液；纽莫康定B0的过柱液浓缩至干，在多相溶剂体系下结晶，得到纽莫康定B0。该方法虽对C0杂质进行了检测和纯度控制，但它的回收率较低，操作复杂，不利于工业生产应用。
中国发明专利 201410711185.7公开了一种采用动态轴向压缩柱制备高纯度纽莫康定B0的方法，纽莫康定粗品浓缩干燥后，加入氯仿和甲醇混合物溶解，上样，氯仿、甲醇和水混合液洗脱，紫外检测峰值最大时收集洗脱液，得目标组分，浓缩干燥即得纽莫康定 B0。该方法虽采用了动态轴向压缩柱来代替传统的硅胶柱，但过程中的固液分离仍采用传统离心和旋转蒸发，分离过程效率低，洗脱剂难以回收利用。
纽莫康定结构式如下：
现有技术在制备过程中采用吸附树脂或活性炭来除杂纯化得到粗品后，主要通过硅胶层析柱将对纽莫康定B0 结构类型物进行分离，但已报道的系统都很难将纽莫康定B0和C0很好分离，且洗脱系统洗脱剂很难回收利用；现有技术没有包含杂质纽莫康定A0的去除，需增加相应分离步骤，造成提取收率的进一步降低。因此高效分离纽莫康定A0、B0和C0，提高回收率，以及回收利用洗脱溶剂，降低成本，对纽莫康定B0的工业化生产有着很重要的意义。采用201410051009.5、201410711185.7专利能够初步实现纽莫康定B0和C0的分离，但存在以下问题：1）发酵粗品中的纽莫康定A0不能得到有效分离；2）在浓缩和结晶过程中，由于纽莫康定在中性或碱性下会在发生开环降解，在生产过程中会发生一定程度的降解；3）使用的溶剂体系对溶剂比例要求严格，比例稍有偏差分离度会明显降低，尤其不能加入影响极性的酸保护剂。
发明内容：
本发明的目的是提供一种应用于工业生产，纽莫康定A0能得到有效分离，回收率高，操作简单、洗脱剂易回收的高效分离纯化纽莫康定的方法。
为实现本发明目的，采用的技术方案为：
高效分离纯化纽莫康定A0、B0和C0的方法，包括以下步骤：
a.溶解：将含有纽莫康定B0的纽莫康定粗品用乙醇充分溶解，溶解时固液比为 1:12～14，g:ml，过滤后得粗品溶液；
b.上柱:采用层析柱分离纯化，层析柱填料选用150～400目硅胶，采用湿法装柱，用乙酸乙酯逐渐将柱子装实后加入粗品溶液；
c.层析:采用上述硅胶柱层析，流速控制在0.5～2.5BV/h，洗脱剂采用低沸点中等极性溶剂、高沸点醇和水组成的三元溶剂体系，三者体积比为(3～8):（3～7）:(1～5)；
d.浓缩及重结晶:将分段收集到的含纽莫康定B0洗脱液减压浓缩，正丙醇中重结晶得到纯品。
所述a步骤溶解过程中，采用超声波进行溶解。
所述c步骤层析过程中，三元溶剂洗脱剂体系中高沸点醇为正丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇、仲戊醇、正己醇中一种。
所述c步骤层析过程中，三元溶剂洗脱剂体系中低沸点中等极性溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醚和丙酮中之一种，低沸点中等极性溶剂与高沸点醇的沸点相差15℃以上。
所述c步骤层析过程中，三元溶剂体系中低沸点中等极性溶剂、高沸点醇和水的体积比为(3～8):（3～6）:(1～4)，或者为(3～5):（3～5）:(2～4)。
所述c步骤层析过程中，在所述三元溶剂体系中添加有机酸，该有机酸在三元溶剂体系中的体积浓度为0.1～0.3％；所述有机酸选自甲酸、乙酸、丙酸、丁酸中之一种。
本发明通过洗脱剂采用低沸点中等极性溶剂、高沸点醇和水组成的三元溶剂体系，三者体积比为(3～8):（3～7）:(1～5)，意外的实现了纽莫康定A0、B0和C0的同时分离，通过硅胶柱层析制备出高纯度纽莫康定B0。
相比于现有纽莫康定分离纯化技术，本发明通过用乙醇溶解纽莫康定进行湿法上样，对于其他的干法上样来说，简化实验操作。本发明的三元溶剂体系洗脱剂相能更好分离纽莫康定A0、B0和C0，大大提高收率，且低沸点中等极性溶剂、高沸点醇和水组成的三元溶剂体系通过物理性质差异较易实现溶剂回收利用，从而降低成本和更有利于环保，对纽莫康定 B0的工业化生产有着很重要的意义。
本发明通过在流动相中加入微量的酸，维持了分离过程中产品的稳定性。
具体实施方式：
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下述实施例中未注明的具体技术或条件，均为常规技术或条件，或按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。
实施例 1：
1、称取5.0g纽莫康定粗品（纽莫康定A0、B0和C0含量分别为2.5%、70.6%和8.8%，）采用超声波溶解于 60ml乙醇，用300～400目硅胶作填料，采用湿法装柱，柱体积为500ml，用乙酸乙酯逐渐将柱子装实，用湿法将粗品溶液上样到层析柱，进行层析柱洗脱。
2、以体积比为4：3 ：3 的乙酸乙酯、异丙醇和水作为洗脱剂，洗脱剂为3 倍硅胶体积的用量对层析柱进行洗脱。
3、分段收集洗脱液并进行减压浓缩，浓缩得到目标产物，在正丙醇中重结晶可得到白色纽莫康定纯品B0 2.2g，回收率为62.3%。
4、制得的成品经HPLC检测C0纯度为0.05%，纽莫康定A0纯度为0.1%，碱降解产物0.11%，纽莫康定B0的正相纯度为 99.7%，反相纯度为 99.4%。
5、HPLC 高效液相检测方法为：
①反相检测条件：测定柱：C18柱，4.6mm×250mm×5um，柱温：40℃；采用等洗脱，流动相为乙腈与水溶液，比例为44：56 ；流速为 1.5mL/min ；检测波长：210nm；进样量：10µL。
②正相检测条件:测定住:SiO2柱，4.6mm×250mm×5um；柱温30℃；流动相A为乙酸乙酯（84%），流动相B为甲醇（9%），流动相C为水（7%）；流速为 1.2mL/min ；检测波长 278nm ；进样量 10µL。运行时间30min。
实施例 2：
1、称取5.0g纽莫康定粗品（纽莫康定A0、B0和C0含量分别为2.5%、70.6%和8.8%，）采用超声波溶解于 60ml乙醇，用300～400目硅胶作填料，采用湿法装柱，柱体积为500ml，用乙酸乙酯逐渐将柱子装实，用湿法将粗品溶液上样到层析柱，进行层析柱洗脱。
2、以体积比为4：3 ：2 的乙酸乙酯、正丁醇和水作为洗脱剂，洗脱剂中加入体积0.1%乙酸，洗脱剂为4倍硅胶体积的用量对层析柱进行洗脱。
3、分段收集洗脱液并进行减压浓缩，浓缩得到目标产物，在正丙醇中重结晶可得到白色纽莫康定纯品B0 2.1g，回收率为59.5%。
4、制得的成品经HPLC检测C0纯度为0.02%，纽莫康定A0纯度为0.06%，纽莫康定B0的正相纯度为 99.8%，反相纯度为 99.7%。
实验例（参照中国发明专利 201410711185.7）。
1、称取5.0g纽莫康定粗品（纽莫康定A0、B0和C0含量分别为2.5%、70.6%和8.8%，）采用超声波溶解于 60ml氯仿，用300～400目硅胶作填料，采用湿法装柱，柱体积为500ml，用氯仿：甲醇（3:1）逐渐将柱子装实，用湿法将粗品溶液上样到层析柱，采用氯仿：甲醇（5:1，质量比）预洗。
2、采用氯仿：甲醇（3:1，质量比）作为洗脱剂，洗脱剂为4倍硅胶体积的用量对层析柱进行洗脱。
3、分段收集洗脱液并进行减压浓缩，浓缩得到目标产物，在正丙醇中重结晶可得到白色纽莫康定纯品B0 1.45g，回收率为41.1%。
4、制得的成品经HPLC检测纽莫康定C0纯度为0.16%，纽莫康定A0纯度为1.6%，碱降解产物0.15%，纽莫康定B0的正相纯度为 98.9%，反相纯度为 98.0%。
实施例1、2与实验例相比，收率差距不大，但实施例1由于没有添加有机酸，产品中存在碱降解杂质。实验例中没有实现纽莫康定A0的有效分离，存在纽莫康定B0降解杂质，收率也明显低于本发明。
Claims (7)
1.高效分离纯化纽莫康定的方法，其特征在于包括以下步骤：
a.溶解：将含有纽莫康定B0的纽莫康定粗品用乙醇充分溶解，溶解时固液比为 1:12～14，g:ml，过滤后得粗品溶液；
b.上柱：采用层析柱分离纯化，层析柱填料选用150～400目硅胶，采用湿法装柱，用乙酸乙酯逐渐将柱子装实后加入粗品溶液；
c.层析：采用上述硅胶柱层析，流速控制在0.5～2.5BV/h，洗脱剂采用低沸点中等极性溶剂、高沸点醇和水组成的三元溶剂体系，三者体积比为(3～8):（3～7）:(1～5)；
d.浓缩及重结晶：将分段收集到的含纽莫康定B0洗脱液减压浓缩，正丙醇中重结晶得到纯品。
2.根据权利要求1所述的高效分离纯化纽莫康定的方法，其特征在于所述a步骤溶解过程中，采用超声波进行溶解。
3.根据权利要求1所述的高效分离纯化纽莫康定的方法，其特征在于所述c步骤层析过程中，三元溶剂洗脱剂体系中高沸点醇为正丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇、仲戊醇、正己醇中一种。
4.根据权利要求1或2所述的高效分离纯化纽莫康定的方法，其特征在于所述c步骤层析过程中，三元溶剂洗脱剂体系中低沸点中等极性溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醚和丙酮中之一种，低沸点中等极性溶剂与高沸点醇的沸点相差15℃以上。
5.根据权利要求1所述高效分离纯化纽莫康定的方法，其特征在于所述c步骤层析过程中，三元溶剂体系中低沸点中等极性溶剂、高沸点醇和水的体积比为(3～8):（3～6）:(1～4)。
6.根据权利要求1所述的高效分离纯化纽莫康定的方法，其特征在于所述c步骤层析过程中，三元溶剂体系中低沸点中等极性溶剂、高沸点醇和水的体积比为（3～5）:（3～5）:（2～4）。
7.根据权利要求1所述的高效分离纯化纽莫康定的方法，其特征在于所述c步骤层析过程中，在所述三元溶剂体系中添加有机酸，该有机酸在三元溶剂体系中的体积浓度为0.1～0.3％；所述有机酸选自甲酸、乙酸、丙酸、丁酸中之一种。
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