CN101475621B - 一种用色谱柱纯化氯法拉滨的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用色谱柱纯化氯法拉滨的方法。该方法采用反相大孔吸附树脂为色谱柱填料制备色谱柱，将浓度为0.001～0.025wt％的氯法拉滨粗品水溶液加入色谱柱后，先用纯水洗脱，然后依次用体积比逐渐减小的纯水/有机溶液混合液作为洗脱液进行梯度洗脱，收集纯度合格的洗脱液并浓缩。本发明的纯化方法使氯法拉滨产品纯度达到99.8％以上，收率达到90％以上，操作简单，适合工业规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及的是氯法拉滨的纯化方法，具体地说是一种用色谱柱纯化氯法拉滨的方法。
背景技术
氯法拉滨(Clofarabine)是一种核苷嘌呤类抗癌药，对多种实体瘤均有作用，对急性白血病的治疗尤为有效，为FDA批准的首个专用于儿童白血病的药物。其结构式如下所示：
美国专利申请WO03011877中公布了氯法拉滨的合成方法，即从1，3，5-三-O-苯甲酰基-α-D-呋喃核糖开始，经重排、氟代、溴化后得到1-溴-2-脱氧-2-氟-3，5-二-O-苯甲酰基-α-D-呋喃核糖，再与2-氯腺嘌呤缩合后脱保护合成而得。其中缩合及脱保护反应式如下所示。
上述缩合反应的产物为β构型的产物III和III的α构型异构体的混合物，该混合物脱保护后的产物包括氯法拉滨和其α构型异构体。由于氯法拉滨和其α构型异构体两种物质的理化性质极其接近，常规的纯化方法如重结晶很难将α构型异构体从氯法拉滨中除去。
上述专利公开了通过合成工艺条件控制能将α构型异构体的含量控制在5％左右。但中国专利申请CN101153049中描述，按照WO03011877公开的技术方案操作，α构型异构体的含量实际大于10％，并公开了通过控制反应条件使α构型异构体的含量减小至2％左右的技术方案。作为一种人用药物，氯法拉滨需要一种纯化方法来达到更高纯度。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种用色谱柱纯化氯法拉滨的方法，该方法使氯法拉滨的含量达到99.8％以上，收率达到90％以上。
本发明的技术方案包含以下步骤：
(1)采用反相大孔吸附树脂为色谱柱填料制备色谱柱；
(2)将浓度为0.001～0.025wt％的氯法拉滨粗品水溶液加入上述色谱柱；
(3)先用纯水对步骤(2)中的色谱柱进行洗脱，然后依次用体积比逐渐减小的纯水/有机溶剂混合液作为洗脱液进行梯度洗脱，所述有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮其中一种。
本发明的技术方案中，所述步骤(1)中色谱柱填料为反相大孔吸附树脂，优选的填料型号为MCI-gel CHP20P和MCI-gel CHP20SS。MCI-gel CHP20P(粒径75-150μm)和MCI-gel CHP20SS(粒径63-150μm)为市售日本三菱公司生产的聚苯乙烯型反相大孔吸附树脂填料，广泛应用于植物提取物分离，脱色素等领域。本发明将他们应用于小分子化学药的纯化分离，特别是氯法拉滨的纯化。最优选的反相大孔树脂填料型号为MCI-gel CHP20P。
将反相大孔吸附树脂填料在装柱前在乙醇中浸泡10小时以上，搅拌均匀装入色谱柱，并用纯水洗至流出液无乙醇，流速为6ml/min左右。选用的色谱柱为柱长：直径比为10～20：1的玻璃色谱柱。氯法拉滨水溶性较差，需要大量水溶解，从节约溶剂和时间考虑，优选浓度为0.025wt％的氯法拉滨粗品水溶液上样。上样时小心缓慢将氯法拉滨粗品水溶液沿色谱柱壁倒入，保持色谱柱上表面为水平。上完样后进行梯度洗脱，先用纯水洗脱，然后用纯水/有机溶剂体积比依次为20：1，20：2，20：3，20：4的洗脱液进行洗脱，有机溶剂优选乙醇。梯度洗脱时流速为2～6ml/min，优选6ml/min。随着洗脱液中甲醇、乙醇或丙酮所占比例的增多，洗脱液的极性降低，根据反相色谱的特点，极性较大的氯法拉滨的α构型异构体先流出色谱柱，极性较小的氯法拉滨在色 谱柱中停留的时间加长。
以HPLC监测洗脱液中氯法拉滨含量，HPLC条件如下：色谱柱SupelDiscovery C18(250×4.6mm，5μm)，流动相为以氢氧化钠调pH到5.5的0.05M磷酸二氢钾溶液-乙腈(85：15，V/V)，进样量10μL，检测波长211nm，柱温：20℃，流速：1.0ml/min。收集以面积归一化法计算氯法拉滨含量大于99.8％，单一杂质含量小于0.1％的洗脱液，合并后在旋转蒸发仪上减压浓缩至干，得到氯法拉滨白色固体，浓缩过程中控制压力大小防止暴沸和冲料。
本发明的方法以反相大孔吸附树脂作为色谱柱填料，并以适合的梯度洗脱条件，使氯法拉滨产品纯度达到99.8％以上，收率达到90％以上。操作简单，无毒无污染，无需特殊设备，溶剂可回收，适合工业化生产。
下面结合具体实施方式的实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
制备实施例 氯法拉滨粗品的合成
氮气保护下，将25g 2-氯腺嘌呤，150ml乙腈和250ml叔戊醇加入1L三颈瓶中，搅拌混合均匀。50℃加入13.2g叔丁醇钾和6.8g氢化钠，搅拌0.5小时后，加入1-溴-2-脱氧-2-氟-3，5-二-氧-苯甲酰基-β-D-呋喃核糖113g，室温反应14小时，抽滤。减压浓缩，冷却析晶，抽滤，干燥，得固体55.2g。
将所得固体37.6g，氢氧化锂6.8g，乙腈300ml和水500ml加入到2L三颈瓶中，50℃搅拌8小时。用醋酸调pH至7-8，减压浓缩，残留物冷却析晶，抽滤，滤饼于50℃真空干燥至恒重。所得固体经高效液相色谱检测，所得产品中氯法拉滨含量为89.6％。
纯化实施例1
向2L烧杯内加入600ml MCI-gel CHP20P填料，用1L无水乙醇浸泡10h。搅拌均匀后，湿法装入玻璃色谱柱中，色谱柱直径5cm，柱长100cm。用10L纯化水洗脱至流出液无乙醇，流速控制在6ml/min。所需时间约为4h。把10g待纯化的氯法拉滨粗品加入至4L纯化水中，加热至全部溶解。自然冷却至室温后上样。所需时间约2h。依次用5L纯化水、5L纯化水和250ml乙醇混合液、5L纯化水和500ml乙醇混合液、5L纯化水和750m乙醇混合液、5L纯化水和1L乙醇混合液洗脱，流速控制在6ml/min。收集流出液，HPLC检测纯度。收集氯法拉滨纯度大于99.8％，单一杂质小于0.1％的馏分，合并后旋转蒸发仪上减压蒸至有大量白色固体析出时，停止旋蒸。过滤得产品。收率91.2％。
纯化实施例2
向2L烧杯内加入600ml MCI-gel CHP20P反向填料，用1L无水乙醇浸泡15h。搅拌均匀后，湿法装入玻璃色谱柱中，色谱柱直径5cm，柱长50cm。用10L纯化水洗脱至流出液无乙醇，流速控制在6ml/min。把5g待纯化的氯法拉滨粗品加入至4L纯化水中，加热至全部溶解。自然冷却至室温后上样。所需时间约2h。依次用5L纯化水、5L纯化水和250ml甲醇混合液、5L纯化水和500ml甲醇混合液、5L纯化水和750m甲醇混合液、5L纯化水和1L甲醇混合液洗脱，流速控制在2ml/min。收集流出液，HPLC检测纯度。收集氯法拉滨纯度大于99.8％，单一杂质小于0.1％的馏分，合并后于旋转蒸发仪上减压浓缩至干，得白色固体。收率90.6％。
纯化实施例3
向2L烧杯内加入600ml MCI-gel CHP20SS反向填料，用1L无水乙醇浸泡15h。搅拌均匀后，湿法装入玻璃色谱柱中，色谱柱直径5cm，柱长50cm。用10L纯化水洗脱至流出液无乙醇，流速控制在6ml/min。把2.5g待纯化的氯法拉滨粗品加入至4L纯化水中，加热至全部溶解。自然冷却至室温后上样。所需时间约2h。依次用5L纯化水、5L纯化水和250ml丙酮混合液、5L纯化水和500ml丙酮混合液、5L纯化水和750m丙酮混合液、5L纯化水和1L丙酮混合液洗脱，流速控制在4ml/min。收集流出液，HPLC检测纯度。收集氯法拉滨纯度大于99.8％，单一杂质小于0.1％的馏分，合并后于旋转蒸发仪上减压浓缩至干，得白色固体。收率90.1％。
Claims (9)
1.一种用色谱柱纯化氯法拉滨的方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)采用反相大孔吸附树脂为色谱柱填料制备色谱柱，所述反相大孔吸附树脂型号为MCI-gel CHP20P或MCI-gel CHP20SS其中一种；
(2)将浓度为0.001～0.025wt％的氯法拉滨粗品水溶液加入上述色谱柱；
(3)先用纯水对步骤(2)中的色谱柱进行洗脱，然后依次用体积比逐渐减小的纯水/有机溶剂混合液作为洗脱液进行梯度洗脱，所述有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮其中一种。
2.根据权利要求1所述的一种用色谱柱纯化氯法拉滨的方法，其特征在于，所述反相大孔吸附树脂型号为MCI-gel CHP20P。
3.根据权利要求1所述的一种用色谱柱纯化氯法拉滨的方法，其特征在于，所述色谱柱的柱长∶直径比为10～20∶1的玻璃色谱柱。
4.根据权利要求1所述的一种用色谱柱纯化氯法拉滨的方法，其特征在于，所述步骤(1)中MCI-gel CHP20P填料在装柱前经过在乙醇中浸泡10小时以上预处理，装入色谱柱后用纯水洗去乙醇。
5.根据权利要求1所述的一种用色谱柱纯化氯法拉滨的方法，其特征在于，所述步骤(2)中氯法拉滨粗品水溶液的浓度为0.025wt％。
6.根据权利要求1所述的一种用色谱柱纯化氯法拉滨的方法，其特征在于，所述步骤(3)中梯度洗脱的纯水/有机溶剂洗脱液体积比依次为20∶1，20∶2，20∶3，20∶4。
7.根据权利要求1或6所述的一种用色谱柱纯化氯法拉滨的方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述有机溶剂为乙醇。
8.根据权利要求1或6所述的一种用色谱柱纯化氯法拉滨的方法，其特征在于，所述步骤(3)中梯度洗脱时流速为2～6ml/min。
9.根据权利要求1所述的一种用色谱柱纯化氯法拉滨的方法，其特征在于，还进一步包括分段收集梯度洗脱时氯法拉滨纯度大于99.8％的洗脱液进行浓缩。
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