CN108948123B - 羟基积雪草酸类化合物的分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种羟基积雪草酸类化合物的分离方法。该分离方法通过采用超临界流体色谱仪进行分离，色谱柱采用纤维素手性柱。该方法分离效果良好，分离得到的产品纯度高，分离速度快，同时色谱柱使用寿命长，溶剂价格低廉且无污染，并可回收再利用，大大提高了分离效率和降低了生产成本。

Description

羟基积雪草酸类化合物的分离方法
技术领域
本发明涉及羟基积雪草酸类化合物的分离方法。
背景技术
羟基积雪草酸(如式1所示)与积雪草酸B(如式2所示)为羟基积雪草酸类化合物，二者为同分异构体，分子式均为C30H48O6(分子量为504)，其化学结构式如下所示：
Figure BDA0001297034840000011
羟基积雪草酸作为五环三萜类化合物，主要以糖苷或游离苷元形态存在于伞形科植物积雪草(Centellaasiatica)中，具有促进伤口愈合、抑制疤痕增生等作用。近年陆续有抗肿瘤、抗纤维化等研究报道及相关专利申请，如题为“一种羟基积雪草酸盐及其制备方法和用途”的中国专利申请CN201410046878.9中记载了羟基积雪草酸是其糖苷在胃肠道内的活性代谢形式，因此，用药时其生物利用度更优。然而，天然来源的羟基积雪草酸，多与一同分异构体积雪草酸B同时存在，二者的差异仅在C-19及C-20上甲基取代基的位置不同。由于二者理化性质极为相似，一般分离条件难以实现其有效分离。本研究小组以高效液相色谱法，采用反相C18色谱柱并在流动相中添加β-环糊精的方法，可基本实现分离，但因流动相中加入β-环糊精，不仅影响色谱柱的使用寿命、容易造成液相色谱通道堵塞、污染吸收池等，而且因分离产物中混有β-环糊精不适合用于制备，因此急需开发一种新的分离方法适用于羟基积雪草酸与其同分异构体积雪草酸B的分析及制备。
发明内容
本发明所解决的技术问题是为了克服现有技术中羟基积雪草酸及积雪草酸B在高效液相色谱中采用反相C18色谱进行分离时，流动相中的β-环糊精影响色谱柱的使用寿命、容易造成液相色谱通道堵塞及污染吸收池等问题，从而提供了一种羟基积雪草酸及积雪草酸B分离方法。该方法通过采用超临界流体色谱仪进行分离，色谱柱采用纤维素手性柱。该方法分离效果良好，分离得到的产品纯度高，分离速度快，同时色谱柱使用寿命长，溶剂价格低廉且无污染，并可回收再利用，大大提高了分离效率和降低了生产成本。
本发明提供了一种羟基积雪草酸类化合物的分离方法，其包含以下步骤：采用超临界流体色谱仪对羟基积雪草酸类化合物进行分离，色谱柱采用纤维素手性柱；所述羟基积雪草酸类化合物包含羟基积雪草酸和积雪草酸B。
本发明中，所述纤维素手性柱是指在高纯多孔硅胶基质上涂覆或键合不同衍生化纤维素作为固定相的手性柱；所述固定相可为微晶三醋酸基、三安息香酸基或三苯基氨基酸盐纤维素。
所述三苯基氨基酸盐纤维素优选氯代纤维素三苯基氨基甲酸酯衍生物，进一步优选纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)或纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)。
所述分离方法中，所述纤维素手性柱优选Pheno Lux Cellulose-2或CHIRALPAKIC-3，进一步优选Pheno Lux Cellulose-2。
所述分离方法中，所述纤维素型手性柱可为分析型或制备型纤维素手性柱；当所述纤维素手性柱为分析型时，所述纤维素手性柱规格可参考本领域的常规规格，例如长度为150mm，内径为4.6mm，硅胶粒径为3μm；当所述纤维素手性柱为制备型时，所述纤维素手性柱规格可参考本领域的常规规格，例如长度为250mm，内径为30mm，硅胶粒径为5μm。
所述分离方法中，较佳地，所述羟基积雪草酸类化合物为羟基积雪草酸和羟基积雪草酸B的混合物。
所述分离方法中，所述超临界流体色谱仪可选用本领域常规的超临界流体色谱仪，分析型(例如Agilent Technologies analytical SFC(SFC-D))或制备型(例如Sepiatec prep SFC 100preparative SFC(SFC-12))均可。
所述分离方法中，所述采用超临界流体色谱仪对羟基积雪草酸类化合物进行分离时，流动相可采用超临界流体和有机溶剂；所述超临界流体可为本领域常用于分离时的常用超临界流体，例如超临界CO2；所述有机溶剂可参照超临界流体色谱用于分离时常用的有机溶剂，例如甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈中的一种或多种；其中，所述超临界流体和所述有机溶剂的体积比优选8:2～4:6，进一步优选6:4；较佳地，所述流动相中还可包含酸或碱；所述酸优选三氟乙酸和/或醋酸；所述碱优选二乙胺和/或三乙胺；所述酸或碱的量优选占所述流动相体积的0.02％～1％，例如0.05％。
所述分离方法中，所述采用超临界流体色谱仪对羟基积雪草酸类化合物进行分离时，流速可参考本领域超临界流体分离时的常规流速，当所述超临界流体色谱仪为分析型时，所述流速可为2～3mL/min，优选2.5mL/min；当所述超临界流体色谱仪为制备型时，所述流速可为50～100mL/min，优选60mL/min。
所述分离方法中，所述采用超临界流体色谱仪对羟基积雪草酸类化合物进行分离时，压力可参考本领域超临界流体分离时的常规压力，例如80～160bar，再例如100bar。
所述分离方法中，所述采用超临界流体色谱仪对羟基积雪草酸类化合物进行分离时，所述纤维素手性柱的柱温可参考本领域超临界流体分离时的常用温度，例如25～40℃，再例如35～38℃。
所述分离方法中，较佳地，所述超临界色谱仪还可配有检测器，所述检测器为可与所述超临界流体色谱仪色谱仪联用的检测器，例如紫外检测器。
所述紫外检测器的检测波长优选204nm～220nm，更优选210nm。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供的分离羟基积雪草酸类化合物的方法分离效果良好，分离得到的产品纯度高，分离速度快，同时色谱柱使用寿命长，溶剂价格低廉且无污染，并可回收再利用，大大提高了分离效率和降低了生产成本。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
称取含待分离羟基积雪草酸和积雪草酸B的混合物样品，加甲醇超声溶解配制成每毫升含约0.5～1毫克待分离样品的溶液。
将上述溶液作为待测样品，进样量为5ul：参考以下条件进行分析检测，
分析型超临界流体色谱仪(Agilent SFC-D)配UV检测器，选择分析型纤维素型色谱柱(Pheno Lux Cellulose-2，150×4.6mm I.D.，3μm)，流动相为二氧化碳-甲醇(含0.05％二乙胺)(60：40)，流速2.5mL/min，压力100bar，柱温35℃，检测波长210nm。
SFC分析结果显示：样品中羟基积雪草酸与积雪草酸B可达到良好分离，分离时间分别为3.058min和2.445min，分离度大于1.5。
实施例2
流动相为二氧化碳-乙醇(含0.05％二乙胺)，其余操作均同实施例1，
SFC分析结果显示：样品中羟基积雪草酸与积雪草酸B可达到良好分离，分离时间分别为2.66min和2.29min，分离度大于1.5。
实施例3
色谱柱选用CHIRALPAK IC-3，其余操作均同实施例1。
SFC分析结果显示：样品中羟基积雪草酸与积雪草酸B可达到良好分离，分离时间分别为5.35min和5.07min，分离度大于1.5。
实施例4
流动相为二氧化碳-乙醇(含0.05％二乙胺)，其余操作均同实施例3，
SFC分析结果显示：样品中羟基积雪草酸与积雪草酸B可达到良好分离，分离时间分别为5.00min和4.72min，分离度大于1.5。
实施例5
称取含待分离羟基积雪草酸和积雪草酸B的混合物样品，加甲醇超声溶解配制成每毫升含约10～50毫克的溶液。
将上述溶液作为待测样品，进样量为2mL：参考以下条件进行制备分离：
制备型超临界流体色谱仪(Agilent SFC-12)配UV检测器，选择制备型纤维素型色谱柱(Pheno Lux Cellulose-2，250×30mm I.D.，5μm)，流动相为二氧化碳-甲醇(60：40)，流速60mL/min，压力100bar，柱温38℃，检测波长210nm。羟基积雪草酸和积雪草酸B的分离时间分别3.78min和2.48min，分离度大于1.5。
分离制备的羟基积雪草酸和积雪草酸B，分别以实施例1超临界流体色谱仪及相应色谱系统进行测试，分离时间3.49min和2.78min，分离度大于1.5。分离所得积雪草酸B纯度99.05％，羟基积雪草酸纯度98.85％。
采用反相HPLC与原料中的峰进行比对，确认分别为积雪草酸B和羟基积雪草酸，反相HPLC条件为：以十八烷基硅胶键合相为填料(色谱柱:ZorbaxExtend-C18，4.6×250mm，5μm，Agilent)；以乙腈-0.1％磷酸4mmol/Lβ-环糊精溶液(38:62)为流动相；检测波长204nm；柱温30℃；流速1ml/min。分离时间分别为8.31min和12.43，分离度为8.89。
实施例6
称取含待分离羟基积雪草酸和积雪草酸B的混合物样品，加甲醇超声溶解配制成每毫升含约0.5～1毫克待分离样品的溶液。
将上述溶液作为待测样品，进样量为5ul：参考以下条件进行分析检测，
分析型超临界流体色谱仪(Agilent SFC-D)配UV检测器，选择分析型纤维素型色谱柱(Pheno Lux Cellulose-2，150×4.6mm I.D.，3μm)，流动相为二氧化碳-甲醇(含0.02％三氟乙酸)(80：20)，流速2mL/min，压力160bar，柱温25℃，检测波长220nm。
SFC分析结果显示：样品中羟基积雪草酸与积雪草酸B可达到良好分离，分离时间分别为5.72min和5.13min，分离度大于1.5。
实施例7
称取含待分离羟基积雪草酸和积雪草酸B的混合物样品，加甲醇超声溶解配制成每毫升含约0.5～1毫克待分离样品的溶液。
将上述溶液作为待测样品，进样量为5ul：参考以下条件进行分析检测，
分析型超临界流体色谱仪(Agilent SFC-D)配UV检测器，选择分析型纤维素型色谱柱(Pheno Lux Cellulose-2，150×4.6mm I.D.，3μm)，流动相为二氧化碳-甲醇(含1％三氟乙酸)(40：60)，流速3mL/min，压力100bar，柱温40℃，检测波长204nm。
SFC分析结果显示：样品中羟基积雪草酸与积雪草酸B可达到良好分离，分离时间分别为2.97min和2.45min，分离度大于1.5。
对比例1
色谱柱选用CHIRALPAK AD-3，其余操作均同实施例1。
SFC分析结果显示：羟基积雪草酸和积雪草酸B未分离，出峰时间为5.80min。

Claims (13)

1.一种羟基积雪草酸类化合物的分离方法，其特征在于，包含以下步骤：采用超临界流体色谱仪对羟基积雪草酸类化合物进行分离，色谱柱采用纤维素手性柱，所述纤维素手性柱的固定相为三苯基氨基酸盐纤维素；
所述羟基积雪草酸类化合物包含羟基积雪草酸和积雪草酸B；
所述采用超临界流体色谱仪对羟基积雪草酸类化合物进行分离时，流动相采用超临界流体和有机溶剂，所述超临界流体为超临界CO2，所述有机溶剂为甲醇、乙醇和异丙醇中的一种或多种；所述超临界流体和所述有机溶剂的体积比为8:2～4:6；所述流动相中还包含酸或碱；所述酸为三氟乙酸和/或醋酸；所述碱为二乙胺和/或三乙胺；所述酸或碱的量占所述流动相体积的0.02％～1％；
所述采用超临界流体色谱仪对羟基积雪草酸类化合物进行分离时，当所述超临界流体色谱仪为分析型时，流速为2～3mL/min；当所述超临界流体色谱仪为制备型时，流速为50～100mL/min；
所述采用超临界流体色谱仪对羟基积雪草酸类化合物进行分离时，压力为80～160bar；所述纤维素手性柱的柱温为25～40℃。
2.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述三苯基氨基酸盐纤维素为纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)或纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)。
3.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述纤维素手性柱为Pheno LuxCellulose-2或CHIRALPAK IC-3；和/或，所述纤维素型手性柱为分析型或制备型纤维素手性柱。
4.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述羟基积雪草酸类化合物为羟基积雪草酸和积雪草酸B的混合物。
5.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述超临界流体和所述有机溶剂的体积比为6:4。
6.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述酸或碱的量占所述流动相体积的0.05％。
7.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述超临界流体色谱仪为分析型时，所述流速为2.5mL/min。
8.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述超临界流体色谱仪为制备型时，所述流速为60mL/min。
9.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述采用超临界流体色谱仪对羟基积雪草酸类化合物进行分离时，压力为100bar；和/或，所述纤维素手性柱的柱温为35～38℃。
10.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于所述超临界色谱仪还配有检测器。
11.如权利要求10所述的分离方法，其特征在于，所述检测器为紫外检测器。
12.如权利要求11所述的分离方法，其特征在于，所述紫外检测器的检测波长为204nm～220nm。
13.如权利要求12所述的分离方法，其特征在于，所述紫外检测器的检测波长为210nm。
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