CN108409751A

CN108409751A - 一种子囊霉素的纯化方法

Info

Publication number: CN108409751A
Application number: CN201810156457.XA
Authority: CN
Inventors: 朱进伟; 石磊; 潘剑; 张敏; 彭湘屏; 高祥; 郑玲辉; 滕云
Original assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2018-02-24
Filing date: 2018-02-24
Publication date: 2018-08-17

Abstract

本发明公开了一种子囊霉素的纯化方法。将子囊霉素上样液用大孔吸附树脂富集，收集洗脱液并浓缩，在浓缩液中加入萃取剂萃取，并浓缩有机相至干粉；将干粉溶解为澄清的甲醇或乙腈溶液，用制备液相色谱仪制备出高纯度的子囊霉素纯品。本发明的制备工艺对子囊霉素中的关键杂质FK523有很好的去除效果，制备出的产品纯度高。

Description

一种子囊霉素的纯化方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种子囊霉素的纯化方法。

背景技术

子囊霉素(ascomycin,immunomycin,FK520,式1)为二十三碳的大环内酯类化合物，是二十世纪六十年代从吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus的培养液中分离而得到的一种大环内酯类抗生素，也是免疫抑制剂他克莫司(tacrolimus,FK-506)的乙基类似物，自从他克莫司的免疫抑制活性被发现之后，也迅速推动了子囊霉素免疫抑制活性研究。欧洲专利EP0323865阐述免疫抑制剂子囊霉素的用途，中国专利CN101036649公开了免疫抑制剂子囊霉素在制备治疗自身免疫性糖尿病和皮肤抑制排斥反应的药物中的用途，也有研究表明其在类风湿性关节炎和牛皮癣等方面的治疗也有显著的功效。子囊霉素除了在治疗自身免疫疾病中有非常好的效果，且还具有抗痉挛、抗疟疾、神经保护再生等活性，有巨大的药用价值和市场应用价值。子囊霉素的结构式如下所示：

目前，我国对子囊霉素的研究尚处于起步阶段，大部分研究工作都集中在子囊霉素的菌种选育和发酵、子囊霉素衍生物的合成开发、抗菌活性和临床应用等方面，还较少有提取纯化子囊霉素的报道，其市场也基本被日本和美国等国外公司占领。为打破生产瓶颈，解决我国对于子囊霉素纯品提取纯化技术空洞的缺陷，加快我国自主生产子囊霉素的脚步，如何制备出高纯度的子囊霉素成品成为我们迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种子囊霉素的纯化方法，通过使用大孔吸附树脂和制备液相色谱，得到稳定且纯度高的产品，实现了子囊霉素与关键杂质FK523(式2)的有效分离，包括以下步骤：

a)利用大孔吸附树脂柱富集子囊霉素上样液，用流动相75％-90％(mL/mL)乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液并浓缩，在浓缩液中加入萃取剂萃取，并浓缩有机相至干粉；

b)将步骤a)所得干粉用配制反相流动相常用的有机溶剂溶解得上柱液，所述干粉与有机溶剂的重量体积比为6～9:100(g/ml)，所述有机溶剂优选甲醇或乙腈，更优选乙腈；将所得上柱液利用制备液相色谱柱分离，以50％～60％(mL/mL)乙腈水溶液为流动相，收集目标组分即为子囊霉素。

在优选的实施方案，所述步骤a)中子囊霉素上样液为子囊霉素粗品经乙醇溶解制得。

在优选的实施方案中，所述步骤a)中大孔吸附树脂选自聚苯乙烯类树脂，优选H-60、HB60、HP20、HP21、SP850、SP207、XAD-1600N或XAD-4，进一步优选XAD-1600N、HP20或SP850，更优选XAD-1600N。

在优选的实施方案中，所述步骤a)中大孔吸附树脂的粒径为0.35mm～0.45mm，特征孔径为形状为球形。

在优选的实施方案中，所述萃取剂选自乙酸丁酯、二氯甲烷、乙酸乙酯、己烷，优选二氯甲烷、乙酸乙酯，更优选乙酸乙酯。

在优选的实施方案中，所述步骤b)中制备液相的制备填料为C₈填料，优选大有C₈填料、华谱C₈填料、Kromasil C₈填料，更优选Kromasil C₈填料。

在优选的实施方案中，所述步骤b)中制备液相色谱柱的制备填料粒径为10μm，孔径为

在优选的实施方案中，所述步骤b)中流动相pH为3～5，优选3.5，流速为50mL/min～70mL/min，优选70mL/min，紫外检测波长为210nm。

在优选的实施方案中，所述子囊霉素粗品中子囊霉素色谱纯度≥64.7％，优选64.7％-75.6％。

本发明调节pH所用的酸可选自无机酸或有机酸，无机酸可选自盐酸、硫酸、磷酸等，有机酸可选自甲磺酸、三氟甲磺酸、甲酸、乙酸、丙酸、草酸、苯磺酸等。

本发明所涉及的子囊霉素的纯度是通过高效液相色谱检测的，仪器及色谱条件为：液相色谱仪型号为岛津LC20AT；色谱柱为Agilent C₈，规格4.6mm*250mm，粒径为5μm；流动相为乙腈：甲基叔丁基醚：水：三氟乙酸＝1600:160:2240:0.4(mL：mL：mL；mL)；紫外检测波长为210nm；流速为1.0mL/min；进样量：10μL；柱温：60℃。

本发明所用的大孔吸附树脂中型号为HP20、HP21、SP850、SP207购自日本三菱化学株式会社，XAD-1600、XAD-4购自罗门哈斯公司，H-60、HB60购自郑州勤实科技有限公司；所使用的制备柱为北京创新通恒LC6000；大有C₈填料购自上海大有色谱技术服务有限公司，华谱C₈填料购自华谱科仪(北京)科技有限有限公司，Kromasil C₈填料，购自阿克苏诺贝尔公司；所使用的溶剂没有特别的限制，可采用商购的常规溶剂，其中所用的乙腈为色谱级，其余有机溶剂为分析级。

应当强调的是，本发明技术方案中所涉及的数值或数值端点，其含义或意义的保护范围并不局限于该数字本身，本领域技术人员能够理解，它们包含了那些已被本领域广为接受的可允许误差范围，例如实验误差、测量误差、统计误差和随机误差等等，而这些误差范围均包含在本发明的范围之内。

本发明相对于现有技术，提供了一种纯化子囊霉素的新的技术方案，通过利用大孔吸附树脂对子囊霉素进行富集，再利用制备液相色谱制得的子囊霉素的纯度可达99％以上，其关键杂质FK523色谱纯度由6.5％左右降到0.1％以下，实现了产物与关键杂质FK523的高效分离，保证了原料药的质量，满足了药品生产的质量要求。此外，本发明的制备工艺简单，不易产生副产物和杂质残留，产品分离纯度高，易于工业化生产，为子囊霉素的生产提供了可行的提取工艺。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步解释说明，但是，它们并不构成对本发明保护范围限制和限定。

大孔吸附树脂在使用前需要进行预处理活化，以保持较好的分离性能，具体步骤如下：加入高于树脂层10cm的乙醇浸泡4小时，然后用乙醇淋洗，洗至流出液在试管中用去离子水稀释不浑浊时为止。最后用去离子水反复洗涤至乙醇含量小于1％或无明显乙醇气味后即可用于实验。

本发明实施例中子囊霉素粗品按照CN1013687B实施例4中记载的方法制备得到。

实施例1

取6.0g子囊霉素粗品(子囊霉素色谱纯度67.2％，FK523色谱纯度6.6％)，用乙醇溶解至500mL得上样液，用型号为XAD-1600N的大孔吸附树脂柱进行动态吸附，上柱流速0.5BV/h，解吸流动相为85％(mL/mL)乙醇水溶液，洗脱流速1.0BV/h，每0.5BV收集后用液相检测；将主峰色谱纯度≥80％的洗脱液合并，在36℃下减压浓缩至无液体滴出后，加入1L乙酸乙酯萃取，再在36℃下减压浓缩乙酸乙酯萃取相，浓缩得干粉3.7g。用重量体积比约为8:100(g/mL)的乙腈46mL溶解所得干粉，溶解澄清后得上柱液49mL，液相检测子囊霉素浓度为58mg/mL。将上述所得上柱液利用装有Kromasil C₈填料的DAC50制备液相色谱仪分离，制备流动相为55％(mL/mL)乙腈水溶液，pH3.5，紫外检测波长为210nm，流速为70mL/min。收集子囊霉素主峰色谱纯度≥99％的组份，然后合并后再经液相色谱检测杂质FK523色谱纯度为0.09％，子囊霉素色谱纯度为99.2％，纯度99.1％，收率91.0％。

实施例2

取5.7g子囊霉素粗品(子囊霉素色谱纯度64.7％,FK523色谱纯度6.5％)，用乙醇溶解至500mL得上样液，用型号为XAD-1600N的大孔吸附树脂柱进行动态吸附，上柱流速0.5BV/h，解吸流动相为75％(mL/mL)乙醇水溶液，洗脱流速1.0BV/h，每0.5BV收集后用液相检测；将主峰色谱纯度≥80％的洗脱液合并，在39℃下减压浓缩至无液体滴出后，加入1L乙酸乙酯萃取，再在39℃下减压浓缩乙酸乙酯萃取相，浓缩得干粉3.8g。用重量体积比约为6:100(g/mL)的乙腈63mL溶解所得干粉，溶解澄清后得上柱液65mL，液相检测子囊霉素浓度为44.6mg/mL。将上述所得上柱液利用装有Kromasil C₈填料的DAC50制备液相色谱仪分离，制备流动相为55％(mL/mL)乙腈水溶液，pH3.5，紫外检测波长为210nm，流速为70mL/min。收集子囊霉素主峰色谱纯度≥99％的组份，然后合并后再经液相色谱检测杂质FK523色谱纯度为0.06％，子囊霉素色谱纯度为99.1％，纯度99.0％，收率92.3％。

实施例3

取6.5g子囊霉素粗品(子囊霉素色谱纯度67.6％,FK523色谱纯度6.4％)，用乙醇溶解至500mL得上样液，用型号为XAD-1600N的大孔吸附树脂柱进行动态吸附，上柱流速0.5BV/h，解吸流动相为90％(mL/mL)乙醇水溶液，洗脱流速1.0BV/h，每0.5BV收集后用液相检测；将主峰色谱纯度≥80％的洗脱液合并，在39℃下减压浓缩至无液体滴出后，加入1L乙酸乙酯萃取，再在39℃下减压浓缩乙酸乙酯萃取相，浓缩得干粉4.1g。用重量体积比为9:100(g/mL)的乙腈46mL溶解所得干粉，溶解澄清后得上柱液48mL，液相检测子囊霉素浓度为66.3mg/mL。将上述所得上柱液利用装有Kromasil C₈填料的DAC50制备液相色谱仪分离，制备流动相为55％(mL/mL)乙腈水溶液，pH3.5，紫外检测波长为210nm，流速为70mL/min。收集子囊霉素主峰色谱纯度≥99％的组份，然后合并后再经液相色谱检测杂质FK523色谱纯度为0.03％，子囊霉素色谱纯度为99.2％，纯度99.1％，收率91.5％。

实施例4

取6.6g子囊霉素粗品(子囊霉素色谱纯度71.2％，FK523色谱纯度6.7％)，用乙醇溶解至500mL得上样液，用型号为HP20的大孔吸附树脂柱进行动态吸附，上柱流速0.5BV/h，解吸流动相为85％(mL/mL)乙醇水溶液，洗脱流速1.0BV/h，每0.5BV收集后用液相检测；将主峰色谱纯度≥80％的洗脱液合并，在36℃下减压浓缩至无液体滴出后，加入1L乙酸乙酯萃取，再在36℃下减压浓缩乙酸乙酯萃取相，浓缩得干粉4.2g。用重量体积比约为8:100(g/mL)的甲醇52mL溶解所得干粉，溶解澄清后得上柱液55mL，液相检测子囊霉素浓度为58.1mg/mL。将上述所得上柱液利用装有华谱C₈填料的DAC50制备液相色谱仪分离，制备流动相为55％(mL/mL)乙腈水溶液，pH3.5，紫外检测波长为210nm，流速为70mL/min。收集子囊霉素主峰色谱纯度≥99％的组份，然后合并后再经液相色谱检测杂质FK523色谱纯度为0.06％，子囊霉素色谱纯度为99.5％，纯度99.3％，收率90.6％。

实施例5

取5.9g子囊霉素粗品(子囊霉素色谱纯度75.6％，FK523色谱纯度6.4％)，用乙醇溶解至500mL得上样液，用型号为HP20的大孔吸附树脂柱进行动态吸附，上柱流速0.5BV/h，解吸流动相为85％(mL/mL)乙醇水溶液，洗脱流速1.0BV/h，每0.5BV收集后用液相检测；将主峰色谱纯度≥80％的洗脱液合并，在36℃下减压浓缩至无液体滴出后，加入1L二氯甲烷萃取，再在36℃下减压浓缩二氯甲烷萃取相，浓缩得干粉3.8g。用重量体积比约为8:100(g/mL)的乙腈47mL溶解所得干粉，溶解澄清后得上柱液50mL，液相检测子囊霉素浓度为58.3mg/mL。将上述所得上柱液利用装有大有C₈填料的DAC50制备液相色谱仪分离，制备流动相为55％(mL/mL)乙腈水溶液，pH3.5，紫外检测波长为210nm，流速为70mL/min。收集子囊霉素主峰色谱纯度≥99％的组份，然后合并后再经液相色谱检测杂质FK523色谱纯度为0.04％，子囊霉素色谱纯度为99.6％，纯度99.3％，收率91.2％。

实施例6

取5.5g子囊霉素粗品(子囊霉素色谱纯度65.6％，FK523色谱纯度6.3％)，用乙醇溶解至500mL得上样液，用型号为SP850的大孔吸附树脂柱进行动态吸附，上柱流速0.5BV/h，解吸流动相为85％(mL/mL)乙醇水溶液，洗脱流速1.0BV/h，每0.5BV收集后用液相检测；将主峰色谱纯度≥80％的洗脱液合并，在36℃下减压浓缩至无液体滴出后，加入1L二氯甲烷萃取，再在36℃下减压浓缩二氯甲烷萃取相，浓缩得干粉3.2g。用重量体积比约为8:100(g/mL)的甲醇40mL溶解所得干粉，溶解澄清后得上柱液41mL，液相检测子囊霉素浓度为49.1mg/mL。将上述所得上柱液利用装有Kromasil C₈填料的DAC50制备液相色谱仪分离，制备流动相为55％(mL/mL)乙腈水溶液，pH3.5，紫外检测波长为210nm，流速为70mL/min。收集子囊霉素主峰色谱纯度≥99％的组份，然后合并后再经液相色谱检测杂质FK523色谱纯度为0.03％，子囊霉素色谱纯度为99.3％，纯度99.1％，收率90.3％。

Claims

1.一种子囊霉素的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)利用大孔吸附树脂柱富集子囊霉素上样液，用75％～90％(mL/mL)乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液并浓缩，在浓缩液中加入萃取剂萃取，并浓缩有机相至干粉；

b)将步骤a)所得干粉用配制反相流动相常用的有机溶剂溶解得上柱液，所述干粉与有机溶剂的重量体积比为6～9：100(g/mL)，所述有机溶剂优选甲醇或乙腈，更优选乙腈；将所得上柱液利用制备液相色谱柱分离，以50％～60％(mL/mL)乙腈水溶液为流动相，收集目标组分即为子囊霉素。

2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤a)中的大孔吸附树脂选自聚苯乙烯类树脂，优选H-60、HB60、HP20、HP21、SP850、SP207、XAD-1600N或XAD-4，进一步优选XAD-1600N、HP20或SP850，更优选XAD-1600N。

3.如权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤a)中的萃取剂选自乙酸丁酯、二氯甲烷、乙酸乙酯、己烷，优选二氯甲烷、乙酸乙酯，更优选乙酸乙酯。

4.如权利要求1-3任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤b)中制备液相色谱柱的制备填料为C₈填料，优选大有C₈填料、华谱C₈填料、Kromasil C₈填料，更优选Kromasil C₈填料。

5.如权利要求1-4任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤b)中流动相的pH为3～5，优选3.5，流速为50mL/min～70mL/min，优选70mL/min。

6.如权利要求1-5任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述子囊霉素上样液为子囊霉素粗品经乙醇溶解制得。

7.如权利要求1-6任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂的粒径为0.35mm～0.45mm，特征孔径为形状为球形。

8.如权利要求1-7任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述制备液相色谱柱的制备填料粒径为10μm，孔径为

9.如权利要求6-8任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述子囊霉素粗品中子囊霉素色谱纯度≥64.7％，优选64.7％-75.6％。