CN105418631B - 一种用高效液相色谱分离纯化奈马菌素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用高效液相色谱纯化莫西菌素前体奈马菌素的方法，所述方法是用苯乙烯‑二乙烯基苯交联的微球为色谱填料，将奈马菌素粗品溶液上样到色谱柱后，以酸性醇水溶液为流动相洗脱吸附在填料上的奈马菌素。本发明不但能够高纯度和高回收率地对奈马菌素进行分离纯化，而且流动相使用量小，纯化时间短，工艺步骤少，从而大大缩短生产周期。

Description

一种用高效液相色谱分离纯化奈马菌素的方法
技术领域
本发明涉及一种纯化方法，特别是一种高效液相色谱法纯化莫西菌素前体奈马菌素的方法。
背景技术
随着抗寄生虫药需求的持续增长，得到高纯度高药效的抗寄生虫药物已是一种不可或缺的技术需求。
莫西菌素(Moxidectin)是一种新型的抗寄生虫大环内酯类第三代阿维菌素类药物，其有更高的脂溶性和水溶性，在血浆中的代谢产物比其他阿维菌素类的药物如伊维菌素、多拉菌素等高，其在体内停留的时间长，因而药效持续更长，可对牛、羊、骆驼安全注射并预防体内外寄生虫。若想高效生产莫西菌素必须首先得到高纯度高回收率的奈马菌素(Nemadectin)。奈马菌素经过化学修饰或者衍生，可以得到莫西菌素。
奈马菌素又名尼莫克汀，它是一种十六元大环内脂类驱虫抗生素，由蓝灰链霉菌发酵生产，也是米尔贝霉素族的一员，同莫西菌素一样可以用于治疗牛羊等动物体内外寄生虫。其具有杀虫谱广、易降解、低残留、无抗药性、对人畜无害、环境污染少等优点。奈马菌素药学活性不如莫西菌素，高纯度的奈马菌素对高纯度的莫西菌素的合成具有重要意义。
奈马菌素的分子式为C36H52O8，其结构式如下：
奈马菌素相对分子质量小于2000，其疏水性较强，在有机溶剂中易溶，可采用反相液相色谱(RPLC)的方法制备。
中国专利CN104193760A公开了一种利用奈马菌素发酵液提取奈马菌素粗品的方法，该方法主要采用板框过滤、闪蒸干燥、浸提、降膜浓缩、酸化、脱色处理、萃取、反萃取、吸附、结晶等一系列物化过程，得到奈马菌素粗品。但该过程步骤繁杂，且该专利并未涉及该过程得到奈马菌素的纯度。
中国专利CN103588784A公开了一种制备高纯度奈马菌素的方法，该方法需要经过萃取、离子交换树脂脱色、大孔吸附树脂1吸附萃取液中的蛋白质、多糖和色素等杂质，大孔树脂2吸附、分离奈马菌素等多个步骤才能使奈马菌素从纯度58％-59％的粗品达到纯度90％以上。
在这些现有技术中，有的纯化方案仅能得到纯度较低的奈马菌素粗品，产品的纯度不能达到后续高效生产莫西菌素的要求，因而需要进一步提高其纯度以满足要求。有的则工序复杂，须经过脱色、萃取、吸附等诸多步骤，并且所用的淋洗液体积较多，有机溶剂比例较大，成本较高，对人体和环境有一定影响，因而需要进一步减少工序及有机溶剂的用量，以达到环境友好、纯度高、回收率高的奈马菌素纯品以满足后续要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种用高效液相色谱纯化奈马菌素的方法，不仅能达到高的纯度和回收率，而且流动相使用量小，纯化时间短，工艺步骤少，从而大大缩短生产周期。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：一种用高效液相色谱纯化奈马菌素的方法，所述方法是用苯乙烯-二乙烯基苯交联的微球为色谱填料，将奈马菌素粗品溶液上样到色谱柱后，以酸性醇水溶液为流动相洗脱吸附在填料上的奈马菌素。
优选的，所述苯乙烯-二乙烯基苯交联的微球是UniPS 30-300或者UniPS 40-300。
优选的，所述奈马菌素粗品用甲醇水溶液或者乙醇水溶液溶解。
优选的，所述酸性醇水溶液流动相为pH在2-3的乙醇和pH在2-3的酸溶液。
优选的，所述奈马菌素粗品的纯度在55％-70％。
优选的，所述流动相洗脱吸附在填料上的奈马菌素过程：先用68-72％的酸性乙醇水溶液洗杂9-10个柱体积，然后再用78-80％的酸性乙醇水溶液洗脱目标组分8-9个柱体积，最后用90％-95％的酸性乙醇水溶液2个柱体积清洗残留组分。
优选的，所述方法在装柱和纯化过程中的压力均小于4Mpa。
UniPS 30-300和UniPS 40-300是苯乙烯-二乙烯基苯交联的聚合物微球，孔径粒径分别为30±1.5μm和40±1.5μm，具有高度的粒径均一性。其作为色谱填料具有耐酸碱、寿命长、反压低，并且载量高、分离效果好等优点。
在纯化奈马菌素时，以UniPS 40-300作为色谱柱的固定相，只需要一步即可将奈马菌素粗品纯度从65％-68％提高到90％以上，且回收率在70％以上，同时具有很好的脱色效果。本分离纯化方法兼顾了产品的纯度和回收率，是一种非常实用、快速的分离纯化奈马菌素的方法，适合工业化生产推广。
因此，本发明应用苯乙烯-二乙烯基苯交联的微球UniPS 30-300和UniPS 40-300为色谱填料，以酸性醇水溶液为流动相洗脱吸附在填料上的奈马菌素，不但能够高纯度和高回收率地对奈马菌素进行分离纯化，而且流动相使用量小，纯化时间短，工艺步骤少，从而大大缩短生产周期。
附图说明
图1是实施例1中使用的色谱填料Uni PS 30-300的扫描电镜图片。
图2是实施例1中使用UniPS 30-300分离纯化奈马菌素的制备图。
图3是实施例1中纯化前的奈马菌素粗品的HPLC分析图谱。
图4是实施例1中纯化后的奈马菌素的HPLC分析图谱。
图5是按照实施例1中的方法纯化奈马菌素后的相关杂质和目标组分奈马菌素随各收集馏分的含量变化趋势图。
图6是实施例2中使用的色谱填料Uni PS 40-300的扫描电镜图片。
图7是实施例2中使用UniPS 40-300分离纯化奈马菌素的制备图。
图8是实施例2中分离纯化前后奈马菌素粗品与纯品的HPLC色谱对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
奈马菌素的纯化：采用(4.6×250)mm的色谱柱，UniPS 30-300(聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚体球粒径30±1.5μm，苏州纳微科技有限公司)作为分离纯化填料，装柱体积4.1ml，用68-72％的酸性乙醇水溶液平衡处理柱子。流动相A为pH值为2～3的盐酸水溶液，流动相B为pH为2～3的乙醇，不同百分比的流动相A和流动相B配成洗脱时所用的流动相。奈马菌素的粗品(纯度65-68％)先用乙醇水溶液溶解，混匀后用0.45μm的滤膜过滤。浓度100mg/ml，上样体积0.42ml，上样量约为10mg/ml。上样流速1ml/min，先用68-72％的酸性乙醇水溶液洗杂9-10个柱体积，78-80％的酸性乙醇水溶液洗脱目标组分8-9个柱体积，最后用90％-95％的酸性乙醇水溶液2个柱体积清洗残留组分。分段收集，前段主要是对前杂相对目标组分奈马菌素保留时间为0.66的杂质的去除，且目标组分损失很少，仅占5％；中段有大量目标组分流出，其大多纯度为90％以上，回收率在60％以上；后段主要是前杂相对目标组分奈马菌素保留时间为0.94的杂质的流出，以及杂质相对保留时间在1.44的后杂的流出，此时目标组分的纯度变低，回收率约占20％。
实施例2
奈马菌素的纯化：采用(4.6×250)mm的色谱柱，UniPS 40-300(聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚体球粒径40±1.5μm，苏州纳微科技有限公司)作为分离纯化填料，装柱体积4.1ml，用68-72％的酸性乙醇水溶液平衡处理柱子。流动相A为pH值为2～3的乙酸水溶液，流动相B为pH为2～3的乙醇，流动相为不同比例的乙醇与乙酸溶液的混合。奈马菌素的粗品(纯度65-68％)先用乙醇水溶液溶解，混匀后用0.45μm的滤膜过滤。浓度为100mg/ml，上样体积0.42ml，上样量约为10mg/ml。上样流速为1ml/min，先用68-72％的酸性乙醇水溶液洗杂9-10个柱体积，78-80％的酸性乙醇水溶液洗脱目标组分8-9个柱体积，最后用90％-95％的酸性乙醇水溶液2个柱体积清洗残留组分。分段收集，前段主要是对前杂相对目标组分奈马菌素保留时间为0.66的杂质的去除，且目标组分损失很少，仅占2％；中段有大量目标组分流出，其大多纯度为90％以上，回收率在70％以上；后段主要是前杂相对目标组分奈马菌素保留时间为0.94的杂质的流出，以及杂质相对保留时间在1.44的后杂的流出，此时目标组分的纯度变低，回收率约占22％。
实施例3
奈马菌素的纯化：采用(4.6×250)mm的色谱柱，NM 100填料(聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚体，微球粒径50-150μm，孔径苏州纳微科技有限公司)作为分离纯化填料，装柱体积4.1ml，用72％的酸性乙醇水溶液平衡处理柱子。流动相A为pH为2～3的盐酸溶液，流动相B为pH为2～3的乙醇。奈马菌素的粗品(纯度65-68％)先用乙醇水溶液溶解，混匀后用0.45μm的滤膜过滤。浓度为100mg/ml，上样体积0.42ml，上样量约为10mg/ml。上样流速为1ml/min，先用72％的酸性乙醇水溶液洗杂9-10个柱体积，78-80％的酸性乙醇水溶液洗脱目标组分6-7个柱体积，最后用90％-95％的酸性乙醇水溶液2个柱体积清洗残留组分。分段收集，目标组分与各个杂质容易同时流出，纯度达到75％的收集馏分，回收率不足40％。
表1将实施例1～3的装填体积、上样量、纯度和回收率做了对比，其中实施例1、2分别用Uni PS 30-300和Uni PS 40-300为色谱填料，奈马菌素的纯度能达到90％以上，回收率在70％左右。而实施例3用NM100作为色谱填料，纯化相同的奈马菌素粗品，相同的装填体积和上样量，采用相同的工艺条件，最终奈马菌素的纯度仅能达到75％左右，回收率仅36％。采用Uni PS 30-300和Uni PS 40-300为色谱填料的色谱柱可以有效地缩窄色谱带和色谱峰，还可以获得最低的反压，从而使这些色谱柱呈高柱效和高分辨率，最终影响分离效果。
表1三个实施例分离纯化结果对比
本发明应用苯乙烯-二乙烯基苯交联的微球Uni PS 30-300和Uni PS 40-300为色谱填料，以酸性醇水溶液为流动相洗脱吸附在填料上的奈马菌素，不但能够高纯度和高回收率地对奈马菌素进行分离纯化，而且流动相使用量小，纯化时间短，从而大大缩短生产周期。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种用高效液相色谱纯化奈马菌素的方法，其特征在于，所述方法是用苯乙烯-二乙烯基苯交联的微球为色谱填料，将奈马菌素粗品溶液上样到色谱柱后，以酸性醇水溶液为流动相洗脱吸附在填料上的奈马菌素；
所述苯乙烯-二乙烯基苯交联的微球是UniPS 30-300或者UniPS 40-300；
所述流动相洗脱吸附在填料上的奈马菌素过程：先用68-72%的酸性乙醇水溶液洗杂9-10个柱体积，然后再用78-80%的酸性乙醇水溶液洗脱目标组分8-9个柱体积，最后用90%-95%的酸性乙醇水溶液2个柱体积清洗残留组分。
2.如权利要求1所述的用高效液相色谱纯化奈马菌素的方法，其特征在于，所述奈马菌素粗品用甲醇水溶液或者乙醇水溶液溶解。
3.如权利要求1所述的用高效液相色谱纯化奈马菌素的方法，其特征在于，所述酸性醇水溶液流动相为pH在2-3的乙醇和pH在2-3的酸溶液的混合。
4.如权利要求1所述的用高效液相色谱纯化奈马菌素的方法，其特征在于，所述奈马菌素粗品的纯度在55%-70%。
5.如权利要求1所述的用高效液相色谱纯化莫西菌素前体奈马菌素的方法，其特征在于，所述方法在装柱和纯化过程中的压力均小于4 Mpa。
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